DE3685996T2

DE3685996T2 - Hybrid-interferone.

Info

Publication number: DE3685996T2
Application number: DE8686810243T
Authority: DE
Inventors: Sefik Prof Dr Alkan; Markus Gerhard Dr Gruetter; Albert Dr Hinnen; Andreas Dr Meister; Francois Dr Meyer
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1985-06-11
Filing date: 1986-06-05
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2006-06-06
Also published as: DK272986A; IE861542L; DK168794B1; NZ216485A; NO175602C; FI862461A0; HK99895A; JPH05308973A; JPH0736757B2; FI862461L; NO862313L; EP0205404A3; CY1842A; PT82736B; HUT41846A; EP0205404A2; PT82736A; KR870000427A; ATE78262T1; AU598196B2

Description

Die Erfindung betrifft neue Hybrid-Interferone, deren mikrobielle Herstellung durch Rekombinante-DNA-Technologie und deren Verwendung zur Behandlung viraler und neoplastischer Erkrankungen.
Die Interferone ("IFNs") sind eine Familie von Polypeptiden, die von einer Vielzahl eukaryotischer Zellen bei Einwirkung verschiedener Mitogene und Viren abgegeben werden. Die Interferone wurden nach ihren chemischen und biologischen Eigenschaften in drei Gruppen eingeteilt: IFN-α, IFN-β und IFN-γ. IFN-α- und -β-Gene werden hauptsächlich in mit Viren, viralen Bestandteilen und doppelsträngiger RNA behandelten Zellen exprimiert. IFN-γ auf der anderen Seite wird als Antwort auf Mitogene synthetisiert.
Für Human-IFN-α wird durch eine Genfamilie codiert, die zumindest 15 Nicht-Allel-Gene umfaßt. Für Human-IFN-β und -IFN-γ codieren einzelne Gene. Das primäre Translationsprodukt von IFN-α umfaßt 189 Aminosäuren (außer IFN-α&sub2;: 188 Aminosäuren), wovon ein Signalpeptid von 23 Aminosäuren durch posttranslationale Modifikation entfernt wird. Human-IFN-β und Human-IFN-γ bestehen aus 187 und 186 Aminosäuren, von denen 21 oder 20 Aminosäuren, die die Signalpeptide darstellen, entfernt werden. Die Homologie der Aminosäure-Sequenz unter IFN-α-Subtypen ist 80-85%, während die Homologie zwischen IFN-β und IFN-α etwa 30-40 % ist. IFN-γ zeigt nur einzelne Aminosäure-Homologien mit IFN-α, was 12 % identischer Reste entspricht.
Die IFNs zeigen antivirale, immunomodulatorische sowie zytotoxische Aktivitäten. Es wurde gezeigt, daß IFN-α-Subtypen (z.B. IFN-α&sub2;, IFN-α&sub1;) unterschiedliche Zielzellspezifitäten aufweisen. Die antivirale Aktivität von IFN-α&sub2; und IFN-α&sub1; ist etwa gleich an bovinen Zellen (MDBK), aber IFN-α&sub2; ist siebenmal wirksamer als IFN-α&sub1; an Human-Zellen (WISH) und 30mal weniger wirksam als IFN-α&sub1; beim Schützen von Mäusezellen (L 929). [M. Streuli u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2848 (1981)]. Der Hinweis, daß Mitglieder der IFN-α-Multigenfamilie im Ausmaß und der Spezifität ihrer antiviralen Aktivität variieren, wurde durch Ergebnisse bestätigt, die aus einigen IFN-α-"Hybriden" (vgl. EP 32134, US 4,414,150) erhalten wurden. Diese "Hybride" wurden konstruiert durch Abspaltung zweier Gene, die für Interferon-α-Subtypen codieren, mit dem Restriktionsenzym PvuII (oder, in zwei Fällen, mit BgIII) und Cross-Ligation der resultierenden Fragmente, sodaß die für den Amino-terminalen Teil codierende DNA-Sequenz eines IFN-Gens fusioniert wurde mit der für den Carboxy-terminalen Teil codierenden DNA-Sequenz des anderen IFN-Gens. Obwohl diese Hybrid-Interferone Änderungen in der Zielzellspezifität im Vergleich zu den Stamm-Interferonen zeigen, wurde nicht gezeigt, daß es Attenuation oder Restriktion bei irgendeiner der drei Interferon-Aktivitäten gab. Solche Attenuation oder Restriktion kann beispielsweise bei klinischer Anwendung wünschenswert sein, wo es wünschenswert ist, die Interferon-Therapie auf ein spezielles Problem wie virale Infektion zu konzentrieren, ohne die Möglichkeit komplizierender Faktoren, die aus anderen Aktivitäten des verabreichten Interferons resultieren.
Es ist also ein Ziel dieser Erfindung, neue Hybrid-Interferone zu bieten, die spezifischere biologische Aktivitäten aufweisen, die aus der selektiven oder vorherrschenden Aktivierung von nur einigen der Interferon-induzierten biochemischen Stoffwechselwege resultieren, und/oder in denen einige der unerwünschten Nebeneffekte natürlicher Interferone, die ihre Anwendung einschränken, wie grippeähnliche Symptome (z.B. Fieber, Kopfschmerzen und Müdigkeit), Magen-Darm-Störungen, Absinken des Blutdrucks und Verlust des Haares, ausgeschlossen oder reduziert werden.
Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone sind abgeleitet von Human-Lymphoblastoid-Interferon LyIFN-α-2 mit der Sequenz
und Human-Lymphoblastoid-Interferon LyIFN-α-3 mit der Sequenz
Diese Interferone sowie Verfahren zu ihrer Herstellung wurden in der europäischen Patentanmeldung 76,489 beschrieben. LyIFN-α-2 ist verwandt (aber nicht identisch) mit Human-Leukozyten-Interferon LeIF-αB (vgl. U.S.-Patent 4,414,150) und hat eine spezifische Aktivität auf Kälbernieren-Embryonalzellen und auf menschliche Vorhaut-Stammzellen (HEF, jeweils infiziert mit vesikulärem Stomatitis-Virus) von 1,85.10&sup8; IU/mg bzw. 2,45.10&sup8; IU/mg. LyIFN-α-3 ist verwandt (aber nicht identisch) mit Human-Leukozyten-Interferon LeIF-αD (vgl. U.S.-Patent 4,414,150) und hat eine spezifische Aktivität auf Kälberzellen und HEF-Zellen (wie oben) von 1,32.10&sup8; IU/mg bzw. 3,7.10&sup6; IU/mg. Weiters hat LyIFN-α-3 eine höhere Thermostabilität und niedrigere antiproliferative Aktivität als LyIFN-α-2.
Es ist ein spezielles Ziel dieser Erfindung, LyIFN-α-2/α-3-Hybrid-Polypeptide zu bieten, die den hohen antiviralen Titer und/oder die höhere antiproliferative Aktivität auf menschliche Zellen von LyIFN-α-2 und die hohe Thermostabilität von LyIFN-α-3 vereinigen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Hybrid-Interferon-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus zwei bis vier Subsequenzen, die hinsichtlich der Identität und Zahl der Aminosäuren Subsequenzen von Human-Lymphoblastoid-Interferonen LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 entsprechen, wobei besagtes Hybrid-Interferon-Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren 1 bis 150 von LyIFN-α-2 und Aminosäuren 151 bis 166 von LyIFN-α-3, einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren 1 bis 92 von LyIFN-α-2, Aminosäuren 93 bis 150 von LyIFN-α-3 und Aminosäuren 151 bis 166 von LyIFN-α-2 und einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren 1 bis 60 von LyIFN-α-2, Aminosäuren 61 bis 92 von LyIFN-α-3, Aminosäuren 93 bis 150 von LyIFN-α-2 oder von LyIFN-α-3 und Aminosäuren 151 bis 166 von LyIFN-α-2 oder von LyIFN-α-3.
Mehr im besonderen betrifft die Erfindung das Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" mit der Formel
das Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" mit der Formel
das Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" mit der Formel
das Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" mit der Formel
das Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" mit der Formel
und das Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" mit der Formel
Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone sind "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" (V) und "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" (II).
Ein erfindungsgemäßes Hybrid-Interferon kann durch Rekombinante-DNA-Technik hergestellt werden, umfassend beispielsweise die Schritte a) Herstellung einer DNA, die das für besagtes Hybrid-Interferon codierende Strukturgen enthält, durch in vitro-Rekombination an den Stellen, die den Aminosäuren 60, 92 bzw. 150 von Interferonen LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 entsprechen, oder durch chemische DNA-Synthese und Einbringen der erhaltenen DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, b) Transferieren des erhaltenen Hybridvektors, der das Hybrid-IFN-Strukturgen trägt, in einen Rezipienten-Wirt, c) Selektion transformierter Wirte von untransformierten Wirten, üblicherweise durch Kultivieren unter solchen Bedingungen, wo nur die transformierten Wirte überleben, d) Kultivieren der transformierten Wirte unter Bedingungen, die Expression des Hybrid-IFN-Strukturgens erlauben, und e) Isolierung des exprimierten Hybrid-IFN.
Die angewandten Methoden werden deutlicher anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen, in denen: Fig. 1 die Aminosäuresequenzen von reifem Ly-IFN-α-2 und LyIFN-α-3 vergleicht. Nur diejenigen Aminosäuren von LyIFN-α-3, die sich von entsprechenden Aminosäuren von LyIFN-α-2 unterscheiden, werden dargestellt. Die Aminosäuresequenz von LyIFN-α-3 ist sonst identisch mit der von LyIFN-α-2. Fig. 2 die Nucleotidsequenzen der codierenden Regionen und Teile der 3'-extracistronischen Regionen von LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 zeigt. Die ATG-Translationsinitiationscodons, die Terminations-Tripletts und passenden Restriktionsorte sind unterstrichen. Die codierenden Tripletts sind numeriert. Fig. 3 die Restriktionskarten von HindIII-PstI kleinen Segmenten von Plasmiden pBR(AP)/LyIFN-α-2 und pBR(AP)/LyIFN-α-3 zeigt. Der weiße Balken (LyIFN-α-3) und der schwarze Balken (LyIFN-α-2) grenzen die codierenden Regionen der reifen IFNs ein. Unten wird die Unterteilung der Primärstruktur von IFN-Polypeptid (166 Aminosäuren) in vier Abschnitte gezeigt.

