DD251996A5 - Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Interferonen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von neuartigen Hybrid-Interferonen sowie ihre Behandlung von Virus- oder neoplastischen Erkrankungen. Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Hybrid-Interferone zur Verfuegung gestellt, die spezifische biologische Aktivitaeten zeigen und die unerwuenschte Nebenwirkungen, die ihre Anwendung einschraenken, ausschliessen oder verringern. Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Hybrid-Interferone zu entwickeln, die die gewuenschten Eigenschaften aufweisen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe geloest, indem ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Interferon-Polypeptid bereitgestellt wird, wobei mit einem Hybrid-Vektor, der eine fuer das Hybrid-Interferon-Polypeptid codierende DNS-Sequenz enthaelt, transformierte Wirtszellen gezuechtet werden und das Hybrid-Interferon isoliert wird. Die neuartigen Hybrid-Interferone besitzen wertvolle Antivirus- und proliferationshemmende Eigenschaften.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von neuartigen Hybrid-Interferonen mit Hilfe der Rekombinant-DNS-Technologie, sowie ihre Anwendung zur Behandlung von Virus- oder neoplastischen Erkrankungen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei den Interferonen („IFNn") handelt es sich um eine Familie von Polypeptiden, die durch eine große Vielzahl eukaryotischer Zellen nach der Einwirkung verschiedener Mitogene und Viren^ausgeschieden werden. Die Interferone wurden aufgrund ihrer chemischen und biologischen Charakteristika in drei Gruppen eingeteilt: IFN-a, IFN-ß und IFN-γ. IFN-a- und -ß-Gene werden vorwiegend in mit Viren, Virusbestandteilen und doppelsträngiger DNS behandelten Zellen ausgedrückt. IFN-γ wird dagegen als Reaktion auf Mitogene synthetisiert.

Human-IFN-ct wird durch eine Gen-Familie, die mindestens 15 nicht-allelomorphe Gene aufweist, codiert. Human-IFN-ß und Human-IFN-γ werden durch einzelne Gene codiert. Das primäre Translationsprodukt von IFN-a umfaßt 189 Aminosäuren (außer IFN-Cc₂:188 Aminosäuren), von denen ein Signalpeptid von 23 Aminosäuren durch post-translationale Modifikation entfernt wird. Human-IFN-ß und Human-IFN-γ bestehen aus 187 und 186 Aminosäuren, von denen 21 oder 20 Aminosäuren, die die Signalpeptide bilden, entfernt sind. Die Aminosäure-Sequenzhomologie unter den IFN-a-Unterarten beträgt 80 bis 85%, während die Homologie zwischen IFN-ß und IFN-a etwa 30 bis 40% beträgt.

IFN-γ zeigt nur einfache Aminosäure-Homologien mit IFN-a, die 12% identischen Paaren entsprechen.

Die IFNn zeigen Antivirus-, immunomodulatorische sowie cytotoxische Aktivitäten. Es wurde demonstriert, daß IFN-a-Unterarten (z. B. IFN-Ct₂, IFN-a,) unterschiedliche Targetzellenspezifitäten zeigen. Die Antivirus-Aktivität von IFN-Ct₂ und IFN-ai ist etwa die gleiche bei Rinder-(MDBK)-Zellen, aber IFN-a₂ ist siebenmal wirksamer als IFN-a, bei Human-(WISH)-Zellen, und dreißigmal weniger wirksam als IFN-a, beim Schutz von Mäuse-(L929)-Zellen. (M. Streuli, u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 2848 [1981]). Der Nachweis, daß Glieder der multigenen IFN-ct-Familie im Ausmaß und der Spezifität ihrer Antivirus-Aktivität verlieren, wurde durch die Ergebnisse erbracht, die bei einigen IFN-a-„Hybriden" erzielt wurden (siehe EP 32 134, US-PS 4 414 150). Diese „Hybriden" wurden durch Spalten von zwei für Interferon-a-Unterarten codierende Gene mit dem Restriktions-Enzym Pvull (oder in zwei Fällen mit BgIII) und Kreuz-Ligatur der resultierenden Fragmente konstruiert, so daß die für den Aminoterminalteil des einen IFN-Gens codierende DNS-Sequenz zur für den Carboxylterminalteil des anderen IFN-Gens codierenden DNS-Sequenz kondensiert wurde. Obwohl diese Hybrid-Interferone Veränderungen in der Targetzellenspezifität im Vergleich zu den Ausgangs-Interferonen aufweisen, konnte nicht demonstriert werden, daß irgendeine Abschwächung oder irgendeine Restriktion bei einer der drei Interferonaktivitäten vorhanden war. Solche Abschwächung oder Restriktion kann zum Beispiel bei klinischen Anwendungsfällen wünschenswert sein, bei denen beabsichtigt ist, die Interferon-Therapie auf ein bestimmtes Problem wie Virusinfektion zu konzentrieren, ohne daß die Möglichkeit komplizierender Faktoren, die von anderen Aktivitäten des verabreichten Interferons stammen, gegeben ist.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Hybrid-Interferone zur Verfugung gestellt, die spezifische biologische Aktivitäten zeigen, die von der selektiven oder vorwiegenden Aktivierung von nur einigen der durch Interferon induzierten biochemischen Bahnen herrühren, und/oder die einige der unerwünschten Nebenwirkungen natürlicher Interferone, die· ihre Anwendung einschränken, wie influenza-artige Symptome (z. B. Fieber, Kopfschmerzen und Müdigkeit), gastrointestinale Störungen, Senkung des Blutdruckes und Haarausfall ausschließen oder verringern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung neuartiger Hybrid-Interferone zu schaffen, die die

gewünschten Eigenschaften aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone werden von Human-Lymphoblastoid-Interferon LylFN-a-2 mit der folgenden Sequenz

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und Human-Lymphoblastoid-Interferon LylFN-a-3 mit folgender Sequenz

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abgeleitet.

Diese Interferone wurden ebenso wie Verfahren zu ihrer Herstellung in der EU-PA Nr. 76 489 beschrieben. LylFN-ct-2 ist mit Human-Leukocyten-Interferon LelF-ctB (siehe US-PS 4 414 150) verwandt (aber nicht identisch) und hat eine spezifische Aktivität für primäre Kalbsnierenzellen und humane embryonale Vorhautzellen (HEF, jeweils mit vesiculären Stomatitisviren infiziert) von 1,85 x 10⁸ IU/mg bzw. 2,45 x 10⁸ IU/mg. LylFN-a-3 ist mit Humanleukocyten-Interferon LelF-aD (siehe US-PS 4 414 150) verwandt (aber nicht identisch) und besitzt eine spezifische Aktivität für Kalbszellen und HEF-Zellen (wie oben) von 1,32 x 10⁸ IU/mg bzw. 3,7 x 10^B IU/mg. Außerdem besitzt LylFN-a-3 eine höhere Thermostabilität und eine geringere proliferationshemmende Aktivität als LylFN-cc-2.

Eine besondere Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung von LylFN-a-2/a-3 Hybrid-Polypeptiden, die den hohen Antivirus-Titer und/oder die höhere proliferationshemmende Aktivität bei Humanzellen von LylFN-ct-2 und die hohe Thermostabilität von LylFN-a-3 vereinigen.

Die Erfindung betrifft spezieil ein Hybrid-Interferon-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die aus zwei bis vier Unter-Sequenzen zusammengesetzt ist, die sich in der Aminosäureidentität und der Anzahl der Unter-Sequenzen von Human-Lymphoblastoid-Interferonen LylFN-cc-2 und LylFN-a-3 entsprechen, wobei das Hybrid-Interferon-Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus den Aminosäuren 1 bis 150 von LylFN-a-2 und den Aminosäuren 151 bis 166 von LylFN-a-3 besteht, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus den Aminosäuren 1 bis 92 von LylFN-a-2, den Aminosäuren 93 bis 150 von LylFN-cc-3 und den Aminosäuren 151 bis 166 von LylFN-a-2 besteht, und ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus den Aminosäuren 1 bis 60 von LylFN-a-2, den Aminosäuren 61 bis 92 von LylFN-a-3, den Aminosäuren 93 bis 150 von LylFN-a-2 oder von LylFN-a-3 und den Aminosäuren 151 bis 166 von LylFN-cc-2 oder LylFN-o-3 besteht, umfaßt.

Genauer gesagt betrifft die Erfindung das Hybrid-Interferon ,,B₁B₂B₃D₄" mit folgender Formel CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS ' SER EU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE .GLN. GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP ' GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS

das Hybrid-Interferon ,,BiB₂D₃B₄" mit folgender Formel . "

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das Hybrid-Interferon „B,D₂B₃D₄" mit folgender Formel

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das Hybrid-lnterferon ,,B]D₂D₃B₄" mit folgender Formel

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(IV),

das Hybrid-lnterferon ,,B₁D₂D₃D₄" mit folgender Formel

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und das Hybrid-lnterferon ,,B₁D₂B₃B₄" mit folgender Formel

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(Vl).

Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone sind ,,B₁D₂D₃D₄" (V) und ,,B₁B₂D₃B₄" (II).

Ein erfindungsgemäßes Hybrid-lnterferon kann durch die Rekombinant-DNS-Technik hergestellt werden, die beispielsweise folgende Schritte umfaßt

a) Herstellung einer DNS, die das für dieses Hybrid-lnterferon codierende Struktur-Gen enthält, durch in vitro Rekombination an den Stellen, die den Aminosäuren 60, 92 bzw. 150 der Interferone LylFN-o-2 und LylFN-o-3.entsprechen, oder durch chemische DNS-Synthese und Einbau der gewonnenen DNS in einen passenden Expressions-Vector,

b) Übertragung des gewonnenen, das Hybrid-DNS-Struktur-Gen tragenden Hybrid-Vectors in einen aufnehmenden Wirt,

c) Selektieren transformierter Wirte von untransformierten Wirten, gewöhnlich durch Züchten unter solchen Bedingungen, bei denen nur die transformierten Wirte überleben,

d) Züchten der transformierten Wirte unter Bedingungen, die die Expression des Hybrid-IFN-Struktur-Gens gestatten, und

e) Isolierung des gebildeten Hybrid-IFN.

Die angewandten Methoden werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den beigefügten Zeichnungen deutlicher werden. In den Zeichnungen stellen dar:

Fig. 1 einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von reifem LylFN-a-2 und LylFN-a-3. Es werden nur diejenigen Aminosäuren von LylFN-a-3 hervorgehoben, die sich von entsprechenden Aminosäuren von LylFN-a-2 unterscheiden. Die Aminosäuresequenz von LylFN-a-3 ist ansonsten mit der von LylFN-a-2 identisch;

Fig. 2 die Nucleotid-Sequenzen der codierenden Regionen und Teile der 3' extracistronischen Regionen von LylFN-a-2 und LylFN-a-3- Die ATG-Translations-Initiierungs-Codons, die Terminations-Triplets und die passenden Restriktionsstellen sind unterstrichen. Die Codierungs-Triplets sind numeriert;

Fig. 3 die Restriktionskarten der Hindlll-Pstl kleinen Segmente von den Plasmiden pBR(AP)/LylFN-cc-2 und pBR(AP)/LylFN-oc-3. Der weiße Balken (LylFN-a-3) und der schwarze Balken (LylFN-oc-2) grenzen die Codierungsregionen der reifen IFNe ab. Unten wird die Unterteilung der Primärstruktur von IFN-Polypeptid (166 Aminosäuren) in vier Sektionen gezeigt; Fig. 4 und 5 die Radioaktivität, die in Abhängigkeit von der Menge von IFN-cc-2 in der in einem Sandwich-RIA gemessenen Testlösung an das Trägerkügelchen gebunden ist.

1. Herstellung von Hybrid-Vectoren, die ein Hybrid-IFN-Stmktur-Gen enthalten Die cDNSn von Human-lnterferon-a, Unterarten oc-2 und a-3 wurden in E. coli geclont. Somit enthalten Plasmid pBR(AP)/LylFN-a-2 und pBR(AP)/LylFN-a-3 Hindlll-Pstl (oder EcoRI-Pstl)-DNS-lnserts, die die Codierungsregionen von LylFN-cc-2 und LyIFN-a-3 unter Kontrolle des ß-Lactamase-Promotors enthalten (siehe EU-PA Nr. 76.489). Die Restriktionskarten der Inserts sind in Fig. 3 wiedergegeben. Man kann leicht sehen, daß die Gene sich in einige gemeinsame Restriktionsstellen teilen (die sich an den Positionen 60, 92 und 150 der IFN-Aminosäuresequenzen befinden), die vorteilhaft für die Konstruktion neuartiger Gene verwendet werden können, die für Hybrid-lnterferone mit günstigen biologischen und/oder physikalischen Eigenschaften codieren. Somit können Rekombinanten (einfacher oder mehrfacher Austausch) zwischen LylFN-a-2 und LylFN-a-3-Genen durch in vitro Rekombination an der Pvull-Stelle (Position 92) und/oder an den Sau3A-Stellen (Positionen 60 und 150) erzeugt werden. Da die Primärstruktur.der Interferone auf diese Weise in 4 Sektionen geteilt werden kann (erste Sektion Aminosäuren 1 bis 60, zweite Sektion Aminosäuren 61 bis 92, dritte Sektion Aminosäuren 93 bis 150 und vierte Sektion Aminosäuren 151 bis 166, siehe Fig. 3), können die erfindungsgemäßen Hybrid-lnterferone durch vier Buchstaben gekennzeichnet werden, wobei jeder Buchstabe für die vorhandene Sektion typisch ist. So wird beispielsweise Hybrid-Interferon (I)₁ das aus den Sektionen 1 bis 3 von Interferon LylFN-a-2 („B", LylFN-a-2 ist mit IFN-aB, supra, verwandt), und Sektion 4 von LylFN-ct-3 („D", LylFN-a-3 ist mit IFN-aD, supra, verwandt) zusammengesetzt ist, als IFN ,,B₁B₂B₃D₄" bezeichnet.

Zur Erleichterung der Erzeugung des verlangten Hybrid-Interferons, müssen die DNS-Inserts, die die LylFN-a-2 bzw. LylFN-a-3 Codierungsregionen enthalten, in einer solchen Weise modifiziert werden, daß die Restriktionsstellen Hindlll (oder EcoRI), Pvull und Pstl für Religationszwecke für sie einzigartig sind. Aus Fig. 3 wird deutlich, daß es eine zusätzliche Pvull-Stelle in der 3' extracistronischen Region des für LylFN-a-2 codierenden Gens gibt. Diese Stelle kann leicht entfernt werden, zum Beispiel durch teilweise Spaltung eines Hybrid-Vectors, der die LylFN-a-2 Codierungsregion mit Pvull enthält, Ligation der resultierenden linearisierten DNS an einen Linker, der eine DNS-Sequenz enthält, die durch die Restriktions-Endonuclease Pstl erkannt wird, Spaltung mit Pstl, Religation der Digests bei geringer DNS-Konzentration und Selektion für Plasmide (z. B. durch Restriktionsanalyse), die die verlangte Modifikation aufweisen, und zwar eine verkürzte 3' extracistronische Region, wobei die Pvull-Stelle eliminiert ist. Analog werden zum Clonen von IFN-Genen verwendete Vectoren am besten so modifiziert, daß die Restriktionsstellen Hindlll, Pvull und Pstl einzigartig für sie sind.

Die Erfindung betrifft Hybrid-Vectoren, die eine DNS-Sequenz umfassen, welche für irgendeines der Hybrid-lnterferone der Formeln I bis IV codiert und operativ an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Der Vector wird.je nach den für die Transformation vorgesehenen Wirtszellen gewählt. Beispiele für geeignete Wirte sind Mikroorganismen, denen Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme fehlen oder die sie nur in geringem Maße aufweisen, wie Hefearten, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, und Stämme von Bakterien, vor allem Stämme von Escherichia coli, zum Beispiel E. coliX1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 oder E. coli K-12-Stamm 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, und außerdem Zellen höherer Organismen, vor allem eingeführte Human- und Tierzell-Linien. Die obigen Stämme von E. coli, beispielsweise E. coli HB101 und E. coli Ja221 und darüber hinaus Saccharomyces cerevisiae werden als Wirtsmikroorganismen bevorzugt. Im Prinzip sind alle Vectoren, die die erfindungsgemäßen Hybrid-IFN-Gene in dem gewählten Wirt replizieren und ausdrucken, geeignet. Beispiele von für die Expression der Hybrid-Interferon-Gene in einem E.-coli-Stamm geeigneten Vectoren sind Bakteriophagen, zum Beispiel Derivate von λ-Bakterio'phagen, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid Co1 E1 und dessen Derivate, zum Beispiel pMB9, pSF2124, pBR317 und pBR322. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Vectoren sind von Plasmid pBR322 abgeleitet. Geeignete Vectoren enthalten ein komplettes Replikon und ein Marker-Gen, wodurch die mit den Expressionsplasmiden transformierten Wirte auf der Grundlage einer phenotypischen Eigenschaft selektiert und identifiziert werden können. Geeignete Marker-Gene verleihen dem Wirt zum Beispiel Widerstandsfähigkeit gegenüber Schwermetallen, Antibiotika und dergleichen. Außerdem enthalten bevorzugte erfindungsgemäße Vectoren außerhalb der Replikon- und Marker-Gen-Regionen Erkennungs-Sequenzen für Restriktions-Endonucleasen, so daß das Hybrid-IFN-Gen, und, wenn es angemessen ist, die Expressions-Kontroll-Sequenz an diesen Stellen eingefügt werden können. Der bevorzugte Vector, das Plasmid pBR322, enthält ein intaktes Replikon, Marker-Gene, die Widerstandsfähigkeit gegenüber Tetracyclin und Ampicillin (tet^R und amp") übertragen, und eine Anzahl einzigartiger Erkennungsstellen für Restriktions-Endonucleasen, zum Beispiel Pstl (spaltet sich in das amp^R-Gen, das tet^R-Gen bleibt intakt), BamHi, Hindlll und Sail (alle spalten sich in das tet^R-Gen, das amp^R-Gen bleibt intakt), Nrul und EcoRI. Verschiedene Expressions-Kontroll-Sequenzen können für die Regulierung der Gen-Expression verwendet werden. Insbesondere werden Expressions-Kontroll-Sequenzen von stark ausgedrückten Genen des zu transformierenden Wirtes verwendet. Im Falle von pBR322 als den Hybrid-Vector und E. coli als den Wirtsmikroorganismus zum Beispiel sind die Expressions-Kontroll-Sequenzen (die unter anderem den Promotor und die Ribosom-Bindestelle enthalten) des Lactose-Operon, Tryptophan-Operon, Arabinose-Operon und dergleichen, das ß-Lactamase-Gen, die entsprechenden Sequenzen des Phage λΝ-Gens oder des Phage fd-Coat-Protein-Gens und andere geeignet. Während das Plasmid pBR322 bereits den Promotor des ß-Lactamase-Gens (ß-lac-Gen) enthält, müssen die anderen Expressions-Kontroll-Sequenzen in das Plasmid eingebaut werden. Vectoren, die für die Replikation und Expression in Hefe geeignet sind, enthalten einen Hefe-Replikations-Start und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybrid-Vectoren, die einen Hefe-Replikations-Start enthalten, zum Beispiel ein chromosomales autonom replizierendes Segment (ars) sind extrachromosomal innerhalb der Hefezellen nach der Transformation enthalten und werden autonom repliziert. Außerdem können Hybrid-Vectoren, die zu der Hefe 2μ-Ρΐ35ηηία-ΟΝ5 homologe Sequenzen enthalten, verwendet werden. Solche Hybrid-Vectoren werden durch Rekombination in die 2μ-Ρΐ33Γηίαβ, die bereits in der Zelle vorhanden sind, integriert, oder replizieren autonom. 2μ-Sequenzen sind besonders für Plasmide mit einer hohen Transformationsfrequenz geeignet, und sie ermöglichen hohe Kop.iezahlen. Der bevorzugte erfindungsgemäße Hefe-Vector ist das Plasmid pJDB207.

Geeignete Marker-Gene für Hefen sind insbesondere diejenigen, die dem Wirt antibiotische Widerstandsfähigkeit verleihen, oder im Falle auxotrophischer Hefemutanten, Gene, die die Wirtsläsionen ergänzen. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Widerstandsfähigkeit gegenüber dem antibiotischen Cycloheximid oder sorgen für Protrophie in einem auxotrophischen Hefemutanten, zum Beispiel das URA3-, LEU2-, HIS3- oder vor allem das TRP1-Gen. Hefe-Hybrid-Vectoren enthalten außerdem vorzugsweise einen Replikationsstart und ein Marker-Gen für einen Bakterienwirt, vor allem E. coli, so daß die Konstruktion und das Clonen der Hybrid-Vectoren und ihrer Zwischenverbindungen in einem Bakterienwirt erfolgen kann.

Expressions-Kontroll-Sequenzen, die sich für die Expression in Hefe eignen, sind beispielsweise diejenigen von stark ausgedrückten Hefe-Genen. So können die Promotoren des TRP1-Gens, des ADHI- oder ADHII-Gens, Säurephosphatase (PHO3 oder PHO5)-Gens, Isocytochrom-Gens, oder ein an der glycolytischen Bahn beteiligter Promotor, wie der Promotor der Enolase-, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase- (GAPDH), 3-Phosphoglyceratkinase-(PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Trrosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Gene verwendet werden. Bevorzugte erfindungsgemäße Vectoren enthalten Promotoren mit Transcriptionskontrolle, z. B. die Promotoren der PHO5-, ADHII- und GAPDH-Gene, die durch Veränderung der Wachstumsbedingungen ein- oder ausgeschaltet werden können. Der PHO5-Promotor kann zum Beispiel einzig durch Erhöhung oder Verringerung der Konzentration des organischen Phosphats in dem Medium unterdrückt oder gelockert werden. Promotoren für die Verwendung in Säugetierzellen sind zum Beispiel Virus-Promotoren, wie HTLV, SV40, Impfpocken-Promotor und dergleichen.

