DD258026A5

DD258026A5 - Verfahren zur Herstellung von Human-Gewebeplasminogen-Aktivator-Mutanten

Info

Publication number: DD258026A5
Application number: DD28944386A
Authority: DD
Inventors: Herbert L Heyneker; Gordon A Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1988-07-06
Also published as: DE3613390C2; NO175216C; EP0199574A2; DK175380B1; IE861055L; FI98930B; MY102550A; JPH0740940B2; GB2173804A; HUT40703A; GR861037B; FR2581652A1; ES8802184A1; NO175216B; EP0199574A3; ES554251A0; FR2581652B1; HU206520B; US5147643A; DK181286A

Abstract

Biologisch aktive, mutierte Gewebeplasminogen-Aktivatoren werden beschrieben, die durch eine stellengerichtete Mutagenese, beispielsweise an der Zweikettenaktivierungsstelle gegen eine Umwandlung in die zweikettige Form resistent gemacht worden sind.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Arzneimittel zur Bekämpfung von Gefäßerkrankungen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Human-Gewebeplasminogen-Aktivator wurde zuerst von Collen et al., (EP-A-41766) als im wesentlichen reines Isolat aus einer naturlichen Quelle identifiziert und auf die erforderliche Plasminogen-Aktivator-Wirkung getestet.

In der Folgezeit wurde in den Laboratorien der Anmelderin Human-Gewebeplasminogen-Aktivator, der im wesentlichen frei von den Proteinen, die normalerweise damit assoziiert sind, ist, durch rekombinante DNA-Technik hergestellt. Diese Arbeit wurde in wissenschaftlichen Veröffentlichungen und in EP-A-93619 festgehalten. EP-A-93619 betrifft die Herstellung von verschiedenen Human-Plasminogenaktivator-Derivaten, die durch Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Ersatz von Aminosäuren auf verschiedene Weise modifiziert sind, beispielsweise durch stellengerichtete („site directed") Mutagenese der zugrunde liegenden DNA.

Wie aus der genannten Druckschrift hervorgeht, liegt Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA) sowohl in einkettiger als auch in zweikettiger Form vor. Beim letztgenannten Produkt handelt es sich um ein proteolytisches Derivat des erstgenannten Produkts. Es wurde gezeigt, daß die proteolytische Umwandlung der einkettigen Form in die zweikettige Form während der Auflösung eines Fibringerinnsels auftritt; vgl. Rijken et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S.2920. Es wird angenommen, daß es sich bei der zweikettigen Form um das Agens handelt, das für die Plasminogenaktivator-Wirkung verantwortlich ist, obgleich eseinige anfängliche Berichte gab, die darauf hinwiesen, daß die einkettige Form von Human-t-PA (Rijken a.a.O.) und die einkettige Form von Schweine-t-PA (vgl. Ranby et al., Thromb. Res., Bd.27 [1982], S. 176) eine gewisse Aktivität haben können; vgl. auch Rijken et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd. 580 (1979), S. 140.

In späteren Untersuchungen wurden jedoch derartige Berichte über die Aktivität des einkettigen Produkts mit dem Argument abgetan, es handle sich um eine Verunreinigung derartiger Präparate mit geringen Mengen an der zweikettigen Form; vgl. Andreasenetal.,EMBOJ.,Bd.30(1984),S.151 und lchinose et al., FEBS Lettchers, Bd. 175 (1984), S.412. Diese späteren Berichte bestätigten die allgemeine Anschauung, daß Serinproteasen, einschließlich t-PA, als inaktive, einkettige Zymogene exprimiert werden, die nur bei der Hydrolyse des Proteins an einer bestimmten Stelle, z.B. Arginin in Stellung 275 im Fall von t-PA, aktiv werden.

In vivo-Vergleiche ein einkettigen mit zweikettigen Plasminogenaktivatoren in bezug auf die Fähigkeit zur Auflösung von Fibringerinnseln wurden unter Einsatz von Kaninchen und Hunden durchgeführt. Bei Kaninchen wurde für die beiden Formen dieses Enzyms etwa die gleiche Wirksamkeit festgestellt; vgl. Collenetal., J. din. Invest, Bd. 71 (1983), S. 368. Bei Untersuchung an einem ähnlichen Modell mit Hunden wurde jedoch davon berichtet, daß die einkettige Form des Plasminogenaktivators geringfügig weniger aktiv als die zweikettige Form ist; vgl. Korningeret al., J. din. Invest., Bd. 69 (1982), S. 573. Diese Untersuchungen zeigen daher, daß der einkettige Plasminogenaktivator in bezug auf die Fähigkeit zur in vivo-Auflösung von Fibringerinnseln nicht besser wirkt als die entsprechende zweikettige Form und tatsächlich sogar weniger wirksam sein kann als die zweikettige Form.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neue Arzneistoffe zur Bekämpfung von vaskulären Erkrankungen, insbesondere zur in vivo-Auflösung von Fibringerinnseln, bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Arzneistoffe zur Behandlung von vaskulären Erkrankungen, d. h. neue Mutanten von Human-t-Pa (Human-Gewebeplasminogen-Aktivator), bereitzustellen, die im Vergleich zu dem von Collen et al., (EP-A-41766) zuerst isolierten Human-t-PA sowie im Vergleich zu den t-PA-Molekülen, die in dervorerwähnten EP-A-93619, die sich mit rekombinanter DNA-Technik befaßt, beschrieben sind, eine gleich gute oder höhere Aktivität aufweisen. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gegenüber spezieller enzymatischer Spaltung resistenten Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA)-Mutanten), gekennzeichnet dadurch, daß man eine Expression einer DNA-Sequenz, die für diese t-PA-Mutante kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle durchführt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung spezielle Mutanten, bei denen bestimmte Aminosäuresubstitutionen innerhalb des Bereichs vorliegen, der die Stellungen 275 und 276 der Human-t-PA-Aminosäuresequenz, die von Arginin und Isoleucin besetzt sind, umfaßt.

Bestimmte enzymatisch aktive Moleküle erkennen diese Stelle(n) (möglicherweise zusammen mit einer oder mehreren benachbarten Aminosäuren) und führen zurfunktionellen Hydrolyse der Bindungen im Anschluß an die basischen Aminosäuren, insbesondere zwischen Arginin/Isoleucin und Lysin/Glycin, was zuzweikettigem Material führt. Diese beiden Ketten bleiben durch eine Disulfidbindung über Cysteinreste assoziiert. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung dient die Substitution an diesen Stellen mit von Arginin und Lysin abweichenden Aminosäuren zur Bildung von Mutanten, bei denen die entsprechenden Spaltungsstellen so verändert sind, daß in vitro oder in vivo zweikettiger Human-t-Pa nicht oder in einem verringerten Anteil gebildet wird. Somit wird gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung mutagenisierter einkettiger Human-t-PA für die Zwecke der Untersuchung der biologischen Aktivität bereitgestellt. Es wurde festgestellt, daß diese Mutanten immun oder zumindest resistent gegen Hydrolyse an der 275/276-Stelle sind und daß die erhaltenen einkettigen Human-t-PA-Mutanten überraschenderweise bei bestimmten biologischen Tests die gleiche Aktivität wie die vorstehend erwähnten Produkte von Collen et al. und/oder wie rekombinante t-PA-Moleküle besitzen. Ferner gibt es Hinweise, daß diese Mutanten weniger reaktiv mit natürlich vorkommenden t-PA-lnhibitoren sind.

Fig. 1 stellt eine Restriktionskarte der DNA von Human-t-PA dar und umfaßt die 5'- und 3' nicht-translatierten Bereiche sowie die für pre-t-PA kodierenden Sequenzen. Der punktierte Bereich stellt das Strukturgen für t-PA dar.

Fig. 2a, b und с steilen die DNA- und Amirtosäuresequertzen MH & ИОН von pre-t-PA unter Einschluß der 5'- und З'-nichttranslatierten Bereiche dar.

Fig. 3 stellt ein Gesamtschema dar, das zur Erzeugung von individuellen Klonen mit Substitutionen in Stellung 275 verwendet wird.

Fig. 4 bis 8 erläutern den Aufbau von pXAPPA18 3'AX10trpR.

Fig. 9 zeigt das Plasmid pPADHFR-6 mit relevanten Restriktionsstellen.

Fig. 10 zeigt die mit radioaktiv markiertem t-PA (linke Seite) und EIKGG t-PA (rechte Seite) gebildeten Plasmaprotease-Inhibitor-

Komplexe nach Nachweis durch Autoradiographie an SDS-PAGE-GeI. Fig. 11 zeigt die Fibrinbindungseigenschaften von einkettigem t-PA, zweikettigem t-PA und mutiertem einkettigem t-PA

(EIKGG)

Fig. 12 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve der in vivo Gerinnungsauflösung (EIK ist mutierter einkettiger t-PA; rt-PA ist nichtmutiertert-PA).

Die hier verwendeten Ausdrücke „Human-Gewebeplasminogen-Aktivator", „Human-t-PA" oder „t-PA" bedeuten einen humanen, exogenen (Gewebetyp) Plasminogenaktivator, der beispielsweise durch rekombinante Zellkultursysteme in bioaktiven Formen gebildet wird, die einen Porteasebereich umfassen und ansonsten dem für Humangewebe nativen Plasminogenaktivator entsprechen. Es ist darauf hinzuweisen, daß von Individuum zu Individuum abweichend natürliche allele Variationen auftreten können, was durch Unterschiede bezüglich einer oder mehrerer Aminosäuren in der Gesamtsequenz nachgewiesen werden kann. Ferner hängen die Glycosylierungsmuster von der Natur der Wirtszellenumgebung ab. Bei Human-Gewebeplasminogen-Aktivator handelt es sich um ein Polypeptid, das zwei funktioneile Bereiche aufweist, die aus einem Proteasebereich, der zur Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin in der Lage ist, und einem kringelhaltigen Bereich bestehen, von dem angenommen wird, daß er für die Fibrinbindung verantwortlich ist. t-PA umfaßt daher Polypeptide mit einem Gehalt an diesen funktioneilen Bereichen als Teil der Gesamtsequenz.