1. Herstellung von Hybridvektoren, die ein Hybrid-IFN-Strukturgen enthalten:

Die cDNAs von Human-Interferon-α-Subtypen α-2 und α-3 wurden in E. coli kloniert. Plasmid pBR(AP)/LyIFN-α-2 und pBR(AP)/LyIFN-α-3 schließen also HindIII-PstI (oder EcoRI-PstI)-DNA-Inserts ein, die codierende Regionen von LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 enthalten, unter der Kontrolle des β-Lactamase-Promotors (vgl. EP-Anmeldung 76,489). Die Restriktionskarten besagter Inserts werden in Fig. 3 dargestellt. Es ist leicht zu sehen, daß die Gene sich einige gemeinsame Restriktionsstellen (an den Positionen 60, 92 und 150 der IFN-Aminosäuresequenzen lokalisiert) teilen, die vorteilhaft herangezogen werden können, um neue Gene zu konstruieren, die für Hybrid-Interferone codieren, die vorteilhafte biologische und/oder physikalische Eigenschaften haben.
Rekombinante (einzelner oder multipler Austausch) zwischen LyIFN-α-2- und LyIFN-α-3-Genen können also durch in vitro-Rekombination an der PvuII-Stelle (Position 92) und/oder an den Sau3A-Stellen (Positionen 60 und 150) generiert werden. Da die Primärstruktur der Interferone in vier Abschnitte (erster Abschnitt Aminosäuren 1 bis 60, zweiter Abschnitt Aminosäuren 61 bis 92, dritter Abschnitt Aminosäuren 93 bis 150 und vierter Abschnitt Aminosäuren 151 bis 166, s. Fig. 3) unterteilt werden kann, können die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone durch vier Buchstaben bezeichnet werden, wobei jeder Buchstabe den vorliegenden Abschnitt anzeigt. Also wird beispielsweise das Hybrid-Interferon (I), das aus den Abschnitten 1 bis 3 des Interferons LyIFN-α-2 ("B", LyIFN-α-2 ist verwandt mit IFN-αB, oben) und Abschnitt 4 von LyIFN-α-3 ("D", LyIFN-α-3 ist verwandt mit IFN-αD, oben) besteht, mit IFN "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" bezeichnet.
Um die Herstellung des gewünschten Hybrid-Interferons zu erleichtern, müssen die die LyIFN-α-2 bzw. LyIFN-α-3 codierenden Regionen enthaltenden DNA-Inserts so modifiziert werden, daß für Religationszwecke die Restriktionsstellen HindIII (oder EcoRI), PvuII und PstI für sie einmalig sind. Es ist anhand der Fig. 3 evident, daß es eine weitere PvuII-Stelle in der 3'-extracistronischen Region des für LyIFN-α-2 codierenden Gens gibt. Diese Stelle kann leicht entfernt werden, beispielsweise durch partielle Spaltung eines Hybridvektors, der die LyIFN-α-2 codierende Region enthält, mit PvuII, Ligation der resultierenden linearisierten DNA mit einem Linker, der eine DNA-Sequenz enthält, die durch die Restriktionsendonuclease PstI erkannt wird, Spalten mit PstI, Religation der Verdaue bei niedriger DNA-Konzentration und Selektion von Plasmiden (z.B. durch Restriktionsanalyse) mit der gewünschten Modifikation, nämlich einer verkürzten 3'-extracistronischen Region, wo die PvuII-Stelle eliminiert ist. Analog werden Vektoren, die zum Klonieren von IFN-Genen verwendet werden, vorteilhaft so modifiziert, daß die Restriktionsstellen HindIII, PvuII und PstI für sie einmalig sind.
Die Erfindung betrifft Hybridvektoren, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eines der Hybrid-Interferone der Formeln I-VI codiert und operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, und auf Verfahren zu ihrer Herstellung.
Der Vektor wird in Abhängigkeit von den Wirtszellen gewählt, die für die Transformation ins Auge gefaßt wurden. Beispiele für geeignete Wirte sind Mikroorganismen, in denen Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme fehlen oder gering vorhanden sind, wie Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, und Bakterienstämme, insbesondere Stämme von Escherichia coli, beispielsweise E. coli X1776, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 oder E. coli K12 Stamm 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, und weiters Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte menschliche oder tierische Zellinien. Die obigen Stämme E. coli, beispielsweise E. coli HB101 und E. coli JA221 und weiters Saccharomyces cerevisiae werden als Wirtsmikroorganismen bevorzugt.
Prinzipiell sind alle Vektoren geeignet, die die Hybrid-IFN-Gene gemäß dieser Erfindung im gewählten Wirt replizieren und exprimieren. Beispiele für Vektoren, die für die Expression der Hybrid-Interferon-Gene in einem E. coli-Stamm geeignet sind, sind Bakteriophagen, beispielsweise Derivate von λ-Bakteriophagen, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid ColE1 und seine Derivate, beispielsweise pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung werden von Plasmid pBR322 abgeleitet. Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replikon und ein Marker-Gen, das die Auswahl und Identifizierung der Wirte erlaubt, die mit den Expressionsplasmiden transformiert sind, auf Basis eines phänotypischen Merkmals. Geeignete Marker-Gene geben dem Wirt beispielsweise Resistenz gegen Schwermetalle, Antibiotika und dergleichen. Weiters enthalten bevorzugte Vektoren dieser Erfindung außerhalb der Replikon- und Marker-Gen-Regionen Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, so daß das Hybrid-IFN-Gen und, falls passend, die Expressionskontrollsequenz an diesen Stellen inseriert werden können. Der bevorzugte Vektor, das Plasmid pBR322, enthält ein intaktes Replikon, Marker-Gene, die Resistenz gegen Tetracyclin und Ampicillin (tetR und ampR) verleihen, und eine Anzahl einzelner Erkennungsstellen für Restriktionsendonucleasen, z. B. PstI (spaltet im ampR-Gen, das tetR-Gen bleibt intakt), BamHI, HindIII und SalI (spalten alle im tetR-Gen, das ampR-Gen bleibt intakt), NruI und EcoRI.
Mehrere Expressionskontrollsequenzen können für die Regulierung der Genexpression verwendet werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen starkexprimierter Gene des zu transformierenden Wirts verwendet. Im Falle von pBR322 als Hybridvektor und E. coli als Wirtsmikroorganismus sind z.B. die Expressionskontrollsequenzen (die unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalten) von Lactose-Operon, Tryptophan-Operon, Arabinose-Operon und dergleichen, β-Lactamase-Gen, die entsprechenden Sequenzen von Phage λ N-Gen oder Phage fd-Hüllprotein-Gen und andere geeignet. Während das Plasmid pBR322 schon den Promotor des β-Lactamase-gens (β-lac-Gen) enthält, müssen die anderen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid eingeführt werden.
Vektoren, die für Replikation und Expression in Hefe geeignet sind, enthalten einen Hefe-Replikationsstart und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikationsstart enthalten, zum Beispiel chromosomal autonom replizierendes Segment (ars), werden extrachromosomal innerhalb der Hefezellen nach der Transformation gehalten und autonom repliziert. Weiters können Hybridvektoren verwendet werden, die zu Hefe 2u Plasmid- DNA homologe Sequenzen enthalten. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination in schon in der Zelle existierende 2u-Plasmide integriert oder sie replizieren autonom. 2u-Sequenzen sind besonders geeignet für Plasmide mit hoher Transformationsfrequenz und erlauben hohe Kopienzahlen. Der bevorzugte Hefevektor der vorliegenden Erfindung ist das Plasmid pJDB207. Geeignete Marker-Gene für Hefen sind insbesondere die, die dem Wirt antibiotische Resistenz verleihen oder, im Falle auxotropher Hefemutanten, Gene, die Wirtläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen zum Beispiel Resistenz gegen die antibiotischen Cycloheximide oder sorgen für Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, zum Beispiel URA3-, LEU2-, HIS3- oder insbesondere TRP1-Gen. Hefe-Hybridvektoren enthalten weiters vorzugsweise einen Replikationsstart und ein Marker-Gen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, so daß die Konstruktion und das Klonieren der Hybridvektoren und ihrer Intermediate in einem bakteriellen Wirt stattfinden können.
Expressionskontrollsequenzen, die für die Expression in Hefe geeignet sind, sind zum Beispiel die von starkexprimierten Hefegenen. Die Promotoren von TRP1-Gen, ADHI- oderADHII-Gen, saure Phosphatase (PHO3 oder PHO5)-Gen, Isocytochrom-Gen oder ein Promotor, der mit dem glycolytischen Weg involviert ist, wie der Promotor von Enolase-, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-,3-Phosphoglyceratkinase(PGK)-, Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-Phosphat-Isomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Gene können verwendet werden. Bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Promotoren mit Transcriptionskontrolle, z.B. die Promotoren der PHO5-, ADHII- und GAPDH-Gene, die durch Variation der Wachstumsbedingungen auf- und abgedreht werden können. Zum Beispiel kann der PHO5-Promotor nur durch Erhöhen oder Senken der Konzentration an anorganischem Phosphat im Medium reprimiert oder dereprimiert werden.
Promotoren für die Verwendung in Säugerzellen sind zum Beispiel virale Promotoren, wie HTLV, SV40, Vaccinia-Promotor und dergleichen.
Der Promotor ist operativ verknüpft mit der codierenden Region, um effektive Expression des Hybrid-Interferons sicherzustellen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor direkt verknüpft mit der codierenden Region von reifem Hybrid-IFN, wobei ein Translationsstartsignal (ATG) an der Verbindung inseriert ist. Eine bevorzugte Region für das Verbinden des Promotors mit der Hybrid-IFN codierenden Region ist zwischen dem Haupt-mRNA- Start und dem ATG des Gens, das natürlich an besagten Promotor gebunden ist.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn Hefe als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, ist eine Signalsequenz in der Konstruktion inkludiert. Geeignete Signalsequenzen sind die natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpften. Zum Beispiel die PHO5-Signalsequenz, weiters die Signalsequenzen der Hefe-Invertase oder α-Faktor-Gene können verwendet werden. Es werden die Kombinationen favorisiert, die eine präzise Spaltung zwischen der Signalsequenz und der reifen Hybrid-IFN-Aminosäuresequenz erlauben. Weitere Sequenzen, wie Pro- oder Spacer-Sequenzen, die spezifische Processing-Signale tragen können oder nicht, können auch in der Konstruktion inkludiert sein, um genaues Processing von Vorläufermolekülen zu erleichtern. Alternativ fusionierte Proteine können generiert werden, die innere Processing-Signale enthalten, welche geeignete Reifung in vivo oder in vitro erlauben.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Hybridvektoren auch die 3'-flankierende Sequenz eines Gens, die die passenden Signale für Transcriptionstermination und Polyadenylierung enthalten. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen sind zum Beispiel die des Gens, das natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpft ist. Falls Hefe als Wirtsmikroorganismus und der PHO5- Promotor als Expressionskontrollsequenz verwendet wird, ist die 3'-flankierende Sequenz vorzugsweise die des PHO5-Gens.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Hybridvektoren, die zur Replikation und phänotypischen Selektion in einem Wirtsstamm befähigt sind, umfassend einen Promotor und eine DNA-Sequenz, die für irgendeines der neuen Hybrid-Interferone codiert, wobei diese DNA-Sequenz zusammen positioniert sind mit Transcriptions-Start- und -Terminations-Signalen sowie Translations-Start- und -Stop-Signalen in besagten Hybridvektoren unter der Kontrolle des besagten Promotors positioniert sind, so daß in einem transformierten Wirt zur Produktion eines erfindungsgemäßen Hybrid-Interferons exprimiert wird.
Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren können hergestellt werden durch in vitro-Ligation passender Segmente der LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 codierenden Regionen und Inserieren des resultierenden Hybrid-IFN-Gens in einen geeigneten Vektor oder durch Ligation eines speziellen IFN- DNA-Segments an eine linearisierte Vektor-DNA, die schon die verbleibenden Abschnitte in solcher Weise enthält, daß das für das gewünschte Hybrid-Interferon codierende Gen gebildet wird. Es wird vorgezogen, daß das DNA-Segment, das die Amino-terminale Endsequenz gibt, schon an die Expressionskontrollsequenz fusioniert ist.
Geeignete Segmente der LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 codierenden Regionen werden speziell von den bevorzugten Startvektoren der vorliegenden Erfindung genommen, nämlich den pBR322-abgeleiteten Plasmiden pAM2 und pAM21. Das Plasmid pAM2 enthält ein HindIII-PstI-Insert mit der LyIFN-α-3 codierenden Region unter Kontrolle des β-Lactamase-Promotors. Der Vektorteil von Plasmid pAM2 ist gegen PvuII resistent. Das Plasmid pAM21 enthält ein HindIII-PstI-Insert, wobei die LyIFN-α-2 codierende Region eine einzige PvuII-Stelle an der Position 92 hat und unter der Kontrolle des β-Lactamase-Promotors steht. Der Vektorteil von Plasmid p21 ist auch gegen PvuII resistent.
Speziell das für Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" codierende Gen wird hergestellt durch Ligation des großen PstI-PvuII-Fragments von Plasmid pAM21, des kleinen Sau3A-PvuII-Fragments von Plasmid pAM21 und des kleinen Sau3A-PstI-Fragments von Plasmid pAM2. Diese Konstruktion resultiert in einem Plasmid (pJC344), das die Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" codierende Region unter der Kontrolle des β-Lactamase-Promotors enthält. Auf ähnliche Weise wird das für Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" codierende Gen hergestellt durch Ligation des großen PvuII-PstI-Fragments von pAM21, des kleinen Sau3A-PvuII-Fragments von Plasmid pAM2 und des kleinen Sau3A-PstI-Fragments von Plasmid pAM21. Diese Konstruktion führt zu einem Plasmid (pJC342), das die Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" codierende Region unter der Kontrolle des β-Lactamase-Promotors enthält. Das für Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" codierende Gen kann hergestellt werden durch Ligation des kleinen HindIII-Sau3A-Fragments von Plasmid pAM21, des kleinen Sau3A-PvuII-Fragments von Plasmid pAM2 und des großen PvuII-HindIII-Fragments von Plasmid pAM2. Diese Konstruktion führt zu einem Plasmid (pAM94), das die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" codierende Region unter der Kontrolle des β-Lactamase-Promotors enthält. Analog wird das für Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" codierende Gen hergestellt durch Ligation des kleinen HindIII-Sau3A-Fragments von Plasmid pAM21, des kleinen Sau3A-PvuII-Fragments von Plasmid pAM2 und des großen PvuII-HindIII-Fragments von Plasmid pAM21. Diese Konstruktion führt zu einem Plasmid (pAM90), das die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" codierende Region unter der Kontrolle des ß-Lactamase-Promotors enthält. Plasmide, die die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" codierende Region (z.B. Plasmid pDM1) oder die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" codierende Region (z.B. Plasmid pDM2) enthalten, können auf ähnliche Art hergestellt werden. Diese Plasmide eignen sich für Replikation und Expression der Hybrid-IFN-Gene in E. coli. Falls erwünscht, kann das für irgendeines der genannten Hybrid-Interferone codierende DNA-Insert aus dem entsprechenden Plasmid excisiert und in eine andere Vektor-DNA eingeführt werden. Auf diese Art können Plasmide erhalten werden, die die Hybrid-Interferon codierende Region unter der Kontrolle eines anderen Promotors als des β-Lactamase-Promotors enthalten und/oder erlauben, daß das Gen in einem anderen Wirt als E. coli exprimiert wird.
Die Herstellung von DNA, die das Strukturgen für irgendeines der genannten Hybrid-Interferone enthält, kann auch mittels chemischer Synthese erfolgen. Geeignete Methoden für die Synthese von DNA wurden in summarischer Form von S.A. Narang präsentiert [Tetrahedron 39, 3 (1983)]. Die bekannten Synthesemethoden erlauben die Herstellung von Polynucleotiden gegen 20 Basen Länge in guter Ausbeute, hoher Reinheit und in relativ kurzer Zeit. Geeignet geschützte Nucleotide werden miteinander durch die Phosphodiester-Methode verknüpft [K.L. Agarwal u.a., Angew. Chem. 84, 489 (1972)], oder die noch effizientere Phosphotriester-Methode [C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972)] oder Phosphittriester-Methode [R.L. Letsinger u.a., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976)]. Eine Vereinfachung der Synthese der Oligonucleotide und Polynucleotide wird durch die Festphasenmethode möglich, in der die Nucleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden werden. Itakura u.a. [J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)] verwenden Trinucleotide verknüpft durch die Phosphotriester-Methode in der Festphasensynthese an Stelle individueller Nucleotide, und diese können kondensiert werden, in kurzer Zeit und mit guten Ausbeuten, zum Beispiel um ein Polynucleotid mit 31 Basen zu ergeben. Die tatsächliche doppelsträngige DNA kann enzymatisch aus chemisch hergestellten kurzen Segmenten aufgebaut werden. Dazu verwenden Khorana u.a. [J. Biol. Chem. 251, 565 (1976)] überlappende Polynucleotid-Sequenzen von beiden DNA-Strängen, die in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten werden und dann chemisch verknüpft werden durch das Enzym DNA-Ligase. Eine andere Möglichkeit umfaßt das Inkubieren von in jedem Fall einer Polynucleotid-Sequenz von den zwei DNA-Strängen mit einem kurzen überlappenden Segment in Gegenwart der vier erforderlichen Desoxynucleosid-Triphosphate mit einer DNA-Polymerase, zum Beispiel DNA-Polymerase I, einem Klenow-Fragment von Polymerase I oder T&sub4;-DNA-Polymerase, oder mit AMV (avian myeloblastosis virus)-Umkehrtranscriptase. Die zwei Polynucleotid-Sequenzen werden in der korrekten Anordnung zusammengehalten durch Basenpaarung und werden mit den erforderlichen Nucleotiden durch das Enzym ergänzt, um eine komplette doppelsträngige DNA zu ergeben [S.A. Narang u.a., Anal. Biochem. 121, 356 (1982)]. Itakura u.a. [J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982)] beschreiben, wie auf Basis dieses Prinzips ein 132 Basenpaare langes Segment des Human-Leukozyten-Interferon α&sub2;-Gens gebaut werden kann in Gegenwart von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aus 4 chemisch synthetisierten Fragmenten, 39 bis 42 Basen lang, wobei 40%ige Ersparnis in der chemischen Synthese im Vergleich mit der Methode, die nur Ligase verwendet, erreicht wird. Eine geeignete Methode zur Herstellung von DNAs gemäß dieser Erfindung wurde beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung 146,785 beschrieben, deren Lehre hier durch Bezugnahme zum Inhalt gemacht wird.
Die chemisch synthetisierte DNA, die das Strukturgen für irgendeines der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone enthält, kann in eine Vektor-DNA inseriert werden, die eine Expressionskontrollsequenz enthält, so daß die Expressionskontrollsequenz die Expression des besagten Gens reguliert.