Der Promotor ist operativ mit der Codierungsregion verknüpft, so daß eine wirksame Expression des Hybrid-Interferons gewährleistet ist. In einem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel ist der Promotor direkt mit der Codierungsregion von reifem Hybrid-IFN verknüpft, wobei ein Translations-Start-Signal (ATG) an der Verbindungsstelle eingefügt ist. Eine bevorzugte Region für die Vereinigung des Promotors mit der Hybrid-IFN-Codierungsregion liegt zwischen dem Haupt-mRNS-Start und der ATG des natürlich an den Promotor angefügten Gens.

In einem anderen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel, vor alle, wenn Hefe als der Wirtsmikroorganismus verwendet wird, ist eine Signalsequenz in der Konstruktion enthalten. Geeignete Signalsequenzen sind solche, die natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpft sind. Beispielsweise können die PHO5-Signalsequenz, außerdem die Signalsequenzen der Hefeinvertase oder a-Faktor-Gene verwendet werden. Es werden diejenigen Kombinationen bevorzugt, die eine genaue Spaltung zwischen der Signalsequenz und der Aminosäuresequenz der reifen Hybrid-IFN erlauben. Zusätzliche Sequenzen, wie Pro- und Spacer-Sequenzen, die spezifische Verarbeitungssignale tragen können oder auch nicht, können ebenfalls in die Konstruktion zur leichteren genauen Verarbeitung von Vorläufermolekülen einbezogen werden. Alternativ können kondensierte Proteine erzeugt werden, die interne Verarbeitungssignale enthalten, die eine einwandfreie Reifung in vivo oder in vitro ermöglichen. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Hybrid-Vectoren auch die 3'-Flankierungssequenz eines Gens auf, die die richtigen Signale für die Transcriptions-Termination und Polyadenylation enthält. Geeignete 3-Flankierungssequenzen sind beispielsweise diejenigen des Gens, die natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpft sind. Falls Hefe als Wirtsmikroorganismus eingesetzt wird und der PHO5-Promotor als Expressions-Kontroll-Sequenz herangezogen wird, dann ist die 3'-Flankierungssequenz vorzugsweise die des PHO5-Gens.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Hybrid-Vectoren, die die Fähigkeit zur Replikation und phenotypischen Selektion in einem Wirtsstamm haben, der einen Promotor und eine DNS-Sequenz umfaßt, die jedes der neuartigen Hybrid-Interferone codiert, wobei die DNS-Sequenz zusammen mit Transcriptionsstart- und Terminationssignalen sowie Translationsstart- und Stopsignalen in den Hybrid-Vectoren unter einer solchen Kontrolle des Promotors untergebracht ist, daß sie in einem transformierten Wirt ausgedrückt wird, um ein erfindungsgemäßes Hybrid-Interferon zu produzieren. Die erfindungsgemäßen Hybrid-Vectoren können durch in vitro Ligation entsprechender Segmente der LylFN-ct-2 und LylFN-cc-3 Codierungsregionen und Einfügen des resultierenden Hybrid-IFN-Gens in einen geeigneten Vector oder durch Ligation eines bestimmten IFN-DNS-Segmentes an eine linearisierte Vector-DNS, die die übrigen Sektionen bereits in einer solchen Weise enthält, daß das für das verlangte Hybrid-Interferon codierende Gen gebildet wird, erzeugt werden. Es empfiehlt sich, daß das die Amino-Terminal-Endsequenz spendende DNS-Segment bereits mit der Expressions-Kontroll-Sequenz verschmolzen ist.

Entsprechende Segmente der LylFN-a-2 und LylFN-a-3 Codierungsregionen werden vor allem von den erfindungsgemäßen bevorzugten Ausgangsvectoren genommen, und zwar den von pBR322 abgeleiteten Plasmiden pAM2 und pAM21. Das Plasmid pAM2 enthält einen Hindlll-Pstl-Insert mit der LylFN-a-3-Codierungsregion unter der Kontrolle der /J-Lactamasepromotors. Der Vectorteil von Plasmid pAM2 ist gegenüber Pvull resistent. Das Plasmid pAM21 enthält einen Hindlll-Pstl-Insert, wobei die LylFN-a-2-Codierungsregion eine einzigartige Pvull-Stelle an der Position 92 besitzt und unter Kontrolle des /i-Lactamase-Promotors steht. Der Vectorteil von Plasmid p21 ist gleichfalls gegenüber Pvull resistent.

Speziell wird das für Hybrid-Interferon ,,B₁B₂B₃D₄" codierende Gen durch Ligation des großen Pstl-Pvull-Fragmentes von Plasmid pAM21, des kleinen San3A-Pvuli-Fragmentes von Plasmid pAM21 und des kleinen Sau3A-Pstl-Fragmentes von Plasmid pAM2 erzeugt. Diese Konstruktion resultiert in einem Plasmid (pJC344), das die Hybrid-Interferon ,,B₁B₂B₃D₄" Codierungsregion unter der Kontrolle des ß-Lactamase-Promotors enthält. In einer ähnlichen Weise wird das für Hybrid Interferon ,,B₁B₂D₃D₄" codierende Gen durch Ligation des großen Pvull-Pstl-Fragmentes von Plasmid pAM21, des kleinen Sau3A-Pvull-Fragmentes von Plasmid pAM2 und des kleinen Sau3A-Pstl-Fragmentes von Plasmid pAM21 hergestellt. Diese Konstruktion resultiert in einem Plasmid (pJC342), das die Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃B₄" Codierungsregion unter der Kontrolle des ß-Lactamase-Promotors enthält. Das für Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" codierende Gen kann durch Ligation des kleinen Hindlll-Sau3A-Fragmentes von Plasmid pAM21, des kleinen Sau3A-Pvull-Fragmentes von Plasmid pAM2 und des großen Pvull-Hindlll-Fragmentes von Plasmid pAM2 hergestellt werden. Diese Konstruktion resultiert in einem Plasmid (pAM94), das die Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" Codierungsregion unter der Kontrolle des ß-Lactamase-Promotors enthält. In analoger Weise wird das für Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃B₄" codierende Gen durch Ligation des kleinen Hindlll-Sau3A-Fragmentes von Plasmid pAM21, des kleinen Sau3A-Pvull-Fragmentes von Plasmid pAM2 und des großen Pvull-Hindlll-Fragmentes von Plasmid pAM21 erzeugt. Diese Konstruktion resultiert in einem Plasmid (pAM90), das die Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃B₄" Codierungsregion unter Kontrolle des /S-Lactamase-Promotors enthält. Plasmide, die die Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃D₄" Codierungsregion enthalten (z. B. Plasmid pDM1) oder die Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃B₄" Codierungsregion (z. B. Plasmid pDM2) enthalten, können in einer ähnlichen Weise hergestellt werden. Diese Plasmide eignen sich zur Replikation und Expression der Hybrid-IFN-Gene in E. coli. Auf Wunsch kann der für ein beliebiges der genannten Hybrid-Interferone codierende DNS-Insert aus dem entsprechenden Plasmid ausgeschnitten und in eine andere Vector-DNS

eingefügt werden. Auf diese Weise können Plasmide gewonnen werden, die die Hybrid-Interferon-Codierungsregion unter der Kontrolle eines anderen Promotors als dem 6-Lactamase-Promotor enthalten, und/oder das Gen kann in einem anderen Wirt als E. coli ausgedrückt werden.

Die Herstellung von DNS, die das Strukturgen für jedes der genannten Hybrid-Interferone enthält, kann auch mit Hilfe der chemischen Synthese vorgenommen werden. Geeignete Methoden für die Synthese von DNS sind in zusammengefaßter Form von S. A. Narang [Tetrahedron 39, 3 (1983)] vorgestellt worden. Durch die bekannten Synthesetechniken ist die Herstellung von Polynucleotiden mit einer Länge von bis zu 20 Basen in guter Ausbeute, mit hoher Reinheit und in einer verhältnismäßig kurzen Zeit möglich. Geeignete geschützte Nucleotide werden durch die Phosphodiester-Methode [K. L Agarwal, u. a., Angew. Chem. 84, 489 (1972)] oder durch die wirksamere Phosphotriester-Methode [C. B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972)] oder die Phosphittriester-Methode [R. L. Letsinger u. a., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976)] miteinander verknüpft. Eine Vereinfachung der Synthese der Oligonucleotide und Polynucleotide wird durch die Festphasenmethode möglich, bei der die Nucleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden werden. Itakura, u. a., [J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)] verwenden Trinucleotide, die durch die Phosphotriester-Methode bei der Festphasensynthese verknüpft wurden, anstelle einzelner Nucleotide, und diese können in kurzer Zeit und bei guten Ausbeuten kondensiert werden, um beispielsweise ein Polynucleotid mit 31 Basen zu ergeben. Die aktuelle . doppelsträngige DNS kann enzymatisch aus chemisch vorbereiteten kurzen Segmenten aufgebaut werden. Dafür verwenden Khorana, u. a., [J. Biol. Chem. 251, 565 (1976)] überlappende Polynucleotid-Sequenzen von beiden DNS-Strängen, die in der richtigen Anordnung durch Basen-Paarung zusammengehalten werden und dann chemisch durch die Enzym-DNS-Ligase verknüpft werden. Eine andere Möglichkeit umfaßt in jedem Fall die Inkubation einer Polynucleotidsequenz von den beiden DNS-Strängen mit einem kurzen überlappenden Segment in Gegenwart der vier erforderlichen Desoxynucleosidtriphosphate mit einer DNS-Polymerase zum Beispiel DNS-Polymerase I, einem Klenow-Fragment von Polymerase I oder T₄ DNS-Polymerase, oder mit AMV (Vogel-Myoblastose-Virus)-Revers-Transcriptase. Die beiden Polynucleotidsequenzen werden dabei in der richtigen Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten und werden mit den erforderlichen Nucleotiden durch das Enzym ergänzt, um eine vollständige doppelsträngige DNS zu ergeben [S. A. Narang, u. a., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)]. Itakura, u. a., [J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982)] beschrieben, wie auf der Basis dieses Prinzips ein 132 Basenpaare langes Segment des Human-Leucozyten-Interferon a₂-Gens in Gegenwart von DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) aus vier chemisch synthetisierten Fragmenten mit einer Länge von 39 bis 42- Basen gebaut werden kann, wodurch eine Einsparung von 40% bei der chemischen Synthese im Vergleich zu der Methode, bei der nur Ligase verwendet wird, erzielt wird. Eine geeignete Verfahrensweise zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNSn wurde beispielsweise in der EU-PA Nr. 146.785 beschrieben, deren Erkenntnisse hier. unter Bezugnahme einbezogen werden.

Die chemisch synthetisierte DNS, die das Strukturgen für jedes der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone aufweist, kann in eine Vector-DNS, die eine Expressions-Kontroll-Sequenz enthält, in einer solchen Weise eingefügt werden,· daß die Expressions-Kontroll-Sequenz die Expression dieses Gens reguliert.

2. Transformation der Wirtszellen

Die Erfindung betrifft.auch ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirtes, das die Transformation eines Wirtes mit einem Expressions-Vector umfaßt, der eine DNS-Sequenz enthält, die für jedes der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone codiert und durch eine Expressions-Kontroll-Sequenz reguliert wird.

Beispiele für geeignete Wirte sind die oben genannten Mikroorganismen wie Stämme von Sachharomyces cerevisiae. Bacillus subtilis und Escherichia coli. Die Transformation mit den erfindungsgemäßen Expressionsplasmiden wird beispielsweise wie in der Literatur beschrieben vorgenommen, so für S. cerevisiae [A. Hinnen, u. a., Proc. Nati. Acad, Sei. USA 75, 1929 (1978)], B. subtilis Anagnostopoulos, u. .,J. Bacteriol. 81, 741 (1961)] und E. coli M. Mandel, u. a., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)].

Danach umfaßt das Transformationsverfahren von E. coli-Zellen eine Ca²⁺-Vorbehandlung der Zellen, um eine DNS-Aufnahme zu ermöglichen, und die Inkubation mit dem Hybrid-Vector. Die Zellen werden in ein selektives Nährmedium übertragen, das die Trennung der transformierten Zellen von den Elternzellen erlaubt. Zellen, die den Vector nicht enthalten, werden in einem solchen Medium nicht überleben. Die Transformation von Hefe umfaßt zum Beispiel die Schritte (1) enzymatische Entfernung der Hefezellwand mit Hilfe von Glucosidasen, (2) Behandlung der gewonnenen Spheroplaste mit dem Vector in Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²⁺-lonen und (3) Regeneration der Zellwand durch Einbettung der Spheroplaste in Agar. Das Regenerationsagar wird vorzugsweise in einer Weise hergestellt, die die gleichzeitige Regeneration und Selektion der transformierten Zellen gestattet

Die Erfindung betrifft auch die transformierten Wirte, die auf dem beschriebenen Wege zu gewinnen sind.

3. Züchtung der transformierten Wirtszellen und Isolierung des ausgedrückten Hybrid-Interferons

Die Erfindung betrifft des weiteren eine Methode zur Herstellung der Hybrid-Interferone der Formeln I bis IV, die dadurch gekennzeichnet ist, daß Wirtszellen, die mit einem Hybrid-Vector transformiert wurden, der eine für jedes der Hybrid-Interferone codierende DNS-Sequenz enthält, gezüchtet werden und das Hybrid-Interferon isoliert wird.

Die transformierten Wirtszellen werden nach im Fachgebiet bekannten Verfahren in einem flüssigen Medium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, gezüchtet.

Verschiedene Kohlenstoffquellen können für die Züchtung der erfindungsgemäßen transformierten Wirte verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind absorbierbare Kohlenwasserstoffe wie Glucose, Maltose, Mannitol oder Lactose, oder ein Acetat, das entweder als solches oder in geeigneten Mischungen verwendet werden kann. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Reptide und Proteine und deren Abbauprodukte wie Trypton, Pepton, oder Fleischextrakta; und weiterhin Hefeextrakte, Malzextrakt und auch Ammoniumsalze, zum Beispiel Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder als solche oder in geeigneten Mischungen Anwendung finden können. Anorganische Salze, die ebenfalls verwendet werden können, sind zum Beispiel Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

Das Medium enthält außerdem zum Beispiel das Wachstum fördernde Substanzen wie Spurenelemente, zum Beispiel Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen verhindern, die das Expressionspiasmid verloren haben. So wird beispielsweise Ampicillin dem Medium zugesetzt, wenn das Expressionsplasmid ein amp^R-Gen enthält. Eine derartige Zugabe antibiotischer Substanzen hat auch die Wirkung, daß verunreinigende, antibiotisch-sensitive Mikroorganismen zerstört werden. Wenn ein Hefestamm, der beispielsweise in einer essentiellen Aminosäure auxotrophisch ist, als der Wirtsorganismus verwendet wird, enthält das Plasmid vorzugsweise ein Gen, das für ein Enzym codiert, das den Wirtsdefekt ergänzt. Die Züchtung des Hefestammes erfolgt in einem minimalen Medium, in dem die genannte Aminosäure ungenügend vorhanden ist.

Die Züchtung erfolgt nach im Fachgebiet bekannten Verfahren. Die Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit werden so gewählt, daß ein maximaler Titer von Hybrid-Interferon gewonnen wird. So wird ein E. coli- oder Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40"C, vorzugsweise etwa 30⁰C, und einem pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7, etwa 4 bis 30 Stunden lang, vorzugsweise so lange, bis maximale Ausbeuten an Hybrid-interferon erzielt sind, gezüchtet. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die maximalen Titer der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, zum Beispiel der Hybrid-Interferone ,,BiD₂D₃B₁", ,,B₁D₂B₃D₄", ,,BiD₂D₃D₄" und ,,B₁D₂B₃B₄", die in rohen Extrakten von zum Beispiel unter Standardbedingungen gezüchteter transformierter Hefe erzielt werden können, deutlich höher sind als die von lnterferon-a-2 und Hybrid-Interferonen ,,B₁B₂D₃D₄" und „D,D₂B₃B₄", die mit den in der US-PS 4.414.150 beschriebenen Hybrid-Interferonen „BD".und „DB" eng verwandt sind.

Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert hat, wird die Züchtung unterbrochen, und das Hybrid-Interferon wird aus den Zellen des Wirtes freigesetzt. Zu diesem Zweck werden die Zellen zerstört, zum Beispiel durch Behandlung mit einem Detergens wie SDS oder Triton, oder mit Lysozym oder einem ähnlich wirkenden Enzym lysiert. Wird Hefe als Wirtsmikroorganismus verwendet, kann die Zellwandung durch enzymatische Digestion mit einer Glucosidase entfernt werden. Alternativ oder zusätzlich können mechanische Kräfte wie Scherkräfte (zum Beispiel X-Presse, French-Presse, Dyno-Mühle) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, oder abwechselnd-Gefrieren, zum Beispiel in flüssigem Stickstoff, und Auftauen, zum Beispiel von 30 bis 40⁰C, sowie Ultraschall zum Aufbrechen der Zellen eingesetzt werden. Das resultierende Gemisch, das Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, ist mit Proteinen, einschließlich Hybrid-Interferon, in einer an sich bekannten Weise nach dem Zentrifugieren angereichert. So werden beispielsweise die meisten der Nicht-Protein-Bestandteile durch Polyethylenimin-Behandlung entfernt, und die Proteine, einschließlich Hybrid-Interferon, werden ausgefällt, zum Beispiel durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat oder mit anderen Salzen. Bakterielle Proteine können gleichfalls durch Ansäuerung mit Essigsäure (zum Beispiel 0,1 %ig, pH-Wert 4 bis 5) ausgefällt werden. Weitere Reinigungsschritte umfassen beispielsweise Ultrafiltration, Diafiltration, Gel-Elektrophorese, chromatographische Verfahren wie lonenaustausch-Chromatographie, Größen-Ausschluß-Chromatographie, HPLC, Umkehrphasen-HPLC und dergleichen, Trennung der Bestandteile des Gemischs aufgrund der Molekülgröße mit Hilfe einer geeigneten Sephadex-Säule, Dialyse, Affinitäts-Chromatographie, zum Beispiel Antikörper-, vor allem monoclonaler Antikörper — Affinitäts-Chromatographie und andere bekannte Verfahren, vor allem die im Fachgebiet bekannten.

Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone höhere Thermostabilitäten als Interferon LylFN-a-2 und Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃D₄". Somit beträgt die Temperatur, bei der 50% der Antivirus-Aktivität verloren geht (Temperaturanstieg von IFN-Lösungen von 1 °C/min) 62,8⁰C im Falle von LylFN-a-2 und 63°C im Falle von Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃D₄", während die entsprechenden Werte von zum Beispiel den Interferonen ,,B₁D₂D₃D₄", ,,B₁D₂B₃B₄", ,,B₁D₂B₃D₄" und ,,B₁D₂D₃B₄" 65°C, 64,7°C, 65,3⁰C bzw. 64,2°C betragen.

Die Erfindung betrifft des weiteren die Hybrid-Interferone der Formeln I bis IV, wenn sie jeweils nach erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft auch die Hybrid-Interferone, die nach erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden können. Die Erfindung betrifft speziell die Hybrid-Vectoren, die transformierten Wirtszellen, die Hybrid-Interferon-Polypeptide und die Verfahren zur Herstellung derselben, wie in den Beispielen beschrieben wird.

Biologische Eigenschaften der Hybrid-Interferone und pharmazeutischen Formulierungen

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone zeigen interessante biologische Eigenschaften, die sie als wertvolle Pharmazeutika qualifizieren.

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone sind durch eine sehr starke Antivirus-Aktivität gegenüber Säugetierzellen wie Rinderund vor allem Humanzellen gekennzeichnet. So sind die Antivirus-Titer, die als die Verringerung der cytopathischen Wirkung nach der Methode von S. Rubinstein, u. a., [J. Virol. 37, 755 (1981) unter Anwendung von vesicularem Stomatitis-Virus (VSV) als Immunitätstestvirus bei Rinder (MDBK)- und Human (WISH)-Zellen] bestimmt wurden, wie folgt:

Tabelle 1 Antivirus-Titer von Hybrid-Interferonen unter Verwendung von VSV als Immunitätstestvirus

Interferon spezifische Aktivität/mg Protein

Rind Human

,,B₁D₂D₃D₄" 1,25 x 10⁸ 1,3 x 10⁸

„B,D₂B₃B₄" 1,25x10⁸ 1,3 X10⁸

,,B₁B₂D₃B₄" 9,5 X10⁷ >2x10⁸

,,B₁D₂B₃D₄" ' 1,9 x 10⁸ 7,7 x 10⁷

,,B₁D₂D₃B₄" · 7,2 x10⁷ 3,8 X10⁷

,,B₁B₂B₃D₄" 1,05x10⁸ 8x10'

,,D₁D₂B₃B₄" (DB) 8,5 x 10⁷ 3,3 x 10⁵

,,B₁B₂D₃D₄" (BD) 1,15 x 10⁸ 2,33 X10⁸

a-2(„B") 1,05x10⁸ 2,13 x 10⁸

a-3(„D") 5,5 x 10⁷ · 6,7 x 10⁶

Demnach ist die Antivirus-Wirkung der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone nicht auf Human-Zellen beschränkt, sondern ist gleichbleibend interspezifisch. Somit sind die Antivirus-Aktivitäten der Hybrid-lnterferane-„B₁D₂D₃D₄", ,,B₁D₂B₃B₄", ,,B₁B₂D₃B₄", ,,B₁D₂B₃D₄" und ,,B₁B₂B₃D₄", die sie bei Humanzellen zeigen, im Grad mit denen von Parent-Interferon a-2 und Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃D₄" zu vergleichen, das dem Hybrid-Interferon „BD" nahe verwandt ist, wie in US-PS 4.414.150 vorgestellt wird, aber dem Parent-Interferon a-3 (um einen Faktor 10 bis 30) und dem Bezugs-Hybrid-Interferon ,,D₁D₂B₃B₄" (um einen Faktor 230 bis 600) deutlich überlegen ist.