Eine „Zweikettenspaltungsstelle" in t-PA umfaßt mindestens den Argininrest in Stellung 275. Jedoch wird von verschiedenen Aminosäuren, die sich in Nachbarschaft oder im Abstand von einigen Resten zur Stellung 275 befinden, ebenfalls angenommen, daß sie Bestandteil des Bereichs sind, der von Enzymen, die den Plasminogenaktivator in die zweikettige Form überführen, erkannt wird. Somit kann ein Ersatz von Aminosäuren an von der Stellung 275 abweichenden Stellen innerhalb dieses Bereichs zu Plasminogenaktivator-Mutanten führen, die gegen die Umwandlung in die zweikettige Form resistent sind. Gemäß einer speziellen Ausführungsform handelt es sich bei der „einkettigen Plasminogen-Aktivator-Mutante" um einen Plasminogenaktivator, der gegen die Umwandlung in die zweikettige Form resistent ist. Er ist durch Einfach- oder Mehrfach-Aminosäuresubstitutionen an der Zweikettenaktivierungsstelle charakterisiert. Aufgrund der Modifikation wird eine derartige Aktivierungsstelle enzymatisch nicht erkannt und daher durch Enzyme, die normalerweise den Plasminogenaktivator in die zweikettige Form überführen, nicht hydrolysiert.

In Analogie zu Trypsin und Chymotrypsin wird angenommen, daß die Bildung der zweikettigen Form von allen Serinproteasen eine Folge der Anwesenheit der freien-a-Aminogruppe in t-PA in Stellung 276 ist. Somit wird bei Spaltung von Arg 275 die a-Aminogruppe 276 frei und tritt in Wechselwirkung mit der Polypeptidkette im Bereich des aktiven Serins von t-PA. Erfindungsgemäß werden alle Mutationen umfaßt, die die Wechselwirkung dieser a-Aminogruppe mit dem aktiven Proteasezentrum stören, ohne daß die Gesamtaktivität des Moleküls verringert wird.

Zur Erzeugung von Mutationen der zugrundeliegenden DNA sowie zur Herstellung der entsprechenden Mutanten können eine Reihe von Verfahren angewandt werden. Ein derartiges Verfahren, das hier als besonders bevorzugte Ausführungsform erläutert wird, umfaßt zunächst die Insertion eines Fragments des nativen t-PA-Gens, das die für den zu mutierenden Bereich kodierenden Sequenzen aufweist, in die replikative Form der Phage M13mp8 unter Bildung von M13mp8PA. Ein synthetisches Oligonucleotid, das zur inserierten t-PA-Sequenz komplementär ist, aber ein oder mehr Nucleotidtripletts, die für die zu substituierende Aminosäure kodieren, enthält, wird sodann mit der einzelsträngigen Form von M13mp8PA unter Bildung eines doppelsträngigen Bereichs verschmolzen. Dieser Bereich dient als Primer für die DNA-Polymerase I-Synthese des restlichen komplementären Strangs. Nach Replikation und Identifikation kann die mutierte t-PA-Sequenz weiter modifiziert oder zum Aufbau eines prokariontischen oder eukariontischen Vektors zur Expression des mutierten t-PA-Polypeptids verwendet werden. Das vorstehend beschriebene allgemeine Verfahren kann auch zur Mutation von t-PA in von den Zweikettenspaltungsstellen 275/276 und/oder 277/278 abweichenden Positionen unter Bildung von mutierten t-PA-Derivaten, die unter die vorliegende Erfindung fallen, verwendet werden. Bei derartigen weiteren Positionen handelt es sich um Polypeptidsequenzen, die gegenüber einer enzymatischen Hydrolyse empfindlich sind, z. B. trypsinartige Spaltungsstellen, die typischerweise Arginin oder Lysin gefolgt von Isoleucin, Serin oder Alanin enthalten. Durch Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb derartiger trypsinähnlicher Spaltungsstellen gelangt man zu t-PA-Mutanten, die gegen die Hydrolyse durch trypsinähnliche Proteasen resistent sind. Diese Resistenz gegen einen enzymatischen Abbau während der Expression und Reinigung sowie während der in vivo-Verabreichung als Arzneimittel führt zu einem t-PA, das im Vergleich zu nicht-mutiertem t-PA seine biologische Aktivität nicht verliert. Beispiele für derartige trypsinähnliche Spaltungsstellen innerhalb des Human-t-PA-Moleküls umfassen Arginin-Alanin (Stellungen 40-41), Arginin-Serin (Stellungen 27-28) und Arginin-Serin (Stellungen 462-463).

A. Allgemeines:

Erfindungsgemäß mutierte t-PA-Derivate werden hergestellt, 1) die Methionin als erste Aminosäure (vorhanden aufgrund der Insertion des ATG-Startsignalcodons vor dem Strukturgen) aufweisen, oder 2) worin das Methionin intra- oder extrazellulär abgespalten ist und die übliche erste Aminosäure vorliegt, oder 3) zusammen entweder mit ihrem Signalpolypeptid oder einem konjugierten Protein, das vom üblichen Signalpolypeptid abweicht, wobei das Signalpolypeptid oder das Konjugat spezifisch in intra- oder extrazellulärer Umgebung abspaltbar sind, oder 4) durch direkte Expression in reifer Form ohne Notwendigkeit der Abspaltung von äußeren, überflüssigen Polypeptiden. Auf jeden Fall wird der so gebildete mutierte Human-t-PA in den verschiedenen Formen gewonnen und bis zu einem solchen Grad gereinigt, daß sich das Produkt zur Behandlung von verschiedenen vaskulären Zuständen oder Erkrankungen eignet, z. B. von Myokardinfarkt, Schlaganfall, Lungenembolie, tiefer Venenthrombose, peripherer arterieller Okklusion und anderen thrombotischen Zuständen.

Mutierter Human-t-PA wird auch funktionell insofern definiert, als es in der Lage ist, sich an Fibrin zu binden und die in vivo oder in vitro-Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin, das wiederum Fibringerinnsel auflöst, zu vermitteln. Der Ausdruck „Expressionsvektor" umfaßt Vektoren, die in der Lage sind, darin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimieren, wobei derartige Sequenzen funktionell mit anderen Sequenzen, die zur Durchführung ihrer Expression in der Lage sind, verknüpft sind und die in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integrierender Bestandteil der chromosomalen DNA replizierbar sind.

Der Ausdruck „rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit den unter Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken aufgebauten Expressionsvektoren transformiert worden sind.

B. Wirtszellkulturen und Vektoren

Die hier beschriebenen Vektoren und Verfahren eignen sich für eine Verwendung in Wirtszellen aus einem breiten Bereich von prokariontischen und eukariontischen Organismen. Beispielsweise ist E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) besonders geeignet. Andere Mikroorganismenstämme, die verwendet werden können, sind E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31537). Diese Beispiele dienen aber lediglich der Erläuterung und stellen keine Beschränkung dar.

Neben Prokarionten können eukariontische Organismen, wie Hefekulturen, verwendet werden. Gegenwärtig werden Kulturen von Zellen, die sich von multizellulären Organismen ableiten, als Wirte bevorzugt. Im Prinzip eignen sich alle derartigen Zellkulturen. Von besonders großem Interesse sind Wirbeltierzellen. Die Vermehrung derartiger Zellen in Kulturen (Gewebekulturen) hat sich zu einem wiederholbaren Verfahren entwickelt; vgl. Tissue Culture, Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson, 1973. Beispiele für derartige wertvolle Wirtszellinien sind VERO und HeLa-Zellen, Zellinien aus dem Ovarium des Chinesischen Hamsters (CHO), W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Verwendung von E. coli unter Einsatz des trp-Promotorsystems und die Verwendung con CHO-Zellen unter Einsatz von Expressionsvektoren, die als einen Promotor die SV40-Replikationsursprungsstelle umfassen. Für den Fachmann ist es jedoch möglich, andere prokariontische oder eukariontische Wirtszellkulturen einzusetzen.

C. Angewandte Methoden

1. Transfefction

Bei Verwendung von Zellen ohne erhebliche Zellwandbarrieren als Wirtszellen kann die Transfektion durch das Verfahren der Cacliumphosphatfällung gemäß Graham et al.. Virology, Bd. 52 (1978), S. 546, durchgeführt werden. Jedoch kann auch eine nukleare Injektion oder Protoplastenfusion angewandt werden.

Bei Verwendung von prokariontischen Zellen oder Zellen, die erhebliche Zellwandbauten aufweisen, besteht die bevorzugte Transfektionsmethode in der Verwendung von Calciumchlorid gemäß Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), Bd. 69 (1972),

2. Vektoraufbau

Zum Aufbau (Konstruktion) von geeigneten Vektoren, die die gewünschte Codier- und Kontrollsequenz enthalten, werden an sich bekannte übliche Ligationstechniken angewandt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und zur Bildung der erforderlichen Plasmide religiert.