2. Transformation der Wirtszellen:

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirts, welches das Transformieren eines Wirts mit einem Expressionsvektor umfaßt der eine DNA-Sequenz enthält, die für irgendeines der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone codiert und durch eine Expressionskontrollsequenz reguliert wird.
Beispiele für geeignete Wirte sind die obgenannten Mikroorganismen, wie Stämme von Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis und Escherichia coli. Die Transformation mit den erfindungsgemäßen Expressionsplasmiden wird zum Beispiel wie in der Literatur beschrieben durchgeführt, für S. cerevisiae [A. Hinnen u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], B. subtilis [Anagnostopoulos u.a., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)] und E. coli [M. Mandel u.a., J. Mol. Biol 53, 159 (1970)].
Demgemäß schließt die Transformationsmethode von E. coli-Zellen Ca²&spplus;-Vorbehandlung der Zellen ein, um DNA-Aufnahme zu ermöglichen, und Inkubation mit dem Hybridvektor. Die Zellen werden in ein selektives Wachstumsmedium transferiert, das Trennung der transformierten Zellen von den Stammzellen erlaubt. Zellen, die den Vektor nicht enthalten, werden in einem solchen Medium nicht überleben. Die Transformation von Hefe umfaßt zum Beispiel die Schritte (1) enzymatische Entfernung der Hefezellwand mittels Glucosidasen, (2) Behandlung der erhaltenen Sphäroplasten mit dem Vektor in Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²&spplus;-Ionen und (3) Regeneration der Zellwand durch Einbetten der Sphäroplasten in Agar. Vorzugsweise wird der Regenerations-Agar so hergestellt, daß er Regeneration und Selektion der transformierten Zellen gleichzeitig erlaubt.
Die Erfindung betrifft auch die auf dem beschriebenen Weg erhältlichen transformierten Wirte.

3. Kultivierung der transformierten Wirtszellen und Isolierung des exprimierten Hybrid-Interferons:

Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Herstellung der Hybrid-Interferone der Formeln I-VI, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Hybridvektor, der eine für irgendeines der besagten Hybrid-Interferone codierende DNA-Sequenz enthält, transformierte Wirtszellen kultiviert werden und das Hybrid-Interferon isoliert wird.
Die transformierten Wirtszellen werden nach auf dem Gebiet bekannten Methoden in einem flüssigen Medium kultiviert, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
Verschiedene Kohlenstoffquellen können für das Kultivieren der transformierten Wirte gemäß dieser Erfindung verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, die für sich allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte; weiters Hefe-Extrakte, Malzextrakt und auch Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die für sich allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die auch verwendet werden können, sind z.B. Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.
Das Medium enthält weiters zum Beispiel wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, z.B. Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen verhindern, die das Expressionsplasmid verloren haben. Also wird dem Medium z.B. Ampicillin zugesetzt wenn das Expressionsplasmid ein ampR-Gen enthält. Eine solche Zugabe antibiotischer Substanzen hat auch den Effekt, daß kontaminierende Antibiotika-empfindliche Mikroorganismen zerstört werden. Wenn ein Hefestamm, der z.B. in einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, enthält das Plasmid vorzugsweise ein Gen, das für ein Enzym codiert, das den Wirtsdefekt komplementiert. Kultivierung des Hefestammes erfolgt in einem Minimalmedium, dem es an dieser Aminosäure mangelt.
Das Kultivieren erfolgt nach auf diesem Gebiet bekannten Methoden. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so gewählt, daß ein maximaler Titer von Hybrid-Interferon erhalten wird. Also wird ein E. coli- oder Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen kultiviert, durch Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40ºC, vorzugsweise etwa 30ºC, und einem pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise etwa pH 7, für etwa 4 bis 30 Stunden, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten des Hybrid-Interferons erreicht werden.
Es wird überraschend festgestellt, daß die maximalen Titer der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, z.B. von Hybrid-Interferonen "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", die in Rohextrakten von z.B. transformierter Hefe erreichbar sind, die unter Standardbedingungen kultiviert wurde, deutlich höher sind als die von Interferon-α-2 und den Hybrid-Interferonen "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;" und "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", die mit den Hybrid-Interferonen "BD" und "DB", die in U.S.-PS 4,414,150 beschrieben werden, nahe verwandt sind.
Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Kultur unterbrochen und das Hybrid-Interferon aus den Zellen des Wirts freigesetzt. Zu diesem Zweck werden die Zellen zerstört, beispielsweise durch Behandlung mit einem Detergens, wie SDS oder Triton, oder lysiert mit Lysozym oder einem ähnlich wirkenden Enzym. Wenn Hefe als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, kann die Zellwand durch enzymatische Verdauung mit einer Glucosidase entfernt werden. Alternativ oder zusätzlich können mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z.B. X-Presse, French press, Dynomill) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid oder abwechselndes Gefrieren, z.B. in flüssigem Stickstoff, und Tauen, z.B. auf 30º bis 40ºC, sowie Ultraschall angewandt werden, um die Zellen aufzubrechen. Das resultierende Gemisch, das Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, wird an Proteinen, einschließlich Hybrid-Interferon, auf an sich bekannte Art nach Zentrifugieren angereichert. So werden zum Beispiel die meisten Nicht-Protein-Bestandteile durch Polyethylenimin-Behandlung entfernt und die Proteine, einschließlich Hybrid-Interferon, werden zum Beispiel durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat oder anderen Salzen ausgefällt. Bakterielle Proteine können auch durch Ansäuren mit Essigsäure (z.B. 0,1%ig, pH 4-5) ausgefällt werden. Weitere Reinigungsschritte schließen zum Beispiel Ultrafiltration, Diafiltration, Gelelektrophorese, chromatographische Verfahren, wie Ionenaustausch-Chromatographie, Größenausschluß -Chromatographie, HPLC, "Umkehrphasen"-HPLC und dergleichen, Trennung der Bestandteile des Gemischs nach der Molekülgröße mittels einer geeigneten Sephadex-Säule, Dialyse, Affinitäts-Chromatographie, z. B. Antikörper-, speziell monoklonale Antikörper-Affinitäts-Chromatographie, und andere bekannte Verfahren, insbesondere die auf dem Gebiet bekannten Verfahren ein.
Überraschend haben die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone größere Thermostabilitäten als Interferon LyIFN-α-2 und Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;". Die Temperatur, bei der 50 % der antiviralen Aktivität verloren werden (Temperaturanstieg von IFN-Lösungen bei 1ºC/min) beträgt also 62,8ºC im Falle von LyIFN-α-2 und 63ºC im Falle des Hybrid-Interferons "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;", während die entsprechenden Werte zum Beispiel für die Hybrid-Interferone "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" 65ºC, 64,7ºC, 65,3ºC bzw. 64,2ºC sind.
Die Erfindung betrifft weiters die Hybrid-Interferone der Formeln I-VI, wann immer sie nach den Methoden der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft auch die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Hybrid-Interferone.
Die Erfindung betrifft speziell die Hybridvektoren, die transformierten Wirtszellen, die Hybrid-Interferon-Polypeptide und die Verfahren zu ihrer Herstellung, wie in den Beispielen beschrieben.

Biologische Eigenschaften der Hybrid-Interferone und pharmazeutische Formulierungen:

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone zeigen interessante biologische Eigenschaften, die sie als wertvolle Pharmazeutika qualifizieren.
Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone werden durch sehr potente antivirale Aktivität auf Säugerzellen, wie bovine und insbesondere menschliche Zellen, gekennzeichnet. Die antiviralen Titer, die als die Reduktion des cytopathischen Effekts nach der Methode von S. Rubinstein u.a. [J. Virol. 37, 755 (1981) unter Verwendung von VSV (vesiculäres Stomatitisvirus) als "challenge"-Virus an bovinen (MDBK) und menschlichen (WISH) Zellen] bestimmt werden, sind wie folgt: Tabelle 1: Antivirale Titer von Hybrid-Interferonen unter Verwendung von VSV als "challenge"-Virus Interferon spezifische Aktivität/mg Protein bovin human
Demgemäß ist die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone nicht auf menschliche Zellen beschränkt, sondern ist invariabel interspezifisch. Die antiviralen Aktivitäten der Hybrid-Interferone "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;", die bei menschlichen Zellen auftreten, sind also im Grad mit denen von Stamm-Interferon α-2 und Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;", das dem Hybrid-Interferon "BD" eng verwandt ist, das in US-PS 4,414,150 beschrieben wird, vergleichbar, aber deutlich überlegen dem Stamm-Interferon α-3 (um einen Faktor 10-30) und dem Referenz-Hybrid-Interferon "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" (um einen Faktor 230-600).
Abgesehen von der allgemeinen antiviralen Aktivität auf menschliche Zellen rufen die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone eine spezifischere Reaktion von Zielzellen hervor. Verschiedene intrazelluläre Enzyme werden bei Interferon-Wirkung induziert. Unter diesen Enzymen ist (2'-5')-Oligoisoadenylatsynthetase ("2-5 A Synthetase"), die (2'5')verknüpfte Oligonucleotide generiert, und diese aktivieren ihrerseits eine latente Endoribonuclease, die virale mRNA spaltet. Es wird überraschend gefunden, daß die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, wie "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" besonders aktive Induktoren von 2-5 A Synthetase-Aktivität in menschlichen Zellen sind. Bei 103 Einheiten/ml ergeben die Hybrid-Interferone "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" einen 17,5fachen, 11,4fachen, 8,5fachen bzw. 9,6fachen Anstieg der 2-5 A Synthetase-Aktivität in Daudi-Zellen verglichen mit einem 5,6-, 3,9-, 4,0- oder 4,3fachen Anstieg auf Wirkung von Stamm-Interferonen α-2 und α-3 und Referenz-Hybrid-Interferonen "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;" bzw. "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;". Weiters zeigen die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone antiproliferative Aktivitäten. Die antiproliferative Aktivität kann wie folgt bestimmt werden: Interferon enthaltende Lösungen werden mit 5.10&sup4; Daudi-Zellen pro ml in 2 ml RPMI-Medium, das 10 % fetales Kälberserum enthält, inkubiert. Die Zellvermehrung wird nach drei Tagen Inkubation durch Zählen lebensfähiger Zellen in einem Hämocytometer unter Anwendung des "Trypan blue"-Ausschlußtests bestimmt. Die Konzentration von Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;", die erforderlich ist, um 50 % Inhibierung der Vermehrung der Daudi-Zellen zu induzieren, ist etwa 4, 4, 1,3, 1,3, 4 bzw. 4 Einheiten/ml, daher ungefähr gleich dem Stamm-Interferon α-2 und dem Referenz-Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;" (etwa 1,3 Einheiten/ml) und überlegen dem Stamm-Interferon α-3 (etwa 20 Einheiten/ml) und dem Referenz-Hybrid-Interferon "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" (etwa 400 Einheiten/ml).
Die antiproliferative Wirkung gegen Krebs des Menschen kann auch in vivo gezeigt werden. Verschiedene Krebsarten menschlichen Ursprungs, wie Krebs der Brust, des Colons und der Lunge, Ovarienkrebs und Melanom, wurden in nackten Mäusen ausgebreitet. Kleine Fragmente der ausgebreiteten Tumore werden isoliert und mittels Trokar unter die "venal capsule" von (Balb/c x DBN/2)F&sub1; (CDF&sub1;) Mäusen implantiert. IFN wird intramuskulär in zwei täglichen Dosen von 5.10&sup5; bis 5.10&sup7; IU/kg/Inj. an den Tagen 1 bis 5 (Tag der Verabreichung: Tag 0) verabreicht. Am Tag 6 werden die Tiere getötet, die Endtumorgrößen werden gemessen und mit den Anfangstumorgrößen (vor IFN-Behandlung) und mit den Tumorgrößen bei unbehandelten Vergleichsmäusen verglichen. Nach Behandlung mit den erfindungsgemäßen Hybrid-Interferonen, zum Beispiel "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;", wird eine beträchtliche und signifikante Inhibierung des Tumorwachstums und - teilweise - Regression von Tumoren beobachtet. Überraschend ist die antiproliferative Aktivität der Hybrid-Interferone der von ursprünglichen Interferonen α-2 und α-3 sowie der der Hybrid-Interferone "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;" und "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" überlegen.
Die antiviralen und antiproliferativen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone machen diese Polypeptide nützlich für die Behandlung von viralen Infektionen, wie Influenza und anderen Virusinfektionen der Atemwege, Herpesvirus-Infektionen, Rabies- und Hepatitis-Infektionen, und neoplastischen Erkrankungen, wie Melanom, Nierenkrebs und Haarzell-Leukämie, des menschlichen und tierischen Körpers, wahlweise in Kombination mit anderen antiviralen oder Antitumor-Mitteln, vorzugsweise in Form pharmazeutischer Zubereitungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffes gegebenenfalls zusammen oder in Vermischung mit anorganischen oder organischen, festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die sich vorzugsweise für parenterale Verabreichung eignen.
Parenterale Formulierungen sind speziell injizierbare Flüssigkeiten, die auf verschiedene Arten wirksam sind, wie intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, intradermal oder subkutan. Solche Flüssigkeiten sind vorzugsweise isotonische wäßrige Lösungen oder Suspensionen, die vor der Verwendung hergestellt werden können, zum Beispiel aus lyophilisierten Zubereitungen, die den Wirkstoff allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Die pharmazeutischen Zubereitungen können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe enthalten, zum Beispiel Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel und/oder Emulgatoren, Solubilisierungsmittel, Salze zur Regulierung des osmotischen Druckes und/oder Puffer. Die vorliegenden pharmazeutischen Zubereitungen, die auf Wunsch weitere pharmakologisch wertvolle Substanzen enthalten können, werden auf an sich bekannte Art hergestellt, zum Beispiel durch herkömmliches Auflösen von Lyophilisierungsprozessen, und enthalten ungefähr 0,1 % bis 100 %, speziell ungefähr 1 % bis ungefähr 50 %, und im Falle von Lyophilisaten bis zu 100 % Wirkstoff. Es ist wert festgehalten zu werden, daß die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone, wie "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", ohne Aktivitätsverlust lyophilisiert und wiederaufgelöst werden können. Im Gegensatz dazu ergeben lyophilisierte Zubereitungen der ursprünglichen Interferone α-2 und α-3 trübe Lösungen mit merklichem Absinken der Aktivität. Die letzteren Interferone können daher nur in gepufferten Lösungen gelagert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß eine pharmakologisch wirksame erfindungsgemäße Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt wird.
Die spezielle Art der Verabreichung und die Dosierung wird vom behandelnden Arzt gewählt, wobei die Eigenheiten des Patienten, die Erkrankung und das Stadium der involvierten Erkrankung berücksichtigt werden. Zum Beispiel werden virale Infektionen üblicherweise durch eine oder zwei Dosen am Tag über einige Tage bis einige Wochen behandelt, während die Behandlung von Neoplasmen typischerweise eine oder mehrere Dosen am Tag über Wochen oder Monate involviert. Die gleichen täglichen Dosis-Level, nämlich etwa 10&sup6; bis 10&sup7; Einheiten, wie sie in der herkömmlichen Interferontherapie verwendet werden, können angewendet werden.

Reinigung von Hybrid-Interferon durch monoklonalen Antikörper:

Es wurde eine Hybridomzellinie mit der Bezeichnung 144 BS 22-6-19 entwickelt, die am 14. März 1985 bei "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, unter der Nummer I-424 hinterlegt wurde. Diese Hybridomzellinie ist ein Hybrid von der Maus-Myelom-Zellinie Sp2/O-Ag14 und von einem B Lymphozyten von der Milz einer Balb/c Maus, immunisiert mit natürlichem Human-IFNα. Es ist eine stabile Zellinie, die den monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung 144 BS abgibt. Die Zellinie kann in Kultur gehalten oder in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und durch Auftauen reaktiviert werden.
Der monoklonale Antikörper 144 BS wird durch Anwendung an sich bekannter Verfahren hergestellt, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzellinie 144 BS 22-6-19 a) in vitro kultiviert und der monoklonale Antikörper aus dem Kultur-Überstand isoliert wird oder b) in vivo in einem geeigneten Säuger propagiert und der monoklonale Antikörper aus Körperflüssigkeiten dieses Säugers gewonnen wird.
Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone können durch Immunoaffinitäts-Chromatographie mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers 144 BS gereinigt werden. Der monoklonale Antikörper wird an einen geeigneten Träger organischen oder anorganischen Ursprungs gebunden, wie vernetzte Agarose, Dextran oder Polyacrylamid in geeignet funktionalisierter Form, gegebenenfalls nach Aktivierung, unter Anwendung auf dem Gebiet bekannter Methoden. Zum Beispiel wird ein Träger, der aktivierte Esterfunktionen trägt, in einer wäßrigen Pufferlösung suspendiert, mit einer Lösung des monoklonalen Antikörpers gemischt, filtriert, resuspendiert und gewaschen, um überschüssigen monoklonalen Antikörper zu entfernen, und mit einer Lösung irrelevanter Proteine behandelt, um freie reaktive Stellen des Trägers zu blockieren. Dieser Antikörper-beschichtete Träger wird verwendet, um selektiv die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone in glycosylierter oder unglycosylierter Form zu binden. Zu diesem Zweck wird Trägermaterial in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel suspendiert, zum Beispiel in einer Salzlösung, wie NaCl-Lösung, oder einer Pufferlösung, wie phosphatgepufferter NaCl-Lösung, NaHCO&sub3;-Lösung oder 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurelösung, und mit der Lösung in Kontakt gebracht, die das Hybrid-Interferon enthält, zum Beispiel in eine Chromatographiesäule geschüttet und die das Hybrid-Interferon enthaltende Lösung eingeführt und durch das Trägermaterial gepumpt, auf Wunsch unter Druck. Ungebundene Proteine und andere Verunreinigungen werden mit wäßrigen Lösungen weggewaschen, zum Beispiel Pufferlösungen in einem pH-Bereich von ungefähr pH 5 bis ungefähr pH 9 und/oder Salzlösungen, z.B. NaCl-Lösung. Das an den Antikörper auf dem Trägermaterial gebundene Hybrid-Interferon wird mit geeigneten wäßrigen Lösungen eluiert, z.B. Pufferlösungen in einem pH-Bereich von ungefähr pH 2 bis ungefähr pH 5, wie Glycin-Puffer oder Citronensäure, oder pH-Gradienten unterschiedlicher Zusammensetzung oder Salzlösungen, z.B. konzentrierte NH&sub4;SCN-Lösung. Das Hybrid-Interferon enthaltende Eluat wird wahlweise neutralisiert, und das gereinigte Hybrid-Interferon daraus nach bekannten Methoden isoliert.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration der vorliegenden Erfindung, sollen aber nicht als Einschränkung ausgelegt werden.

Experimenteller Teil:

In den Beispielen verwendete Abkürzungen: DTT = 1,4-Dithiothreitol; TNE = 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA enthaltende Lösung; Tris = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; TE = 10 mM Tris, 50 uM EDTA enthaltende Lösung; N-Medium enthält Bacto-Trypton (10 g, Difco), Hefe-Extrakt (1 g, Difco), Glucose (1 g), NaCl (8 g), CaCl&sub2;.2H&sub2;O (249 mg) pro 1 l Lösung; TBE = 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA enthaltende Lösung; BSA = Rinderserumalbumin; HAT = Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin; Ig = Immunglobulin; IU = Internationale Einheit (der Interferon-Aktivität); MAb = monoklonaler Antikörper; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Teil I: Konstruktion und Klonierung von Interferon α-2/α-3-Hybriden in Escherichia coli:

Alle Hybrid-Interferon-Protein codierenden Sequenzen, die nachstehend beschrieben werden, wurden operativ mit dem β-Lactamase-Promotor verknüpft, in ein pBR322-abgeleitetes Expressionsplasmid kloniert und in E. coli transformiert.

Beispiel 1: Konstruktion von PvuII-resistenten Vektoren, die DNA-Sequenzen der Lymphoblastoid-IFNs α-2 und α-3 tragen:

pBR322 wird mit PvuII (Biolabs) geschnitten, und die lineare DNA wird an einen [³²P]-BclI-Linker [d(ATGTGTGATCACACAT] synthetisiert durch die Festphasen-Phosphotriester-Methode, vgl. H. Rink u.a., Nucleic Acids Research 12, 6369 (1984)] wie folgt ligiert:
Die restringierte Plasmid-DNA (1 ug, etwa 0,7 pmol Enden) wird an ³²P-markierte BclI-Linker-DNA (etwa 40 pmol Enden) in 50 ul Reaktionsvolumen, das 20 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP und 40 U/ul T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) enthält, ligiert. Nach 2-3 h Inkubation bei 15ºC wird die wäßrige Phase mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird ausgefällt durch die Zugabe von 1/9 Volumen 10 x TNE, 2,5 Volumina Ethanol und -20ºC über Nacht. Das DNA-Pellet wird in 50 ul TE pH 8,0 resuspendiert und durch einen 5-23 % Saccharosegradienten (50 mM Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA) in einem Kontron-TST-60-Rotor 4 h bei 58000 UpM bei 15ºC zentrifugiert. Der Gradient wird von oben nach unten fraktioniert, und die Radioaktivität jeder Fraktion wird durch Cerenkov-Zählung aufgezeichnet. Interessierende Fraktionen werden zusammengefaßt und die DNA mit Ethanol und TNE gefällt. Das DNA-Pellet wird in Restriktionspuffer resuspendiert und mit BClI verdaut und wieder ausgefällt nach Extraktion der wäßrigen Phase mit Phenol/Chloroform. Diese lineare DNA wird dann bei einer Konzentration von 5 ug/ml unter Bedingungen rezirkularisiert, die denen identisch sind, die für die Linkerligation beschrieben wurden.
Die ligierte DNA wird mit den Enzymen HindIII, PvuII (zum Eliminieren restlicher intakter pBR322) und PstI geschnitten, und das große HindIII-PstI-Fragment (3600 bp+ Linker), das den Replikationsursprung und das ampR-Gen enthält, wird durch Saccharosegradient-Zentrifugation isoliert.
HindIII-PstI-Inserts von CG-pBR(AP)/LyIFN-α-2 (1160 bp) und von CG-pBR(AP)/LyIFN-α-3 (1020 bp) (Europäische Patentanmeldung 76.489), erhalten durch Saccharosegradient-Zentrifugation, werden jedes in die oben hergestellte DNA ligiert, was zu Plasmiden pAM4 und pAM2 führt, die LyIFN-α-2 bzw. LyIFN-α-3 codierende Regionen enthalten, unter der Kontrolle des β-Lactamase-Promotors.
Ligierte DNA wird direkt verwendet, um kompetente E. coli wie folgt zu transformieren: Das DNA-Ligationsgemisch (oder Fraktionen davon) wird in 150 ul 15 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM MgCl&sub2;, 10mM NaCl, 0,5 mM EDTA transferiert, und 50 ul CaCl&sub2;-behandelte Rezipienten-E. coli HB 101 werden zugesetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten auf 0ºC gehalten, dann 2 min auf 42ºC gebracht, und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird 1 ml N-Medium zugesetzt. Die Inkubation wird 1 h bei 37ºC fortgesetzt (Schüttler-Plattform, 250 UpM), wonach 600 ul auf McConkey-Agar (Difco) plattiert werden, der Tetracyclin (10 ug/ml) enthält. Die Petrischalen werden 16-18 h bei 37ºC inkubiert, wenn bakterielle Kolonien beobachtet werden können.
Plasmid-DNA wird aus den Transformanten nach der folgenden Methode erhalten. 10 ml N-Medium, das Tetracyclin (10 ug/ml) enthält, werden mit jeweils einer Transformantenkolonie inokuliert, und die Kulturen werden bei 37ºC bewegt (Schüttelplattform, 150-300 UpM), bis sie eine optische Dichte von 0,9-1,1 (650 nm) erreicht hatten. Die Zellen werden geerntet und in einem gleichen Volumen Tetracyclin (10 ug/ml) und Chloramphenicol (80 ug/ml) enthaltenden N-Mediums resuspendiert. Die Inkubation wird bei 37ºC weitere 18 Stunden fortgesetzt, um die Zahl der Plasmidkopien pro Zelle zu amplifizieren. Die Bakterien werden geerntet, und das bakterielle Pellet wird in 50 mM Tris HCl pH 8 (10 ml pro Gramm Naßzellengewicht) resuspendiert, und Lysozym (sigma) wird der zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml zugesetzt. Nach 10 Minuten bei 0ºC wird die Lösung auf 50 mM EDTA eingestellt, nach 10 min bei 0ºC wird Triton X 100 zu einer Endkonzentration von 0,8 % zugesetzt, und die Zubereitung wird 1 h auf 0ºC gehalten, gefolgt von Zentrifugieren in einem Sorvall-SS-34-Rotor bei 18000 UpM für 30 Minuten. Nach Extraktion des klaren Überstandes mit Phenol, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform wird RNase A (Sigma) zu einer Endkonzentration von 25 ug/ml zugesetzt, und die Lösung wird 1 h bei 37ºC inkubiert. Zur Entfernung von RNA werden NaCl (1 M Endkonzentration) und Polyethylenglycol 6000 (7,5 % Endkonzentration) zugesetzt, und die Zubereitung wird 2 h bei -10ºC gehalten, gefolgt von 10minütigem Zentrifugieren bei 10000 UpM und 0ºC in einem Sorvall-SS-34-Rotor. Die Pellets werden in 200 ul TNE resuspendiert und wieder mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert vor Wiederausfällung (durch Zugabe von 500 ul Ethanol, 5 min bei -80ºC, 10 min Eppendorf-Zentrifuge). Die DNA-Pellets werden in 20-40 ul TE resuspendiert. Typische Ausbeuten, die aus dieser Vorgangsweise resultieren, sind etwa 20 ug Plasmid-DNA.
Die hergestellten Plasmid-DNAs (pAM4 und pAM2) werden Restriktionsenzymanalyse unterworfen. Die Struktur von pAM4 und pAM2 wird bestätigt.