Abgesehen von der allgemeinen Antivirus-Aktivität bei Humanzellen führen die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone zu einer spezifischeren Reaktion von Target-Zellen. Somit sind verschiedene intrazelluläre Enzyme an der Interferon-Wirkung beteiligt. Zu diesen Enzymen gehören (2'-5') Oligoisoadenylatsynthetase („2-5 A Synthetase"), die (2'5^;) verknüpfte Oligonucleotide erzeugt, die ihrerseits eine latente Endoribonuclease aktivieren, die Virus-mRNS spaltet. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone wie ,,B₁D₂D₃D₄", ,,B₁D₂B₃B₄", ,,B₁B₂B₃D₄" und ,,B₁B₂D₃B₄" besonders aktive Anreger für die 2-5 A Synthetase-Aktivität in Humanzellen sind. So ergeben die Hybrid-Interferone ,,B₁D₂D₃D₄" ,,B₁D₂B₃B₄", ,,B₁B₂B₃D₄" und ,,B₁B₂D₃B₄" eine 17,5fache, 11,4fache, 8,5fache bzw. 9,6fache Erhöhung der 2-5 A Synthetase-Aktivität in Daudi-Zellen bei Einheiten/ml gegenüber einer 5,6-, 3,9-, 4,0- oder4,3fachen Erhöhung der Wirkung bei den Parent-Interferonen a-2 und a-3 und Bezugs-Hybrid-Interferonen ,,B₁B₂D₃D₄" bzw. ,,D₁D₂B₃B₄".

Außerdem weisen die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone proliferationshemmende Aktivitäten auf. Die proliferationshemmende Wirkung kann wie folgt ermittelt werden: Interferon enthaltende Lösungen werden mit 5 x 10⁴ Daudi-Zellen je ml in 2 ml RPMI-Medium, das 10% fötales .Kalbsserum enthält, inkubiert. Die Zellenvervielfachung wird nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen durch Zählen der lebensfähigen Zellen in einem Haemocytometer unter Anwendung des Trypan-Blau-Ausschließungstests bestimmt. So beträgt die zur Induzierung einer 50%igen Inhibition von Daudi-Zellen-Vervielfachung erforderliche Konzentration von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄", ,,B₁D₂B₃B₄", ,,B₁B₂B₃D₄", ,,B₁B₂D₃B₄", ,,B₁D₂B₃D₁" und ,,B₁D₂D₃B₄" etwa 4, 4, 1,3, 1,3, 4 bzw.

4 Einheiten/ml, und ist somit annähernd dem Parent-Interferon a-2 und dem Bezugs-Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃D₄" (etwa

1,3 Einheiten/ml) äquivalent und dem Parent-Interferon a-3 (etwa 20 Einheiten/ml) und dem Bezugs-Hybrid-Interferon ,,D₁D₂B₃B₄" (etwa 400 Einheiten/ml) überlegen.

Die proliferationshemmende Wirkung gegenüber Human-Krebs kann gleichfalls in vivo demonstriert werden. So wurden verschiedene Krebsarten menschlichen Ursprungs wie Krebs der Brust, des Dickdarmes und der Lunge, Eierstockkrebs und Melanom in nackten Mäusen erregt. Kleine Fragmente der erzeugten Tumore werden isoliert und durch eine Hohlnadel unter die venale Kapsel von (Balb/c χ DBA/2)F₁ (CDF₁) Mäusen implantiert. IFN wird intramuskulär in zwei täglichen Dosen von 5 χ 10⁵ bis

5 x 10⁷ lU/kg/lnj. an den Tagen 1 bis 5 (Tag der Verabreichung: Tag 0) verabreicht. Am Tage 6 werden die Tiere getötet, die endgültigen Tumorgrößen werden gemessen und mit den anfänglichen Tumorgrößen (vor der IFN-Behandlung) und den Tumorgrößen bei unbehandelten Kontrollmäusen verglichen. Nach der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Hybrid-Interferonen, zum Beispiel ,,B₁D₂D₃D₄" und ,,B₁B₂D₃B₄", konnte eine erhebliche und signifikante Inhibition des Tumorwachstums und teilweise Rückbildung von Tumoren beobachtet werden. Überraschenderweise ist die proliferationshemmende Wirkung der Hybrid-Interferone der der Parent-Interferone a-2.und a-3 sowie der der Hybrid-Interferone ,,B₁B₂D₃D₄" und ,,D₁D₂B₃B₄" überlegen.

Durch die Antivirus- und proliferationshemmenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone sind diese Polypeptide nützlich zur Behandlung von Virusinfektionen wie Grippe und anderen Virusinfektionen der Luftwege, Herpes-Virus-Infektionen, Tollwut- und Hepatitis-Infektion und neoplastischen Erkrankungen wie Melanom, Nierenkrebs und Haarzellen-Leukämie des Human- oder Tierkörpers, möglicherweise in Kombination mit anderen Antivirus- oder Antitumormitteln, vorzugsweise in der Form pharmazeutischer Präparate, die eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffes, wahlweise zusammen mit anorganischen oder organischen, festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Trägermitteln vermischt, die vorzugsweise für die parenterale Verabreichung geeignet sind, enthalten.

Bei parenteralen Formulierungen handelt es sich vor allem um injizierbare Flüssigkeiten, die auf verschiedenen Wegen wirksam sind, so intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, intradermal oder subkutan. Solche Flüssigkeiten sind vorzugsweise isotonische wäßrige Lösungen oder Suspensionen, die vor Gebrauch zubereitet werden können, zum Beispiel aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirkstoff alleine oder zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und/oder Adjuvanzien enthalten, zum Beispiel Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel und/oder Emulgiermittel, Solubilisierungsmittel, Salze zur Regulierung des osmotischen Druckes und/oder Puffer. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate, die auf Wunsch weitere pharmakologisch wertvolle Substanzen enthalten können, werden in einer an sich bekannten Weise hergestellt, zum Beispiel mit Hilfe herkömmlicher Auflösung von Lyophilisierungsprozessen, und sie enthalten annähernd 0,1 % bis 100%, vor allem annähernd von 1 % bis annähernd 50%, und im Falle von Lyophilisaten bis zu 100% Wirkstoff. Es soll nicht unerwähnt bleiben, daß die erfindungsgemäßen

Hybrid-Interferone wie ,,BiD₂D₃D₄" lyophilisiert sein und ohne Verlust an Aktivität wieder gelöst werden können. Im Gegensatz dazu ergeben lyophilisierte Präparate der Parent-Interferone a-'2 und a-3 trübe Lösungen mit einer merklichen Abnahme der Aktivität. Die zuletzt genannten Interferone können daher nur in gepufferten Lösungen aufbewahrt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine pharrnakologisch aktive Verbindung der Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel vermischt

Die betreffende Verabreichungsart und die Dosierung wird von dem jeweiligen Arzt gewählt werden, der die Besonderheiten des Patienten, die Krankheit und den Erkrankungszustand berücksichtigen wird. Zum Beispiel werden Virusinfektionen gewöhnlich durch tägliche oder zweimal täglich verabreichte Dosen über einige Tage bis zu einigen Wochen behandelt, während die Behandlung von Neoplasmen im allgemeinen tägliche oder mehrmalige tägliche Dosen über Wochen oder Monate verlangt. Eskönnen die gleichen täglichen Dosismengen, und zwar etwa 10⁶ bis 10⁷ Einheiten, wie sie in der herkömmlichen Interferon-Therapie üblich sind, angewandt werden.

Monoclonale Antikörper für die Interferon-Hybriden

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung eines neuartigen monoclonalen Antikörpers für IFN α mit hoher Affinität für , verschieden Unterarten von IFN α, einschließlich IFN-ct-Hybriden, und geringer Affinität für andere Unterarten von IFN α, und von Hybridoma-Zellen, die diese ausscheiden.

Der neuartige monoclonale Antikörper ist dadurch gekennzeichnet, daß er eine hohe Affinität für IFN α/Β, D, F und verwandte Unterarten (siehe D. V. Goeddel, u. a., Nature 290, 20 [1981]) sowie Hybriden dieser Unterarten, vor allem die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, aber eine geringe Affinität gegenüber beispielsweise IFN cc/A-Unterarten besitzt.

Der monoclonale Antikörper wird als 144 BS bezeichnet. Dieser monoclonale Antikörper wird durch die Hybridoma-Zell-Reihe mit der Bezeichnung 144 BS 22-6-19 ausgeschieden. Die Erfindung betrifft auch Derivate dieses monoclonalen Antikörpers, z. B.

Antikörper-Fragmente, radioaktiv markierte monoclonale Antikörper und Konjugate des monoclonalen Antikörpers mit Enzymen oder dergleichen.

Fragmente des erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers sind z. B. Fab, Fab' oder F(ab')₂ Fragmente, die ihre Spezifität für die antigenen Determinanten beibehalten, d. h. die das charakteristische Bindungsmuster des monoclonalen Parent-Antikörpers an Human IFN-a- und IFN-o-Hybrid-Unterarten beibehalten.

Radioaktiv markierte monoclonale Antikörper enthalten z. B. radioaktives Jod (¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwefel (³⁵S), Tritium (³H) oder dergleichen. Bevorzugt werden monoclonale Antikörper, die mit radioaktivem Jod markiert sind.

Erfindungsgemäße Antikörper-Konjugate sind z. B. Konjugate des monoclonalen Antikörpers oder von Fragmenten davon mit Enzymen wie Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, ß-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Kohlenstoffanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphatdehydrogenase, oder mit Avidin oder Biotin. In solchen Konjugaten ist der Antikörper an das Enzym direkt oder mit Hilfe eine Spacer- oder Linkergruppe gebunden. Bevorzugt werden Konjugate des monoclonalen Antikörpers mit den Enzymen Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase.

Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper ist durch seine Bindungsfähigkeit gegenüber Polypeptiden gekennzeichnet, die zu verschiedenen Unterarten von Human-IFN α gehören. Die Bindungsfähigkeit wird z. B. in der sogenannten kombinierten Immunopräzipitations-Bioanalyse bestimmt, wie sie von S. S. Alkan, u. a., in „Protides of the biological fluids" (Protide der biologischen Flüssigkeiten), Herausgeber H. Peeters, Pergamon Press, Bd. 30, Seiten 495 bis 498 (1983) beschrieben wird. Bei dieser Analyse wird eine IFN α enthaltende Lösung mit dem zu testenden monoclonalen Antikörper inkubiert, die gebundenen und ungebundenen monoclonalen Antikörper durch die Zugabe eines polyclonalen Serums, das alle die getesteten Antikörper bindet, ausgefällt, das Immunpräzipitat abgetrennt und wieder in saurer Lösung gelöst, und die dabei freigesetzte IFN α in einer klassischen Bioanalyse auf der Grundlage der Antivirus-Aktivität von IFN α bestimmt.

Es ist überraschend, daß sich der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper stark an die IFN-cc-Unterarten B, D, F und Hybriden davon bindet, ebenfalls an die IFN-a-Unerarten C und J, aber eine geringe Affinität gegenüber der IFN-ct-Unterart A zeigt, eine Unterart, die durch alle anderen bekannten monoclonalen Antikörper gebunden wird, die mehr als drei IFN-ct-Unterarten erkennen,

d. h. Antikörper mit breiter Unterartenerkennung wie der monoclonale Antikörper NK2 (D. Secher, u. a., Nature 285, 446 [1980]), die monoclonalen Antikörper EBI-1, 2 und 3, die in der EU-PA 119 476 offenbart werden, oder der monoclonale Antikörper LO-22, der in der PA-WO 84/03106 vorgestellt wird.

Gegenüber dem in der PA-WO 84/03105 vorgestellten monoclonalen Antikörper YOK, der für die IFN-cc-Unterart D spezifisch ist, zeigt der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper überraschenderweise eine breite Spezifität, vor allem gegenüber den IFN-ct-Unterarten B und F, die nicht durch den Antikörper YOK gebunden sind.

Von dem erfindunsgemäßen monoclonalen Antikörper mit der Bezeichnung 144 BS wurde gefunden, daß er zu der Immunoglobulin-Klasse IgG₁ K (Kappa) gehört, wie durch allgemein bekannte Methoden ermittelt wurde, z. B. die Immuno-Diffusions-Ouchterlony-Technik unter Verwendung klassen-spezifischer zweiter Antikörper.

Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper und Derivate davon werden durch an sich bekannte Verfahren gewonnen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Hybridoma-Zell-Reihe 144 BS 22-6-19

a) in vitro gezüchtet wird und der monoclonale Antikörper aus der überstehenden Nährflüssigkeit isoliert wird, oder

b) in vivo in einem geeigneten Säugetier vermehrt wird und der monoclonale Antikörper aus den Körperflüssigkeiten des betreffenden Säugetiers gewonnen wird, und, wenn verlangt

c) der gewonnene monoclonale Antikörper in ein Derivat davon umgewandelt wird.

Geeignete Kulturmedien für die erfindungsgemäße in vitro Züchtung nach Verfahren a) sind Standard-Nährmedien wie Dulbecco's Modified Eagle Medium oder RPMI 1640 Medium, wahlweise durch ein Säugetierserum, ζ. B. fetales Kalbsserum, ergänzt. Die Isolierung des monoclonalen Antikörpers erfolgt durch Präzipitation des in der überstehenden Nährflüssigkeit vorhandenen Proteins durch Ammoniumsulfat oder dergleichen, worauf die Reinigung des Immunoglobulins durch übliche Chromatographieverfahren wie Gelfiltration, lonenaustausch-Chromatographie, Chromatographie auf DEAE-Cellulose oder Immunoaffinitäts-Chromatographje folgt.

Große Mengen des vorgesehenen monoclonalen Antikörpers können durch die Vermehrung der Hybridoma-Zellreihe nach Verfahren b) gewonnen werden. Zell-Clone werden in syngenetische Säugetiere injiziert, wodurch antikörpererzeugende Tumore wachsen. Nach einer bis drei Wochen wird der vorgesehene monoclonale Antikörper aus Körperflüssigkeiten des betreffenden Säugetieres gewonnen. Als Beispiel wird die von Balb/c-Mäusen erhaltene Hybridoma-Zellreihe intraperitoneal in Balb/c-Mäuse

injiziert, die wahlweise mit einem Kohlenwasserstoff wie.Pristan vorbehandelt worden sind, und nach einer bis zwei Wochen wird Ascites-Flüssigkeit von diesen Mäusen gesammelt. Der monoclonale Antikörper wird mit Hilfe an sich bekannter Verfahren, z. B. durch Präzipitation des Proteins mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, von den Körperflüssigkeiten isoliert, worauf die Reinigung des Immunoglobulins mit Hilfe üblicher Chromatographieverfahren, wie Gelfiltration, lonenaustausch-Chromatographie, Chromatographie auf DEAE-Cellulose oder Immunoaffinitäts-Chromatographie vorgenommen wird.

Fragmente des monoclonalen Antikörpers, zum Beispiel Fab, Fab' oder F(ab')₂ Fragmente, die ihre Spezifität gegenüber den antigenen Determinanten der IFN-cc-Unterarten beibehalten, können von dem nach den Verfahren a) und b) gewonnenem monoclonalen Antikörper durch an sich bekannte Verfahren erhalten werden, z. B. durch Digestion mit Enzymen wie Pepsin oder Papain und/oder Spaltung von Disulfidbindungen durch chemische Reduktion.

Mit radioaktivem Jod markierte monoclonale Antikörper können mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Jodierungsverfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch Markierung des monoclonalen Antikörpers mit radioaktivem Natrium- oder Kaliumiodid und einem chemischen Oxydationsmittel wie Natriumhypochlorit, Chloramin T oder dergleichen, oder einem enzymatischen Oxydationsmittel wie Lactoperoxidase, Glucoseoxidase und Glucose. Radioaktiv markierte erfindungsgemäße monoclonale Antikörper werden auch durch die Zugabe radioaktiv markierter Nährstoffe zu den Nährmedien der in vitro Züchtung von Schritt a) erzeugt. Solche markierten Nährstoffe enthalten beispielsweise radioaktiven Kohlenstoff (¹⁴C), Tritium (³H), Schwefel (³⁵S) oder dergleichen und sind zum Beispiel L-('⁴C)-Leucin, L-(³H)-Leucin oder L-(³⁵S)-Methionin.

Konjugate des erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers werden mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt, z. B. durch die Umsetzung des nach Verfahren a) oder b) hergestellten monoclonalen Antikörpers oder eines nach obiger Beschreibung davon hergestellten Fragmentes mit einem Enzym in Gegenwart eines Kopplungsnnittels, z. B. Glutaraldehyd, Perjodat, Ν,Ν'-o-Phenylendimaleimid, N-(m-Maleimidobenzyoloxy)succinimid, N-(3-(2'-Pyridyldithio)-propionoxy)-succinimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethyiaminopropyl)carbodiimid oder dergleichen. Konjugate mit Avidin werden ebenso hergestellt. Konjugate mit Biotin werden z. B. durch die Umsetzung des monoclonalen Antikörpers mit einem aktivierten Ester von Biotin, wie dem Biotin N-hydroxysuccinimidester, hergestellt.

Die Erfindung betrifft außerdem die Hybridoma-Zellreihe mit der Bezeichnung 144 BS 22-6-19, die am 14. März 1985 in der „Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, unter der Nummer 1-424 hinterlegt wurde. Bei dieser Hybridoma-Zellreihe handelt es sich um einen Hybriden der Mäuse-Myelom-Zellreihe Sp2/0-Ag14 und einen B Lymphocyten der Milz einer mit natürlicher Human-IFN α immunisierten Balb/c-Maus. Es ist eine beständige Zellreihe, die den monoclonalen Antikörper mit der Bezeichnung 144 BS ausscheidet. Die Zellreihe kann in Kultur gehalten werden oder kann in flüssigem Stickstoff tiefgefrören und durch Auftauen reaktiviert werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der genannten Hybridoma-Zellreihe, die den monoclonalen Antikörper 144 BS ausscheidet, gekennzeichnet dadurch, daß Balb/c-Mäuse mit einer natürlichen Human-IFN α immunisiert werden, antikörper-erzeugende Milzzellen der Mäuse mit Zellen der Myolom-Zellreihe Sp2/0-Ag14 verschmolzen werden, die durch die Fusion gewonnenen Hybridzellen geclont werden und ein den verlangten Antikörper ausscheidender Zellclon ausgewählt wird. Die Immunisierung der Mäuse wird so vorgenommen, daß z. B. natürliche Human-IFN α zwei- bis viermal parenteral, wie intraperitoneal und/oder subkutan, in Abständen von 10 bis 40 Tagen in Mengen von etwa 10⁵ IU bis etwa 10⁶ IU injiziert wird. Die Injektionen enthalten wahlweise ein die Lymphocyten-Produktion stimulierendes Adjuvans wie vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans.

Antikörper-erzeugende Milzzellen, die zwei bis fünf Tage nach der letzten Wiederholungsinjektion entnommen wurden, werden in Gegenwart eines Fusionspromotors mit Zellen der Myelom-Zellreihe Sp2/0-Ag14 verschmolzen. Als Fusionspromotoren kommen z. B. in Frage Sendai-Virus oder andere Paramyxo-Viren, wahlweise in UV-inaktivierter Form, Claciumionen, oberflächenaktive Lipide wie Lysolecithin, oder Polyethylenglycol. Vorzugsweise werden die Myolom-Zellen mit einem drei- bis zwanzigfachen Überschuß von Milzzellen von immunisierten Mäusen in einer etwa 30% bis etwa 60% Polyethylenglycol mit einer relativen Molekülmasse zwischen 1 000 und 4000 enthaltenden Lösung verschmolzen.

Nach der Fusion werden die Zellen wieder suspendiert und in selektivem HAT-Medium gezüchtet. Dabei werden nur Habridoma-Zellen überleben, weil sie die Fähigkeit, in vitro zu wachsen und zu replizieren, wobei diese Fähigkeit von den Myelom-Zellen stammt, mit dem Fehlen von HGPRT- oder TK-Genen verbinden, die für das Überleben in dem HAT-Medium wichtig sind, wobei diese Gene von den antikörper-erzeugenden Milzzellen der immunisierten Mäuse herrühren.