Ausführungsbeispiele

1. Aufbau von M13mp8PAbglll für die t-PA-Mutagenese

Human-t-PA-DNA wurde aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung dieser beiden t-PA-Plasmide ist in der vorstehend beschriebenen EP-A-93619, auf die hier Bezug genommen wird, beschrieben. Das Plasmid pA25E10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA-Gens kodieren, und 772 Basenpaare des З'-nicht-translatierten Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit Sacl und BgIII verdaut, um ein 744-Basenpaar-Fragment zu erhalten, das nach vorstehend erwähnten üblichen Verfahren isoliert wurde. Wie aus der bekannten Sequenz- und Restriktionskarte von t-PA in Fig. 1 ersichtlich ist, enthält dieses Fragment die Codons für die t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und umfaßt einen Teil des З'-nicht-translatierten Bereichs.

Das Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Strukturgen für t-PA und einen Teil des З'-nicht-translatierten Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit Sacl und BgIII verdaut, um ein 1230-Basenpaar-Fragmentzu erhalten, das isoliert wurde. Dieses Fragment enthält Codons für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.

Diese Fragmente wurden unter Anwendung von üblichen Verfahren miteinander verknüpft und mit BgIII verdaut. Ein 1974-Basenpaar-Fragment, das die Codons für die gesamte reife t-PA-Sequenz plus einen Teil des З'-nicht-translatierten Bereichs enthielt, wurde isoliert. Doppelsträngige M13mp8 (Messing et al.. Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Hrsg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam [1981], S. 143) wurde mit BamHI verdaut und mit dem durch BgIII verdauten t-PA unter Bildung von M13mp8PABgill verschmolzen. E. coli JM 101-Zellen (ATCC 33876) wurden mit der doppelsträngigen replikativen Form von M13mp8PABglll transformiert. Die einzelsträngigen und doppelsträngigen (RF) Formen von M13mp8PABgIII können aus E. coli JM 101-Zellen, die mit dieser Phage infiziert sind, isoliert werden. Die einzelsträngige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.

2. Synthese von Primern für die stellenspezifische Mutagenese

Das Human-t-PA-Strukturgen wurde durch stellenspezifische Mutagenese zur Expression von t-PAs mit Aminosäuresubstitutionen an verschiedenen Stellungen modifiziert. Synthetische Oligonucleotide wurden hergestellt, beispielsweise gemäß dem Festphasen-Phosphortriesterverfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei (USA), Bd.75 (1978), S. 5765. Die folgenden synthetischen Primer wurden hergestellt und für die stellenspezifische Mutagenese verwendet:

Native Aminosäure	G	Pro	GIn	Phe	275	He	Lys	GIy	279
sequenz		CCT	CAG	TTT	Ar₃	ATC	AAA	GGA	GIy
Native DNA-Sequenz	G				CGC				G
Primer 1B8-DNA-		CCT	CAG	TTT	GIy	ATC	AAA	GGA
Sequenz	G				GGT				G
Primer 2C9-DN A-		CCT	CAG	TTT	GIu	ATC	AAA	GGA
Sequenz					GAA		Ne		G
Primer4A10-DNA-			G	TTT	GIy	ATC	ATC	GGA
Sequenz-TT	G				GGT		He		GGG
Primer 3A7-DNA-		CCT	CAG	TTT	GIy	ATC	ATC	GGA
Sequenz	G				GGT		He		G
Primer4B3-DNA-		CCT	CAG	TT	GIu	ATC	ATC	GGA
Sequenz			GAA			G

GTC

Die Aminosäure- und Gensequanz von nativem t-PA ist in den ersten beiden Zeilen wiedergegeben. Die Primer haben Tripletts, die sich am angegebenen Rest von der nativen Gensequenz unterscheiden. Die entsprechende Aminosäuresubstitution ist oberhalb des für diese Aminosäure kodierenden Tripletts angegeben.

3. Stellenspezifische Mutagenese

Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde zur Erzeugung von unterschiedlichen t-PA-Klonen, die die mutierte Sequenz der synthetischen Primer enthielten, verwendet. Es wird das allgemeine Verfahren von Adelman et al., DNA, Bd.2 (1983), S. 183, angewandt. Das Gesamtschema zur Erzeugung der einzelnen Klone ist in Fig.3 dargestellt. M13RF1B8, M13RF2C9 und M13RF4A10 wurden unter Verwendung der Primer, die die gezeigten Mutationen für die einzelnen Aminosäuren enthielten, erzeugt. EinzelstängigesM13RFA4A10, das eine Mutation in Stellung 277 enthielt, wurde mit Primer 3A7 oder 4B3 zur Erzeugung von M13RF3A7 bzw. M13RF4B3 verschmolzen. Gereinigte M13-RF-DNA aus diesen mutierten T-PA-Genen wurde aus E. coli JM 101-Zellen hergestellt. Anschließend wurden DNA-Fragmente mit einem Gehalt an der mutierten t-PA-DNA-Sequenz zum Aufbau der Expressionsvektoren für den mutierten t-PA verwendet.

SOng eines synthetischen Oligonucleotids wurde 30 Minuten bei 37°C in ΙΟμΙ 50 millimolarTris-HCI vom phUWert 7,5, 10 millimolar MgCI₂,10 millimolarDithiothreit, 1 тіІІітоІагАТРтііеіпетСепаКапЗиТД-РоІуписІеоіігікіпазерповрпогуІіеП. Zur Verwendung als Tracer wurden 400 ng synthetisches Oligonucleotid auf die vorstehende Weise phosphoryliert, mit der Abänderung, daß ATP durch 60 mCi [γ³²-Ρ]-ΑΤΡ (3 000 цСі/тМоІ) ersetzt wurden, wodurch man etwa 50 bis 60 χ 10⁶cpm/400ng des 24meren erhielt. Zur Heteroduplexbildung wurden 10ngeinzelsträngigesM13mp8PABglll 10 Minuten auf 95°C erwärmt und langsam (30min) in 40μ110 millimolarTris-HCI vom pH-Wert 7,5,10 millimolar MgCI₂,1 millimolarDithiothreit mit einem Gehalt an 10ng phosphoryliertem Primär und 50ng mit EcoRI verdautem großem Fragment von M13mp8PABglllRF abgekühlt. Die Primerextension wurde durch Zugabe von 10μΙ Ligasepuffer mit einem Gehaltan 2 millimolar ATP, jeweils 0,25 millimolar dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5UE. coli-DNA-Polymerase l-großem Fragment und 400 U T4-DNA-Ligase gestartet. Nach 1 h bei 12°C wurde das Reaktionsgemisch zur Transformation von E.coli JM 101-Zellen verwendet.

Die Transformation wurde durch Vermischen von ΙΟμΙ des Ligationsgemisches mit 200 μΙ kompetenten JM101-Zellen und anschließende 30minütige Inkubation auf Eis und 5minütige Inkubation bei 37⁰C erreicht. Sodann wurden 3,5ml 2YT-Topagar bei 55⁰C mit 300μΙ gesättigten JM-101-Zellen, ΙΟμΙ IPTG (200 millimolar) und 50μΙ Xgal vermischt und nach Zugabe der transformierten Zellen auf 9-cm-Petrischalen mit einem Gehalt an LB ohne Arzneistoffe ausgestrichen. Farblose Plaques wurden entnommen und auf eine Mikrotiterplatte mit einem Gehalt an 100 μΙ 2YT-Medium übertragen. Die inokulierten Mikrotiterflüssigkeiten wurden auf LB-Agarplatten von 15cm Durchmesser, die mit einem Rasen von 600 μΙ JM101-Zellen in 8ml 2YT-Topagar überschichtet waren, aufgedrückt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch Iminütigen physikalischen Kontakt auf eine Nitrocellulosescheibe übertragen. Die Nitrocellulosescheibe wurde 3 min mit 0,5 m NaOH und 1,5 m NaCI behandelt und 2mal 15 Minuten mit 3 m NaCI-0,5 m Tris-HCI vom pH-Wert 7,5 und sodann 15 min mit 2X SSC gewaschen. Das Prähybridisierungsgemisch enthielt 10 millimolar Tris vom pH-Wert 7,5,5 millimolar EDTA, 0,9 m NaCI, 1XDenhardt,0,5%NP40,100 mikromolar ATP, 1 millimolar Natriumpyrophosphat, 1 millimolar Natriumphosphat und 50 μg/ml E. coli tRNA. 1X Denhardt enthält pro Liter 200mg Ficoll, 200mg Polyvinylpyrrolidon und 200mg Rinderserumalubin (BSA; Fraktion V). Die Scheibe wurde 90 Minuten bei 80⁰C unter vermindertem Druck erwärmt. Anschließend wurde die Scheibe 3 h mit 6ml Prähybridisierungsflüssigkeit in einer Petrischale unter darauffolgender Zugabe von markiertem Primer mit 5 χ 10⁶cpm inkubiert und über Nacht hybridisiert. Die selektive Waschung der Scheibe wurde mit 0,4X SSC bei 49⁰C durchgeführt. Nach dem Trocknen wurde die Scheibe auf einen Röntgenfilm aufgelegt

Positive Hybridisierungsklone wurden ferner durch Didesoxysequenzierung analysiert; vgl. Aldemann, a.a. O.

