DD256149A1 - Verfahren und vorrichtung zur regelung der geloest-sauerstoff-konzentration - Google Patents
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Abstract
Es werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Regelung der Geloest-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium einer zugefuetterten Fermentation beschrieben. Ziel der Erfindung ist die Vermeidung von Sauerstofflimitation waehrend der gesamten Fermentation, insbesondere bei der Produktion hoher Biomassekonzentrationen. Die Aufgabe der Erfindung besteht demgemaess in der Regelung der Geloest-Sauerstoff-Konzentration und wird ueber die Zufuetterung von Naehrsubstrat geloest. Der Vorteil der Erfindung besteht in der Stetigkeit der Naehrsubstratzufuetterung und der daraus resultierenden Kontinuitaet des Stoffwechsels der Kultur.
Description
Hierzu 1 Seite Zeichnung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur zugefütterten, aeroben Fermentation und ist anwendbar in der mikrobiologischen Forschung und Industrie sowie bei der Abwasserbehandlung.
Bei verschiedenen Fermentationsprozessen ist die Einhaltung einer bestimmten Gelöst-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium erforderlich. Diese verläuft im Allgemeinen abfallend mit wachsender Biomassekonzentration.
Dem Stand der Technik entsprechen Verfahren zur Regelung der Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium durch Veränderung der Sauerstoffeintragsleistung des Fermentors /P. Präve u. a., Handbuch der Biotechnologie, R. Oldenburg-Verlag, München,
Der Nachteil dieser Verfahren besteht darin, daß dabei primär Parameter wie Rührerdrehzahl, Belüftungsrate, Fermentordruck usw. verstellt und sekundär Größen wie Scherbelastung, Mischverhalten, Gas-Hold-Up, Schaumniveau usw. verändert werden müssen, was aus Verfahrens- oder reaktortechnischen Gründen nicht erwünscht oder begrenzt sein kann.
Es ist bekannt, daß bei Limitation essentieller Substrate ein rascher Anstieg der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium erfolgen kann /siehe z. B. DD-PS 206493/. Es sind Verfahren zur Steuerung der Substratzufütterung bekannt, wobei der Substratzulauf in Abhängigkeit von der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium oder in der Abluft erfolgt /vgl. US-PS 3,384,553 und CH-PS 595441/. Bekannt ist weiterhin ein Verfahren zur aeroben Kultivierung, wobei das Substrat, speziell eine Kohlenstoffquelle, dann zugefüttert wird, wenn dieGelöst-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium um einen bestimmten Betrag innerhalb einer bestimmten Zeit ansteigt /DE-OS 2546236/.
Der wesentliche Nachteil der genannten Verfahren besteht in der periodischen und physiologisch wirksamen Unterbrechung der Nährsubstratzufütterung.
Der Anstieg der Sauerstoffkonzentration, welcher die Zugabe von Substrat auslöst, erfolgt erst bei praktisch vollständiger Auszehrung dieses Substrates. Nach Beginn der Zugabe vergeht eine bestimmte Zeit bis zum Wiedereinsetzen des Stoffwechsels. Danach kommt es zu einem unkontrollierbaren Absinken der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration, bis die zugesetzte Nährstoff menge verbraucht ist.
Diese periodische Störung des Gleichgewichtszustandes der mikrobiologischen Kultur kann Wachstumshemmung, Stoffwechselinstabilität und die Produktion unerwünschter Metabolite zur Folge haben./Pirt S. J., Principles of microbe and cell cultivation, Blackwell Scientifice 1975/.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Führung von Fermentationsprozessen unter Ausschluß von Sauerstofflimitation zur Erzeugung hoher Biomassen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung zu beschreiben, womit die Regelung der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration vorgenommen werden kann. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß dem Kulturmedium eine begrenzte Menge Nährsubstrat einmalig oder schrittweise zugesetzt wird, welche von der mikrobiologischen Kultur verbraucht ist, bevor im Kulturmedium Sauerstofflimitation auftritt, und daß danach die Zufütterung von weiterem Nährsubstrat durch stetige Zudosierung erfolgt, wobei allein durch Variation der Zuflußrate ein beliebiger Wert der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration innerhalb eines bestimmten Bereiches, vorzugsweise 10% bis 60% der relativen Sauerstoff-Sättigungskonzentration, eingestellt und konstantgehalten wird. Zur Realisierung des Verfahrens wird die Fermentation in zwei Phasen geteilt. Die erste Phase der Kultivierung dient dem Anwachsen der mikrobiologischen Kultur sowie der Einleitung eines quasistationären Kultivierungszustandes in der zweiten Phase. Sie ist gekennzeichnet durch einen Überschuß an Nährsubstrat und ein Absinken der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium. Das Absinken der Sauerstoffkonzentration wird ggf. durch Anheben der Sauerstoffeintragsleistung verzögert, z. B. durch Erhöhung der Rührerdrehzahl in den gegebenen Grenzen. Die einmalige oder schrittweise Zugabe von Nährsubstrat in der ersteh Phase wird so bemessen, daß die insgesamt zugesetzte Menge verbraucht ist, bevor die Sauerstoffkonzentration unter einen für die Kultivierung kritischen Wert absinkt. Der Zeitpunkt des Verbrauches wird angezeigt durch einen schnellen Anstieg der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration oder die rasche Änderung anderer Prozeßgrößen wie pH-Wert, CO2-Bildung u.a.. An diesem Punkt beginnt mit der stetigen Zufütterung von Nährsubstrat die zweite, quasistationäre Phase der Kultivierung. Je größer dabei die pro Zeiteinheit in das Kulturmedium geförderte Nährsubstratmenge ist, umso niedriger wird die Gelöst-Sauerstoff-Konzentration — und umgekehrt. Unter stetiger Zufütterung wird verstanden, daß keine physiologisch wirksame Unterbrechung der Nährsubstratzufütterung auftritt.