Geeignete Kulturmedien für die Vermehrung von Hybridoma-Zellen sind die Standard-Nährmedien, wie Dulbecco's Modified Eagle Medium, minimal essentielles Medium, RPMI 1640-Medium und dergleichen, wahlweise ergänzt durch Serum, z. B. 10 bis 15% fetales Kalbsserum. Vorzugsweise werden zu Beginn des Zellwachstums Füttererzellen zugegeben, z. B. normale peritoneale ' Exsudatzellen der Maus, Milzzellen, Markknochen-Macrophagen oder dergleichen. Die Nährmedien werden in regelmäßigen Abständen durch selektives HAT-Medium ergänzt, um ein Überwachsen der Hybridoma-Zellen durch normale Myelom-Zellen zu verhindern.

Die überstehende Flüssigkeit der Hybridoma-Zellkultur wird in bezug auf den verlangten monoclonaien Antikörper gescreent, vorzugsweise mit einer kombinierten Immunopräzipitations-Bioanaiyse oder einer Radioimmunoanalyse. Positive Hybridoma-Zellen werden geclont, z. B. durch Begrenzung der Verdünnung, vorzugsweise zweimal oder mehr. Die geclonten Zellreihen können in einer herkömmlichen Weise eingefroren werden.

Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper und/oder seine Derivate sind für die qualitative und quantitative Bestimmung und/oder die Reinigung von Human IFN-a-Unterarten aus natürlichen Quellen oder durch Rekombinant-DNS-Methoden hergestellt und von Human-Hybrid-IFNn, vor allem der erfindungsgemäßen, nützlich.

Zum Beispiel kann der monoclonale Antikörper oder dessen Derivat, wie ein Enzymkonjugat oder ein radioaktives Derivat, in jeder der bekannten Immunoanalysen verwendet werden, die auf der Bindungs-Wechselwirkung zwischen der antigenen Determinante, z. B. einem Polypeptid mit IFN-a-Aktivität, und dem monoclonalen Antikörper beruht. Beispiele für solche Analysen sind Radioimmunoanalysen, Enzymimmunoanalysen, Immunofluoreszenz, Latex-Agglutination und Hemagglutination. Solche Immunoanalysen sind wertvoll, z. B. bei der Überwachung der Produktion und Reinigung von IFN α aus natürlichen Quellen oder " genetisch manipulierten Mikroorganismen und von Hybrid-IFN-a-Proteinen und zur qualitativen und quantiativen Bestimmung von IFN α und Hybrid-IFN α in biologischen Flüssigkeiten, z. B. von Patienten mit einer IFN-a-Therapie oder solchen, die eine derartige Therapie brauchen.

Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper kann als solcher oder in Form eines radioaktiv markierten Derivats bei einer Radioimmunoanalyse (RIA) verwendet werden. Jede der bekannten Modifikationen einer RIA kann angewandt werden, zum Beispiel

RIA in homogener Phase, Festphasen-RIA oder heterogene RIA, einfache RIA oder Doppel-(Sandwich-) RIA mit direkter oder indirekter (vergleichender) Bestimmung von IFN o. Es wird eine Sandwich-RIA bevorzugt, bei der ein geeigneter Träger, zum Beispiel die Plaste-Oberfläche einer Mikrotiterplatte oder eines Reagenzglases, zum Beispiel aus Polystyrol, Polypropylen oder Polyvinylchlorid, Glas- oder Plastekügelchen, Filterpapier oder Dextran Celluloseacetat oder Nitrocelluloseblätter oder dergleichen mit einem für eine IFN-cc-Unterart spezifischen monocionalen Antikörper einfach durch Adsorption oder wahlweise nach der Aktivierung des Trägers, zum Beispiel mit Glutaraldehyd oder Cyanogenbromid, beschichtet wird und mit der Testlösung und einer Lösung eines mit ¹²⁵J radioaktiv markierten monocionalen Antikörper inkubiert wird, wobei der gelöste monoclonale Antikörper ein anderes Epitop der IFN-ct-Unterart als der träger-gebundene monoclonale Antikörper erkennt, und die Menge der IFN α oder Hybrid-IFN α durch Messen der an den Träger gebundenen Radioaktivität bestimmt wird. Bei einer solchen bevorzugten Radioimmunoanalyse ist entweder der träger-gebundene Antikörper oder der radiomarkierte Antikörper der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper oder ein Derivat davon nach obiger Beschreibung, wobei der andere Antikörper ein monoclonaler Antikörper für außerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung liegende IFN α ist, oder ein polyclonaler Antikörper, wahlweise in Form eines radiomarkierten Derivats.

Besonders bevorzugt wird e,ine Sandwich-Radioimmunoanälyse nach obiger Beschreibung, bei der der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper an ein Kügelchen, zum Beispiel ein Polystyrolkügelchen, gebunden ist, dieses beschichtete Kügelchen in einem Test von Standardlösung, die IFN α oder Hybrid-IFN α enthält, inkubiert wird und schließlich mit einem radiomarkierten monocionalen Antikörper, der ein anderes IFN-ct-Epitop erkennt, entwickelt wird.

Die Fig. 4 und 5 zeigen die an das Trägerkügelchen gebundene Radioaktivität in Abhängigkeit von der Menge von zu der IFN-a-/B-Unterart gehörendem IFN-a-2-Polypeptid in der Testlösung, wie mit Hilfe einer Sandwich-RIA gemessen werden kann, die im experimentellen Teil ausführlich beschrieben wird. Durch die Sensibilität der RIA ist eine schnelle, zuverlässige und quantitative Bestimmung von 150 bis 5000 IU/ml IFN-a-2-Unterart oder sogar von nur einer IU/ml der IFN-ct-2-Unterart möglich, wenn eine zeitraubendere Verfahrensweise angewandt wird. Ähnliche Ergebnisse lassen sich bei einer Sandwich-RIA zur Bestimmung von zu anderen IFN-ct-Unterarten, z. B. der IFN-a/D-Unterart oder der IFN-ct/F-Unterart, gehörenden Polypeptiden und vor allem der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone erzielen.

Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper kann als solcher oder in Form eines enzym-konjugierten Derivats in einer Enzym-Immunoanalyse verwendet werden. Solche Immunoanalysen umfassen Testverfahren, bei denen ein erfindungsgemäßes enzymmarkiertes monoclonales Antikörperderivat, an sich bekannte enzym-markierte Antikörper, die die Epitope des erfindungsgemäßen Anti-IFN-a-Antikörpers erkennen und binden, oder andere Anti-IFN-ct-Antikörper verwendet werden. Es wird eine ELISA (enzym-verknüpfte Immunoadsorbant-Analyse) bevorzugt, bei der ein Träger nach obiger Beschreibung für eine RIA mit dem erfindungsgemäßen monocionalen Antikörper beschichtet wird, mit einer IFN α enthaltenden Testlösung und danach mit einem polyclonalen Serum für IFN α, zum Beispiel Schafserum, inkubiert wird und schließlich die gebundenen Antikörper des polyclonalen Serums durch enzym-markierte Antikörper, die sie erkennen und binden, entwickelt werden, und die Menge von gebundener IFN a durch eine Enzym-Substrat-Reaktion bestimmt wird. Ein solcher enzym-markierter Antikörper ist zum Beispiel ein phosphatase-markiertes Ziegen-Anti-Schaf-Immunoglobulin. Es wird gleichfalls eine ELISA bevorzugt, bei der ein Träger, der mit einem monocionalen Antikörper, der spezifisch für eine IFN-a-Unterart ist, beschichtet wurde, mit einer IFN α enthaltenden Testlösung und mit einer Lösung eines mit einem Enzym konjugierten monocionalen Antikörpers inkubiert wird, wobei der gelöste monoclonale Antikörper ein anderes Epitop der IFN-a-Unterart erkennt als der träger-gebundene monoclonale Antikörper. Mit Hilfe einer Enzym-Substrat-Reaktion, die beispielsweise zu einer Farbänderung führt und mit dem Auge oder mit optischen Meßinstrumenten verfolgt werden kann, wird die Menge von gebundenem Enzym, die der Menge von IFN α oder IFN-a-Hybrid-Unterart in der Testlösung proportional ist, gemessen.

Besonders bevorzugt wird eine Enzym-Immunoanalyse, die Immunodot-Analyse genannt wird, bei der Test- oder Standardlösungen, die IFN α oder Hybrid-IFN α enthalten, auf einen mikroporösen Träger, der eine hohe Eigenaffinität für Polypeptide besitzt, zum Beispiel auf Nitrocellulose, aufgetüpfelt werden, der einen oder mehrere Tropfen der IFN-cc-enthaltenden Sonden tragende Träger in einer Lösung des erfindungsgemäßen monocionalen Antikörpers, danach in einer Lösung eines enzym-markierten zweiten Antikörpers, der den erfindungsgemäßen monocionalen Antikörper erkennt und bindet, und schließlich in einer Lösung eines Enzymsubstrats, das zu einem nachweisbaren Signal führt, zum Beispiel einer gefärbten Substanz, inkubiert wird. Ein solcher enzym-markierter zweiter Antikörper ist z. B. Kaninchen-Anti-Maus-Immunoglobulin, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert wurde und mit geeigneten Enzymsubstraten wie 4-Chlor-1 -naphthol oder dergleichen entwickelt werden kann. Die erfindungsgemäße Verwendung des monocionalen Antikörpers und dessen Derivate nach obiger Beschreibung für die qualitative und quantitative Bestimmung von IFN-a-Unterarten oder Hybrid-IFN α umfaßt auch andere an sich bekannte Immunoanalysen, zum Beispiel Immunofluoreszenztests, bei denen Antikörpef-Konjugate oder Antigen-Konjugate mit fluoreszierenden Substanzen verwendet werden, Latex-Agglutination mit antikörper-beschichteten oder antigen-beschichteten Latexpartikeln oder Haemagglutination mit antikörper-beschichteten oder antigen-beschichteten roten Blutkörperchen oder dergleichen.

Die Erfindung betrifft auch Testmaterial für die qualitative und quantitative Bestimmung von IFN-a-Unterarten und Hybrid-IFN α gemäß der Erfindung, das den monocionalen Antikörper 144 BS und/oder ein Derivat davon und wahlweise andere monoclonale oder polyclonale Antikörper für Human IFN α und/oder Adjunkte umfaßt.

Erfindungsgemäße Testausrüstungen für eine Radioimmunoanalyse enthalten zum Beispiel einen geeigneten Träger, unbeschichtet oder beschichtet mit einem monocionalen Antikörper für IFN α, wahlweise gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines monocionalen oder polyclonalen Antikörpers für IFN α und/oder ein radiomarkiertes Derivat davon, wobei mindestens einer der auf den Träger in Lösung oder in radiomarkierter Form aufgebrachten monocionalen Antikörper ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper ist, Standardlösungen von Human-IFN α, Pufferlösungen und wahlweise Polypeptide und Detergenzien zur Verhinderung nicht-spezifischer Adsorption und Aggregatbildung, Pipetten, Reaktionsgefäße, Eichkurven und dergleichen. Die erfindungsgemäßen Testausrüstungen für eine Enzym-Immunoanalyse enthalten zum Beispiel einen geeigneten Träger, wahlweise gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines monocionalen und/oder polyclonalen Antikörpers für IFN α und eines enzym-markierten monocionalen oder polyclonalen Antikörpers für IFN α oder für einen ersten IFN α erkennenden Antikörper, worin zumindest entweder der monoclonale Antikörper für IFN α oder das enzym-markierte Antikörperderivat für IFN α der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper oder dessen Derivat ist, Enzymsubstrate in fester oder gelöster Form, Standardlösungen von Human-IFN a, Pufferlösungen und wahlweise Polypeptide und Detergenzien, Pipetten, Reaktionsgefäße, Eichkurven, Farbskalentafeln und dergleichen.

IFNa aus natürlichen Quellen oder IFN-a-Unterarten oder mit IFNa verwandte Polypeptide, wie die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, können durch die Immunoaffinitäts-Chromatographie mit Hilfe des erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers gereinigt werden. Der monoclonale Antikörper oder ein Fragment davon wird an einen geeigneten Träger organischer oder anorganischer Herkunft, wie vernetzte Agarose, Dextran oder Polyacrylamid in entsprechend funktionalisierter Form, wahlweise nach der Aktivierung gebunden, wobei im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren angewandt werden. Zum Beispiel wird ein aktivierte Esterfunktionen tragender Träger in einer wäßrigen Pufferlösung suspendiert, mit einer Lösung des monoclonalen * Antikörpers oder eines Fragmentes davon vermischt, filtriert, erneut suspendiert und zur Entfernung von überschüssigem monoclonalem Antikörper gewaschen und mit einer Lösung von irrelevanten Proteinen behandelt, um freie reaktionsfähige Positionen des Trägers zu blockieren. Dieser antikörper-beschichtete Träger wird verwendet, um Human-IFN-a-Unterarten, z. B. IFN α/Β, IFN α/D und IFN a/F-Unterarten und verwandte Polypeptide, wie die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, selektiv in glycosylierter oder unglycosylierter Form zu binden. Zu diesem Zweck wird Trägermaterial in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel, zum Beispiel einer Salzlösung wie NaCI-Lösung oder einer Pufferlösung wie einer phosphat-gepufferten NaCI-Lösung, NaHCO_rLösung oder 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurelösung, suspendiert und mit der IFN α enthaltenden Lösung in Berührung gebracht, indem sie beispielsweise in eine Chromatographiesäule gegossen wird und die IFN enthaltende Lösung zugegeben und durch das Trägermaterial, auf Wunsch unter Druck, gepumpt wird. Ungebundene Proteine und andere Verunreinigungen werden mit wäßrigen Lösungen, zum Beispiel Pufferlösungen mit einem pH-Wert-Bereich von annähernd pH 5 bis annähernd pH 9 und/oder Salzlösungen, zum- Beispiel NaCI-Lösungen.ausgewaschen. Die an der Antikörper auf dem Trägermaterial gebundene IFNa wird mit geeigneten wäßrigen Lösungen eluiert, zum Beispiel Pufferlösungen mit einem im Bereich von annähernd pH 2 bis annähernd pH 5 liegenden pH-Wert, wie Glycinpuffer oder Zitronensäure, oder pH-Gradienten unterschiedlicher Zusammensetzung oder Salzlösungen, zum Beispiel konzentrierter HN₄SCN-Lösung. Das IFN α enthaltende Eluat wird wahlweise neutralisiert, und die gereinigte IFN α wird mit Hilfe bekannter Verfahren daraus isoliert. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen aber nicht als eine Einschränkung derselben aufgefaßt werden.

Experimenteller Teil

In den Beispielen gebrauchte Abkürzungen

DTT 1,4-Dithiothreitol

TNE Lösung die 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM NaCI 2 mM EDTA enthält

Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

TE Lösung, die 10 mM Tris, 50 μΜ EDTA enthält

N-Medium enthält Bacto-Tryptone (10 g, Difco), Hefeextrakt (1 g, Difco), Glucose (1 g), NaCI (8 g), CaCI₂ H₂O

(249 mg) je 1 I Lösung

TBE Lösung, die 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA enthält

BSA Rinderserumalbumin

HAT Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin

Ig Immunoglobulin

IU Internationale Einheiten (der Interferon-Aktivität)

Mab . monoclonaler Antikörper

PBS phosphat-gepufferte Salzlösung

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Teil I: Konstruktion und Cloning von Interferon a-2/a-3-Hybriden in Escherichia coli Alle unten beschriebenen Hybrid-Interferon-Protein-Codierungssequenzen wurden operativ mit dem ß-Lactamase-Promotor verknüpft, in ein von pBR322 abgeleitetes Expresionsplasmid geclont und in E. coli HB101 transformiert.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1: Konstruktion von Pvull resistenten Vectoren, die DNS-Sequenzen der Lymphoblastoid IFNe a-2 und a-3 tragen pBR322 wird mit Pvull (Biolabs) zerschnitten, und die lineare DNS wird an einen (³²P)-Bcll-Linker (d[ATGTGTGATCACACAT], der nach der Festphasen-Phosphotriester-Methode, siehe H. Rink, u. a.. Nucleic Acids Research 12, 6369 [1984] synthetisiert wurde) wie folgt gebunden:

Die eingeschränkte Plasmid-DNS (1 μg, etwa 0,7 pMol Enden) wird an ³²P-markierte Bcll-Linker-DNS (etwa 40 pMol Enden) in 50 μΙ Reaktionsvolumen, das 20 mM Tris-HCI, pH-Wert 7, 8, 10 mM MgCI₂, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP und 40 U/μΙ T₄ DNS Ligase (Biolabs) enthält, gebunden. Nach einer Inkubationszeit von 2 bis 3 h bei 15°C wird die wäßrige Phase mit einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNS wird durch die Zugabe von 1/9 Volumen 1OxTNE, 2,5 Volumen Ethanol und bei einer gleichbleibenden Temperatur von -20⁰C über Nacht ausgefällt. Das DNS-Pellet wird erneut in 50 μΙ TE, pH-Wert 8,0, suspendiert und durch einen 5 bis 23% Sucrose-Gradienten (50 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,/1 mM EDTA) in einem Kontron-Rotor TST 60 4 Stunden lang mit 58000 U/min und bei 15°C zentrifugiert. Der Gradient wird von oben nach unten fraktioniert, und die Radioaktivität in jeder Fraktion wird durch Cerenkov-Zählung verfolgt. Interessierende Fraktionen werden zusammengenommen, und die DNS wird mit TNE und Ethanol ausgefällt. Das DNS-Pellet wird erneut in Restriktions-Puffer ausgefällt und mit BC1I digeriert und nach der Extraktion der wäßrigen Phase mit Phenol/Chloroform wieder ausgefällt. Die lineare DNS wird dann mit einer Konzentration von 5 μg/ml unter Bedingungen rezirkuliert, die mit den für die Linker-Ligation beschriebenen identisch waren.

Die ligierte DNS wird mit den Enzymen HindiIi, Pvull (um zurückgebliebenes intaktes pBR322 zu eliminieren) und Pstl zerschnitten, und das Hindlll-Pstl große Fragment (3600 BP + Linker), das den Ursprung der Replikation und das amp^R-Gen enthält, wird durch Sucrose-Gradienten-Zentrifugieren isoliert.

Durch Sucrose-Gradienten-Zentrifugieren gewonnene Hindlll-Pstl-Inserts von CG-pBR(AP)/Lylfn-a-2 (1160 BP) und von CG-pBR(AP)/LylFN-a-3 (1 020 BP) (EU-PA 76.489) werden jeweils in die oben hergestellte DNS eingebaut, wodurch die Plasmide pAM4 und pAM2 entstehen, die die LylFN-a-2 bzw. LylFN-a-3-Codierungsregionen unter der Kontrolle des ß-Lactamase-Promotors enthalten.

Ligierte DNS wird direkt zur Transformation leistungsfähiger E. coli wie folgt verwendet: Das DNS-Ligationsgemisch (oder

Fraktionen davon) wird in 150 μΙ 15 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, 10 mM CaCI₂, 10 mM MgCI₂, 10 mM NaCI, 0,5 mM EDTA übertragen, und 50 μΙ der mit CaCI₂ behandelten Rezipient E. coli HB101 werden zugesetzt. Das Gemisch wird 20 min lang auf 0°C gehalten, dann 2 min lang auf 42°C gebracht, und nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wird 1 ml N-Medium zugegeben. Die Inkubation wird bei 37°C 1 h fortgesetzt (Rüttelplattform, 250 U/min), worauf 600 μΙ auf McConkey-Agar/(Difco), das Tetracyclin (10 μg/ml) enthält, aufgestrichen werden. Die Petrischalen werden bei 37⁰C bis 18 Stunden lang inkubiert, wobei Bakterienkolonien zu beobachten sind. ' ·

Plasmid-DNS wird von den Transformanten durch folgende Verfahrensweise gewonnen. 10 ml N-Medium, das Tetracyclin (10 μg/ml) enthält, werden jeweils mit einer Transformanten-Kolonie geimpft, und die Kulturen werden bei 37°C bewegt (Rüttelplattform, 150 bis 300 U/min), bis sie eine optische Dichte von 0,9 bis 1,1 (650 nm) erreicht haben. Die Zellen werden geerntet und erneut in einem gleichen Volumen von N-Medium, das Tetracyclin (10 μg/ml) und Chloramphenicol (80 μς/ΓηΙ) enthält, suspendiert. Die Inkubation wird bei 37 ⁰C weitere 18 h lang fortgesetzt, um die Anzahl von Plasmidkopien pro Zelle zu erhöhen. Die Bakterien werden geerntet, und das Bakterienpellet wird erneut in 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 8 (10 ml je Gramm Naßzellengewicht) suspendiert, und Lysozym (Sigma) wird bis zu einer endgültigen Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt. Nach 10 min bei 0°C wird die Lösung auf 50 mM EDTA eingestellt, nach 10 min bei 0°C wird Triton X 100 bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,8% zugegeben, und das Präparat wird 1 h lang bei O⁰C gehalten, worauf Zentrifugieren in einem Sorvall-Rotor SS-34 für eine Dauer von 30 min bei 18000 U/min folgt. Nach der Extraktion der klaren überstehenden Flüssigkeit mit Phenol und zwei anschließende Extraktionen mit Chloroform wird RNase A (Sigma) bis zu einer endgültigen Konzentration von 25 pg/ml zugesetzt, und die Lösung 1 h lang bei 37°C inkubiert. Zur Entfernung von RNS werden NaCI (1 M endgültige Konzentration) und Polyethylenglycol 6000 (7,5% endgültige Konzentration) zugegeben und das Präparat wird 2 h lang auf -10°C gehalten, worauf 10 min Zentrifugieren mit 10000 U/min und bei 0⁰C in einem Sorvall-Rotor SS-34 folgt. Die Pellets werden erneut in 200 μΙ TNE suspendiert und abermals mit Phenol/Chloroform (1:1) vor der Repräzipitation (durch Zugabe von 500 μΙ Ethanol, 5 min bei -80⁰C, 10 min Eppendorf-Zentrifuge) extrahiert. Die DNS-Pellets werden erneut in 20 bis 40 μΙ TE suspendiert. Typische bei dieser Verfahrensweise erzielte Ausbeuten sind etwa 20 μg Plasmid-DNS. Die hergestellten Plasmid-DNSn (pAM4 und pAM2) werden der Restriktions-Enzym-Analyse unterzogen. Die Struktur von pAM4 und pAM2 wurde bestätigt.