4. Aufbau von Vektoren zur Expression der t-PA-Mutante in E. coli pXAPPA18 3'A10trpR

Das Plasmid pXAPPA18 3'AX10trpR wurde zur Verwendung als Expressionsvektor für die verschiedenen mutierten t-PA-DNA-Sequenzen aufgebaut. Das zum Aufbau dieses Plasmids verwendete Gesamtschema ist in Fig.4 bis 8 dargestellt. Das erhaltene Plasmid ergibt sich auf Fig. 8. Es enthält trpR-Repressorgen und eine Deletion von pBR322-DNA-Sequenzen, die die Plasmidamplifikation hemmen. Diese Deletion, als XAP-Deletion bekannt, besteht in der Entfernung von 641 Basebpaaren der pBR322- DNA-Sequenzen zwischen den Aval- und Pvull-Restriktionsstellen von pBR322 gemäß Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Cold Spring Harbor Press, Bd.43 (1979), S. 77. Das trpR-Repressorgen kompensiert die vorzeitige Derepression dert-PA-Expression, verursacht durch die erhöhte Plasmidkopienanzahl. Beim Zwischenprodukt zum Aufbau von pXAPPA18 3'AX10trpR handelt es sich um das Plasmid pPA18, das gemäß Fig.4 aufgetragen wurde. Dieses Plasmid enthält das gesamte pre-t-PA-Strukturgen sowie die 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereiche. Ein mit dem t-PA-Gen assoziierter trp-Promotor und Sequenzen, die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz verleihen, sind ebenfalls für dieses Plasmid charakteristisch.

Zum Aufbau von pPA18 werden vier Plasmide verwendet, nämlich pFIFtrp69, pHKYIO, ptPAtrp12 und pPA25E10. Das Plasmid pFIFtrp69 ist bei Goeddel et al.. Nucleic Acids Res., Bd.8 (1980), S.4057, beschrieben. Das Plasmid pHKYIO ist in PE-A-36776 beschrieben. Die Plasmide ptPAtrpi 2 und pPA25EiO sind bei Pennica et al., Nature, Bd. 301 (1983), S. 214 und in der vorerwähnten EP-A-93619 beschrieben.

Allgemein wird das Plasmid pFIFtrp 69 mit Pstl und Xbal zur Bildung des 950-Basenpaar-Fragments, das in Fig. 1 als Fragment 1 bezeichnet ist, verdaut. Das Plasmid ptPAtrpi 2 wurde mit Xbal und NAH verdaut. Daraus wurde die 340-Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 4 mit Fragment 4 bezeichnet ist, isoliert. Das Plasmid pPA25E10 wurde mit Narl und BgIII verdaut. Daraus wurde das 1604-Basenpaar-Fragment, das in Fig.4 mit Fragment 3 bezeichnet ist, isoliert. Das Plasmid pHKYIO wurde mit Pstl und BgIII unter Bildung eines 2900-Basenpaar-Fragments, das in Fig.4 mit Fragment 2 bezeichnet ist, verdaut. Diese vier Fragmente wurden verknüpft. Diese DNA wurde zur Transformation von E. coli-Zellen unter Bildung von pPA18 verwendet. Das Plasmid pPA18 wurde isoliert und mit Sau3A verdaut und anschließend mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I zum Auffüllen der Restriktionsstelle behandelt. Das nicht zirkuläre Plasmid wurde mit Sacl behandelt. Eine 389-Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 5 mit Fragment 5 bezeichnet ist, wurde isoliert. Das Plasmid pPA18 wurde auch mit Sacl und BamHI verdaut. Daraus wurde das Vektorfragment 6 isoliert. Das Plasmid pBR322 (vgl. Boyer et al., Gene, Bd.2 [1977], S.95) wurde mit EcoRI verdaut und anschließend mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt. Diese offenendige DNA-Sequenz wurde

mit BamHI unter Bildung der 375-Basenpaar-Sequenz, die in Fig. 5 als Fragment 7 bezeichnet ist, behandelt. Die Fragmente 5,6 und 7 wurden verknüpft. Dieses Präparat wurde zur Transformation von E. coli verwendet, wodurch das Plasmid ρΡΑ183'Δ erhalten wurde. Dieses Plasmid ist äquivalent zu pPA18, mit der Ausnahme, daß ein Teil des З'-nicht-translatierten Bereichs des t-PA-Gens entfernt worden ist.

Das Plasmid ρΡΑ183'Δ wurde mit Pstl und Narl verdaut, um ein 313-Basenpaar-Fragmentzu bilden, das in Fig.6 als Fragmente bezeichnet ist. Dieses Fragment kodiert für die Aminosäuren 8 bis 109. Das synthetische Oligonucleotidfragment 9 hat folgende Sequenz:

S'CTAGAATTATGTCTTATCAAGTTATTTGCA

TTAATACAGAATAGTTCAATAA 5'

Diese synthetische DNA wurde mit der Pstl-Stelle von Fragment 8 verknüpft, um das Arginincodon in Stellung 7 und die ersten 6 Aminosäurecodons des reifen t-PA-Moleküls zu regenerieren. Ferner wurde eine Ribosomenbindungsstelle in 5'-Stellung zum synthetischen N-terminalen Methionincodon, das sich unmittelbar in 5'-Stellung zum Rest 1 der reifen t-PA-Aminosäure-Codierungssequenz befindet, positioniert. Das 5'-Ende dieses Oligonucleotids enthält eine Xbal-Restriktionsstelle. Somit wurde das Fragment 8 in Gegenwart des synthetischen Oligonucleotidfragments 9 verknüpft und das behandelte Gemisch mit Xbal und Narl unter Bildung des Fragments 10 (vgl. Fig. 6) behandelt.

Das Plasmid ρΡΑ183'Δ wurde mit Narl und Sacl unter Bildung der 900-Basenpaar-Sequenz, die in Fig.7 mit Fragment 11 bezeichnet ist, verdaut. Dieses Plasmid wurde auch mit Sacl und Xbal unter Bildung des Vektorfragments 12 von Fig. 7 verdaut. Die Fragmente 10,11 und 12 wurden verknüpft und zur Transformation von E. coli verwendet, woraus dann pPA183'ΔΧ10 isoliert wurde. Eine DNA-Sequenz mit der XAP-Deletion und dem trpR-Repressorgen wird von pFMBtrpR, das in EP-A-136907 beschrieben ist, abgeleitet. Kurz zusammengefaßt, wurde das Plasmid aus drei bekannten Plasmiden aufgebaut: phGH 107 (EP-A- 22242) wurde als Quelle für den lac-induzierbaren Promotor verwendet; ptrpR3 (Roder et al.. Molecular Genetics, Bd. 176 [1979], S. 361) wurde als Quelle für die für den trp-Repressor kodierende Sequenz verwendet; und pFMB1 (EP-A-68693) wurde als Quelle für die Kodierungssequenz für das vom Stamm A24 abgeleitete FMD-Antigen verwendet.

Um die trp-Repressorsequenz zu erhalten, wurde ptrpR3 mit Haelll behandelt, und die 334-Basenpaar-Fragment wurde aus einem 6% Acrylamidgel isoliert. Das isolierte Fragment wurde mit 16mer EcoRI-Linkern der Sequenz

5'CCATAGAATTCTATGg.

verknüpft.

Um das Vektorgerüst und den lac-Promotor zu erhalten, wurde phGH107 zuerst mit EcoRI verdaut und sodann mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Das große Vektorfragment mit einem Gehalt am lacUV5-Promotor wurde sodann mit dem zugeschnittenen trpR-Plasmid unter Verwendung von T4-Ligase verknüpft. Das LigationsgemischwurdeinE.coM transformiert. Plasmid-DNA aus Transformanten wurde isoliert, und die Anwesenheit des geswünschten Plasmids mit der Bezeichnung ptpR/hGH107 bestätigt; Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309.

ptrpR/hGH107 wurde partiell mit EcoRI verdaut, unter Verwendung von Klenow stumpfendig gemacht und mit Pvull behandelt, wodurch man das lac-Promotor/trp-Repressoroperon (das 530bp-Fragment) bereitstellte. Durch partielle Pvull-Verdauung von pFMBI und Isolierung des Vektorfragments an 6% Polyacrylamid erhielt man das Expressionsvektorgerüst mit einem Gehalt an der für FMB unter Kontrolle des trp-Promotors kodierenden Sequenz. Das ptrpR/hGH107-Fragment wurde mit dem pFMBI-Pvull-Verdauungsprodukt vermischt und mit T4-Ligase verknüpft. Das Ligationsgemisch wurde dann zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet. Die Transformanten wurden als Quelle für Plasmid-DNA verwendet. Das erhaltene Plasmid pFMB/trpR wurde durch Miniscreening bestätigt und zur Orientierung der Insertion durch Aval-Pvull-Verdauung bereitgestellt. Das Plasmid pFMB/trpR wurde mit Ndel und BamHI verdaut. Das Fragment mit einem Gehalt an dem trpR-Repressor wurde isoliert. Das Plasmid ρΡΑ183'ΔΧ 10 wurde mit Ndel und BamHI verdaut. Das Hauptvektorfragment wurde isoliert. Dieses Vektorfragment und das trpR-Repressorsegment aus pFMB/trpR wurden verknüpft, und das DNA-Gemisch zur Transformation von E. coli verwendet, woraus dann das Plasmid pXAPA183'AX10trpR isoliert wurde, wie in Fig. 8 gezeigt ist.