Beispiel 2: Eliminierung der 3'-extracistronischen PvuII-SteIIe aus pAM4:

Anders als pAM2 (α-3) enthält pAM4 (α-2) noch zwei PvuII-Stellen (vgl. Fig. 3). Um die Konstruktion von Hybrid-IFN-Genen an der PvuII-Stelle innerhalb der IFN codierenden Region zu erleichtern, wird die zweite PvuII-Stelle innerhalb der extracistronischen Region eliminiert.
Diese Modifizierung von Plasmid pAM4 ist im wesentlichen eine Deletion der 3'-extracistronischen IFN α-2 cDNA-Sequenz zwischen PstI und der 3'-extracistronischen PvuII-Stelle (vgl. Fig. 3). pAM4 wird teilweise mit PvuII [5 ug pAM4 in 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 Einheit/ug PvuII (Biolabs) zugesetzt, Verdau für 5 Minuten bei 37ºC, Stop durch Phenol-Extraktion] verdaut und an [³²P]-PstI-Linker (Collaborative Research, Methode wie im Beispiel 1 beschrieben) ligiert. Das DNA-Gemisch wird in E. coli HB 101 wie oben transformiert, und die Plasmide von 16 Kolonien werden durch Restriktionsenzymanalyse unter Verwendung von PstI, PvuII und HindIII hinsichtlich der Gegenwart einer Deletion mit der korrekten Größe (246 bp) gescreent. Aus den 16 gescreenten Kolonien sind drei unmodifiziertes pAM4, eine ist ein Multimer, fünf haben eine große Deletion (620 bp) und sieben tragen die gewünschte kleine Deletion (246 bp). Ein Klon mit einem verkürzten IFN α-2-Insert (HindIII-PstI-kleines Fragment nun 907 bp) wird gewählt und mit pAM21 bezeichnet.

Beispiel 3: Konstruktion von Pvu-Hybriden mit Crossover-Stellen an der Aminosäure 92:

Plasmide pAM2 (α-3) und pAM21 (α-2) werden jedes mit HindIII und PvuII geschnitten, was zur Excision von DNA-Fragmenten (521 bp) führt, die die β-Lactamase-Promotorsequenzen und die N-terminalen Hälften der IFN-Gene (für Aminosäuren 1 bis 92 codierend) enthalten. Die großen und kleinen Fragmente (etwa 4Kb bzw. 521 bp) werden durch Saccharosegradienten-Zentrifugation getrennt, und die großen Fragmente werden dephosphoryliert durch Behandlung mit 1 ug DNA-Fragmenten in 50 ul 50 mM Tris pH 8 mit 1 Einheit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm pro 10 pmol 5'-Enden für 30 min bei 37ºC. Hybrid-IFN "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;"- und "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;"-Gene werden durch Ligation der entsprechenden großen und kleinen DNA-Fragmente konstruiert, die oben beschrieben wurden [großes HindIII-PvuII-Fragment ( 4Kb) aus pAM2 ligiert an das kleine HindIII- PvuII-Fragment (521 bp) aus pAM21 führte zum Typ B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;-IFN, etc.]. Ligation erfolgt in 10 ul-Volumina, enthaltend 20 mM Tris.HCl pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP, 40 Einheiten/ul T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) und ungefähr 500 ng große DNA-Fragmente und 20-40 ng kleine DNA-Fragmente. Nach 5 h bei 15ºC werden 5 ul der Ligationsmischungen verwendet, um E. coli HB101 wie oben zu transformieren, was zu jeweils etwa 1000 transformierten Kolonien führt. Es werden jeweils drei Kolonien herausgenommen, ihre Plasmid-DNA wird isoliert und mit den Enzymen HindIII, PvuII, EcoRI, TaqI und PstI analysiert. Zwei Kolonien, die Plasmid-DNAs der vorhergesagten Struktur [pAM 27 ("B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;") und pAM 33 ("D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;")] enthalten, werden ausgewählt.

Beispiel 4: Konstruktion von Hybrid-IFN-Genen "crossed over" bei Aminosäure 150:

Plasmide pAM 2 (α-3) und pAM 21 (α-2) werden jedes mit PvuII und PstI verdaut. Die DNA-Fragmente werden durch Saccharosegradienten-Zentrifugation in große PvuII-PstI-Fragmente (etwa 4 Kb, für die N-terminalen 92 Aminosäuren von IFNs α-2 und α-3 codierend) und kleine PvuII-PstI- Fragmente (386 bzw. 495 bp lang, für die C-Termini von IFNs α-2 und α-3 codierend) getrennt. In einem zweiten Schritt werden die gereinigten kleinen PvuII-PstI-Fragmente von pAM2 und pAM21 jedes wie folgt ³²P-markiert:
Die DNA-Fragmente ( 1 ug) werden jedes in 50 ul 50 mM Tris-HCl pH 8,0 gelöst und dephosphoryliert durch Behandlung mit 1 U/10 pmol 5'-Enden alkalischer Phosphatase für 30 min bei 37ºC. Das Enzym wird durch Inkubation für 1 Stunde bei 65ºC inaktiviert, und die DNA wird durch Adsorption und Elution von DEAE-Cellulose gereinigt und in Ethanol ausgefällt. Die DNA wird in einem 20-ul-Reaktionsvolumen phosphoryliert, das 50 mM Tris-HCl pH 9,5/10 mM MgCl&sub2;/(5 mM DTT, 30-40 ul lyophilisiertes γ-[³²P]-ATP (Amersham, 6000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) und 0,5 U/ul T&sub4;-DNA-Kinase (P.L Biochemicals) enthält. Nach 20 min bei 37ºC wird die Reaktion durch Zugabe von EDTA zu 10 mM gestoppt. Ein Überschuß ( 4 ug) entsprechendes unbehandeltes DNA-Fragment wird dann zugesetzt, und die Lösung wird mit Phenol und Chloroform extrahiert. DNA wird von dem restlichen γ-[³²P]-ATP durch Chromatographie durch Sephadex G-50 in TNE getrennt. Die ausgeschlossenen Peak-Fraktionen, wie durch Cerenkov-Zählung überwacht, werden zusammengefaßt und mit Ethanol präzipitiert.
Die ³²P-markierten PvuII-PstI kleinen Fragmente werden jedes vollständig mit Sau3A verdaut, und die restringierte DNA wird durch Elektrophorese in einem 6 % Polyacrylamidgel unter Verwendung von TBE als Laufpuffer getrennt. 4 DNA-Fragmente, die PvuII-Sau3A (172 bp jedes, für Aminosäuren 93 bis 150 von IFNs α-2 und α-3 codierend) und Sau3A-PstI (214 bp bzw. 323 bp, für Aminosäuren 151 bis 166 von IFNs α-2 und α-3 codierend) entsprechen, werden aus dem Gel isoliert.
Durch Religation von 3 passenden Fragmenten (siehe Tabelle 2) werden 4 Hybrid-IFN-Typen "crossed over" bei Aminosäure 150 generiert. Die entsprechenden Plasmide werden in einer Reihe von Schritten rekonstruiert; in einer ersten Ligationsreaktion werden äquimolare Mengen von PvuII-Sau3A- und Sau3A-PstI-DNA-Fragmenten in 10 ul Ligationspuffer, der 20 mM Tris.HCl pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP und 40 Einheiten/ul T&sub4;-DNA-Ligase enthält, 3-6 Stunden bei 15ºC ligiert (was zu concatemerer DNA führt). Nach Verdauung mit PvuII-PstI und Extraktion mit Phenol/Chloroform (1:1) wird ein Überschuß an entsprechendem PvuII-PstI großem Fragment [dephosphoryliert: typischerweise 1 ug DNA in 50 ul 50 mM Tris.HCl pH 8 (etwa 0,6 pmol 5'-Enden) behandelt mit 0,06 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm für 30 min bei 37ºC] zugesetzt, und die DNA wird wieder ligiert. E. Coli HB 101 wird transformiert, und 4 Klone, die DNA der vorhergesagten Struktur tragen, wie durch Restriktionsanalyse bestimmt wird (PvuII, Sau3A, TaqI und EcoRI), werden herausgenommen. Die Klone werden E. coli HB 101 pJC334, pJC37, pJC342 und pJ344 (vgl. Tabelle 2) genannt.

Tabelle 2:

Ursprung von DNA-Fragmenten, die für die Konstruktion der Hybrid-IFNs - "crossed over" bei Aminosäure 150 - verwendet werden. In Klammern werden die IFN-Type und der Abschnitt von αIFN, für den auf den Fragmenten codiert wird, angegeben. ligierte DNA-Fragmente (Länge) resultierende Hybrid-IFN-Type Klon- und Plasmid-Bezeichnung PvuII-PstI (etwa 4Kb) PvuII-Sau3A (170 bp) Sau3A-PstI

Beispiel 5: Konstruktion von Hybrid-IFN-Genen, "crossed over" bei Aminosäure 60:

Die Konstruktion dieser Hybrid-IFN-Gene erfolgt im wesentlichen auf die gleiche Weise wie im Beispiel 4 beschrieben.
Plasmide pAM 2 (α-3) und pAM 21 (α-2) werden jedes mit HindIII und PvuII geschnitten, und die Fragmente werden durch Saccharosegradienten-Zentrifugation getrennt. Die HindIII-PvuII- kleinen Fragmente (521 bp, die β-lac-Promotorregion enthaltend und für die N-terminalen 92 Aminosäuren von IFNs α-2 und α-3 codierend) werden ³²P-markiert und teilweise mit Sau3A (0,5 Einheiten Enzym pro ug DNA, 5 Minuten bei 37ºC, Stoppreaktion durch Phenolextraktion) verdaut. Das resultierende Gemisch von Fragmenten wird durch Elektrophorese in 6% -Polyacrylamidgel aufgelöst, und 4 Fragmente (zwei 424 bp-HindIII-Sau3A-Fragmente und zwei 97 bp-Sau3A- PvuII-Fragmente) werden aus dem Gel extrahiert. Religation von 3 passenden Fragmenten durch die schrittweise Vorgangsweise wie im Beispiel 4 beschrieben (s. Tabelle 3) und Transformation in E. coli HB 101 führt zu Transformanten von nur 2 der erwarteten 4 Konstruktionen: pAM65 ("D&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;") und pAM90 ("B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;"). Tabelle 3: Ursprung von DNA-Fragmenten, die für die Konstruktion von 2 Hybrid-IFN-Genen -"crossed over" bei Aminosäure 61 - verwendet werden. In Klammern werden die IFN-Type und der Abschnitt von αIFN, für den auf den Fragmenten codiert wird, angegeben. DNA-Fragment-Typ (Länge) resultierende Hybrid-IFN-Type Klon- und Plasmid-Bezeichnung HindIII-Sau3A (424 bp) Sau3A-PvuII (97 bp) HindIII-PvuII (etwa 4Kb)
Für die Konstruktion der anderen beiden Hybrid-IFN-Gene, "crossed over" bei Aminosäure 61, werden die Plasmide pAM65 und pAM90 jedes mit HindIII und PvuII geschnitten, und die kleinen HindIII-PvuII-DNA-Fragmente (521 bp) werden nach Elektrophorese in Agarose-Gelen isoliert. Ligation des kleinen HindIII-PvuII-Fragments von pAM90 mit dem großen HindIII-PvuII-Fragment von pAM2 führt zu pAM94 (B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;), und Ligation des kleinen HindIII-PvuII-Fragments von pAM65 mit dem großen HindIII-PvuII-Fragment von pAM21 ergibt Plasmid pAM76 (D&sub1;B&sub2;B&sub3;B&sub4;). Die Struktur der vier obigen Plasmid-DNAs wird durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt.
Die jeweiligen Klone werden als E.coli HB101 pAM65, pAM90, pAM94 und pAM76 bezeichnet.