Beispiel 2: Eliminierung'der S'-extracistronischen Pvull-Stelle von pAM4

Im Gegensatz zu pAM2 (oc-3) enthält pAM4 (a-2) immer noch zwei Pvull-Stellen (siehe Fig. 3). Zur Erleichterung der Konstruktion von Hybrid-IFN-Genen an der Pvull-Stelle innerhalb der IFN-Codierungsregion wird die zweite Pvull-Stelle innerhalb der extracistronischen Region eliminiert.

Bei dieser Modifikation von Plasmid pMA4 handelt es sich im wesentlichen um eine Deletion der 3'-extracistronischen IFNct-2 cDNS-Sequenz zwischen Pstl und der 3'-extracistronischen Pvull-Stelle (siehe Fig. 3). pAM4 wird teilweise mit Pvull digeriert (5 μg pAM4 in 50 mM NaCI, 6 mM MgCI₂, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, 1 Einheit/Vg Pvull (Biolabs) zugesetzt, 5 min lang bei 37⁰C digeriert, Abbruch durch Phenolextraktion) und wird an (³²P)-Pstl-Linker (Collaborative Research, Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben) ligiert. Das DNS-Gemisch wird in E. coli HB 101 wie oben übertragen, und die Plasmide von 16 Kolonien werden durch Restriktions-Enzym-Analyse gescreent, wobei Pstl, Pvull und Hindlll für das Vorhandensein einer Deletion mit der richtigen Größe (246 BP) verwendet werden. Von den gescreenten 16 Kolonien sind drei unmodifizierte pAM4, eine ist ein Multimer, fünf haben eine große Deletion (620 BP) und sieben tragen die kleine erwünschte Deletion (246 BP). Ein Clon mit einem verkürzten lFNa-2 Insert (Hindlll-Pstl-kleines Fragment jetzt 907 BP) wird ausgewählt und als pAM21 bezeichnet.

Beispiel 3: Konstruktion von Pvu-Hybriden mit Kreuzungsstellen an Aminosäure 92 Die Plasmide pAM2 (cc-3) und PaM21 (a-2) werden jeweils mit Hindlll und Pvull zerschnitten, was zur Excision von DNS-Fragmenten (521 BP) führt, die die ß-Lactamase-Promotor-Sequenzen und die N-Terminal-Kälften der IFN-Gene enthalten (die für die Aminosäuren 1 bis 92 codieren). Die großen und kleinen Fragmente (etwa 4 Kb bzw. 521 BP) werden durch Sucrose-Gradienten-Zentrifugation getrennt, und die großen Fragmente wurden durch Behandlung von 1 μg DNS-Fragmenten in 50 μΙ 50 mMTris, pH-Wert 8, mit 1 Einheit alkalischer Kalbsnieren-Phosphatase je 10 pMol 5'-Enden, 30 min lang bei 37°C dephosphoryliert. Hybrid-IFn ,,B]B₂D₃D₄"- und „D_tD₂B₃B,,"-Gene werden durch Ligation der entsprechenden oben beschriebenen großen und kleinen DNS-Fragmente konstruiert (großes Hindlll-Pvull-Fragment [~ 4 Kb] von PAM2 an kleines Hindlll-Pvull-Fragment [521 BP] von pAM21 ligiert, resultierte in B₁B₂D₃D₄-IFN usw.). Die Ligaton wird in ΙΟ-μΙ-Volumen vorgenommen, die 20 mM Tris-HCI, pH 7,8, 10 mM MgCI₂, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP, 40 Einheiten μΙ T₄-DNS-Ligase (Biolabs) und annähernd 500 ng große DNS-Fragmente und 20 bis 40 ng kleine DNS-Fragmente enthalten. Nach 5 h bei 15°C werden 5 μΙ des Ligationsgemischs zur Transformation von E. coli HB101 wie oben verwendet, wodurch sich jeweils etwa 1 000 transformierte Kolonien ergeben. Drei Kolonien werden jeweils ausgewählt, ihre Plasmid-DNS wird isoliert und mit den Enzymen Hindlll, Pvull, EcoRI, Taql und Pstl analysiert. Zwei Kolonien, die Plasmid-DNSn mit der vorausgesagten Struktur (pAm 27 [,,B₁B₂D₃D₄"] und pAM 33 [,,D₁D₂B₃B₄"]) enthalten, werden selektiert.

Beispiel 4: Konstruktion von Hybrid-IFN-Genen, überkreuzt an Aminosäure 150 Die Plasmide pAM2 (cc-3) und pAM21 (a-2) werden je mit Pvull und Pstl digeriert. Die DNS-Fragmente werden durch Sucrose-Gradienten-Zentrifugation in Pvull-Pstl-große Fragmente (etwa 4 Kb, die die N-terminalen 92 Aminosäuren von IFNn a-2 und a-3 codieren) getrennt. In einem zweiten Schritt werden die gereinigten Pvull-Pstl-kleinen Fragmente von pAM2 und pAM21 jeweils wie folgt ³²P-markiert:

Die DNS-Fragmente (~ 1 μg) werden je in 50 μΙ 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, gelöst und durch Behandlung mit 1 U/10 pMol 5'-Enden alkalischer Phosphatase 30 min lang bei 37°C dephosphoryliert. Das Enzym wird durch 1 h Inkubation bei 65⁰C inaktiviert, und die DNS wird durch Adsorption und Eluierung von DEAE-Cellulose gereinigt und in Ethanol ausgefällt. Die DNS wird in einem Reaktionsvolumen von 20 μΙ phosphoryliert, das 50 mM Tris-HCI, pH 9,5/10 mM MgCI₂/(5 mM DTT, 30 bis 40 μΙ lyophilisierter Y-[³²P]-ATP (Amersham, 6000 Ci/mMol, 1 mCi/ml) und 0,5 U/μΙ T₄ Kinase (P. L. Biochemicals) enthält. Nach 20 min bei 37 ⁰C wird die Reaktion durch die Zugabe von EDTA bis 10 mM abgebrochen. Dann wird ein Überschuß (~ 4 μg) von entsprechendem unbehandeltem DNS-Fragment zugesetzt, und die Lösung wird mit Phenol und Chloroform extrahiert. Die DNS wird durch Chromatographie durch Sephadex G-50 in TNE von der zurückgebliebenen Y-[³²P]-ATP getrennt. Die ausgesonderten Peak-Fraktionen, die durch Cerenkov-Zählung ermittelt wurden, werden zusammengenommen und mit Ethanol ausgefällt.

Die³²P-markierten Pvull-Pstl-kleinen Fragmente werden jeweils vollständig mit Sau3A digeriert,, und die eingeschränkte DNS wird durch Elektrophorese in einem 6%igen Polyacryiamidgel unter Verwendung von TBE als Laufpuffer getrennt. 4 DNS-Fragmente, die Pvull-Sau3A (jeweils 172 BP, die die Aminosäuren 93 bis 150 der IFNe α-2 und α-3 codieren), und Sau3A-Psti (214 BP bzw. 324 BP, die die Aminosäuren 151 bis 166 von IFNn α-2 und α-3 codieren) werden von dem Gel isoliert.

Durch Religation von 3 passenden Fragmenten (siehe Tabelle 2) werden an Aminosäure 150 überkreuzte 4-Hybrid-IFN-Arten erzeugt. Die entsprechenden Plasmide werden in einer Reihe von Schritten rekonstruiert; in einer ersten Ligations-Reaktion werden äquimolare Mengen von Pvuil-Sau3A und Sau3A-Pstl DNS-Fragmenten in 10 μΙ Ligationspuffer, der 20 mM Tris-HCI, pH 7,8,10 mM MgCI₂,10 mM DTT, 0,5 mM rATP und 40 Einheiten/μΙ T4 DNS-Ligase enthält, 3 bis 6 Stunden lang bei 15°C ligiert (woraus concatemerische [verknüpfte?] DNS resuliert). Nach der Digestion mit Pvull-Pstl und Extraktion mit Phenol/Chloroform (1:1) wird ein Überschuß des entsprechenden Pvull-Pstl-großen Fragmentes [dephosphoryliert: im allgemeinen 1 μg DNS in 50 μΙ 50 mM Tris-HCI, pH 8, (etwa 0,6 pMol 5' Enden) behandelt mit 0,06 Einheiten alkalischer Kalbsnieren-Phosphatase 30 min lang bei 37⁰C] zugesetzt und die DNS erneut ligiert. E. coli HB101 wird transformiert; und 4 Clone, die DNS mit der vorausgesagten durch Restriktionsanalyse bestimmten Struktur tragen (Pvull, Sau3A, Taql und EcoRI) werden ausgewählt. Die Clone werden als E. coli HB101 pJC334, pJC37, pJC342 und pJ344 bezeichnet (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2: Ursprung von DNS-Fragmenten, die zur Konstruktion der an der Aminosäure 150 überkreuzten Hybrid-IFNe verwendet wurden. In Klammern werden der IFN-Typ und die an den Fragmenten codierte a-IFN-Sektion angegeben.

Resultierender

Hybrid-iFN-Typ Clon-und Plasmid- Ligierte DNS-Fragmente (Länge)

Bezeichnung (Pvull-Pstl Pvull-Sau3A Sau3A-Pstl

(etwa 4 Kb) (170 BP) (210BP, α-2)

(320 BP, α-3)

AM2 (α-3,.92) Am2 (α-3₉₃_₁₅₀) Am21 (a-2,₅,_₁₆₆)

AM2 (a-3,_₉₂) Am21 (a-3₉3_₁₅o) Am2 (a-3₁₅₁__!66)

AM21 (a-2,_₉₂) Am2 (a-3_M_,5o) Am2.1 (a-2₁₅,__1M)

AM21 (a-2,_s₂) Am21 (a-2₉₃.₁₅o) Am21 (α-3 ₁₅₁.₁₆₆)

D1D2D3B4"	pJC334
D1D2B3D4"	pJC337
B1B2D3B4"	pJC342
B1B2B3D4"	pJC344

Beispiel 5: Konstruktion von an Aminosäure 60 überkreuzten Hybrid-IFN-Genen Die Konstruktion dieser Hybrid-IFN-Gene erfolgt im wesentlichen durch die gleiche Verfahrensweise, wie sie in Beispiel 4

beschrieben wurde.

Die Plasmide pAM2 (α-3) und pAm21 (α-2) werden jedes mit Hindlll und Pvull zerschnitten, und die Fragmente werden durch Sucrose-Gradienten-Zentrifugation getrennt. Die Hindll-Pvull kleinen Fragmente (521 bP, die die ß-lac-Promotorregion enthalten und die N-terminalen 92 Aminosäuren der Ifne α-2 und α-3 codieren) werden ³²P-markiert und teilweise mit Sau3A (0,5 Einheiten Enzym je μg DNS, 5 Minuten lang bei 37⁰C, Abbruch der Reaktion durch Phenolextraktion digeriert. Das resultierende Gemisch von Fragmenten wird erneut durch Elektrophorese in 6%igen Polyacrylamidgelen gelöst, und 4 Fragmente (zwei 424 BP Hindlll-Sau3A Fragmente und zwei 97 BP Sau3A-Pvull Fragmente) werden aus dem Gel extrahiert. Die Religation von 3 entsprechenden Fragmenten durch die in Beispiel 4 beschriebene schrittweise Verfahrensweise (siehe Tabelle 3) und die Transformation in E. coli HB101 resultiert in Transformanten mit nur 2 der erwarteten 4 Konstruktionen: pAM65 (,,D₁B₂D₃D₄") und pAM90 (,,B₁D₂B₃B₄").

Tabelle 3: Ursprung von DNS-Fragmenten, die zur Konstruktion von zwei an der Aminosäure 61 überkreuzten Hybrid-IFN-Genen verwendet werden. In Klammern sind der IFN-Typ und die an den Fragmenten codierte Sektion von alFN bezeichnet.

Resultierender Hybrid-IFN-Typ

Clon- und Plasmidbezeichnung

DNS-Fragment-Typ (Länge)

Hindlll-Sau3A Sau3A-Pvull Hindlll-Pvull

(424 BP) (97 BP) (etwa 4 Kb)

D₁B₂D₃D₄ B₁D₂B₃B₄

pAm65 pAM90

Am21 (a2₆₂_₉₂₎ Am2 (a-3₆₂_₉₂)

Am2 (a-393_,66) AM 21 (a-2₉₃_₁₆₆)

Für die Konstruktion der beiden anderen an Aminosäure 61 überkreuzten Hybrid-IFN-Gene werden die Plasmide pAM65 und pAM90 je mit Hindlll und Pvull zerschnitten, und die kleinen Hindlll-Pvull-DNS-Fragmente (521 BP) werden nach der Elektrophorese in Agarosegel isoliert. Die Ligation des Hind-lll-Pvull-kleinen Fragments von pAM90 mit dem Hindlll-Pvull-großen Fragment von pAM2 resultiert in pAM94 (B₁D₂D₃D₄), und die Ligation des kleinen Hindlll-Pvull-Fragmentes von pAM65 mit dem Hindlll-Pvull-großen Fragment von pAM21 ergibt Plasmid pAM76 (D₁B₂B₃B₄). Die Struktur der obigen vier Plasmid-DNSn wird durch

Restriktions-Enzym-Analyse bestätigt.

Die entsprechenden Clone werden als E. coli HB101 pAM65, pAM90, pAM94 und PÄM76 bezeichnet.

Teil II: Konstruktion und Clonen von Interferon a-2/a-3-Hybriden in Saccharomyces cerevisiae Alle unten beschriebenen Hybrid-Interferon-Protein-Codierungssequenzen wurden mit dem PHO5-Promotor und den PHOS-Transcriptions-Terminations-Signalen verknüpft, in den Hefe 2 μ Vector pJDB207 geclont und in den Hefestamm

S. cerevisiae GRF18 transformiert.

Beispiel6: Konstruktion von Expressions-Plasmid p31 RT (Δ 72)

Plasmid pJDB207/IF2(5,)A 72 (EU-PA Nr. 100 561) wird mit Hindlll und EcoRI digeriert, und ein 470-BP-Fragment, das das Carboxy-Terminalende von Interferon α-2 und PHO5 Transcriptions-TerminantionsrSignale aufweist, wird durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution (R. Yang, u. a., Methods Enzym. 68, 176 [1979]) unter Verwendung von Micro-Collodion Bags (Sartorius, Göttingen, BRD) isoliert. Plasmid p31R (siehe EP 100 561) wird mit Hindlll und EcoRI digeriert, und

der 4,1 Kb Vectorteil wird unter Anwendung der gleichen Technik isoliert. Nach der Ligation von 200 ng Vector- und Insert-DNS unter Anwendung von E. coli T4 DNS-Ligase und Transformation von E. coli HB101 zu Ampicillin-Resistenz, wird ein p31 RT(A 72) genanntes Plasmid, das den PH05-Promotor, das C-Terminal-Ende von Interferon ce-2 und PHO5 Transcriptions-Terminantionssignale enthält, isoliert und seine Struktur durch Restriktionsanalyse bestätigt.

Beispiel 7: Konstruktion der Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM104, AM114 und AM119 PHO5 Expressions-Plasmid p31 RT(A 72) (siehe Beispiel 6) wird mit EcoRI und Xhol digeriert, und die vertieften 3'-Enden werden mit dCTP, dGTP, dATP und dTTP unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von DNS-Polymerase I von E. coli ausgefüllt. Die stumpfen Enden werden anschließend mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Die Plasmide pJC334, pAM90 und pJC337 (Beispiele 4 und 5) werden mit Taql (pJC334 und pAM90) oder mit Taql und EcoRI (pJC337) digeriert, und die 3'-vertieften Enden werden mit den entsprechenden Desoxynucleotiden nach obiger Beschreibung ausgefüllt. DNS-Fragmente von annähernd 560 Basenpaaren werden durch Agarosegel-Eiektrophorese und Elektroeluierung unter Verwendung von Micro-Collodion Bags wie oben isoliert. Die Ligation von 200 ng vorbereitetem Vectorteil von Plasmid p31 RT(A 72) und 200 ng eiuierten DNS-Fragmenten unter Verwendung von T4 DNS-Ligase und die Transformation von E. coli HB101 zu Ampiciilin-Resistenz führen zu den Plasmiden p31 R/IFN AM104 (das die Hybrid-Interferon ,,D₁D₂D₃B₄" Codierungssequenz enthält), p31R IFN AM119 (das die Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃B₄" Codierungssequenz enthält) bzw. p31R IFN AM114 (das die Hybrid-Interferon ,,D₁D₂B₃B₄" Codierungssequenz enthält. Durch Zerschneiden dieser Plasmide mit BamHI und Hindlll wird ein DNS-Fragment von annähernd 1 300 BP mit der Konfiguration PHO5 Promotor - IFN Protein Codierungssequenz - PHO5 Transcriptions-Terminations-Signal durch Agarosegel-Eiektrophorese und Elektroeluierung isoliert. Dieses Fragment wird zwischen die Hindlll- und BamHI-Steilen von Plasmid pJDB207 geclont. Die Plasmide werden in Hefestamm GRF18 bis Leu⁺ transformiert (siehe EP 100 561, siehe auch Beispiel 14). Die resultierenden Clone werden als S. cerevisiae GRF 18/pJDB207 PHO5/IFN AM104, GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AM114und GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AM119 bezeichnet.

Beispiel 8: Konstruktion von Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM129 Plasmid pAM94 (Beispiel 5) wird vollständig mit Taql und teilweise (in Gegenwart von 10 ng/ml Ethidiumbromid) mit EcoRI zerschnitten. Ein DNS-Fragment von annähernd 580 BP wird durch Agarosegel-Eiektrophorese und Elektroeluierung isoliert und an den mit EcoRI und Xhol zerschnittenen, gel-gereinigten Vectorteil von Plasmid p31RT(A 72) ligiert (siehe Beispiel 6). Nach der Transformation von E. coli HB101 zu Ampicillin-Resistenz wird das Plasmid p31R PHO5/IFN AM129 isoliert. Dieses die Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" Codierungsregion enthaltende Plasmid wird mit Hindlll und BamHI digeriert, und das 1 300-BP-DNS-Fragment wird wie in Beispiel 7 beschrieben in pJDB207 ligiert. Das Plasmid wird wie oben in Hefestamm GRF 18 transformiert. Das resultierende Clon wird als S. cerevisiae GRF18/pJDB 207 PHO5/AM129 bezeichnet.

Beispiel 9: Konstruktion der Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM106, AM110 und AM112 Die Plasmide pJDB207 PHO5 IFN/AM104, AM114 und AM129 (siehe Beispiel 7 und 8) werden mit BamHI und Pvull digeriert und die 6,8 Kb Vectorteile, die die jeweiligen C-Terminal-Enden der Interferon-Codierungsregionen enthalten, werden durch Agarosegel-Eiektrophorese und Elektroeluierung isoliert. In gleicher Weise wird Plasmid pJDB207R/(a-2)A 72 (EU-PA 100 561) mit BamHI und Pvull digeriert und ein DNS-Fragment von 800 BP isoliert. Die Ligation der entsprechenden Fragmente und die Transformation von E. coli HB101 führen zu den Plasmiden pJDB207 PHO5/IFN AM106 (das die Hybrid-Interferon ,,B₁B₂B₃D₄" Codierungsregion enthält), AM112 (das die Hybrid-Interferon „B,B₂D₃B₄"-Codierungsregion enthält) und AM110 (das die Hybrid-Interferon „B,B2D₃D₄"-Codierungsregion enthält). Der Hefestamm GRF18 wird wie gewöhnlich transformiert. Die resultierenden Cionewerden als S. cerevisiae (GRF18 pJDB207 PHO5/IFN AM106, pJDB207 PHO5/1FN AM110 bezeichnet.

Beispiel 10:Konstruktion der Plasmide pJDB207 PHO5/IFN DM1 und DM2

Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM119 (Beispiel 7) wird mit Hindlll und BgIII digeriert, und der 7,5 Kb Vectorteil, der das N-Terminal-Ende der Interferon-Codierungsregion enthält, wird durch Agarosegel-Eiektrophorese und Elektroeluierung isoliert. In gleicher Weise werden die Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM114und pJDB207 PHO5/IFN AM104 (siehe Beispiel 7) jeweils mit den gleichen Enzymen digeriert, und DNS-Fragmente von etwa 600 BP, die das C-Terminal-Ende der Interferon-Codierungsregion enthalten, werden isoliert. Die entsprechenden Fragmente werden mit T4 DNS-Ligase ligiert. Nach der Transformation von E. coli HB101 werden die Plasmide pJDB207 PHO5/IFN DM1, das die Hybrid-Interferon „B,D₂D₃D₄"-Codierungsregion enthält, und pJDB207 PHO5IFN DM2, das die Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃B₄" Codierungsregion enthält, gewonnen. Der Hefestamm GRF18 wird nach obiger Beschreibung transformiert. Die resultierenden Clone werden als S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PHO5/IFN DM1 und S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PHO5/IFN DM2 bezeichnet.