Die Konzentration des zugefütterten Nährsubstrates im Kulturmedium befindet sich auf einem Wert nahe Null, das bedeutet, daß es vollständig verbraucht wird.
Es wurde festgestellt, daß innerhalb der zweiten Kultivierungsphase eine Verdopplung bis Verdreifachung der Biomasse stattfinden kann.
Zur Sollwertführung der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration in der zweiten Phase dient die erfindungsgemäße Vorrichtung. Die Stetigkeit des Substratzuflusses wird durch ein lineares Regelprinzip realisiert. Das Regelprinzip beruht auf der kontinuierlichen Subtraktion des Sollwertes vom Istwert der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration und der Steuerung der Substratzuflußrate gemäß der erhaltenen Differenz. Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält den Fermentor mit einer Meßeinrichtung zur kontinuierlichen Messung der Gelöst-Saüerstoff-Konzentration im Kulturmedium, einen Subtrahierer, einen Sollwertgenerator, einen Regelverstärker, eine Dosiereinrichtung mit stetig verstellbarer Förderrate sowie das Vorratsgefäß für das zugefütterte Substrat. Das vom Substrahierer gebildete Differenzsignal gelangt über den Regelverstärker auf den Steuereingang der angeschlossenen Dosiereinrichtung, welche das Substrat vomVorratsgefäß in den Fermenter fördert.
Der Regelverstärker besteht im einfachsten Falle aus einem Proportionalverstärker, so daß die Substratzuflußrate um so größer ist, je größer die Differenz von Ist- und Sollwert ist. Zur Kompensation von Instabilitäten der Regelung, welche resultieren können aus Verzögerungs- und Totzeiten sowie Nichtlinearität des geregelten Systems, kann der Regelverstärker weitere Komponenten enthalten. Als Beispiel seien genannt integrierende und differenzierende Übertragungsglieder, welche dem zeitlichen Integral sowie der Änderungsgeschwindigkeit der Soll-Istwert-Differenz entsprechende Signale erzeugen und diese dem proportionalen Steuersignal nach dem Prinzip der Superposition überlagern.
Der Vorteil der Erfindung besteht insbesondere in der Führung der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration auf einem vorwählbarem konstanten Wert, ohne Unterbrechung der Nährsubstratzufuhr. Die dadurch erzielbare Kontinuität des mikrobiologischen Stoffwechsels wirkt sich außerordentlich günstig auf die Produktion großer Biomassekonzentrationen im Kulturmedium aus.
An Ausführungsbeispielen sollen das Verfahren und die Vorrichtung näher beschrieben werden. Es zeigt die Fig. ein Blockschema einer zur Durchführung des Verfahrens geeigneten Vorrichtung.
Im30l-Fermentorwird Escherichia coli bei einer Temperatur von 29°C und einem pH-Wert von 7,0 kultiviert. Das Kulturmedium enthält Mineralsalze, Spurenelemente und Glucose in wäßriger Lösung.