5. E. coli-Expressionsvektoren fürt-PA-Mutanten

Fig. 8 stellt den zur Expression von t-Pa und t-PA-Mutanten in E. coli verwendeten Vektor ρΧΑΡΡΑ183'ΔΧ1 Otrp dar. Wie ersichtlich ist, wird die Expression des nativen t-PA-Strukturgens durch den trp-Promotor kontrolliert. Es wird auf die Xbal-, Narl- und Sacl-Restruktionsstellen hingewiesen. Das Plasmid pXAPPA183'AX10trpR wurde mit Narl und Xbal verdaut. Ein in Fig. 1 als Fragment 1 bezeichnetes 340-Basenpaar-Fragment wurde isoliert. Ein in Fig. 8 als Fragment 2 bezeichnetes Vektorfragment wurde erhalten, indem man das große Fragment, das durch Verdauung von pXAPPA183'AX10trpR mit Xbal und Sacl erhalten wurde, isolierte. Das Fragment 3 (900 bp) wurde erhalten, indem man RF-DNA der einzelnen mutierten t-PA M13-Klone, die durch stellenspezifische Mutagenese erhalten worden waren, mit Narl und Sacl verdaute (Fig.3). Die unterschiedliche mutierte t-PAs exprimierenden Vektoren wurden erhalten, indem man die Fragmente 1 und 2 mit den entsprechenden Fragmenten 3 verknüpfte und zur Transformation von E. coli verwendete, woraus dann die einzelnen mutierten E. coli-t-PA-Expressionsvektoren erhalten wurden:

pXAPPAI 8 3'Δχ1 OtrpR 1B8 pXAPPA18 3'Δχ1 OtrpR 2C9 pXAPPA18 3'Ax10trpR 4A10 pXAPPAI 8 3'Δχ1 OtrpR 3A7 pXAPPAI 8 3'ΔχΙ OtrpR 4B3

Diese Plasmide sowie der Wildtyp-t-PA-Expressionsvektor pXAPPAI83'ΔΧ1 OtrpR wurden zur Transformation von E. coli W3110fhuA~ verwendet.

E. coli W3110fhuA~ ist ein gegen T1-Phagen resistentes Bakterium, das durch Deletion oder Inversion von DNA-Sequenzen, die mit dem fhuA-Gen assoziiert sind, gekennzeichnet ist, wie aus der US-Anmeldung 06/673955 vom 21.11.1984 hervorgeht. Kurz zusammengefaßt, wird E. coli W3110 (ATCC 27325) mit λ-Bakteriophagen mit einem Gehalt an dem transponierbaren Element Tn10, das die Tetracyclinresistenz verleiht, transduziert. Stämme von mit Tn10 transduziertem W3110 werden in bezug auf die Resistenz gegen Phageninfektion ausgewählt. Phagenresistente Stämme werden vereinigt und mit dem Bakteriophagen P1 infiziert. Das erhaltene Lysat wird zur Transduktion von E. coli AT982 (Bukhari et al., J. Bacteriology, Bd. 105 [1971], S.844) verwendet. Der Stamm AT982 enthält eine Dap-Mutation in der Nähe des fhuA-Gens. Demgemäß zeigt die Transduktion des Stamms AT982 durch das P1-Lysat und die Auswahl der Transduktanten, die gegen Tetracyclin resistent sind und die die Dap-Funktion regenerieren, daß das Transposon Tn10 sich innerhalb des fhuA-Gens befindet. Stämme die gegen Tetracyclin resistent sind und die regenerierte Dap-Funktion aufweisen, werden als DNA-Quelle für Bakteriophagen P1-Transduktion von E. coli W3110 verwendet. Transduzierte W3110-Stämme, die die Tetracyclinresistenz und die Phagenresistenz exprimieren, werden ausgewählt. Aus diesen Stämmen wird sodann auf der Basis der Resistenz gegen Phageninfektion und der Reversion zur Tetracyclinempfindlichkeit eine Auswahl getroffen; Naloy et al., J. Bacteriology, Bd. 145 (1981), S. 1110. Die mit der Beibehaltung der Resistenz gegen TI-Phageninfektion gekoppelte Reversion zur Tetracyclinempfindlichkeit zeigt, daß die mit dem fhuA-Gen assoziierte DNA-Sequenz entweder deletiert oder irreversibel invertiert worden ist. So aufgebaute Stämme werden als E. coli W3110fhuA~ bezeichnet. .

Die das transponierbare Element Tn10 enthaltenden Phagen, die zur Insertion von Tn10 in W3110 verwendet wurden, wurden folgendermassen aufgebaut. Als Ausgangsmaterial diente A-CI857b 2210am29. Diese Phage ist bekannt; Kleckner, J. Mol. Biol., Bd. 116(1977), S. 125, und wurde aus drei bekannten λ-Mutanten nach üblichen Verfahren aufgebaut. Ein Lysat dieser λ-Phage wurde an amber-Suppressor-E. coli C600 (ATCC 23724), das nach bekannten Verfahren zum Einbau desTniO-Transposons manipuliert worden war, hergestellt; Kleckner et al., J. Mol. Biol., Bd. 116 (1977), S. 125. Dieses Lysat wurde zur Infektion von E. coli C600 (Л-СІ857), das einen amber-Suppressor und eine den cl857-Genotyp tragenden λ-Prophagen enthält. Die Lysate von gegen Tetracyclin resistenten Kolonien wurden durch Wärmeinduktion unter Züchtung der gegen Tetracyclin resistenten Kolonien zunächst in Brühe bei 32⁰C und anschließend 90 Minuten bei 42⁰C hergestellt. Das Lysat wurde sodann auf E. coli C600 ausgestrichen und der Replikaplattierung unterworfen. Die auf E.coli C600 erscheinenden Plaques wurden bei 32⁰C auf E. coli C600 und E. coli W3102 sup+ (Ximm434), das die Heteroimmunprophage Ximm434 enthält, replikaplattiert; N. Kleckner et al., Genetics, Bd. 90 (1978), S. 427. Auf dem heteroimmunen Stamm austretende Plaques wurden auf Tetracyclinplatten ausgestrichen. Auf diesen Platten auftretende Plaques eignen sich zur Transduktion von Tetracyclinresistenz und werden im vorstehend beschriebenen Verfahren zur Erzeugung von E. coli W3110fhuA~ verwendet.

Nativer t-PA und mutierter t-PA wurden aus 10-Liter-Kulturen dieser Zellen, die mit dem entsprechenden t-PA oder mutierten t-PA-Plasmid transformiert worden waren, erhalten. Die Expression wurde durch Tryptophanmangelmedien induziert.

6. Expressionsvektoren für die t-PA-Mutanten in Säugetierzellen

Das Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet, vgl. die vorgenannte EP-A-93619) ist in Fig.9 dargestellt. Die Expression des nativen t-PA-Strukturgens erfolgt unter der Kontrolle des frühen Promotors für das SV40 T-Antigen. Dieser Promotor kontrolliert auch die Expression des DHFR-Gens. Hingewiesen wird auf die BgIII-, BstXI- und BstEII-Restriktionsstellen. Ein in Fig. 9 als Fragment 1 bezeichnetes Vektorfragment wurde durch Isolation des großen Fragments erhalten, das durch Verdauung von pPADHFR-6 mit BgIII und BstEII erhalten worden war. Das in Fig. 9 als Fragment 2 bezeichnete Fragment wurde durch Isolation des 400 Basenpaar t-PA-Fragments erhalten, das durch Verdauung von pPADHFR-6 mit BgIII und BstXI erhalten worden war. Ein 1141-Basenpaar-t-PA-Fragment, das die gewünschten Mutatinen enthielt und dem Fragment 3 in Fig.9 entsprach, wurde durch Verdauung von RF-DNA aus den mutierten t-PA-Klonen mit BstXI und BstEII erhalten. Die Fragmente 1 und 2 wurden mit den jeweiligen Fragmenten 3 verknüpft. Die DNA-Gemische wurden zur Transformation von E. coli verwendet. Aus den einzelnen Transformanten wurden die jeweiligen eukariontischen Expressionsvektoren erhalten:

pPADHFR-61B8 PPADHFR-6 2C9 pPADHFR-64A10 pPADHFR-6 3A7 pPADHFR-64B3

Diese Plasmide sowie die nicht-mutierten t-PA-Expressionsvektoren pPADHFR-6 wurden zur Transfektion von DHFR-Mangel-CHO-Zellen gemäß den vorstehenden Angaben (Graham et al.. Virology, Bd.52 [1973], S.456 und EP-A-93619) verwendet. Die Expression von nativem und mutiertem t-PA wurde verstärkt, indem man die Kulturen steigenden Konzentrationen an Methotrexat aussetzte.

Beispielsweise wurden die Plasmide pPADHFR-6 2C9 und pPADHFR-6 1B8 zur Transfektion von DHRF-Mangel-CHO-Zellen (Urlab & Chasin, PNAS, Bd. 77 [1980], S. 4216) unter Einsatz der Calciumphosphat-Fällungsmethode von Graham et al.. Virology, Bd. 52 (1973), S. 456, verwendet.

In sämtlichen Fällen wurden die Kolonien, die im selektiven Medium (Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin [-HGT]) vereinigt und im -HGT-Medium weiter gezüchtet. Diese Zellen wurden in einer Menge von 2 χ 10⁵ Zellen pro 100ml Plattein 250 nanomolar Methotrexat (MTX) ausgestrichen, um eine Auswahl für die Amplifikation der Plasmidsequenzen zu treffen. 5 Kone, die in 250 nanomolar MTX wuchsen, wurden von der Platte extrahiert. Bei allen diesen Klonen wurde festgestellt, daß sie t-PA in das Medium sekretierten. Diese Klone wurden zur weiteren Untersuchung herangezogen.

E. Testverfahren

1. Reinigung von mutierter t-PA- und t-PA

Die verschiedenen, gemäß den vorstehenden Ausführungen in Säugetierzellen exprimierten t-PAs wurden in das Zellkulturmedium sekretiert. Das diese t-PAs enthaltende Medium wurde direkt in verschiedenen, nachstehend beschriebenen Tests eingesetzt oder einem oder mehreren der folgenden Reinigungsstufen unterworfen, um die Reinheit an t-PA oder mutierter t-PA vor der Durchführung dieser Tests zu erhöhen.