Beispiel 11 konstruktion von Plasmid pJDB207 PHO5/IFN HRi43

Plasmid pJDB207R/IF(cc-2)A 72 (EU-PA Nr. 100 561) wird mit BamHI und Pvull digeriert, und ein DNS-Fragment von 6,8 Kb wird isoliert. In gleicher Weise wird Plasmid pJDB207R/IF(cc-3) (EU-PA 100 561) mit den gleichen Enzymen digeriert, und es wird ein DNS-Fragment von 800 BP isoliert. Durch die Ligation der beiden DNS-Fragmente und die Transformation von E. coli HB101 zu Ampicillin-Resistenz entsteht Plasmid pJDB207 PHO5/IFN HRi43, das die Hybrid-Interferon ,,D₁D₂B₃B₄" Codierungsregion enthält. Der Hefestamm GRF18 wird wie oben transformiert. Die resultierenden Clone werden als S. cerevisiae GRF18 pJDB207 PHO5/IFN HRi43 bezeichnet.

Beispiel 12:Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18 und Induktion der Interferon-Produktion Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM129 (,,B₁D₂D₃D₄") wird analog der Beschreibung (Hinnen, u. a„ Proc. Natl. Acad. Sei., USA 75, 1929 [1978]) in den Saccharomyces cerevisiae Stamm GRF18 (a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can®) eingefügt. Ein μg Plasmid-DNS wird zu 100 μΙ einer Spheroplast-Suspension gegeben, und die Mischung wird mit Polyethylenglycol behandelt. Die Spheroplaste werden mit 10 ml Regenerationsagar vermischt und auf Hefe-Minimal-Medium-Platten ohne Leucin ausgestrichen. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen bei 30°C werden etwa 1 000 transformierte Zellen erhalten. Eine einzige Hefekolonie von den Hefe-Transformationsplatten (genannt Saccharomyces cerevisiae (GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AM129) wird in 10 ml Hefe-Minimal-Medium in einem 100-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei 3O⁰C mit 200 U/min 24 Stunden lang bis zu einer Dichte von etwa 2 bis 3 x 10⁷ Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden einmal mit 20 ml niedrigem-P, Minimalmedium (wie „Difco Hefe-Minimal-Medium ohne Aminosäuren" ergänzt durch 20 g/l Glucose, aber aus den Bestandteilen nach der Rezeptur von Difco

hergestellt [Difco Handbuch, Difco Laboratories, Detroit, USA], außer das 0,03 g/l KH₂PO₄ plus 1 g/l KCI anstelle von 1 g/l KH₂PO₄ verwendet wird) gewaschen. Drei ml der erneut suspendierten Zellen werden zum Impfen von 300 ml niedrigem-Pi Minimalmedium bzw. 300 ml normalem Minimalmedium in 1 000-ml-Erlenmeyerkolben verwendet. Die Inkubation erfolgt bei 30°C und 160 U/min. Auf die Induktion des PHO5-Promotors folgt die Messung der Erscheinungsform der Säurephosphatase-Aktivität in ganzen Zellen nach der Beschreibung (Toh-e, u. a., J. Bacteriol. 113, 727 [1973]). DieZellen werden bis zu etwa 1 bis 2 χ 10⁷Zellen/ml gezüchtet (Inkubationszeit 26 bis 30 h).

Beispiel 13:Herstellung von Hefezellextrakten und Bestimmung des Interferon-Titers Zellen von dem 300-ml-Nährmedium (siehe Beispiel 12) werden bei einer Dichte von 1 bis 2 χΊθ'/ml durch Zentrifugieren in einem Sorvall-Rotor GSA in einem Zeitraum von 5 min bei 8000 U/min und 4°C gesammelt. Die Zellen werden einmal mit 100 ml H₂O gewaschen, erneut in 6 ml eiskaltem Lysisgemisch [0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, 1 % [V/V] Triton X-100, 0,0001 IVl PMSF [Merck]) gewaschen und in ein 30-ml-Corex-Röhrchen übertragen. Die Suspension wird erneut 5 min lang in einem Sorvall-Roor SS-34 mit 8000 U/min bei 4°C zentrifugiert und in 3 ml Lysismischung bei O⁰C erneut suspendiert. Vier Gramm Glaskügelchen (Durchmesser 0,4 mm) werden zu den Zellen gegeben, und die Suspension wird auf einem Vortex Mixer (Scientific Instruments Inc., USA) 30 see lang mit voller Geschwindigkeit geschüttelt und anschließend 1 min lang in einem Eisbad gekühlt. Dieser Schüttelvorgang wird 5- bis 10mal wiederholt, bis mehr als 90% der Zellen aufgebrochen sind (Überprüfung unter dem Lichtmikroskop). Zellenstückchen und Glasperlen werden durch 10 min Zentrifugieren mit 8000 U/min bei 4°C in einem Sorvall-Rotor HB-4 entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird in Eppendorf-Röhrchen übertragen, in flüssigem Stickstoff gefrostet und bei -6O⁰C aufbewahrt. Die Interferon-Aktivität wird nach S. Rubinstein, u. a., (J. Virol 37, 755 [1981]) als 7 χ 10⁹ Einheiten/ml Zellextrakt ermittelt. ι , *

In einer analogen Weise zu der in den Beispielen 12 und 13 beschriebenen wird S. cerevisiae Stamm GRF18 mit den Plasmiden pJDB207 PHO5/IFN AM119 (,,B₁D₂B₃B₄"), AM106 (,,B₁B₂B₃D₄"), AM112 (,,B₁B₂D₃B₄"), DM1 (,,B₁D₂B₃D₄"), DM2 (,,B₁D₂D₃B₄"), AM110 (,,B₁B₂D₃D₄") und.HRi43 (,,D₁D₂B₃B₄") transformiert. Die resultierenden Stämme werden gezüchtet. Die Zellen werden geerntet, und die Interferon-Titer werden wie oben bestimmt. Die IFN-Titer sind wie folgt: S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AM119: 5 · 10⁹ Einheiten/ml

S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AM106: 7 10⁷ Einheiten/ml

S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AM112: 2 10« Einheiten/ml

S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN DM1: 3 10⁹ Einheiten/ml

S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN DM2: 5 · 10⁹ Einheiten/ml

S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN AMHO: 3 · 10⁸Einheiten/ml

S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PHO5/IFN HRi43: 1 · 10⁹ Einheiten/ml

Unter den gleichen Bedingungen ergeben die S. cerevisiae Stämme GRF18/pJDB207R/IF (a-2) und/IF(a-3) (EU-PA 100 561) Titer von 1 x 10⁸ bzw. 3 x 10⁹ Einheiten/ml.

Beispiel 14:Produktion von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" durch transformierte Hefezellen auf einer 30-ml-Skale Hefestamm GRF 18, der das Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM129 trägt, das das Gen für Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" unterhalb von dem Säurephosphatase-Promotor PHO5 codiert, wird auf die Oberfläche einer Agrarkultur von YNB Medium aufgestrichen. Die Platte wird bei 30⁰C inkubiert, bis zusammenfließendes Wachstum zu beobachten ist. Eine sterile Schlinge wird zum Übertragen ,einer Portion der Oberflächenkultur in einen Schüttelkolben verwendet, der das Vorkulturmedium IFN/21 enthält, bestehend aus: Hefeextrakt (Difco) 10,0 g

L-Asparagin H₂O 6,6 g

KH₂PO₄ 1,0 g

MgSO₄ -7 H₂O 1,9 g

L-Histidin 0,02 g

D-Glucose (Monohydrat) 33,0 g je 1 I entionisiertes Wasser

Der 500-ml-Kolben hat eine einzige Trennwand und enthält 100 ml Medium. Das Medium wird unter Verwendung von entionisiertem Wasser hergestellt und hat einen pH-Wert von annähernd"6,0. Die Glucose wird getrennt sterilisiert. Nach dem Impfen wird die erste Vor-Kultur 24 h lang bei 3O⁰C auf einem Orbital-Rüttler mit 5 cm Wurfweite bei einer Geschwindigkeit von 250 U/min inkubiert. Der Kolben mit der ersten Vor-Kultur liefert das Inokulum für die Kolben der zweiten Vor-Kultur. Diese Kolben erhalten ein Inokulum von 1 % V/V. Das Medium und die Inkubationsbedingungen sind mit denen für die erste Vor-Kultur identisch. Es werden ausreichend Kolben von der zweiten Vor-Kulturstufe vereinigt, um 1 % V/V Inokulum für den 30-l-Fermenter (3 Kolben/Fermenter) zu erhalten. Der Produktionsfermenter hat ein Betriebsvolumen von 30 I, enthält vier Trennwände und ein einziges Flügel-Turbinen-Rührwerk mit sechs Schaufeln mit einem Durchmesser von 115 mm. Die Bewegungsgeschwindigkeit beträgt 600 U/min, Luft wird mit 1 Vol/Vol/min eingeblasen und der Überdruck wird auf 0,3 Bar gehalten. Die Fermentationstemperatur beträgt 30⁰C. Der Fermenter wird mit Medium lFN/23 sterilisiert, das enthält: >

Hefeextrakt (Difco)	2,0	g
L-Asparagin H2O	6,6	g
MgSO4- 7 H2O	1,0	g
L-Histidin	0,02	g
D-Giucose (Monohydrat)	33,0 ς	5 je 1

I entionisiertes Wasser

wobei Glucose getrennt sterilisiert und zugegeben wird, um ein Endvolumen von 30 I zu erhalten.

Nach der Impfung wird der pH-Wert der Fermentation durch die Zugabe von Natriumhydroxid so reguliert, daß er nicht unter 6,0 abfällt. Die Fermentation dauert etwa 18 Stunden oder bis die maximale Ausbeute an Interferon erreicht ist.

Die optische Dichte, die ein allgemeines Maß für das Wachsen der Hefe ist, erreicht einen zwischen 6 und 7 OD-Einheiten liegenden Wert. Die Glucose wird zum großen Teil aber nicht vollständig verbraucht, und es findet eine Induktion von Säurephosphatase-Aktivitat gleichlaufend mit der Erzeugung von Interferon statt.

Der Interferon-Titer kann in rohen Extrakten gemessen werden, die durch mechanische Zellzerstörung im Laboratorium hergestellt werden, und er beträgt 7 x 10⁹ Einheiten/l Zellextrakt. Der Proteingehalt des rohen Extraktes betragt annähernd 1 mg/ml.

Am Ende der Fermentation kann die Nährbrühe vor dem Ernten und der Gewinnung des Hybrid-Interferons notfalls auf 10°C gekühlt werden.

30 I Nährbrühe mit einem pH-Wert von 6,0 werden auf 10°C gekühlt, und die Zellen werden mit Hilfe einer Sharpies® Zentrifuge getrennt. Die klare überstehende Flüssigkeit enthält keine IFN-Aktivität. Die gewonnene Zellmasse wird mit Buffer x (1 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5 M NaCI, 20 μΜ Phenylmethylsulfonylfluorid) bis auf 1400 ml aufgefüllt und hat einen pH-Wert von 8,0. Nach dem Abkühlen auf 5 bis 10⁰C wird die Suspension durch eine DYNO®-Mill (Typ KDL Pilot, 0,6 I) geleitet, die mit Polyurethan-Rührflügeln und 500 ml Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 0,75 mm versehen ist und eine Rührgeschwindigkeit von 3000 U/min und eine Speisegeschwindigkeit von 10 l/h besitzt, wodurch die Zellen zerrissen werden. Die Suspension hat einen pH-Wert von 8. Die die zerbrochenen Zellen enthaltende Suspension wird durch Zentrifugieren geklärt. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Sorvall-Rotor6SA mit 12000 U/min, bei 4°C20 min lang.

DerdasPlasmid pJDB207 PHO5/IFN AM119, AM1.06, AM112, DM1 bzw. DM2 tragende Stamm S. cerevisiae GRF18 kann gezüchtet werden, und eine das entsprechende Hybrid-Interferon enthaltende geklärte Lösung kann in einer analogen Weise hergestellt werden.

Beispiel 15:Herstellung von Extrakten von E. coli Stamm HB101/pAM94 und Bestimmung von IFN-Aktivität

E. coli Stamm HB101/pAM94 wird bis zu einer optischen Dichte von 8 bei 650 nm in 1 Liter M 9 Medium, das 0,4% Casaminosäuren und 2% Glucose enthält, gezüchtet. Die Zellen werden sedimentiert und erneut in Puffer (16 g Zellen in 160 ml Puffer), der 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0, 0,5 M NaCI, 5 mM EDTA und 100 μΜ PMSF enthält, suspendiert. Lysozym wird bis zu einer endgültigen Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Die Lösung wird anschließend 30 min lang auf Eis gehalten. Die Zellen in dieser Suspension werden mit Hilfe eines Sorvall Omnimix bei einer Einstellung von dreimal für 60 Sekunden geöffnet. Die die aufgebrochenen Zellen enthaltende Suspension wird durch 20 min Zentrifugieren in einem Sorvall-Rotor 6SA mit 120Ö0 U/min bei 4⁰C geklärt. Die überstehende Flüssigkeit wird hinsichtlich der IFN-Aktivität unter Anwendung des Verfahrens von S. Rubinstein, u. a. (supra) analysiert.

Es wurde eine IFN-Aktivität von 5 x 10⁷ Einheiten/ml Zellextrakt gefunden.

In einer analogen Weise werden die E. coli Stämme HB101/pAM90, pJC344 und pJC342 gezüchtet, und die Interferon-Titer werden wie oben als 5 χ 10^β, 5 χ 10⁷ und 5 x 10⁶ Einheiten/ml Zellextrakt ermittelt.

Beispiel 16:Herstellung von Hybridoma-Zellen

a) Quelle für Immunogen: Eine Probe von halb-gereinigtem Human-Leukocyten-IFN (IFN α), bezogen von Dr. K. Cantell (Helsinki), mit einer spezifischen Aktivität von 13 x 10⁶ IU je mg Protein wird für die Immunisierung verwendet.

b) Immunisierungsprotokoll: Sieben 10 bis 14 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse (Tierfarm, Sisseln, Schweiz) werden durch die Injektion von 4 x 10⁵ IU von IFN α (Beispiel 16), emulgiert in vollständigem Freundschen Adjuvans (Difco), in die vier Fußballen immunisiert. Eine weitere Injektion von 4 χ 10⁵ IU von IFN α in unvollständigem Freundschen Adjuvans wird am Tage 30 verabreicht und eine Verstärkungsinjektion (i. p.) von 6 χ 10⁵ IU von IFNa in PBS am Tage 60. Drei Tage später wird jeweils die Milz für die Fusion verwendet.

c) Zellfusion: Alle Fusionsexperimente werden nach der Verfahrensweise von G. Köhler und C. Milstein [Nature 256, 495 (1975)] unter Verwendung der nicht-ausscheidenden Sp 2/0-Ag14 Myelom-Reihe [M. Shulman, C. D. Wilde und G. Köhler, Nature 276, 269 (1978)] ausgeführt. 10^s Milzzellen werden mit 10' Myelomzellen in Gegenwart von 1 ml 50%igem Polyethylenglycol (PEG 1500, Serva) vermischt. Nach dem Waschen werden die Zellen erneut in 48 ml üblichem Dulbeccos Minimum Essential Medium (Gibco Nr. 0422501) suspendiert. 3 x 10⁶ normale peritoneale Exsudat-Zellen der Maus werden pro Fusion als Fütterungszellen zugegeben. Die Zellen werden in 48 x 1 -ml-Züchtungsvertiefungen verteilt und 3 bis 6 Wochen lang dreimal wöchentlich mit Standard HAT Selektionsmedium gefüttert. Wenn das Wachsen von Hybridoma-Zellen sichtbar wird, werden die überstehenden Flüssigkeiten durch eine kombinierte Immunopräzipitations-Bioanalyse (Beispiel 19) gescreent. Von den insgesamt 221 Hybridomas wurde bei 10 Hybridomas festgestellt, daß sie Anti-IFNd-Antikörper erzeugen. Die Hybridoma-Zellen werden durch Begrenzungsverdünnung mindestens einmal in Mikrotiterplatten geclont. Hybridoma 144 BS wird für weitere Untersuchungen ausgewählt, weil es besonders beständig ist und große Mengen von Immunoglobulin ausscheidet.

Beispiel 17: Isolierung und Reinigung von monoclonalem Antikörper

8 bis 10 Wochen alte Balb/c-Mäuse (Tierfarm, Sisseln, Schweiz) werden intraperitoneal mit 0,3 ml Pristan (Aldrich) vorbehandelt.

Nach 2 bis 3 Wochen werden 2 bis 5 x 10⁶ geclonte Hybridoma-Zellen und 0,2 ml Pristan intraperitoneal eingeimpft. Nach 8 bis 10 Tagen wird Ascitesflüssigkeit gesammelt, mit 800 χ g zentrifugiert und bei -20°C aufbewahrt.

Aufgetaute Ascitesflüssigkeit wird 60 min lang mit 50000 x.g zentrifugiert. Eine auf der Oberfläche schwimmende Fettschicht wird sorgfältig entfernt, und die Proteinkonzentration wird auf eine Konzentration von 10 bis 12 mg/ml eingestellt. Rohes Immunoglobulin wird durch tropfenweise Zugabe von 0,9-Volumen-Äquivalenten von gesättigtem Ammoniumsulfat bei 0⁰C ausgefällt, danach in 20 mM Tris-HCI/50 mM NaCI (pH 7,9) gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Es wird eine Immunoglobulinfraktion durch DEAE-D52 Cellulose-(Whatman)-Chromatographie unter Anwendung eines Puffer-Gradienten-Systems von 20 mM Tris-HCI/25-400 mM NaCl, pH 7,9, gewonnen. Das Immunoglobulin wird abermals mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in PBS in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) demonstriert einen Reinheitsgrad von mehr als 95 Prozent bei den monoclonalen Antikörpern 144 BS.

Beispiel 18: Bestimmung der Klasse und Unterklasse von monoclonalen Antikörpern Die Klasse und Unterklasse von durch geclonte Hybridoma-Zellen erzeugten monoclonalen Antikörpern wird durch die bekannte Agar-Gel-Immunodiffusionstechnik von Ouchterlony unter Verwendung von klassen- und unterklassen-spezifischen Kaninchen-Antikörpern (Bionetics) bestimmt. Die Ergebnisse werden durch eine Enzym-Immunoanalyse (ELISA) in folgender Weise bestätigt: Mikrotiterplatten werden mit 1 μg eines Kaninchen-Immunoglobulin-Präparates eines klassen- oder unterklassen-spezifischen Serums (Bionetics) in 50 μΙ PBS pro Vertiefung beschichtet.

Die freie Bindungskapazität der Platte wird mit einem Puffer von 1 % Rinderserumalbumin in PBS mit einem Gehalt von 0,2% NaN₃ (M/V), pH 7,4, gesättigt. ΙΟΟ-μΙ-Sonden, die monoclonale Antikörper enthalten, werden 1 h lang bei 37⁰C in den Vertiefungen inkubiert. Die Platten werden mit PBS gewaschen, anschließend 1 h lang bei 37⁰C mit einem phosphatase-konjugierten Kaninchen-Immunoglobulinpräparat mit der gleichen wie für das Beschichten der Platten angewandten Spezifität inkubiert. Das fixierte Enzym wird durch Inkubation (37⁰C, 30 min) mit einer Lösung des Enzymsubstrats p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml in Diethanolamin-Puffer 10%, der 0,5 mW! MgCI₂ und 0,02% (M/V) NaN₃, pH 9,8 enthält) und Messen der optischen Dichte bei 405 nm entwickelt. Die monoclonalen Antikörper 144 BS gehören zu der Klasse IgG₁ K (Kappa).

Beispiel 19: Kombinierte Immunopräzipitations-Bioanalyse

50 μΙ rohe natürliche Human-Leukozyten-IFN- oder Rekombinant-IFN-a-Polypeptide (Beispiel 20a) (10⁴ IU/ml) werden mit gleichen Mengen von Testlösung vermischt, z. B. den überstehenden Nährflüssigkeiten von Hybridomas-,.oder PBS-Lösungen von gereinigten monocionalen Antikörpern, und 2 Stunden lang bei 37°C in Mikroröhrchen (Eppendorf 3810) inkubiert. Anschließend werden 50 μΙ des zuvor titrierten Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Antikörpers (Nordic) zugegeben, und das Gemisch wird 1 Stunde lang bei 37°C und danach 16 Stunden lang bei 4⁰C inkubiert, wodurch freie und IFN-gebundene monoclonale Antikörper immune Komplexe bilden. Die Röhrchen werden mit12000 U/min bei 4°C 5 min lang zentrifugiert. Das immune Präzipitat wird einmal mit 1 ml kalter gepufferter Salzlösung (pH 7,2) gewaschen, danach in 200 μΙ gepufferter Salzlösung, pH 2,2, gelöst. Die dadurch freigesetzte IFN-Aktivität wird in einer Standard-Bioanalyse nach J. A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 723 (1971) bestimmt. Die Inhibition der cytopathischen Wirkung von Mengo-Virus (400 Plaque bildende Einheiten je Vertiefung) wird unter Verwendung von Hep-2-Zellen (3 x 10⁴ Zellen je Vertiefung) in Mikrotiterplatten ermittelt.