Teil II: Konstruktion und Klonierung von Interferon α-2/α-3-Hybriden in Saccharomyces cerevisiae:

Alle Hybrid-Interferon-Protein codierenden Sequenzen, die nachstehend beschrieben werden, wurden an den PHO5-Promotor und die PHO5-Transcriptions-Terminations-Signale geknüpft, in den Hefe 2u Vektor pJDB207 kloniert und in den Hefestamm S. cerevisiae GFR18 transformiert.

Beispiel 6: Konstruktion von Expressionsplasmid p32RT (Δ72):

Plasmid pJDB207/IF2(5&sub1;) Δ 72 (Europäische Patentanmeldung 100.561) wird mit HindIII und EcoRI verdaut, und ein 470 bp-Fragment, das das Carboxyl-terminale Ende von Interferon α-2 und PHO5-Transcriptions-Terminations-Signale umfaßt, wird durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution [R. Yang u.a., Methods Enzym. 68, 176 (1979)] unter Verwendung von Micro-Collodion Bags (Sartorius, Göttingen, BRD) isoliert. Plasmid p31R (vgl. EP 100.561) wird mit HindIII und EcoRI verdaut, und der 4,1 kb-Vektorteil wird unter Anwendung derselben Technik isoliert. Nach Ligation von 200 ng Vektor und Insert-DNA unter Verwendung von E. coli T4-DNA-Ligase und Transformation von E. coli HB101 zu Ampicillin-Resistenz wird ein Plasmid isoliert, p31RT(Δ 72) genannt, den PHO5- Promotor, das C-terminale Ende von Interferon α-2 und PHO5-Transcriptions-Terminations-Signale enthaltend, und seine Struktur wird durch Restriktionsanalyse bestätigt.

Beispiel 7: Konstruktion der Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM104, AM114 und AM119:

PHO5-Expressionsplasmid p31RT(Δ 72) (siehe Beispiel 6) wird mit EcoRI und XhoI verdaut, und die zurückgesetzten 3'-Enden werden mit dCTP, dGTP, dATP und dTTP unter Verwendung von Klenow-Fragment von DNA Polymerase I von E. coli gefüllt. Die stumpfen Enden werden anschließend mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Plasmide pJC334, pAM90 und pJC337 (Beispiele 4 und 5) werden mit TaqI (pJC334 und pAM90) oder mit TaqI und EcoRI (pJC337) verdaut, und die 3'-rückgesetzten Enden werden mit den entsprechenden Desoxynucleotiden gefüllt, wie oben beschrieben. DNA-Fragmente von ungefähr 560 Basenpaaren werden durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution unter Verwendung von Micro-Collodion Bags wie oben isoliert. Ligation von 200 ng hergestelltem Vektorteil von Plasmid p31RT(Δ72) und 200 ng eluierten DNA-Fragmenten unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und Transformation von E. coli HB 101 zu Ampicillin-Resistenz führt zu Plasmiden p31R/IFN AM104 (die Hybrid-Interferon "D&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" codierende Sequenz enthaltend), p31R IFN AM119 (die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" codierende Sequenz enthaltend) bzw. p31R IFN AM114 (die Hybrid-Interferon "D&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" codierende Sequenz enthaltend). Durch Schneiden dieser Plasmide mit BamHI und HindIII wird ein DNA-Fragment von ungefähr 1300 bp mit der Konfiguration PHO5-Promotor - IFN-Protein codierende Sequenz - PHO5-Transcriptions-Terminations-Signal durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Dieses Fragment wird zwischen HindIII- und BamHI-Stellen von Plasmid pJDB207 kloniert. Die Plasmide werden in den Hefe-Stamm GFR18 zu Leu+ transformiert (vgl. EP 100.561, auch Beispiel 14). Die resultierenden Klone werden als S. cerevisiae GFR 18/pJDB207 PHO5/IFN AM104, GFR18/pJDB207 PHO5/IFN AM114 und GFR18/pJDB207 PHO5/IFN AM119 bezeichnet.

Beispiel 8: Konstruktion von Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM129:

Plasmid pAM94 (Beispiel 5) wird vollständig mit TaqI geschnitten und teilweise (in Gegenwart von 10 ng/ml Ethidiumbromid) mit EcoRI. Ein DNA-Fragment von etwa 580 bp wird durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert und zu dem EcoRI- und XhoI-geschnittenen, Gel-gereinigten Vektorteil von Plasmid p31RT(Δ 72) (vgl. Beispiel 6) ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 zu Ampicillin-Resistenz wird das Plasmid p31R PHO5/IFN/AM129 isoliert. Dieses Plasmid, das die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" codierende Region enthält, wird mit HindIII und BamHI verdaut, und das 1300 bp DNA-Fragment wird in pJDB207 wie im Beispiel 7 beschrieben ligiert. Das Plasmid wird in Hefe-Stamm GFR 18 wie oben transformiert. Der resultierende Klon wird mit S. cerevisiae GFR18/pJDB 207 PHO5/IFN AM129 bezeichnet.

Beispiel 9: Konstruktion der Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM106, AM110 und AM112:

Die Plasmide pJDB207 PHO5 IFN/AM104, AM114 und AM129 (siehe Beispiele 7 und 8) werden mit BamHI und PvuII verdaut, und die 6,8 Kb-Vektorteile, die die jeweiligen C-terminalen Enden der Interferon codierenden Regionen enthalten, werden durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Ebenso wird das Plasmid pJDB207R/(α-2) Δ72 (Europäische Patentanmeldung 100.561) mit BamHI und PvuII verdaut, und ein DNA-Fragment von 800 bp wird isoliert. Ligation der entsprechenden Fragmente und Transformation von E. coli HB101 gibt die Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM106 (die Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" codierende Region enthaltend), AM112 (die Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" codierende Region enthaltend) und AM110 (die Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;" codierende Region enthaltend). Der Hefe-Stamm GFR18 wird wie üblich transformiert. Die resultierenden Klone werden als S. cerevisiae GFR18 pJDB207 PHO5/IFN AM106, pJDB207 PHO5/IFN AM112 und pJDB207 PHO5/IFN AM110 bezeichnet.

Beispiel 10: Konstruktion der Plasmide pJDB207 PHO5/IFN DM 1 und DM 2:

Das Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM119 (Beispiel 7) wird mit HindIII und BglII verdaut, und der 7,5 Kb Vektorteil, der das N-terminale Ende der Interferon codierenden Region enthält, wird durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Ebenso werden die Plasmide pJDB207 PHO5/IFN AM114 und pJDB207 PHO5/IFN AM104 (s. Beispiel 7) jedes mit den gleichen Enzymen verdaut, und DNA- Fragmente von etwa 600 bp, die das C-terminale Ende der Interferon codierenden Region enthalten, werden isoliert. Die entsprechenden Fragmente werden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 werden die Plasmide pJDB207 PHO5/IFN DM1, die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" codierende Region enthaltend, und pJDB207 PHO5/IFN DM2, die Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" codierende Region enthaltend, erhalten. Der Hefe-Stamm GFR 18 wird wie oben beschrieben transformiert. Die resultierenden Klone werden als S. cerevisiae GFR pJDB207 PHO5/IFN DM1 und S. cerevisiae GFR18 pJDB207 PHO5/IFN DM2 bezeichnet.

Beispiel 11: Konstruktion des Plasmids pJDB207 PHO5/IFN HRi43:

Das Plasmid pJDB207R/IF(α-2) Δ72 (Europäische Patentanmeldung 100.561) wird mit BamHI und PvuII verdaut, und ein DNA-Fragment von 6,8 kb wird isoliert. Ebenso wird das Plasmid pJDB207R/IF (α-3) (EP 100.561) mit den gleichen Enzymen verdaut, und ein DNA-Fragment von 800 bp wird isoliert. Ligation der beiden DNA-Fragmente und Transformation von E. coli HB101 zu Ampicillin-Resistenz gibt das Plasmid pJDB207 PHO5/IFN HRi43, das die Hybrid-Interferon "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" codierende Region enthält. Der Hefe-Stamm GFR18 wird wie oben transformiert. Die resultierenden Klone werden als S. cerevisiae GFR18 pjDB207 PHO5/IFN HRi43 bezeichnet.

Beispiel 12: Transformation von Saccharomyces cerevisiae GFR18 und Induktion der Interferonproduktion:

Das Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM129 ("B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;") wird in Saccharomyces cerevisiae Stamm GFR18 eingeführt (α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR) eingeführt, analog wie beschrieben [Hinnen u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Ein ug Plasmid-DNA wird zu 100 ul einer Sphäroplasten-Suspension zugesetzt und das Gemisch wird mit Polyethylenglycol behandelt. Die Sphäroplasten werden mit 10 ml Regenerationsagar vermischt und auf Hefe-Minimalmedium-Platten ohne Leucin plattiert. Nach Inkubation für 3 Tage bei 30ºC werden etwa 1000 transformierte Zellen erhalten.
Eine einzelne Hefe-Kolonie von den Hefetransformationsplatten [Saccharomyces cerevisiae GFR 18/pJDB207 PHO5/IFN AM129 genannt] wird herausgenommen in 10 ml Hefe-Minimalmedium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben und bei 30ºC bei 200 UpM 24 Stunden zu einer Dichte von etwa 2-3x10&sup7; Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden einmal mit 20 ml niedrigem Pi-Minimalmedium [wie "Difco yeast minimal medium without amino acids", ergänzt mit 20 g/l Glucose, aber hergestellt aus den Komponenten gemäß der Rezeptur von Difco (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA), außer daß 0,03 g/l KH&sub2;PO&sub4; plus 1 g/l KCl statt 1 g/l KH&sub2;PO&sub4; verwendet werden] gewaschen. Drei ml der resuspendierten Zellen werden verwendet, um 300 ml niedriges Pi-Minimalmedium bzw. 300 ml normales Minimalmedium in 1000-ml-Erlenmeyerkolben zu inokulieren. Die Inkubation erfolgt bei 160 UpM bei 30ºC. Der Induktion des PHO5-Promotors folgt Messung des Auftretens von Saure-Phosphatase-Aktivität in ganzen Zellen, wie beschrieben (Tohe u.a., J. Bacteriol. 113, 727 (1973). Die Zellen werden zu etwa 1-2x10&sup7; Zellen/ml (26-30 h Inkubation) gezüchtet).

Beispiel 13: Herstellung von Hefezellenextrakten und Bestimmung des Interferon-Titers:

Zellen aus den 300 ml Kulturmedium (siehe Beispiel 12) bei einer Dichte von 1-2x10&sup7; Zellen/ml werden durch Zentrifugieren in einem Sorvall-GSA-Rotor für 5 Minuten bei 8000 UpM bei 4ºC gesammelt. Die Zellen werden einmal mit 100 ml H&sub2;O gewaschen, in 6 ml eiskalter Lyse-Mischung [0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,4, 1 % (v/v) Triton X-100, 0,0001 M PMSF (Merck)] resuspendiert und in ein 30-ml-Corex-Röhrchen transferiert. Die Suspension wird wieder 5 min in einem Sorvall-SS-34-Rotor bei 8000 UpM bei 4ºC zentrifugiert und in 3 ml Lyse-Mischung bei 0ºC resuspendiert. Vier Gramm Glasperlen (0,4 mm Durchmesser) werden zu den Zellen zugegeben, und die Suspension wird in einem Vortex-Mischer (Scientific Instruments Inc., USA) bei voller Geschwindigkeit 30 s geschüttelt und dann 1 min in einem Eisbad gekühlt. Dieses Schütteln wird 5 bis 10 Mal wiederholt, bis mehr als 90 % der Zellen zerbrochen sind (Prüfung unter dem Lichtmikroskop). Zelldetritus und Glasperlen werden durch Zentrifugieren für 10 min bei 8000 UpM bei 4ºC in einem Sorvall-HB-4-Rotor aus der Lösung entfernt. Der Überstand wird in Eppendorf-Röhrchen transferiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -60ºC gelagert. Die Interferon-Aktivität wird nach S. Rubinstein u.a. [J. Virol 37, 755 (1981)] zu 7.10&sup9; Einheiten/ml Zellextrakt bestimmt.
Auf analoge Weise wie in den Beispielen 12 und 13 beschrieben, wird der S. cerevisiae-Stamm GFR18 mit den Plasmiden pJDB207 PHO5/IFN AM119 ("B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;"), AM106 ("B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;"), AM112 ("B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;"), DM1 ("B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;"), DM2 ("B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;"),AM110 ("B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;") und HRi43 ("D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;") transformiert. Die resultierenden Stämme werden kultiviert. Die Zellen werden geerntet und die Interferon-Titer wie oben bestimmt. Die IFN-Titer sind wie folgt: S. cerevisiae GFR18/pJDB207PHO5/IFNAM119:5.10&sup9;Einheiten/ml;S.cerevisiaeGFR18/pJDB207PHO5/IFNAM106: 7.10&sup7; Einheiten/ml; S. cerevisiae GFR18/pJDB207 PHO5/IFN AM112: 2.10&sup8; Einheiten/ml; S. cerevisiae GFR18/pJDB207 PHO5/IFN DM1: 3.10&sup9; Einheiten/ml; S. cerevisiae GFR18/pJDB207 PHO5/IFN DM2 : 5.10&sup9; Einheiten/ml; S. cerevisiae GFR18/pJDB207 PHO5/IFN AM110: 3.10&sup8; Einheiten/ml; S. cerevisiae GFR18/pJDB207 PHO5/IFN HRi43: 1.10&sup9; Einheiten/ml.
Unter denselben Bedingungen geben S. cerevisiae-Stämme GFR18/pJDB207R/IF (α-2) und/IF (α-3) (EP 100.561) Titer von 1.10&sup8; bzw. 3.10&sup9; Einheiten/ml.