Die in der ersten Kultivierungsphase zugesetzte Menge an Glucose von insgesamt 75g je Liter Kulturlösung führt zu einer Biomassekonzentration von ungefähr 30g/l (Biotrockenmasse), bei der im Fermentor Sauerstofflimitation auftritt. Bei dieser Zelldichte und gleichzeitig maximalem Sauerstoff ei nt rag erreicht die Gelöst-Sauerstoff-Konzentration einen Wert von 20% der relativen Sauerstoff-Sättigungskonzentration (pOvWert). Dieser Wert soll nicht unterschritten werden, damit der Stoffwechsel streng aerob verläuft. Die maximale Sauerstoffeintragsleistung ist bestimmt durch die Verfahrens- und reaktortechnischen Höchstwerte von Belüftung (181/minS, Fermentor-Überdruck (7OkPa) und Rührerdrehzahl (1 000 rpm). In Tafel 1 sind einige wichtige Kultivierungsparameter zu markanten Zeitpunkten dargestellt.
Zu Beginn der Fermentation (O.Stunde) werden zwei Drittel, zur 16. Kultivierungsstunde der Rest der oben genannten Glucosemenge zugesetzt. Nach dem Anwachsen der Kultur beginnt etwa ab der 10. Stunde der pC>2-Wert deutlich abzufallen und erreicht zur 16. Stunde die Schwelle von 20%. Danach wird zunächst durch langsame Steigerung der Rührerdrehzahl dieser Wert konstantgehalten.
Zwischen der 19. und 20. Stunde erreicht die Drehzahl ihr Maximum. Damit ist auch der Sauerstoffeintrag auf dem verfahrenstechnischen Höchstwert angelangt und kann nicht weiter gesteigert werden. Demzufolge beginnt der pO2-Wert unter die Schwelle von 20% abzufallen. Kurze Zeit darauf ist die Glucose im Kulturmedium verbraucht, der pOvWert steigt innerhalb weniger Minuten von 15 auf 80% an.
Hier beginnt die zweite Phase der Fermentation.
Der pO2-Wert wird nun durch stetige Zufütterung von Glucoselösung auf einem Sollwert von 20% konstantgehalten.
Die dazu verwendete Vorrichtung gemäß Figur enthält den Fermentor 1 mit einer Meßeinrichtung zur kontinuierlichen Messung des pO2-Wertes im Kulturmedium. Die Meßeinrichtung 2 besteht aus einer amperometrischen Gelöst-Sauerstoff-Elektrode und dem zugehörigen Meßverstärker. Das von der Meßeinrichtung 2 gelieferte elektrische Signal, sowie der am Sollwertgenerator 4 eingestellte Wert werden dem zugeordneten Subtrahierer 3, hierin Form eines elektronischen Differenzverstärkers, zugeführt.
Der Sollwertgenerator 4 liefert ein elektrisches Signal, das durch ein präzisionspotentiometer eingestellt wird. Dem Subtrahierer 3 ist ein proportionaler, elektronischer Regel verstärker 5 nachgeschaltet, dessen elektrisches Ausgangssignal eine Dosiereinrichtung 6 steuert. Diese besteht aus einer Peristaltikpumpe, deren Drehzahl sich entsprechend dem elektrischen Ausgangssignal des Regelverstärkers 5 einstellt. Die Pumpe fördert das Substrat (Glucoselösung) vom Vorratsgefäß 7 in den Fermentor 1.
Bei Inbetriebnahme der Vorrichtung hat die Dosierrate der Glucoselösung zunächst einen maximalen Betrag infolge der großen Soli-Ist-Differenz des pO2-Wertes. Dieser strebt dadurch schnell dem Sollwert von 20% entgegen. Nach einem Einschwingvorgang von wenigen Minuten Dauer stellt sich ein stabiler pO2-Wert von 20 ± 2% ein, der bis zum Ende der Fermentation aufrechtgehalten wird. Die Glucose wird dabei kontinuierlich mit einer spezifischen Förderrate von 18-25g jeLiter Kulturlösung und Stunde vom Vorratsgefäß in den Fermentor gepumpt.
Zur 24. Stunde wird die Fermentation abgebrochen, da sich die spezifische Wachstumsrate asymptotisch dem Wert Null annähert.
Auf diese Weise wird ohne Sauerstofflimitation das Doppelte der kritischen Biomasse geerntet.
Tafel 1
| Zeit | 0 | Biomasse | pO2-Wert | Rührer- | |
| 16 | Drehzahl | ||||
| h | 19V2 | g/i | % | rpm | |
| 193/4 | 0,02 | 100 | 500 | ||
| erste | 20 | 13 | 20 | 500 | |
| Phase | 24 | 30 | 20 | 1000 | |
| zweite | 34 | 12-80 | 1000 | ||
| 35 | 20 | 1000 | |||
| 63 | 20 | 1000 |
Im 4501-Fermentor mit 250-3001 Arbeitsvolumen wird Escherichia coli unter Bedingungen und auf einem Nährmedium wie im Beispiel 1 kultiviert.