Beispiel 20: Bestimmung von Interferon-Spezifität .

a) Quelle von Rekombinant-IFNa-Polypeptiden: LylFN-a-1, LylFN-a-2und LylFN-a-3 Polypeptide, die mit IFN-a-F, IFN-a-B bzw. lFN-a-D in Beziehung stehen, werden in der EU-PA Nr. 76489 beschrieben. IFN-a-A und IFNo-J werden von Dr. J. Davies (Biogen, Genf) und von Prof. C. Weissmann (Universität Zürich, Schweiz), IFN-cc-C von dem Weissmann Institut der Wissenschaften, Abteilung Virologie, Rehovot, Israel, bezogen.

b) Quelle monoclonaler zum Vergleich verwendeter Antikörper für IFN

Monoclonale Antikörper 1K2 und 2K2 werden nach der Beschreibung in der GB-PS 2 108 510 hergestellt. MAb NK2 und YOK werden von Celltech (Berkshire), IY-1 und IY-2 von Inter-Yeda (Israel), S-1, S-2, S-3 und S-4von Dr. C. Favre, UNICET, Dardilly (Frankreich) und MAb I/24 von M. Aguet, Universität Zürich (Schweiz) bezogen.

c) Die Bestimmung der Reaktionsfähigkeit von verschiedenen monoclonalen Antikörpern für die IFN-a-Unterarten wird mit Hilfe der kombinierten Immunopräzipitations-Bioanalyse von Beispiel 19 und der von D. S. Secher, Nature 290, 501 (1981) beschriebenen Tandem-Radioimmunoanalyse vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Die monoclonalen Antikörper 144 BS, 1K2 und 2K2 reagieren nicht mit Human-IFNß (Rentschier, Laupheim, Westdeutschland) oder Human IFN γ (Bio Science Emmenbrücke, Schweiz).

Tabelle 4: Immunopräzipitation durch MAb's von Rekombinant IFN-a-Unterarten

Monoclonale IFN-a-Unterarten

Antikörper A a-2 C a-3 a-1

1K2 + ++ '-

100% Bindung + + + 75% Bindung

50% Bindung + 25% Bindung

+ 10% Bindung — 0% Bindung

Blindprobe: Bindung wurde nicht bestimmt (annähernde Werte)

Die Ergebnisse von Tabelle 4 zeigen, daß der monoclonale Antikörper 144 BS ein einzigartiges Bindungsmuster aufweist.

Bemerkenswert sind vor allem die geringe Bindung an IFN-a-A und die wirksame Bindung an IFN-a-2, IFN-a-3 und IFN-a-1-Polypeptide.

Außerdem ermöglichen die Ergebnisse von Tabelle 4 die Epitop-Analyse, die schematisch in Tabelle 5 dargestellt wird.

Tabelle 5: Epitop-Analyse von Rekombinant IFN-ct-Unterarten

Rekombinant Epitop, erkannt durch monocionalen Antikörper

IFN-a-Unterart 144Bs" 1K2 NK2,S-3 YOK S-1 S-2 S-4,

2K2 IY-I, 1/24 IY-2

AV VV VV V Y Y VV Λ ΛΛ ' '" ' ' """ '"'ΛΛ /\ Λ /\ /\y\

_a_2 xx XX χ

_a_3 xx xx XX

et-1 X X X

Aus der Analyse in Tabelle 5 ergibt sich die Tatsache, daß die Epitop-Kombination von jeder IFN-a-Unterart einzigartig ist. Außerdem gestattet die Analyse die Voraussage geeigneter Paare von monocionalen Antikörpern zur Bestimmung spezifischer Unterarten von IFN α mit der Ausschließung anderer Unterarten in einer Tandem-Immunoanalyse. Zum Beispiel wird die Kombination des monocionalen Antikörpers 144 BS mit einem der MAb's NK2, S-3, IY-1 oder I/24 nützlich für den Nachweis von IFN'-a-B ohne Interferenz durch IFN-a-D sein, und die Kombination des MAb 144BS mit MAb YOK für den Nachweis von IFN-a-D in Gegenwart von IFN-a-B.

Beispiel 21: Herstellung einer Immunoadsorbenssäule

Ein ml abgesetztes Äffi-Gel® 10 (Bio-Rad) wird nach den Anweisungen des Herstellers mit 17 mg monoclonalem Antikörper 144BS gekoppelt: Äff i-Gel® wird auf einem Sinterglasfilter zuerst mit kaltem destilliertem Wasser und danach mit einer 0,1 M NaHCO₃-Lösung,pH-8,0 (Kopplungspuffer) gewaschen. Eine Suspension von 50% Gel in Kopplungspuffer wird in ein Plasteröhrchen übertragen, mit einem gleichen Volumen gereinigter Lösung von monoclonalem Antikörper vermischt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gedreht. Nach der Kopplung wird das Gel mit Kopplungspuffer gewaschen und zur Blockierung nicht-umgesetzter Stellen mit 0,1 ml 1 M Ethariolamin-HCI (pH 8,0) 1 bis 2 Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt. Das Gel wird mit PBS in Gegenwart von 1OmM NaN₃ gewaschen und darin bei 4°C aufbewahrt.

Beispiel 22: Reinigung von Rekombinant-IFNa durch Immunoaffinitäts-Chromatographie Eine Suspension von Rekombinant IFNa erzeugenden zerbrochenen E. coli Zellen, z.B. E. coil HB101/pAM94 (siehe Beispiel 15) wird durch 20min Zentrifugieren in einem Sorvall-Rotor 6SA mit 12000U/min bei 4⁰C geklärt. Polyethylenimin (Polyimin P®, Fluka,pH8,0) wird der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt, bis eine endgültige Konzentration von 0,25% (M/V) erreicht ist. Die Lösung wird 1 h lang gerührt und anschließend zentrifugiert. Das Pellet wird verworfen, und die überstehende Flüssigkeit wird mit festem Ammoniumsulfat bis auf 65% Sättigung gebracht. Diese Mischung wird 1 h lang gerührt und anschließend zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Pellet in einem zehntel Volumen (15 bis 20ml) von PBS (pH7,2) suspendiert. Die Lösung wird über Nacht gegen 0,02% NaN₃ enthaltende PBS dialysiert.

Die dialysierte Lösung wird mit 1 ml des Immunoaffinitätsgels von Beispiel 21 vermischt. Dieses Gemisch wird 1 Stunde lang vorsichtig bewegt, dann in eine Säule gefüllt und nacheinander mit 5 Säulenvolumen PBS, 5 Säulenvolumen 0,5M NaCI und 0,2% Triton X-100® enthaltender PBS und 5 Säulenvolumen PBS gewaschen. Alternativ wird das Immunoaffinitätsgel zuerst in die Säule gefüllt und die dialysierte Lösung oben aufgegeben, dann wie beschrieben gewaschen. Die Rekombinant-Hybrid-IFNα (,,B₁D₂D₃D₄") wird mit einem sauren Puffer, pH 2,5, eluiert, der 0,1 M Zitronensäure und 0,3 M NaCI enthält. Die aktiven IFN-Fraktionen werden mit 1 M Tris neutralisiert, gegen PBS dialysiert und auf etwa 0,1 mg/ml Protein unter Verwendung von Ultrafiltrations-Flachbettmembranen XM 10 (Amicon Corp.) konzentriert.

Das maximale Kapazitätsvermögen der Immunoaffinitätssäule von Beispiel 21, die 17mg monocionalen Antikörper 144BS enthält, beträgt etwa 1,2mg von je IFN-a-2 und IFN-a-3-Polypeptiden, mindestens 0,8mg von Polypeptid Typ lFN-a-1,1,15mg Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃D₄", 1,25mg Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃B₄", 1,25mg Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄", 0,44mg Hybridinterferon ,,B₁B₂B₃D₄" 1,6mg Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃D₄", 1,6mg Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃B₄", 1,15mg Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃D₄" und 1,25mg Hybrid-Interferon ,,D₁D₂B₃B₄". Das Immunoadsorbensgel kann für bis zu 50 Trennungen ohne wesentlichen Verlust an Kapazität verwendet werden. Rekombinant-Polypeptide vom Typ IFN-a-2, IFN-a-3, IFN-a-1 und durch diese Methode gereinigte Hybrid-Interferone sind bei der SDS-PAGE homogen.

Beispiel 23: Immunodot-Analyse

Die Immunodot-Analyse wird nach R. Hawkes, u. a., Anal. Biochem. 119, 142 (1982) ausgeführt. Natürliche oder Rekombinant-Interferone enthaltende Sonden werden in verschiedenen Konzentrationen auf Nitrocellulose-Blätter aufgetüpfelt. Die Tupfen werden luftgetrocknet, und die zurückbleibende Bindungskapazität der Nitrocellulose wird durch Inkubation in einem Tris-Puffer (0,15 M NaCI, 0,01 Tris-HCI, pH 7,6), der 10% Pferdeserum enthält, blockiert. Die Nitrocellulosestreifen werden danach mit einer Lösung von monoclonalem Antikörper 144 BS (23 ,ug/ml) inkubiert, und ähnlich hergestellte Streifen werden entweder mit einer Lösung von monoclonalem Antikörper 2K2 (30 μg/ml) zum Vergleich, einer Lösung eines normalen Mäuse-Immunoglobulins (Verdünnung 1:100) als negative Kontrolle, oder einer Lösung eines polyclonalen Anti-Human-lnterfereon-a-Mäuseserums (Enzo, Verdünnung 1:1 000) als positive Kontrolle inkubiert. Nach dem Waschen werden alle Streifen mit ,Kaninchen-Anti-Mäuse-Immunoglobulin, das mit Peroxidase (Nordic, Verdünnung 1:400) markiert ist, behandelt und der gebundene zweite Antikörper wird mit einem Peroxidasesubstrat, 4-Chlor-1 -naphthol entwickelt.

Der monoclonale Antikörper färbt Polypeptide vom Typ IFN-a-D (wie IFN-a-3) in Konzentrationen von nur 0,4 ng je Tupfen und Polypeptide vom Typ IFN-a-B (wie IFN-a-2) bei 10 ng Tupfen, während MAb 2K2 nur Polypeptide vom Typ IFN-a-D erkennt (4 ng je Tupfen).

Beispiel 24: Kügelohen-Radioimmuno-Tandem-Analyse

a) Radiomarkierung von monocionalem Antikörper 144 BS mit ¹²⁵J: 0,1 mg monoclonaler Antikörper 144 BS wird mit ¹²⁵J Natriumiodid (1 mC) und Chloramin T nach einer Standardmethode von F. C. Greenwood, u. a., Biochem. J. 89,114 (1963) jodiert. Das Reaktionsprodukt wird mit einer lonenaustauschsäule Bio-Rad® AG 1 x 8 gereinigt und die Aktivität auf 4 x 10⁵ cpm/ml durch Verdünnung mit PBS standardisiert.

Die Jodinierung von monocionalem Antikörper 2K2 wird ebenso vorgenommen. Monoclonal Antikörper YOK und NK2 stehen im Handel in radiomarkierter Form von Celltech zur Verfugung.

b) Kopplung von monocionalem Antikörper 144 BS an Makrokügelchen

Polystyrolkügelchen (Durchmesser 6,3 mm, Spherotech AG, Zürich) werden 16 Stunden lang bei 4⁰C durch sanftes Schaukeln in einer Lösung von 1 mg/ml MAb 144 BS in einem Kopplungspuffer von PBS, der 5 mM EDTA und 0,1 % NaN₃ (pH 8) enthält, in einem Verhältnis von 20 Kügelchen je 10 ml Lösung inkubiert. Die beschichteten Kügelchen werden anschließend in einen Blockierungspuffer von PBS übertragen, der 10% Pferdeserum und 0,1 % NaN₃ enthält, und darin bei 4°C bis zum Gebrauch, mindestens 24 Stunden lang, gehalten

Die Kopplung der anderen MAb wird in gleicher Weise vorgenommen.

c) Anaiyseverfahren: Plasteröhrchen (Falcon, 5 ml) werden über Nacht mit 0,5 ml Blockierungspuffer von PBS, der 10% Pferdeserum und 0,1 % NaN₃ enthält, beschichtet. Der Puffer wird durch Aspiration entfernt, und 0,2 ml einer IFN-enthaltenden Testoder Standardlösung in Blockierungspuffer werden direkt unten in das Röhrchen gegeben. Ein MAb-gekoppeltes und blockiertes Kügelchen von Beispiel 24b wird kurz auf einem sauberen Tuch getrocknet vorsichtig ohne Schaumbildung in das die IFN-Lösung enthaltende Röhrchen übertragen. Das Kügelchen wird 4 bis 6 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubiert. Die IFN-Lösung wird durch Aspiration entfernt, und jedes Kügelchen wird dreimal mit 2 ml Blockierungspuffer gewaschen. Das Kügelchen wird danach in 0,2 ml eines zweiten ¹²⁵J-markierten Antikörpers (Beispiel 24a) entsprechend bis 80 x 10³ cpm 16 Stunden lang bei 4⁰C inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und in ein neues Röhrchen zur Zählung übertragen.

Tabelle 6 enthält die Ergebnisse für Standardlösungen von IFN-a-3 und IFN-a-2 Polypeptiden, die mit verschiedenen Kombinationen von Festphasen-(kügelchen-gekoppelten) erstem Antikörper und ^12S-markiertem zweiten Antikörper erzielt wurden.

Tabelle 6: Selektion einer geeigneten Kombination von monoclonalen Antikörper für IFN-a-2 und IFN-a-3 Polypeptidanalyse

Festphasen-	radiomarkierter	cpm je 103	IU/ml gefunden
Antikörper	zweiter Antikör	IFN-a-3	IFN-a-2
	per
144BS	2K2	113	105
144BS	144BS	103	58
144BS	YOK	16 793	313
144BS	NK2	78	3 733 .
2K2	144BS	52	2
polyclonal	144BS	1 572	546

Polyclonal: Kügelchen-gekoppelter polyclonaler Schaf-Anti-IFN-a-Antikörper, bezogen von Celltech.

Die besten Ergebnisse werden mit einer Kombination von MAb 144 BS mit MAb YOK für den Nachweis von IFN-a-3 und mit der Kombination von MAb 144 BS mit MAb NK2 für den Nachweis von IFN-a-2 erzielt.

Figur 4 zeigt das Ergebnis quantitativer Titrationsexperimente mit der Kombination von MAb 144 BS, gekoppelt an, die feste Phase und MAb NK2 in radiomarkierter Form. Die Analyse führt zu linearen Ergebnissen von 1 bis 5000 IU/ml (2 pg/ml bis 10 ng/ml) von Polypeptiden des IFN-a-B-Typs. Differenzen in den Titrationskurven von IFN-a-2 und Polypeptid vom „Standard B"-Typ (von Celltech) sind auf Abweichungen bei den Messungen der beiden IFN-Präparate bei der Bioanalyse zurückzuführen.

Ähnliche Ergebnisse werden bei quantitativen Experimenten zur Messung von Polypeptiden des IFN-a-D-Typs mit der Kombination von MAb 144 BS, gekoppelt an die feste Phase und MAb YOK in radiomarkierter Form erzielt. Durch die Analyse wird bis zu 1 IU/ml (2 pg/ml) Polypeptide vom IFN-a-D-Typ zuverlässug nachgewiesen. Die Kombination von an die feste Phase gekoppeltem MAb 144 BS und MAb NK2 kann gleichfalls für die Bestimmung von Polypeptiden vom Typ IFN-a-F benutzt werden.

d) Abgekürztes Analyseverfahren (gleichzeitige Analyse):

Unter Anwendung des in Beispiel 24c) beschriebenen allgemeinen Verfahrens wird das' MAb-gekoppelte Kügelchen 3 Stunden lang bei Raumtemperatur mit der Testlösung (0,1 ml) und dem radiomarkierten zweiten Antikörper (0,1 ml) zusammen inkubiert, wodurch die dazwischenliegenden Waschvorgänge wegfallen.

Figur 5 zeigt, daß die abgekürzte gleichzeitige Analyse zuverlässig für das schnelle Screenen von Polypeptidproben vom Typ IFN-a-B (wie IFN-a-2), die 150 IU/ml oder mehr enthalten, angewandt werden kann, allerdings ist sie erheblich weniger sensitiv als die Analyse von Beispiel 24c).

bg = Hintergrund

e) Testausrüstung für Kügelchen-Radio-Immuno-Tandem-Analyse:

Eine Testausrüstung für die in Beispiel 24c) beschriebene Analyse enthält: Plasteröhrchen, Falcon 5 ml

Polystyrol-Kügelchen, 6,3 mm, beschichtet mit monoclonalem Antikörper 144 BS in PBS, die 10% Pferdeserum und 0,1 % NaN₃ enthält

²⁵J markierten monoclonalen Antikörper YOK mit einer spezifischen Aktivität von 4 x 10⁵ cpm/ml ¹²⁵J markierten monoclonalen Antikörper NK2 mit einer spezifischen Aktivität von 4 x 10⁵ cpm/ml Standardlösung IFN-a-1, die 10⁴ IU/ml enthält Standardlösung IFN-a-2, die 10* IU/ml enthält Standardlösung IFN-a-3, die 10⁴ IU/ml enthält ' PBS, die 10% Pferdeserum und 0,1 % NaN₃ enthält

Beispiel 25: Enzym-Immunoanalyse-(EUSA)

a) Markierung von monoclonalem Antikörper 144 BS mit alkalischer Phosphatase:

1,4 mg MAb 144 BS in 1,4 ml PBS werden 2 Stunden lang mit einer 5 mg alkalischen Phosphatase enthaltenden Lösung (SIGMA P6774, Typ VII-T) nach dem Standardverfahren von Voller, u. a., Bull. World Health Organ. 53, 55 (1976) unter Verwendung von Glutaraldehyd (0,2% V/V) gekoppelt. Das Konjugat wird in 5 ml Tris-Puffer 0,05 M, pH 8,0, übertragen, der 1 mMol MgCI₂, 1 % BSA und 0,02% NaN₃ enthält. Die Lösung wird im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt.

b) Analyseverfahren: Polypropylen-Mikrotiterplatten (Dynatech Labs. Inc.) werden in einem Zeitraum von 2 Stunden bei 37°C und über Nacht bei 4°C mit 150 μΙ einer Lösung des monoclonalen Antikörpers NK2 (Celltech, 10 Mg/ml) in einem Puffer, pH 8,6, (carbonatgepufferte 0,9%ige Salzlösung, die 0,02% Natriumazid enthält) beschichtet. Die Platten werden fünfmal mit PBS gewaschen, und noch vorhandene protein-reaktionsfähige'n Stellen werden durch einstündige Inkubation bei 37°C mit 250 μΙ eines Puffers, pH 7,4 (0,2% Gelatine und 0,2% NaN₃ in PBS) gesättigt. Die in dieser Weise beschichteten Platten können bei 4°C einige Tage lang in diesem Puffer aufbewahrt werden.

50 μΙ einer Verdünnungsreihe einer Testlösung oder einer Standardlösung, die IFN-ct-Unterarten enthält, 50 μΙ Puffer, pH 7,4, und 50 μΙ einer Lösung des phosphatase-markierten Antikörpers 144 BS (Beispiel 25a), die 1:100 mit Puffer pH 7,4 verdünnt wurde, werden vermischt und in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten 2 Stunden lang bei 37⁰C und 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Platten werden fünfmal mit PBS gewaschen, danach 30 Minuten lang bei 37°C mit 150 μΙ einer Lösung von p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml in 10%igem Diethanolaminpuffer, 0,5 mM MgCI₂, pH 9,8) inkubiert. Durch Messen der optischen Dichte bei 405 nm wird die Menge des freigesetzten p-Nitrophenols bestimmt, die der Menge der gebundenen Enzymphosphatase proportional ist und somit der Menge der IFN-a-Unterart in der Testlösung proportional ist.

Diese Analyse kann zur Bestimmung der Menge von Polypeptiden vom Typ IFN-a-B (wie IFN-a-2) oder IFN-o-F angewandt werden. Zur Bestimmung von Polypeptiden des Typs IFN-cc-D (wie IFN-a-3) wird die Mikrotiterplatte mit dem monoclonalen Antikörper YOK (Celltech) anstelle von NK2 beschichtet. Ähnliche Ergebnisse können erzielt werden, wenn die Mikrotiterplatten mit MAb 144 BS beschichtet und die phosphatase-gekoppelten MAb NK2 bzw. YOK als zweite Antikörper verwendet werden.

c) Testausrüstung für ELISA: Eine Testausrüstung für die in Beispiel 25b) beschriebene Analyse enthält: Polypropylen-Mikrotiterplatten,

20 ml monoclonalen Antikörper NK2 (10 μg/ml) in carbonatgepufferter Salzlösung (0,9% NaCI, 0,42% NaHCO₃, 0,0072% Na₂CO₃, 0,02% NaN₃)

1 ml alkalischen phosphatase-gekoppelten MAb 144 BS (Beispiel 10,1, 0,3 mg Antikörper je ml) in Tris-Puffer (0,05 M, 1 mM

MgCI₂, 1 % BSA, 0,02% NaN₃, pH 8,0)

2 ml Standardlösung IFN-a-1, die 10⁴ IU/ml enthält 2 ml Standardlösung IFN-a-2, die 10"IU/ml enthält 2 ml Standardlösung IFN-a-3, die 10" IU/ml enthält

300 ml PBS

300 ml Puffer pH 7,4 (0,2 Gelatine und 0,2% NaN₃ in PBS) 50 ml p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml) in Diethanolaminpuffer (10%, 0,5 mM MgCI₂, 0,02% NaN₃, eingestellt mit HCI auf einen

pH-Wert von 8,9) Eichkurve Farbintensitätsskala.