Medien aus CHO-Zellen mit einem Gehalt an mutiertert-PA wurden absatzweise mit chelatbildender Sepharose (Pharmacia) (10 bis 20 ml Harz/Liter Medium) unter Aktivierung mit Zinkchlorid gemäß Rijken et al., Biochem. Biophys. Acta. Bd. 580 (1979), S. 140 extrahiert und auf einem Filter gesammelt. Das Harz wurde in eine Säule geschüttet, mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,02 m Natriumphosphat vom pH-Wert 8,0,0,25 m NaCI, 0,01 %Tween 80 und 10mg/Liter Aprotinin gewaschen. Der t-PA wurde mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 50 millimolar Imidazol eluiert. Der vereinigte t-PA wurde gegen 0,02 m Natriumphosphat vom pH-Wert 8,0,25 m NaCI und 0,01 % Tween 80 dialysiert und auf ein Lysin-Sepharoseharz (Radcliffe et al.. Arch. Biochem. Biophys., Bd. 189 [1978], S. 185 und Allen et al.. Thrombosis Hemostasis, Bd.45 [1981], S.43) oder auf Benzamidin-Sepharoseharz (Bykowska et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd.703 [1982], S. 113) aufgesetzt. Das Zinkchelatharz wurde kurz mit 0,02 m Natriumphosphat vom pH-Wert 8,1 m NaCI und 0,01 % Tween 80 gewaschen. Der t-PA oder mutierte t-PA wurde mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 0,5m Arginin eluiert. Die Benzamidin-Sepharose wurde mit dem Dialysepuffer gewaschen und mit dem Dialysepuffer mit einem Gehalt an 1 m Guanidin eluiert. Die erhaltenen Proteine wiesen gemäß Analyse durch SDS-PAGE eine Reinheit von mehr als 90% auf. Zusätzlich zur Anwendung der vorstehenden Reinigungstechniken können immobilisierte monoklonal Antikörper verwendet werden; vgl. Nielsen et al., EMBOJ., Bd. 2 (1983), S. 115.

2. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Medienproben mit einem Gehalt an t-PA-Protein oder den mutierten t-PA-Proteinen wurden unter vermindertem Druck eingeengt und mit Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffer verdünnt. Sofern indiziert, wurde 10 millimolar Dithiothreit (DTT) zugesetzt, um die Proteindisulf ide zu reduzieren. Eine diskontinuierliche SDS-Elektrophorese unter Verwendung von 10% oder 7 bis 17% Polyacrylamid-Trenngelen wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S.680, durchgeführt. Zur Analyse der Plasmaproben wurde Trenngele mit 4 bis 10% SDS-Polyacrylamidgradienten mit dem Puffersystem von Laemmli eingesetzt. Aus der SDS-PAGE-Analyse wurden die Molekulargewichte durch Vergleich mit der Beweglichkeit von Proteinen bekannter Molekulargewichte ermittelt.

3. Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösung

Rekombinanter (nicht-mutierter) t-PA und mutierte t-PAs wurden auf ihre Fähigkeit zur Auflösung von Fibringerinnseln mittels des Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösungstests untersucht.

Kurz zusammengefaßt, wurde Thrombin (Sigma Chemical Co.) in destilliertem Wasser in einer Konzentration von etwa 1000 Einheiten/ml gelöst. Diese Vorratslösung wurde mit Testpuffer, der 0,06 m Dinatriumhydrogenphosphat, 0,06 m Natriumdihydrogenphosphat, 200 mg/Liter Natriumazid und 0,01 % Tween 80 enthielt, 1:30 verdünnt. Eine Reihe von Teströhrchen mit einem Gehalt an 0,5ml verdünnter Thrombinlösung (30 bis 40 Einheiten/ml) und 0,5ml unterschiedlicher Konzentrationen an t-PA (16ng/ml bis 1 χ 10⁶ng/ml), entsprechender Kontrollen oder unbekannten Proben in geeigneten Verdünnungen wurden hergestellt. Eine zweite Reihe von Teströhrchen mit einem Gehalt an 20 μΙ Plasminogenlösung (1,0 mg/ ml) und 1,0ml Fibrinogenlösung (1 mg/ml) sowie 10μΙ Hohlglas-Mikrokügelchen von mehr als 45 mesh (0,354mm; 3M Company) wurde ebenfalls hergestellt. Die vorstehenden Reagentien und Teströhrchen wurden bis zur letzten Stufe des Tests auf Eis belassen. 200 μΙ Thrombin-t-PA- oder Thrombin-mutierter-t-PA-Lösungen wurden zu einem Teströhrchen mit einem Gehalt an Plasminogen, Fibrinogen und Mikrokügelchen gegeben, sodann 15 Sekunden heftig vermischt und schließlich in ein Wasserbad von 37 ⁰C gebracht. Innerhalb von 30 Sekunden bildeten sich in den einzelnen Röhrchen Gerinnsel. Die Zeit zwischen der t-PA-Zugabe und dem Endpunkt der Reaktion wurde gemessen. Der Endpunkt wurde als der Zeitpunkt definiert, zu dem die Mikrokügelchen beim Test an die Oberfläche aufgestiegen waren.

Die Menge an thrombolytischer Aktivität einer speziellen Probe wurde unter Bezugnahme auf eine t-PA-Eichkurve ermittelt. Die spezifische Aktivität wurde unter Bezugnahme auf die durch Radioimmunoassay ermittelte Menge an t-PA oder mutiertem t-PA berechnet.

4. In v'rtro-Gerinnselauflösungstest

Rekombinanter t-PA und mutiertert-PA wurden ferner in einem in vitro-Gerinnselauflösungssystem getestet.

Kurz zusammengefaßt, wurden Humanblutproben mit 3,13% Natriumeitrat als Antikoagulationsmittel gewonnen. Die zelluläre Fraktion wurde durch Zentrifugation entfernt. Jeweils 1 ml Plasma wurde mit 50μΙ 0,5m CaCI₂,25μΙ Rinderthrombin (100 Einheiten/ml) und 10μΙ Human ¹²⁵J-Fibronogen (ЮООООсрт/ΙΟμ) versetzt. Dieses Plasmagemisch wurde in einen Siliconschlauch mit einem Innendurchmesser von 4mm eingesaugt und 1 h bei 37^CC inkubiert. Aus auf 1 cm Länge

abgeschnittenen Schlauchstücken wurden die Gerinnsel entfernt und in Puffer mit einem Gehalt an 0,3m NaCI, 0,02 m Natriumeitrat (pH-Wert 5) und 0,01 % Tween 80 gegeben. Die Gerinnsel wurden 4mal innerhalb von 1 h mit frischem Puffer gespült. Die Radioaktivitätsmenge in der letzten Spülflüssigkeit betrug nicht mehr als etwa 10% der Radioaktivitätsmenge im Gerinnsel. Die einzelnen Gerinnsel wurden sodann in 2,5ml Plasma gebracht. Eine 250^I-Plasmaprobe wurde zum Zeitpunkt Null entnommen. Proben von t-PA oder mutiertem t-PA wurden in einem Volumen von 100μΙ zugegeben. Proben von 250μΙ wurden nach 1,2,3 bzw. 4 Stunden entnommen. Die Radioaktivität dieser Proben wurde bestimmt. Standards mit einem Gehalt an 5,10, 20 und 40t-PA-Einheiten pro ml wurden parallel dazu angesetzt. Die prozentuale Auflösung wurde nach Korrektur auf Volumenänderungen der einzelnen Proben berechnet.

5. Chromogene Tests

S-228: t-Pa kann direkt unter Verwendung des synthetischen, chromogenen Kali-Tripeptidsubstrats S-2288 (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) gemessen werden. Für diesen Test werden t-PA und 1 millimolar S-2288 (Endkonzentration) in 0,05 m Tris (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,012 m NaCI und 0,01% Tween 80 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50μΙ Eisessig zu 0,5 ml Reaktionsgemisch gestoppt. Die Aktivität wird aus der Absorption bei 405 nm unter Anwendung der folgenden, vom Hersteller angegebenen Gleichung gerechnet:

Aktivität in 0,5 ml IU-min

Reaktionsgemisch _ Δ0Ρ x 793,65 OD

(IU, internationale " _T. . ,

Einheiten) Inkubations-

S-2251: Die Plasminogenaktivierung durch t-PA wurde unter Verwendung des chromogenen, für Plasmin spezifischen Kabi-Tripeptidsubstrats S-2251 (Helena Laboratories) gemessen. Eine Aliquotmenge der Probe wurde mit 0,10ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,7mg/ml Plasminogen (0,05m Tris, pH-Wert 7,4,0,012m NaCI) und 0,02 ml einer Humanfibrinogenlösung mit einem Gehaltan 20mg/ml (0,05 m Tris-HCI, pH-Wert 7,4,0,012 m NaCI) vermischt. Das Volumen wurde auf 0,15 ml eingestellt. Sodann wurde das Gemisch 10 Minuten bei 37⁰C inkubiert und anschließend mit 0,35ml S-2251 (1,0 millimolare Lösung im vorgenannten Puffer) versetzt. Die Reaktion wurde 5 oder 10 Minuten bei 37⁰C durchgeführt. Sodann wurde Eisessig (50μΙ) zur Beendigung der Reaktion zugesetzt. Die Absorption bei 405 nm wurde gemessen. Die quantitative Aktivitätsmenge wurde durch Vergleich der Ergebnisse unter Verwendung einer Probe von rekombinantem nativem t-PA, die unter Verwendung des S-2288-Tests standardisiert worden war, ermittelt. Dies war zu Beginn erforderlich, da die Absorption bei 405 nm von Tag zu Tag mit Alterung des Plasminogens variierte und sich auch veränderte, wenn unterschiedliche Präparate von Plasminogen und Fibrinogen verwendet wurden. Diese Variation konnte schließlich durch sorgfältige Herstellung von großen Mengen an Humanplasminogen (glu-Plasminogen) unter anschließender Lyophilisation von Aliquotmengen des Materials verringert werden. Die Aliquotmengen wurden bei -20⁰C gelagert. Vor der Verwendung wurden die rekonstituierten Plasminogenpräparate höchstens 4 Stunden bei 0⁰C aufbewahrt. Die Stimulierung dert-PA-Aktivität durch Fibrinogen wurde gemessen, indem man die Aktivität der Lösungen mit hohen Fibrinogenkonzentrationen mit ähnlichen Reaktionsgemischen, in denen kein Fibrinogen enthalten war, verglich. Aufgrund der Unlöslichkeit von Fibrin'wurde bei diesem Test Fibrinogen verwendet. Durch diese Stimulierung durch hohe Fibrinogenkonzentrationen konnte offensichtlich die Stimulierung, die durch unlösliches Birin erwartet werden konnte, nachgeahmt werden.