Beispiel 14: Herstellung von Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" durch transformierte Hefezellen im 30-I-Maßstab:

Der Hefestamm GFR18, der das Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM129, das für das Gen für Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" codiert, downstream vom Saure-Phosphatase-Promotor PHO5 trägt, wird auf die Oberfläche einer Agar-Kultur von YNB-Medium gestrichen. Die Platte wird bei 30ºC inkubiert, bis confluentes Wachstum beobachtet wird. Eine sterile Schleife wird verwendet, um einen Teil der Oberflächenkultur in einen Schüttelkolben zu transferieren, der das Vorkulturmedium enthält, IFN/21 enthaltend: Hefe-Extrakt (Difco) 10,0 g; L-Asparagin.H&sub2;O 6,6g; KH&sub2;PO&sub4; 1,0g; MgSO&sub4;.7H&sub2;O 1,9g; L-Histidin 0,02g; D-Glucose (Monohydrat) 33,0g pro 1 l entionisiertes Wasser.
Der 500-ml-Kolben hat einen einzigen Strombrecher und enthält 100 ml Medium. Das Medium wird unter Verwendung von entionisiertem Wasser hergestellt und hat einen pH-Wert von ungefähr 6,0. Die Glucose wird separat sterilisiert. Nach Inokulieren wird die erste Vorkultur 24 Stunden bei 30ºC auf einem Orbitalschüttler mit 5 cm Hub bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdr./min inkubiert. Der erste Vorkultur-Kolben bietet ein Inokulum für die zweiten Vorkulturkolben. Diese Kolben erhalten Inokulum von 1 % (v/v). Das Medium und die Inkubationsbedingungen sind identisch mit jenen für die erste Vorkultur. Es werden ausreichend Kolben aus der zweiten Vorkultur-Stufe vereinigt, um für 1 % v/v Inokulum für den 30-l-Fermenter (3 Kolben/Fermenter) zu sorgen. Der Produktionsfermenter hat ein Betriebsvolumen von 30 l, enthält 4 Strombrecher und einen einzelnen 6-Schaufel-Turbinenrührer mit einem Durchmesser von 115 mm. Die Rührgeschwindigkeit ist 600 U/min, Luft wird zu 1 Vol./Vol./min eingebracht und der Überdruck wird auf 0,3 bar gehalten. Die Fermentionstemperatur beträgt 30ºC. Der Fermenter wird mit Medium IFN/23 sterilisiert, das: Hefe-Extrakt (Difco) 2,0 g; L-Asparagin.H&sub2;O 6,6 g; MgSO&sub4;.7H&sub2;O 1,0 g; L Histidin 0,02 g; D-Glucose (Monohydrat) 33,0 g pro 1 l entionisiertes Wasser enthält, wobei Glucose separat sterilisiert und zugegeben wird, um ein Endvolumen von 30 l zu erreichen.
Nach der Inokulation wird der Fermentations-pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid so kontrolliert, daß er nicht unter 6,0 fällt. Die Fermentation dauert etwa 18 Stunden oder bis die maximale Ausbeute an Interferon erreicht ist.
Die optische Dichte, die ein geeignetes Maß für das Wachstum der Hefe ist, erreicht einen Wert zwischen 6-7 OD-Einheiten. Die Glucose wird weitgehend, aber nicht vollständig verbraucht, und es gibt eine Induktion der Saure-Phosphatase-Aktivität gleichzeitig mit der Produktion von Interferon.
Der Interferon-Titer kann in Rohextrakten gemessen werden, die durch mechanische Zellzerstörung im Labor hergestellt werden, und beträgt 7.10&sup9; Einheiten/l Zellextrakt. Der Proteingehalt des Rohextrakts beträgt ungefähr 1 mg/ml.
Am Ende der Fermentation kann die Kulturbrühe, falls erforderlich, vor dem Ernten und der Gewinnung des Hybrid-Interferons auf 10ºC gekühlt werden.
30 l Kulturbrühe von pH 6,0 werden auf 10ºC gekühlt, und die Zellen werden mit einer Sharples -Zentrifuge getrennt. Der klare Überstand enthält keine IFN-Aktivität. Die erhaltene Zellmasse wird mit Puffer X (2 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 20 uM Phenylmethylsulfonylfluorid) auf 1400 ml eingestellt und hat einen pH-Wert von 8,0. Nach Abkühlen auf 5-10ºC leitet man die Suspension durch eine DYNO -Mill (Type KDL Pilot, 0,6 l), die mit Polyurethan-Rührscheiben und 500 ml Glasperlen von 0,5-0,75 mm Durchmesser versehen ist und eine Rührgeschwindigkeit von 3000 UpM und eine Beschickungsrate von 10 l/h hat, wobei die Zellen zerstört werden. Die Suspension hat einen pH-Wert von 8. Die die gebrochenen Zellen enthaltende Suspension wird durch Zentrifugieren geklärt. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Sorvall-6SA-Rotor bei 12000 UpM bei 4ºC 20 min lang.
Der Stamm S. cerevisiae GFR18, der das Plasmid pJDB207 PHO5/IFN AM119, AM106, AM112, DM1 bzw. DM2 trägt, kann kultiviert werden, und eine geklärte Lösung, die das entsprechende Hybrid-Interferon enthält, kann auf analoge Art hergestellt werden.

Beispiel 15: Herstellung von Extrakten von E. coli-Stamm HB101/pAM94 und Bestimmung der IFN-Aktivität:

E. coli-Stamm HB101/pAM94 wird zu einer optischen Dichte von 8 bei 650 nm in 1 Liter M 9 Medium gezüchtet, das 0,4 % Casaminosäuren und 2 % Glucose enthält. Die Zellen werden sedimentiert und in Puffer resuspendiert (16 g Zellen in 160 ml Puffer), der 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA und 100 uM PMSF enthält. Lysozym wird zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Die Lösung wird dann 30 min auf Eis gehalten. Die Zellen in dieser Suspension werden unter Verwendung eines Sorvall-Omnimix in einer Einstellung von 3 Mal 60 Sekunden geöffnet. Die Suspension, die die gebrochenen Zellen enthält, wird durch Zentrifugieren in einem Sorvall-6SA-Rotor bei 12000 UpM bei 4ºC 20 min geklärt. Der Überstand wird hinsichtlich der IFN-Aktivität nach der Methode von Rubinstein u.a. (oben erwähnt) untersucht.
Es wird eine IFN-Aktivität von 5.10&sup7; Einheiten/ml Zellextrakt gefunden.
Auf analoge Weise werden die E. coli-Stämme HB101/pAM90, pJC344 und pJC342 kultiviert, und die Interferon-Titer werden wie oben bestimmt, sie sind 5.10&sup8;, 5.10&sup7; bzw. 5.10&sup6; Einheiten/ml Zellextrakt.

Beispiel 16: Herstellung von Hybridomzellen:

a) Immunogenquelle:

Eine Probe von halbgereinigtem natürlichem Human-Leukozyten-IFN (IFNα), erhalten von Dr. K. Cantell (Helsinki), mit einer spezifischen Aktivität von 13x10&sup6; IU pro mg Protein wird für die Immunisierungen verwendet.

b) Immunisierungsprotokoll:

Sieben weibliche Balb/c Mäuse (Tierfarm Sisseln, Schweiz), 10-14 Wochen alt, werden durch Injizieren von 4x10&sup5; IU IFNα (Beispiel 16a), emulgiert in vollständigem Freund's Adjuvans (Difco), in die vier Fußballen immunisiert. Eine weitere Injektion von 4 x 10&sup5; IU IFNα in unvollständigem Freund's Adjuvans wird am Tag 30 gegeben und eine Auffrischungsinjektion (i.p.) von 6 x 10&sup5; IU IFNα in PBS am Tag 60. Drei Tage später wird die Milz für die Fusionierung entnommen.

c) Zellfusion:

Alle Fusionsexperimente werden gemäß der Methode von G. Köhler und C. Milstein [Nature 256, 495 (1975)] unter Verwendung von nicht-sezernierender Sp 2/O-Ag14 Myclom- Linie [M. Shulman, C.D. Wilde und G. Köhler, Nature 276, 269 (1978)] durchgeführt. 10&sup8; Milz- Zellen werden mit 10&sup7; Myclom-Zellen in Gegenwart von 1 ml 50 % Polyethylenglycol (PEG 1500, Serva) vermischt. Nach dem Waschen werden die Zellen in 48 ml Standard-Bulbecos essentiellem Minimalmedium (Gibco Nr. 0422501) resuspendiert. 3 x 10&sup6; normale peritoneale Mäuse-Exsudatzellen pro Fusion werden als Feeder-Zellen zugesetzt. Die Zellen werden in 48 x 1 ml "costar" Vertiefungen verteilt, und 3 Mal pro Woche wird Standard-HAT-Selektionsmedium zugeführt, 3 bis 6 Wochen lang. Wenn das Wachstum von Hybridom-Zellen sichtbar wird, werden die Überstände durch einen kombinierten Immunpräzipitations-Bioassay (Beispiel 19) gescreent. Aus einer Gesamtheit von 221 Hybridomen finden sich 10 Hybridome, die anti-IFNα-Antikörper produzieren. Die Hybridomzellen werden durch limitierende Verdünnung in Mikrotiterplatten zumindest einmal kloniert. Hybridom 144 BS wird für weitere Studien gewählt, weil es besonders stabil ist und große Mengen Immunglobulin abgibt.

Beispiel 17: Isolierung und Reinigung von monoklonalem Antikörper:

Balb/c Mäuse, 8-10 Wochen alt (Tierfarm Sisseln, Schweiz), werden intraperitoneal mit 0,3 ml Pristan (Aldrich) vorbehandelt. 2-3 Wochen später werden 2-5x10&sup6; klonierte Hybridom-Zellen und 0,2 ml Pristan intraperitoneal inokuliert. Nach 8-10 Tagen wird Aszites-Flüssigkeit gesammelt, bei 800 x g zentrifugiert und bei -20ºC gelagert.
Aufgetautes Aszitesfluid wird bei 50000 x g 60 min zentrifugiert. Eine auf der Oberfläche schwimmende Fettschicht wird sorgfältig entfernt, und die Proteinkonzentration wird auf eine Konzentration von 10-12 mg/ml eingestellt. Roh-Immunglobulin wird durch tropfenweise Zugabe von 0,9 Volumsäquivalenten gesättigtem Ammoniumsulfat bei 0ºC ausgefällt, dann in 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Eine Immunglobulinfraktion wird durch DEAE-D52-Cellulose (Whatman)-Chromatographie unter Verwendung eines Puffergradientensystems von 20 mM Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9, erhalten. Das Immunglobulin wird wieder mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in PBS bei einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) demonstriert einen Reinheitsgrad von mehr als 95 % für die monoklonalen Antikörper 144 BS.

Beispiel 18: Herstellung einer Immunadsorbens-Säule:

Ein ml abgesetztes Affi-Gel 10 (Bio- Rad) wird an 17 mg monoklonale Antikörper 144 BS nach den Anweisungen des Herstellers gekoppelt: Affi-Gel 10 wird auf einem Sinterglasfilter zuerst mit kaltem destilliertem Wasser und dann mit einer 0,1 M NaHCO&sub3;-Lösung pH 8,0 (Kopplungspuffer) gewaschen. Eine Suspension von 50 % Gel in Kopplungspuffer wird in ein Kunststoffröhrchen transferiert, mit einem gleichen Volumen gereinigter monoklonaler Antikörper-Lösung vermischt und 4 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Nach der Kopplung wird das Gel mit Kopplungspuffer gewaschen und, um nicht umgesetzte Stellen zu blockieren, mit 0,1 ml 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8,0) 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Gel wird mit PBS in Gegenwart von 10 mM NaN&sub3; gewaschen und darin bei 4ºC gehalten.