Beispiel 26: Reinigung von Hybrid-Interferonen unter Anwendung von Präzipitations- und Chromatographieverfahren

1 I Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" enthaltende, durch Zentrifugieren gereinigte Lösung (siehe Beispiel 13 bis 15) wird unter Anwendung von

2 M HCI angesäuert, bis die Lösungen einen pH-Wert von 2,2 erreicht. Die Lösung wird 1 h lang bei 4°C gerührt und das ausgefällte Protein wird durch Zentrifugation (GSA Sorvall-Rotor mit 12000 U/min, 20 min lang bei 4⁰C) abgetrennt. Das Pellet wird verworfen, und die überstehende Flüssigkeit wird mit festem Ammoniumsulfat auf 30% Sättigung gebracht. Diese Lösung wird 1 h lang bei 4⁰C gerührt und anschließend zentrifugiert. Die das Interferon enthaltende überstehende Flüssigkeit wird danach gegen 0,1 M NH₁HCO₃ bei einem pH von 8,2 dialysiert. Es wird eine Interferon-Aktivität von etwa 10⁸ IU/ml gefunden.

Eine Säule, die 50 ml gelierende Sepharose 6B (Pharmacia) mit einem Zusatz von Cu²⁺ Ionen nach den Anweisungen des Herstellers enthält, wird unter Anwendung von 250 ml 0,05 M Natriumacetat, pH 7,0, und 0,5 M NaCI äquilibriert. 200 ml dialysierte Lösung (siehe oben) werden bei 4°C der Säule zugegeben. Die Säule wird mit 150 ml Äqulibrierungspuffer gewaschen. Die Eluierung von gebundenem Interferon wird unter Anwendung eines linearen Gradienten von

250 ml 0,05 M Natriumacetat, pH 7,0, und 0,5 M NaCI

250 ml 0,05 M Natriumacetat, pH 2,8, und 0,5 M NaCI

und anschließend durch eine Wäsche von 150 ml 0,05 M Natriumacetat, pH 2,8, und 0,5 M NaCI vorgenommen.

Die aktiven Interferonfraktionen werden zusammengenommen und gegen 0,05 M Tris-HCI-Puffer, pH 8,0, dialysiert. Die Interferon-Aktivität in der dialysierten Lösung beträgt annähernd 10⁸ IU/ml. Die maximale Kapazität der Säule beträgt etwa 75 mg Interferon ,,B₁D₂D₃D₄".

Eine Säule, die 50 ml Ionenaustauscher Q-Sepharose (Pharmacia) enthält, wird unter Anwendung von 250 ml 0,05 M Tris-HCI-Puffer, pH 8,0, äquilibriert. 100 ml der obigen dialysierten, Interferon enthaltenden Lösung werden bei Raumtemperatur auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird anschließend mit 50 ml Äqilibrierungspuffer gewaschen. Gebundenes Interferon wird unter Anwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 0,7 M NaCI in 200 ml Tris-HCI, pH 8,0, eluiert.

Das reine Interferon eluiert bei etwa 0,3 M NaCI. Die aktiven Fraktionen zeigen eine einzige Bande mit einer offensichtlichen relativen Molekülmasse von 19000 bei der Analyse auf SDS-Polyacrylamidgelen. Die maximale Kapazität der Anionenaustauschsäule beträgt etwa 50 mg Hybrid-Interferon ,,BiD₂D₃D₄".

In einer analogen Weise können die Hybrid-Interferone ,,BiD₂B₃B₄", „B,D₂B₃D₄", „B,D₂D₃B₄", ,,B₁B₂B₃D₄" und ,,B₁B₂D₃B₄" gereinigt werden.

Beispiel 27: Lyophilisierung von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" Interfero ,,BiD₂D₃D₄", das mit Hilfe entweder der Immunoaffinitäts-Chromatographie unter Anwendung von monoclonalem Antikörper 144 BS oder mit Hilfe herkömmlicher Chromatrographieverfahren (siehe Beispiel 26) gereinigt wurde, wird gegen 0,5 M NH₄HCO₃ dialysiert und anschließend lyophilisiert. Geringe Wasservolumen werden zweimal der lyophilisierten Probe zur vollständigen Entfernung von NH₄HCO₃ zugesetzt. Die Lösung wird danach erneut lyophilisiert. Die Rekonstitution der Interferon „BiD₂D₃D₄"-Lösung wird wife folgt vorgenommen: 0,5 M NH₄HCO₃, pH 8,2 wird der lyophilisierten Probe zur Erlangung einer Interferon-Konzentration von etwa 0,1 mg/ml zugesetzt. Das wieder gelöste Interferon hat eine spezifische Antivirus-Aktivität von 2 χ 10⁸ IU/mg, wobei diese Aktivität mit dem entsprechenden Wert vor der. Lyophilisierung identisch ist.

Beispiel 28: Physikalisch-chemische Charakterisierung von Hybrid-Interferonen Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone und die parentalen Interferone werden der Polyacrylamid-SDS-Gel-Elektrophorese nach der von Laemmli (Nature 227, 680 [1970]) beschriebenen Methode unterzogen. Die offensichtlichen relativen Molekülmassen der Hybrid-Interferone, angegeben in Kilo-Dalton (kD) sind in Tabelle 7 zusammengestellt. Tabelle 7 enthält auch die isoelektrischen Punkte (pl) der Hybrid-Interferone, wie sie unter Anwendung von Ampholine® enthaltenden LKB Polyacrylamidgelen bestimmt wurden.

Tabelle 7: Offensichtliche relative Molekülmasse und isoelektrische Punkte von Hybrid-Interferonen

α-2	27 000
α-3	20 000
BiB2D3D4	27 000
D1D2B3B4	20 000
B1B2B3D4	27 000
B,B2D3B4	26 000
B1D2D3D4	19 000
B1D2B3D4	20 000
BiD2D3B4	20 000
B1D2B3B4	20 000

IFN offens. relative Molekülmasse pl

5,2

5,2

5-6 (gestreut)

5,0

5,2

5-6 (gestreut)

5,4

5,6

5,5

5,4

Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone wird unter Anwendung eines 470 A Protein-Sequenzers von Applied Biosystems oder unter Anwendung eines 890 C Beckman-Sequenzers bestimmt. In beiden Fällen wird automatisierte Edman-Degradation vorgenommen. Die gefundene Struktur stimmt vollkommen mit der angenommenen überein. Bei der N-terminalen Aminosäure handelt es sich um Cystein.

Beispiel 29: Einfluß von Hybrid-Interferonen auf den Grad der (2'-5') Oligoisoadenylat-Synthetase-Aktivität von Daudi-Zellen Daudi-Zellen werden mit 2 x 10⁵ Zellen/ml in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kalbsserum, das die angegebenen Konzentrationen (siehe Tabelle 8) der Hybrid-Interferone ,,B₁B₂B₃D₄", ,,B₁D₂B₃B₄", ,,BiD₂D₃D₄" und ,,B₁B₂D₃B₄" enthält, gezüchtet. Nach einer Behandlungszeit von 24 Stunden werden 5 x 10⁶ Zellen je Probe zentrifugiert (9 000 U/min) und erneut in 500 μΙ kaltem Lysispuffer (20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure-Puffer, pH 7,5, 5 mM MgCI₂, 120 mM KCI, 7 mM Dithiothreitol, 10% Glycerol, 0,5% Nonidet P40) gelöst und 2 min lang auf Eis inkubiert. Die Proben werden danach zentrifugiert (9000 U/min, 8 min, 4°C), und die überstehende Flüssigkeit wird gewonnen und wie folgt in bezug auf (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase-Aktivität analysiert:

Die überstehende Flüssigkeit wird mit 50 μΙ Poly(rl).(rC)-Agarose (P.-L. Biochemicals) 15 min lang bei 30°C vermischt, und das nicht-adsorbierte Material wird durch Zentrifugieren entfernt. Das Poly(rl).(rC)-adsorbierte Material wird mit 2,5 mM ((X³²P) ATP, 400 Ci/mMol (Amersham International) 20 h lang bei 3O⁰C inkubiert, mit bakterieller alkalischer Phosphatase (Sigma) behandelt und anschließend aus einer Säule von saurem Aluminiumoxid (Sigma) (300 μΙ) mit 3,0 ml 1 M Glycin-HCI-Puffer, pH 2,0, nach der Beschreibung (Merlin, u. a., Analyt. Biochem. 110, 190 [1981]) eluiert. Die Ergebnisse in Tabelle 8 sind als ...-fache Erhöhung der (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase-Aktivität in mit Interferon behandelten Zellen im Verhältnis zum Grad der Enzym aktivität von unbehandelten Kontrollzellen angegeben (durchschnittliche Aktivität 51,6 ± 8,7 pMol/h/10⁵ Zellen).

Tabelle 8

...-fache Erhöhung der (2'-5') (A)

Synthetase-Aktivität

[pMol ATP zugesetzt/h/10⁵ Zellen]

IFN Konzentration	1	10	100	1 000
[Einheiten/ml]
IFN a-2(„B")	3,6	4,0	5,7	5,6
α-3 („D")	2,2	3,2	3,2	3,9
,,B1B2D3D4"	3,4	3,2	4,6	4,0
,,D1D2B3B4"	2,6	2,1	4,8	4,3
,,B1B2B3D4"	9,4	8,4	10,0	8,5
,,B1D2B3B4"	5,6	5,7	7,8	11,4
,,B1D2D3D4"	5,8	8,9	12,1	17,5
,,B1B2D3B4"	5,6	7,0	9,1	9,6

Beispiel 30: Pharmazeutisches Präparat (parenteraie Verabreichung)

2 mg Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄" mit einer spezifischen Aktivität von 1,3 x 10⁸ Einheiten/mg bei Human WlSH-Zellen werden in 30 ml 5 N Human-Serum-Albumin gelöst. Die resultierende Lösung wird durch ein bakteriendichtes Filter geleitet, und die filtrierte Lösung wird unter aseptischen Bedingungen in 100 Fläschchen verteilt, von denen jedes 2,6 x 10⁶ Einheiten reines Hybrid-Interferon enthält. Die für die parenteraie Verabreichung geeigneten Fläschchen werden vorzugsweise im Kalten, zum Beispiel bei -20°C, aufbewahrt.

In dergleichen Weise können 5,2 χ 10⁶ oder 1,04 x 10⁷ Einheiten enthaltende Fläschchen durch Anwendung von 4 bzw. 8 mg Hybrid-Interferon hergestellt werden.

Jn einer analogen Weise können Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃B₄", ,,B₁B₂D₃B₄", ,,B₁D₂B₃D₄", ,,B₁D₂D₃B₄" oder ,,B₁B₂B₃D₄" (spezifische Aktivitäten 1,28 x 10⁸, 2 x 10⁸, 7,7 x 10⁷, 3,8 χ 10⁷ bzw. 8 x 10⁷) enthaltende Fläschchen zubereitet werden.

Zeichnungen:

Fig. 1 Vergleich der Aminosäure-Sequenzen von LylFN-a-2 und LylFN-a-3

I

ASP

LEU

PRO

GLN

THR

HIS

SER

LEU

GLY

ASN

ARG

ARG

ALA

LEU

16

a-2

CYS

GLU

ASP

ILE

a-3

MET

LEU

ALA

GLN

MET

ARG

ARG

ILE

SER

PRO

PHE

SER

CYS

LEU

LYS

32

a-2

LEU

SER

SER

Met

ASP

a-3

HIS

ASP

PHE

GLU

PHE

PRO

GLN

GLU

GLU

PHE

ASP

ASP

LYS

GLN

48

a-2

ARG

GLY

GLY

ASN

PHE

a-3

60

LYS

ALA

GLN

ALA

ILE

SER

VAL

LEU

HIS

GLU

MET

ILE

GLN

GLN

64

a-2

GLN

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LEU

THR ' · I

a-3

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LEU

PHE

SER

THR

LYS

ASP

SER

SER

ALA

ALA

LEU

ASP

GLU

80" :

a-2

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THR

TRP

THR .

a-3

92

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LEU

ASP

GLU

PHE

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ILE

GLU

LEU

ASP

GLN

GLN

LEU

ASN

ASP

96 : I !

a-2

LEU

LYS

CYS

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LEU ! I j

a-3

SER

CYS

VAL

MET

GLN

GLU

VAL

GLY

VAL

ILE

GLU

SER

PRO

LEU

112

a-2

GLU

ALA

GLU

ARG

GLY

THR

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a-3

GLU

ASP

SER

ILE

LEU

ALA

VAL

ARG

LYS

TYR

PHE

GLN

ARG

ILE

128

a-2'

TYR

ALA

LYS

ARG

THR

a-3

ANS

TYR

LEU

THR

GLU

LYS

LYS

TYR

SER

SER

CYS

ALA

TRP

GLU

VAL

144

a-2

LEU

PRO

VAL

a-3

150

ALA

GLU

ILE

MET

ARG

SER

PHE

SER

LEU

SER

ILE

ASN

LEU

GLN

160

a-2

ARG

LEU

THR

LYS

a-3

166

GLU

LEU

LYS

SER

LYS

GLU

a-2

ARG

ARG

ARG

a-3

Fig. 2: Nucleotid-Sequenz der Codierungsregionen von LylFN-a-2 und LylFN-a-3 {Codierungs-Tripletts sind numeriert) a-2 ...GAG ACAATAACCCTG ATAAATG CTTCAATAATATTG AAAAAG G AAG AGTAATG

a-3 ...GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAATG

1 Sau3A 16

a-2 TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAC AGG AGG GCC TTG ATA' a-3 TGT GAT CTC CCT GAG ACC CAC AGC CTG GAT AAC AGG AGG ACC TTG ATG

32

a-2 CTC CTG GCA CAA ATG CGA AGA ATC TCT CCT TTC TCC TGC CTG AAG GAC a-3 CTC CTG GCA CAA ATG AGC AGA ATC TCT CCT TCC TCC TGT CTG ATG GAC

48

a-2 AGA CAT GAC TTT GAA TTC CCC CAG GAG GAG TTT GAT GAT AAA CAG TTC a-3 AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GAT GGC AAC CAG TTC

Sau3A 64

a-2 CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC a-3 CAG AAG GCT CCA GCC ATC TCT GTC CTC CAT GAG CTG ATC CAG CAG ATC

80

a-2 TTC AAC CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCT TTG GAT GAG ACC a-3 TTC AAC CTC TTT ACC ACA AAA GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG GAC

Pvull 96

a-2 CTT CTA GAT GAA TTC TAC ATC GAA CTT GAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG a-3 CTC CTA GAC AAA TTC TGC ACC GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT GAC TTG

112

a-2 GAG TCC TGT GTG ATG CAG GAA GTG GGG GTG ATA GAG TCT CCC CTG ATG -3 GAA GCC TGT GTG ATG CAG GAG GAG AGG GTG GGA GAA ACT CCC CTG ATG

128

a-2 TAC GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT a-3 AAT GCG. GAC TCC ATC TTG GCT GTG AAG AAA TAC TTC CGA AGA ATC ACT

144

a-2 CTA TAT CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC TCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC a-3 CTC TAT CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC

160

a-2 AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTA TCA ATC AAC TTG CAA AAA a-3 AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC CTC TCT TTA TCA ACA AAC TTG CAA GAA a-2 AGA TTG AAG AGT AAG GAA TGA GACCTG GTACAACACG GAAATGATTCTTATAGACT a-3 AGA TTA AGG AGG AAG GAA TAA CACCTGGTCCAACATGAAACAATTCTTATTGACTC a-2 AATACAGCAGCTCACACTTCGACAAGTTGTGCTCTTTCAAAGACCCTTGTTTCTGCCAAAACC a-3 ATATACCAGGTCACGCTTTCATGAATTCTGCCATTTCAAAGACTCTCACTTCTGCTATAACTA a-2 ATGCTATGmTGAATCAAATGTGTCAAGTGTTTTCAGGAGTGTTAAGCAACATCCTGTT a-3 TGACCATGCTGATAAACTGATTTATCTATTTAAATATTTATTTAGCTATTCATAAGATTT

Pvull Sau3A

a-2 CAGCTGTATGGGCACTAGTCCCTTACAGATGACCATGCTGATGGATCTATTCATCTATTTATT a-3 AAATTAI I I I IGTTCATATAACATCATGTGCATCTTTACACTGTGGTTAGTGTAATAAAACAT a-2 TAAATCTTTATTTAGTTAACTATCTATAGGGCTTAAATTAGTTTTGTTCATATTATATTATGT a-3 GTTCCTTATATTTACTCAAATTCATTATTTT...

a-2 GAACTTTTACATTGTGAATTGTGTAACAAAAACATGTTCTnATATTTATTATTTTGCCTTGT a-2 TTATTAAATTTTTACTATAG...

Fig. 3:Restriktionskarten von Hindlll-Pst kleinen Fragmenten der Plasmide CG-pBR(AP)/LylFN-a-2 und CG-pBR(AP)/LylFN-a-3 Die weißen Balken (IFN-a-3) und die schwarzen Balken (IFN-a-2) begrenzen die Codierungsregionen der reifen IFNe. Darunter befindet sich das IFN-Polypeptid (166 Aminosäuren). In Klammern wird die Anzahl der Aminosäurereste angegeben, durch die sich die IFNe-a-2 und a-3 in jeder Sektion voneinander unterscheiden.

Legende der Restriktionsstellen:

Fig. 4: 1 Standard-IFN-a-B-2 IFN-Typ B - Konzentration (IU/ml)

Fig. 5: IFN-a-2-Konzentration (IU/ml)

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung eines Hybrid-Interferon-Polypeptids mit einer aus zwei bis vier Untersequenzen zusammengesetzten Aminosäuresequenz, die in der Aminosäureidentität und der Anzahl von Untersequenzen den Human-Lymphoblastoid-Interferonen LylFN-a-2 und LylFN-a-3 entspricht, wobei das Hybrid-lnterferon-Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die ein Polypeptid mit einer aus den Aminosäuren 1 bis 150 von LylFN-a-2 und den Aminosäuren 151 bis 166 von LylFN-a-3 bestehenden Aminosäuresequenz, ein Polypeptid mit einer aus den Aminosäuren 1 bis 92 von LylFN-a-2, den Aminosäuren 93 bis 150 von LylFN-a-3 und den Aminosäuren 151 bis 166 von LylFN-a-2 bestehenden Aminosäuresequenz, und ein Polypeptid mit einer aus den Aminosäuren 1 bis 60 von LylFN-a-2, den Aminosäuren 61 bis 92 von LylFN-a-3, den Aminosäuren 93 bis 150 von LylFN-a-2 oder LylFN-a-3 und den Aminosäuren 151 bis 166 von LylFN-a-2 oder LylFN-a-3 bestehenden Aminosäuresequenz umfaßt, gekennzeichnet dadurch, daß mit einem Hybrid-Vektor, der eine für das Hybrid-lnterferon-Polypeptid codierende DNS-Sequenz enthält, transformierte Wirtszellen gezüchtet werden und das Hybrid-Interferon isoliert wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Hybrid-lnterferon-Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hybrid-lnterferon-Polypeptid ,,B₁B₂B₃D₄" mit der Formel CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU METTYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU. VAL VAL ARGALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU,

Hybrid-lnterferon-Polypeptid ,,B₁B₂D₃B₄" mit der Formel

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Hybrid-lnterferon-Polypeptid ,,B₁D₂B₃B₄" mit der Formel

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Hybrid-lnterferon-Polypeptid ,,B₁D₂D₃B₄" mit der Formel

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Hybrid-lnterferon-Polypeptid ,,B₁D₂D₃D₄" mit der Formel

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Hybrid-lnterferon-Polypeptid ,,B₁D₂B₃B₄" mit der Formel

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GLU. >

3. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Hybrid-Interferon ,,B₁B₂B₃D₄", gekennzeichnet dadurch, daß der Hybrid-Vektor eine für das Hybrid-Interferon codierende DNS-Sequenz enthält.

4. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Hybrid-Interferon ,,B₁B₂D₃B₄", gekennzeichnet dadurch, daß der Hybrid-Vektor eine für das Hybrid-Interferon codierende DNS-Sequenz enthält.

5. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃D₄", gekennzeichnet dadurch, daß der Hybrid-Vektor eine für das Hybrid-Interferon codierende DNS-Sequenz enthält.

6. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃B₄", gekennzeichnet dadurch, daß der Hybrid-Vektor eine für das Hybrid-Interferon codierende DNS-Sequenz enthält.

7. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂D₃D₄", gekennzeichnet dadurch, daß der Hybrid-Vektor eine für das Hybrid-Interferon codierende DNS-Sequenz enthält..

8. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Hybrid-Interferon ,,B₁D₂B₃B₄", gekennzeichnet dadurch, daß der Hybrid-Vektor eine für das Hybrid-Interferon codierende DNS-Sequenz enthält.