6. In vivo-lnhibitor-Komplextest

Rekombinanter t-PA und mutierter t-PA wurden in vitro zur Ermittlung ihrer Reaktivität mit natürlich auftretenden Inhibitoren der t-PA-Aktivität getestet. Allgemein wurden t-PA und mutierter t-PA mit ¹²⁵J unter Verwendung von Jodobeads (Pierce Chemical Co.) jodiert, wodurch man t-PA oder mutierten t-PA mit einer spezifischen Radioaktivität von etwa 2x10⁶cpm^g erhielt. Für die in vitro-Komplexbildung wurden der radioaktiv markierte t-PA (1 μς) zu frisch gewonnenem, mit Citrat versetztem Humanvollblut (500 μΙ) gegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Verdünnung einer Aliquotmenge mit 2% SDS gestoppt. Die Proben wurden in 4 bis 10% Polyacrylamidgradienten-SDS-PAGE analysiert. Die Komplexe wurden durch Autoradiographie nachgewiesen.

7. Fibrinbindungstest

Die Methode für die Fibrinbindung steltl eine Modifikation der Methode von Rijkenet al., J. Biol. Chem., Bd.257 (1982), S. 2920 dar. Die zu untersuchende t-PA-Probe (500 ng) wird zu einer Lösung mit einem Gehalt an 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,4,0,12 m NaCI, 0,01 % Tween 80,1 mg/ml Humanseruma'lbumin und verschiedenen Konzentrationen an plasminogenfreiem Fibrinogen (0,0,1,0,5 bzw. 1,0mg/ml) gegeben. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches beträgt 1 ml. die Probe wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach 1 Einheit Thrombin zugesetzt wird. Die Proben werden 1 Stunde bei 37"C inkubiert. Das Gerinnsel wird unter Verwendung eines Glasstabs entfernt. Die Menge an im Überstand ungebunden verbleibendem t-PA wird bestimmt. Die Daten werden als prozentualer Anteil des gebundenen t-PA gegen die Fibrinkonzentration aufgetragen (Fig. 11).

8. In vivo-Gerinnselauflösung

Das in vivo-Gerinnselauflösungsmodell von Collen et al., J. Clin. Invest, Bd. 71 (1983), S. 368, wurde angewendet. Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 3 kg wurden mitKetamin betäubt. Die Jugularvene wurde katheterisiert, und kleine verbindende Gefäße in dem Bereich wurden abgebunden. Etwa 2cm der Jugularvene wurden mit reversiblen Ligaturen isoliert. Ein Faden wurde vom proximalen zum distalen Ende des Segments gelegt. Das Segment wurde mit einer Kochsalz-Thrombin-Lösung gespült und mit frischem Kaninchenblut, das '²⁵J-Humanfibrinogen enthielt, gefüllt. Nach 30 Minuten wurde der Blutfluß durch das Gerinnsel wieder aufgenommen. Die intravenöse t-PA-lnfusion wurde mit einem Anfangsbolusvon 10% der Gesamtdosis begonnen. Die Infusion wurde über 4 Stunden hinweg gegeben. 30 Minuten nach Infusionsende wurde das Gerinnsel gewonnen und ausgezählt. Die Radioaktivitätsausbeute diente als Qualitätskontrolle. Blutproben, Urin, Tupfer und Spritzen wurden ausgezählt, um zu gewährleisten, daß die im ursprünglichen Gerinnsel bestimmte Radioaktivitätsmenge exakt war.

F. Testergebnisse

t-PA-Mutanten mit folgenden Sequenzen an der Zweikettenaktivierungsstelle, d. h. den Resten 270 bis 279, wurden in E. coli- und Ovariumzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) exprimiert:

275 279

nativ -Arg-Ile-Lys-Gly-Gly- (RIKGG)

1B8 -GIy-IIe-Us-GIy-GIy- (GIKGG)

2C9 -Glu-Ile-Lys-Gly-Gly- (EIKGG)

1. Western-Blots und Zymographie

Die in CHO-Zellen exprimierten EIKGG- und GIKGG-Mutanten wurden durch Western-Blots von reduzierten und nichtreduzierten SDS-PAGE-Gelen analysiert. Nativer einkettiger t-PA ergab zwei Banden mit Molekulargewichten von 52000 und 50000 Dalton aufgrund einer unterschiedlichen Glycosylierung. Die EIKGG-Mutante aus nicht-reudziertem SDS-PAGE zeigte eine immunoreaktive Hauptbande bei einem Molekulargewicht von etwa 50000 Dalton. Das Western-Blot der Mutante GIKGG von nicht-reduziertem SDS-PAGE wies jedoch ein Molekulargewicht von 55000 Dalton auf. Der offenbare Molekulargewichtsunterschied zwischen der GIKGG-Mutante und nativem t-PA kann auf eine geringfügig unterschiedliche Konformation oder Kohlenhydratstruktur im Vergleich zu nativem t-PA hinweisen. Die Spaltung des Proteins bei Arg 275 kann durch ein geringeres Molekulargewicht von t-PA bei Analyse unter anschließender Reduktion (wobei die Protease- und Kringel-Ketten getrennt werden) nachgewiesen werden. Zymographien der reduzierten SDS-PAGE-GeIe ergaben, daß die Plasminogenaktivatorwirkung in diesen Proben sich beim Molekulargewicht der immunoreaktiven Bande der einkettigen Form von t-PA (etwa 60000) befand. Die zweikettige Form von t-PA besitzt eine elektrophoretische Beweglichkeit, die einem Molekulargewicht von etwa 30000 Dalton entspricht. Dieses Verfahren zeigte, daß die einkettigen Formen von mutierten t-PA-Proteinen in Medien aus transformierten Zellen vorhanden waren.

S-2251-Test

Die Ergebnisse der Analyse von nativem und mutiertem EIKGG-t-PA durch den S-2251-Test sind in Tabelle I angegeben. Diese Werte wurden vor der Anwendung von Glu-Plasminogen beim Test zur Verringerung der Testvarianz erhalten. Der natürlich auftretenden t-PA-Sequenz RIKGG wurde eine willkürliche spezifische Aktivität in Gegenwart von Fibrinogen auf der Basis des S-2288-Tests zugewiesen. Dieser t-PA-Standard wurde mit den einzelnen EIKGG-t-PA-Mutanten getestet, um die Ergebnisse zu normalisieren.

Es ist ersichtlich, daß die EIKGG-t-PA-Mutante unabhängig vom Reinigungsgrad eine spezifische Aktivität beim S-2251-plus-Fibrinogentest aufweist, die größer als die Aktivität von rekombinanter t-PA ist.

Tabelle I

	Mutante	S-2251 +	S-2251 -	Fibrinogen-
Mutation	nativ	Fibrinogen	Fibrinogen	Stimulation
RIKGG¹	2C9	(250 000)"	25000	10,0
EIKGG¹	2C9	1000000	3400	290,0
EIKGG²	2C9	420000	3100	134,0
EIKGG³	520000	7 000	74,0

1 gereinigt unter Verwendung von Zinkchelat-Lysin-Agarose

2 gereinigt unter Verwendung von Zinkchelat und Benzamidin-Agarose

3 getestet ohne Reinigung

4 festgesetzte Aktivität

Die Daten von Tabelle IA wurden unter Verwendung von hochwertigem, lyophilisiertem Glu-Plasminogen erhalten. Bei dem besser reproduzierbaren Test ergab sich, daß die EIKGG-Mutante eine gleich große Aktivität beim S-2251-Test in Gegenwart von Fibrinogen aufweist. In Abwesenheit von Fibrinogen ist die Mutante noch weniger aktiv als das native Produkt (Tabelle I und I A), was eine größere Spezifität beweist.

Tabelle IA Mutation	Mutante	S-2251 + Fibrinogen	S-2251 - Fibrinogen	Fibrinogen- Stumulation
RIKGG¹ EIKGG¹	nativ 2C9	(250 00O)² 248000	17600 500	14 500

1 gereinigt unter Verwendung von Zinkchelat-Lysin-Agarose

2 festgesetzte Aktivität

2. Bläschenfreisetzung-Gerinnselauflösung und in vitro-Gerinnselauflösungstest Der Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösungstest wurde zur Ermittlung der spezifischen Aktivität von rekombinantem t-PA und gereinigter EIKGG-t-PA-Mutante durchgeführt. Die Aktivität der einzelnen t-PAs wurde gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren ermittelt. Die Konzentration an t-PA und EIKGG-mutiertem t-PA wurden durch Radioimmunoassay ermittelt. Die Ergebnisse dieses Tests sind zusammen mit der spezifischen Aktivität in Tabelle Il angegeben.

Tabelle II

Probe

I.D.

U/ml Aktivität

Protein — konz. mg/ml

spezifische Aktivität

EIKGG* EIKGG* t-PA**

8440 7698 5640

0,088 0,088 0,088

95 909 87477 64090

1 einmaliges Einfrieren-Auftauen

2 viermaliges Einfrieren-Auftauen

* gereinigt unter Verwendung von Zinkchelat und Benzamidin-Agarose

** gereinigt unter Verwendung von Zinkchelat und Lysin-Agarose

Der Bläschenfreisetzungs-Gerinnselauflösungstest zeigt, daß eine einkettige Mutante von t-PA, speziell der EIKGG-mutierte t-PA, eine spezifische Aktivität aufweist, die um 50% über der von rekombinantem t-PA liegt. Wie ersichtlich ist, führt wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu einer leichten Abnahme der spezifischen Aktivität des EIKGG-mutierten t-PA. Jedoch behält die mutierte t-PA immer noch eine größere spezifische Aktivität als rekombinantert-PA.

3. In vivo-lnhibitorkomplextest

Die Inaktivierung von Proteasen durch Plasmaproteaseinhibitoren stellt einen gut untersuchten Mechanismus zur Inaktivierung von Serumproteasen dar. Die erhaltenen Komplexe sind gegen Denaturierung stabil und können durch Elektrophorese an SDS-PAGE bestimmt werden. Bei diesem Verfahren wird radioaktiv markierter t-PA zu Plasma oder Vollblut gegeben und die Probe bei 37⁰C inkubiert. Sodann wird die Probe durch SDS-PAGE behandelt und anschließend der Autoradiographie unterworfen. Der Nachweis der radioaktiven Markierung in Stellungen mit einem Molekulargewicht, das größer als das Molekulargewicht von freiem t-PA ist, ist ein Hinweis für die Menge an gebildetem t-PA-Proteaseinhibitorkomplex. Bei Analyse in Rattenblut bildete t-PA langsam Komplexe mit einem Molekulargewicht von mehr als 200000. Nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden konnten mehr als 70% der radioaktiven Markierung in diesen Komplexen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu bildete mutiertert-PA keine derartigen Komplexe. Der Großteil der durch Autoradiographie nachgewiesenen radioaktiven Markierung blieb in der Position von freiem, nicht-inaktiviertem Enzym. Bei Durchführung einer ähnlichen Analyse inHumanblut (Fig. 10) bildete t-PA ebenfalls derartige Komplexe, aber zusätzlich auch Komplexe mit Molekulargewichten zwischen 100000 und 200000. Wie bei Rattenblut bildete der mutierte t-PA deutlich weniger Inhibitorkomplexe mit Molekulargewichten von mehr als 200000. Die Proteaseinhibitorkomplexe mit Molekulargewichtswerten von 100000 bis 200000 waren noch anwesend. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Mutante nicht durch Proteinaseinhibitoren, die Komplexe mit Molekulargewichten von mehr als 200000 bilden, inaktiviert wird. Spezielle Unterschiede lassen sich in der Reaktivität von t-PA und mutiertem t-PA bei der Bildung von Komplexen zwischen 100000 und 200000 feststellen.

4. Fibrinbindung

Es wurde früher berichtet, daß die einkettigen und zweikettigen Formen von t-PA etwa die gleiche Affinität gegenüber Fibrin aufweisen (Rijken et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 [1982], S. 2920). Bei dem hier beschriebenen Test wird im Gegensatz dazu für die einkettige Form von t-PA im Vergleich zur zweikettigen Form eine deutlich höhere Fibrinaffinität festgestellt (Fig. 11).

5. In vivo-Gerinnselauflösung

Fig. 12 zeigt die relativen Dosis-Wirkungs-Kurven für t-PA (o) oder die EIK-Mutante (·). Die Daten werden als Mittelwerte ± mittlerer Standardfehler für 5 Kaninchen pro Gruppe angegeben. Der Abstand zwischen den beiden Kurven bei 50%iger Auflösung wurde gemessen. Die Fähigkeit zur EIK-Bildung von t-PA war um den Faktor 2,4 größer als bei der nicht-mutierten Form (RIK). Eine statistisch signifikante Differenz wurde bei der Dosis von 0,25 mg/kg (p < 0,01) erreicht.

G. Schlußfolgerungen

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Mutante in bezug auf den Rest 275 von t-PA aus zwei Gründen wirksamer als die natürliche Form ist.

1. Erhöhte Spezifität: Tests der t-PA-Funktion weisen auf ein aktiveres/spezifischeres Protein hin.

2. Verringerte in vivo-Plasmainhibitorbindung: Die in vivo-Hemmung von derartigen Mutanten zeigt eine Abnahme der Inaktivierung durch bestimmte Proteaseinhibitoren. Dies ermöglicht die Zirkulation der aktiven nicht-komplexierten Form von t-PA, wodurch sich eine erhöhte t-PA-Wirkung zur Gerinnselauflösung ergibt.

Die wissenschaftliche Literatur ist in bezug auf dieenzymatischen Eigenschaften der einkettigen Form von t-PA widersprüchlich. Um die Funktion von t-PA besser zu verstehen, kann man homologe Proteine berücksichtigen. Eingehende Untersuchungen wurden an den Serinproteasen Trypsin und Chymotrypsin durchgeführt. Der t-PA-Proteasebereich weist eine sehr große Ähnlichkeit zu diesen Proteinen auf. Eine ähnliche Funktionsweise wird angenommen. Auf der Basis des für Trypsin und Chymotrypsin bestimmten Funktionsmechanismus ist zu erwarten, daß eine Verhinderung der Spaltung in der Position Arginin 275 von t-PA nur die funktionellen Eigenschaften des Proteasebereichs beeinflußt. Die erhöhte Fibrinaffinität für die Mutanten ist daher überraschend.

Unabhängig von den beteiligten Reaktionsmechanismen (erhöhte Spezifität, Mangel an Proteaseinhibitorbindung, erhöhte Fibrinaffinität oder Kombinationen dieser Eigenschaften) wurde beim Testen einer Mutante auf ihre Fähigkeit zur in vivo-Auflösung einer blockierten Vene festgestellt, daß die Mutante um den Faktor etwa 2,5 aktiver ist als t-PA mit natürlicher Sequenz. Wie vorstehend erörtert, wurde gezeigt, daß die einkettige Form von t-PA an der Gerinnselstelle in die zweikettige Form übergeführt wird. Eine derartige Umwandlung führt zu einem Verlust der Vorteile der einkettigen Form. Nur bei einer mutierten Form von t-PA, die durch physiologische Proteasen nicht in die zweikettige Form übergeführt wird, bleiben die Vorteile an der Gerinnselstelle erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von gegenüber spezieller enzymatischer Spaltung resistenten Human-Gewebeplasminogen-Aktivator (t-PA)-Mutanten, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Expression einer DNA-Sequenz, die für diese t-PA-Mutante kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle durchführt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Mutante herstellt, die im wesentlichen frei von zweikettiger Form ist.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine einkettige Mutante herstellt.

4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Mutante in einkettiger Form herstellt, die durch stellengerichtete Mutagenese von DNA an einer Zweikettenspaltungsstelle stabilisiert ist.

5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Mutante herstellt, bei der in der Stellung 275 eine von Arginin verschiedene Aminosäure vorliegt.

6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der genannten Aminosäure um Glycin oder Glutaminsäure handelt.

7. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Zweikettenaktivierungsstelle im Bereich der Reste 270 bis 279 von t-PA angeordnet ist und die stellengerichtete Mutagenese zur Substitution an mindestens einem Aminosäurerest innerhalb der genannten Zweikettenaktivierungsstelle führt.

8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Substituenten durch Ersatz von Isoleucin am Rest 276 erfolgt.

9. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Substitution durch Ersatz von Arginin am Rest 275 erfolgt.

10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine einkettige Mutante mit verringerter Aktivität gegenüber Proteaseinhibitoren herstellt.

11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine einkettige Mutante mit einer im Vergleich zu nicht mutiertem Gewebeplasminogen-Aktivator höheren spezifischen Aktivität für die Plasminogen-Umwandlung herstellt.

12. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine gegen enzymatische Hydrolyse an einer trypsinartigen Spaltungsstelle stabile Mutante, wobei die Spaltungsstelle durch Arginin oder Lysin charakterisiert ist, durch Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren der Spaltungsstelle durch eine andere Aminosäure herstellt.

13. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die DNA-Sequenz, die für die +-PA-Mutante kodiert, durch stellengerichtete Mutagenfese herstellt.

14. Verfahren nach Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß man

(a) eine Insertion eines Fragments von nativem t-PA-Gen, das für den zu mutierenden Bereich kodiert, in die replikative Form eines geeigneten Phagen durchführt,

(b) ein zur inserierten t-PA-Sequenz komplementäres synthetisches Oligonucleotid, das eines oder mehrere Nucleotidtripletts, die für die zu substituierenden Aminosäuren kodieren, enthält, mit der einzelsträngigen Form des gemäß (a) erhaltenen Produkts unter Bildung eines doppelsträngigen Bereichs verschweißt und

(c) den erhaltenen doppelsträngigen Bereich als Primer für eine DNA-Polymerase I-Synthese des restlichen komplementären Strangs verwendet.

Hierzu 14 Seiten Zeichnungen