Die kritische Biomasse, bei welcher der pO2-Wert auf 25% des Sättigungswertes absinkt, beträgt 15-20g/l (Biotrockenmasse) beim Maximum des verfahrenstechnischen Sauerstoffeintrages. Zum Erreichen dieser Biomassekonzentration wird in der ersten Kultivierungsphase eine Glucosemenge von insgesamt 35g je Liter Kulturlösung bilanziert. Der Maximalwert des Sauerstoffeintrages für dieses Verfahren ist bestimmt durch die Höchstwerte von Belüftung (200l/min), Fermentor-Überdruck (7OkPa) und Rührerdrehzahl (600rpm).
Tafel 2 zeigt einige wichtige Kultivierungsparameter zu markanten Zeitpunkten.
Zu Beginn der Fermentation werden zwei Drittel der bilanzierten Glucosemenge zugegeben. Etwa zur 6. Stunde der Fermentation beginnt der Abfall des pO2-Wertes, der zur 9. Stunde die 25%-Schwelle erreicht. Ein weiteres Absinken wird zunächst durch automatische Erhöhung der Rührerdrehzahl verhindert. Zur 11. Stunde ist die vorgelegte Glucose verbraucht, der pO2-Wert steigt schnell an. Daraufhin wird sch rittweise, in kleinen Portionen, Glucoselösung zugefüttert. Der pO2-Wert fällt dadurch wieder auf den Wert von 25%, die Rührerdrehzahl erhöht sich weiterhin. Zur 12. Stunde ist diese auf dem Maximalwert angelangt. Es beginnt nun die zweite Phase der Kultivierung.
Der pO2-Wert wird durch stetige Zudosierung von Glucoselösung entlang eines Sollwert-Zeit-Profiles geführt.
Die dazu verwendete Vorrichtung entspricht der im Beispiel 1 gegebenen Erläuterung. Die zeitliche Änderung des Sollwertes erfolgt in Stufen an dem zum Sollwertgenerator gehörenden Potentiometer von Hand.
Der Sollwert wird zunächst auf 25% eingestellt und ab der 16. Stunde um jeweils 2,5% pro Stunde abgesenkt.
Die spezifische Dosierrate verläuft in einem Bereich von 13-16g Glucose je Liter Kulturlösung und Stunde. Der Förderstrom der Glucoselösung paßt sich automatisch der Zunahme des Fermentor-Arbeitsvolumens an.
Zur 20. Stunde wird die Fermentation abgebrochen, da die Reaktor-Füllgrenze erreicht ist.
Auf diese Weise wird unter Vermeidung von Sauerstofflimitation, und unter Berücksichtigung der 1,2fachen Zunahme des Arbeitsvolumens, mehr als das Dreifache der kritischen Biomasse geerntet.
Tafel 2
| Zeit | 0 | Biomasse | pO2-Wert | Rührer- |
| 9 | Drehzahl | |||
| h | 11 | g/i | % | rpm |
| 12 | 0,04 | 100 | 320 | |
| 16 | 4 | 25 | 320 | |
| 20 | 12 | 25-80 | 500 | |
| 17 | 25 | 600 | ||
| 37 | 25 | 600 | ||
| 48 | 15 | 600 |
Claims (3)
1. Verfahren zur Regelung der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration im Kulturmedium einer zugefütterten Fermentation, gekennzeichnet dadurch, daß dem Kulturmedium eine begrenzte Menge Nährsubstrat einmalig oder schrittweise zugesetzt wird, welche von der mikrobiologischen Kultur verbraucht ist, bevor im Kulturmedium Sauerstofflimitation auftritt, und daß danach die Zufütterung von weiterem Nährsubstrat durch stetige Zudosierung erfolgt, wobei allein durch Variation der Zuflußrate ein beliebiger Wert der Gelöst-Sauerstoff-Konzentration innerhalb eines bestimmten Bereiches, vorzugsweise 10-60% der relativen Sauerstoff-Sättigungskonzentration, eingestellt und konstantgehalten wird.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentation während der Phase der stetigen Zufütterung in eine zyklische fed-batch-Kultivierung übergeleitet wird.
3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß ein Fermentor (1) über eine Meßeinrichtung (2) zur kontinuierlichen Messung der Gelöst-Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium mit dem einen Eingang eines Substrahierers (3), ein Sollwertgenerator (4) mit dem anderen Eingang des Substrahierers (3) verbunden ist, und die Differenz von Ist- und Sollwert über einen Regelverstärker (5) auf den Stelleingang einer Dosiereinrichtung (6) mit stetig verstellbarer Förderrate geführt wird, die ein Vorratsgefäß (7) mit dem Fermentor (1) verbindet.
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