Beispiel 19: Reinigung von rekombinantem IFNα durch Immunoaffinitäts-Chromatographie:

Eine Suspension von gebrochenen E. coli-Zellen, die rekombinante IFNα produzieren, z.B. E. coli HB 101/pAM94 (vgl. Beispiel 15), wird durch Zentrifugieren in einem Sorvall-6SA-Rotor bei 12000 UpM bei 4ºC 20 min geklärt. Polyethylenimin (Polyimin P , Fluka, pH 8,0) wird zum Überstand zu einer Endkonzentration von 0,25 % (w/v) zugesetzt. Die Lösung wird eine Stunde gerührt und anschließend zentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand zu 65 % Sättigung mit kaltem Ammoniumsulfat gebracht. Diese Mischung wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in einem Zehntel Volumen (15-20 ml) PBS (pH 7,2) suspendiert. Die Lösung wird über Nacht gegen 0,02 % NaN&sub3; enthaltendes PBS dialysiert.
Die dialysierte Lösung wird mit 1 ml des Immunoaffinitätsgels von Beispiel 18 gemischt. Diese Mischung wird 1 Stunde leicht bewegt, dann in eine Säule gepackt und nacheinander mit 5 Säulenvolumina PBS, 5 Säulenvolumina 0,5 M NaCl und 0,2 % Triton X-100 enthaltendem PBS und 5 Säulenvolumina PBS gewaschen. Alternativ wird das Immunoaffinitätsgel zuerst in eine Säule gepackt und die dialysierte Lösung oben aufgegeben, dann wie beschrieben gewaschen. Das rekombinante Hybrid-IFNα ("B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;") wird mit einem sauren Puffer pH 2,5 eluiert, der 0,1 M Citronensäure und 0,3 M NaCl enthält. Die aktiven IFN-Fraktionen werden mit 1 M Tris neutralisiert, gegen PBS dialysiert und auf etwa 0,1 mg/ml Protein unter Verwendung von Ultrafiltrations "flat bed membranes" XM10 (Amicon Corp.) konzentriert.
Die maximale Kapazität der Immunadsorbenssäule von Beispiel 18, die 17 mg monoklonalen Antikörper 144 BS enthält, ist etwa 1,2 mg von jedem von IFN-α-2- und IFN-α-3-Polypeptiden, zumindest 0,8 mg IFN-α-1-Typ Polypeptid, 1,15 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;", 1,25 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", 1,25 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", 0,44 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;", 1,6 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;", 1,6 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;", 1,15 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;" und 1,25 mg Hybrid-Interferon "D&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;". Das Immunadsorbensgel kann für bis zu 50 Trennungen ohne wesentlichen Kapazitätsverlust verwendet werden. Nach dieser Methode gereinigte rekombinante IFN-α-2-, IFN-α-3-, IFN-α-1-Typ Polypeptide und Hybrid- -Interferone sind auf SDS-PAGE homogen.

Beispiel 20: Reinigung von Hybrid-Interferonen unter Anwendung von Fällung und chromatographischen Methoden:

1 l Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" enthaltende Lösung, durch Zentrifugieren (vgl. Beispiele 13-15) gereinigt, wird mit 2 M HCl angesäuert, bis die Lösung pH 2,2 erreicht. Die Lösung wird 1 h bei 4ºC gerührt, und das ausgefällte Protein wird mittels Zentrifugation (GSA Rotor Sorvall bei 12000 UpM bei 4ºC für 20 Minuten) abgetrennt. Das Pellet wird verworfen und der Überstand mit festem Ammoniumsulfat auf 30 % Sättigung gebracht. Diese Lösung wird 1 h bei 4ºC gerührt und dann zentrifugiert. Der das Interferon enthaltende Überstand wird dann gegen 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; bei pH 8,2 dialysiert. Man findet eine Interferon-Aktivität von etwa 10&sup8; IU/ml.
Eine Säule, die 50 ml chelatierende Sepharose 6B (Pharmacia), beladen mit Cu²&spplus;-Ionen gemäß den Anweisungen des Herstellers, enthält, wird unter Verwendung von 250 ml 0,05 M Natriumacetat pH 7,0 und 0,5 M NaCl äquilibriert. 200 ml dialysierte Lösung (siehe oben) werden bei 4ºC auf die Säule aufgebracht. Die Säule wird mit 150 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen. Elution von gebundenem Interferon erfolgt unter Anwendung eines linearen Gradienten von 250 ml 0,05 M Natriumacetat pH 7,0 und 0,5 NaCl, 250 ml 0,05 M Natriumacetat pH 2,8 und 0,5 M NaCl, und gefolgt von Waschung mit 150 ml 0,05M Natriumacetat pH 2,8 und 0,5 M NaCl.
Die aktiven Interferon-Fraktionen werden zusammengefaßt und gegen 0,05 M Tris HCl-Puffer pH 8,0 dialysiert. Die Interferon-Aktivität in der dialysierten Lösung beträgt etwa 10&sup8; IU/ml. Die maximale Kapazität der Säule beträgt etwa 75 mg Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;".
Eine Säule, die 50 ml Q-Sepharose-Anionenaustauscher (Pharmacia) enthält, wird unter Verwendung von 250 ml 0,05 M Tris.HCl-Puffer pH 8,0 äquilibriert. 100 ml der obigen dialysierten Interferon enthaltenden Lösung werden bei Raumtemperatur auf die Säule aufgebracht. Die Säule wird anschließend mit 50 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen. Gebundenes Interferon wird unter Anwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 0,7 M NaCl in 200 ml 0,05 M Tris.HCl pH 8,0 eluiert. Das reine Interferon eluiert bei etwa 0,3 M NaCl. Die aktiven Fraktionen zeigen eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 19000, wenn an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert wird. Die maximale Kapazität der Anionenaustauschsäule ist etwa 50 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;".
Auf analoge Art können die Hybrid-Interferone "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" gereinigt werden.

Beispiel 21: Lyophilisierung von Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;":

Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;", über Immunaffinitäts-Chromatographie unter Verwendung von monoklonalem Antikörper 144 BS oder über herkömmliche chromatographische Methoden (vgl. Beispiel 20) gereinigt, wird gegen 0,5 M NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert und anschließend lyophilisiert. Kleine Volumina Wasser werden zweimal zu der lyophilisierten Probe zugesetzt, um NH&sub4;HCO&sub3; vollständig zu entfernen. Die Lösung wird dannn wieder lyophilisiert.
Rekonstitution der Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;"-Lösung wird wie folgt durchgeführt: 0,5 M NH&sub4;HCO&sub3; wird der lyophilisierten Probe zugesetzt um eine Interferon-Konzentration von etwa 0,1 mg/ml zu erhalten. Das wiederaufgelöste Interferon hat eine spezifische antivirale Aktivität von 2.10&sup8; IU/mg, welche Aktivität der des entsprechenden Wertes vor der Lyophilisierung identisch ist.

Beispiel 22: Physikochemische Charakterisierung von Hybrid-Interferonen:

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone und die ursprünglichen Interferone werden Polyacrylamid-SDS-Gelelektrophorese nach der von Laemmli [Nature 227, 680 (1970)] beschriebenen Methode unterworfen. Die scheinbaren Molekulargewichte der Hybrid-Interferone, in Kilo-Dalton (kD) angegeben, werden in der Tabelle 4 angegeben. Die Tabelle 4 enthält auch die Isoelektrischen Punkte (pI) der Hybrid-Interferone, wie unter Verwendung von Ampholine enthaltenden LKB-Polyacrylamid- Gelen bestimmt. Tabelle 4: Scheinbare Molekulargewichte und isoelektrische Punkte von Hybrid-Interferonen scheinb. Molekulargewicht
Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Hybrid-Interferone wird unter Verwendung eines 470 A Protein-Sequenators von Applied Biosystems oder unter Verwendung eines 890 C Beckman-Sequenators bestimmt. In beiden Fällen wird automatisierter Edman-Abbau durchgeführt. Die gefundene Struktur ist in voller Übereinstimmung mit der erwarteten. Die N-terminale Aminosäure ist Cystein.

Beispiel 23: Effekt von Hybrid-Interferonen auf den Level der (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase-Aktivität in Daudi-Zellen:

Daudi-Zellen werden zu 2 x 10&sup5; Zellen/ml in RPMI 1640-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum, das die angegebene Konzentration (vgl. Tabelle 8) der Hybrid-Interferone "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" und "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" enthält, gesät. Nach 24 Stunden Behandlung werden 5 x 10&sup6; Zellen pro Probe zentrifugiert (9000 U/min) und in 500 ul kaltem Lyse-Puffer (20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure-Puffer pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 120 mM KCl, 7 mM Dithiothreitol, 10 % Glycerin, 0,5 % Nonidet P 40) resuspendiert und 2 Minuten auf Eis inkubiert. Die Proben werden dann zentrifugiert (9000 U/min, 8 min, 4ºC), und der Überstand wird gewonnen und hinsichtlich der (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase-Aktivität wie folgt untersucht:
Der Überstand wird mit 50 ul Poly(rI).(rC)-Agarose (P-L Biochemicals) 15 Minuten bei 30ºC vermischt, und das nicht adsorbierte Material wird durch Zentrifugieren entfernt. Das Poly(rI).(rC)-adsorbierte Material wird mit 2,5 mM (α³²P)-ATP, 400 Ci/mmol (Amersham International) 20 h bei 30ºC inkubiert, mit bakterieller alkalischer Phosphatase (Sigma) behandelt und dann aus einer Säule von sauerem Aluminiumoxid (Sigma) (300 ul) mit 3,0 ml 1 M Glycin-HCl-Puffer pH 2,0 wie beschrieben [Merlin u.a., Analyt. Biochem. 110, 190 (1981)] eluiert. Die Ergebnisse in der Tabelle 5 werden als Vielfaches des Anstiegs der (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase-Aktivität in mit Interferon behandelten Zellen im Verhältnis zum Level der Enzymaktivität in unbehandelten Vergleichszellen (mittlere Aktivität 51,6 ± 8,7 pmol/h/10&sup5; Zellen) ausgedrückt. Tabelle 5 Vielfaches des Anstiegs der (2'-5') (A)-Synthetase-Aktivität [pmol ATP eingebracht/h/10&sup5; Zellen] IFN-Konzentration [Einheiten/ml]

Beispiel 24: Pharmazeutische Zubereitung (Parenterale Verabreichung):

2 mg Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" mit einer spezifischen Aktivität von 1,3.10&sup8; Einheiten/mg auf Human-WISH-Zellen werden in 30 ml 5N Humanserumalbumin gelöst. Die resultierende LÖsung leitet man durch ein bakteriologisches Filter, und die filtrierte Lösung wird unter aseptischen Bedingungen in 100 Vials, die jeweils 2,6.10&sup6; Einheiten reines Hybrid-Interferon enthalten, unterteilt. Die Vials, die sich für parenterale Verabreichung eignen, werden vorzugsweise in der Kälte gelagert, z.B. bei -20ºC.
Auf die gleiche Art können 5,2.10&sup6; oder 1,04.10&sup7; Einheiten enthaltende Vials durch Verwendung von 4 bzw. 8 mg des Hybrid-Interferons zubereitet werden.
Auf analoge Weise können Hybrid-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;", "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" oder "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" enthaltende Vials (spezifische Aktivitäten 1,28.10&sup8;, 2.10&sup8;, 7,7.10&sup7;, 3,8.10&sup7; bzw. 8.10&sup7;) zubereitet werden.

Claims

1. Hybrid-Interferon-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus zwei bis vier Subsequenzen, die hinsichtlich der Identität und Zahl der Aminosäuren Subsequenzen von Human- Lymphoblastoid-Interferonen LyIFN-α-2 und LyIFN-α-3 entsprechen, wobei besagtes Hybrid-Interferon-Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren 1 bis 150 von LyIFN-α-2 und Aminosäuren 151 bis 166 von LyIFN-α-3, einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren 1 bis 92 von LyIFN-α-2, Aminosäuren 93 bis 150 von LyIFN-α-3 und Aminosäuren 151 bis 166 von LyIFN-α-2, und einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren 1 bis 60 von LyIFN-α-2, Aminosäuren 61 bis 92 von LyIFN-α-3, Aminosäuren 93 bis 150 von LyIFN-α-2 oder von LyIFN-α-3 und Aminosäuren 151 bis 166 von LyIFN-α-2 oder von LyIFN-α-3.

2. Hybrid-Interferon-Polypeptid "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" mit der Formel

nach Anspruch 1.

3. Hybrid-Interferon-Polypeptid "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" mit der Formel

nach Anspruch 1.

4. Hybrid-Interferon-Polypeptid "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" mit der Formel

nach Anspruch 1.

5. Hybrid-Interferon-Polypeptid "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" mit der Formel

nach Anspruch 1.

6. Hybrid-Interferon-Polypeptid "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" mit der Formel

nach Anspruch 1.

7. Hybrid-Interferon-Polypeptid "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" mit der Formel

nach Anspruch 1.

8. Pharmazeutische Zubereitung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Hybrid-Interferons nach Anspruch 1 enthält.

9. Verwendung eines Hybrid-Interferons nach Anspruch 1 zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen.

10. Hybrid-Interferon nach Anspruch 1 zur Verwendung bei einer Methode zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

11. Verfahren zur Herstellung eines Hybrid-Interferons nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert wurden, der eine für das Hybrid-Interferon codierende DNA-Sequenz enthält, kultiviert werden und besagtes Hybrid-Interferon isoliert wird.

12. Rekombinanter Vektor, umfassend eine für ein Hybrid-Interferon nach Anspruch 1 codierende DNA-Sequenz.

13. Wirtszelle, die transformiert ist mit einem rekombinanten Vektor, der eine für ein Hybrid-Interferon nach Anspruch 1 codierende DNA-Sequenz enthält.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Stamm von Escherichia coli und einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae.