DE3851259T2

DE3851259T2 - Mutierter t-PA mit Kringle-Ersatz.

Info

Publication number: DE3851259T2
Application number: DE3851259T
Authority: DE
Inventors: Akira Hashimoto; Yasunori Ikeda; Eileen R Mulvihill; Bjorn A Nexo; Suguru Suzuki; Shinji Yoshitake; Teruaki Yuzuriha
Original assignee: Novo Industri AS; Eisai Co Ltd; Zymogenetics Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Eisai R&D Management Co Ltd; Zymogenetics Inc
Priority date: 1987-06-04
Filing date: 1988-06-03
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2008-06-04
Also published as: FI882628A0; EP0293934A1; AU617323B2; FI882628L; ATE110772T1; NO179754C; NO179754B; DE3851259D1; ES2058180T3; ZA883958B; FI882628A7; KR970005251B1; IE881681L; NO882453L; AU1741088A; NZ224915A; JPH0448433B2; EP0293934B1; NO882453D0; DK302288D0

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft fibrinolytische Mittel, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. Genauer gesagt betrifft sie Gewebeplasminogenaktivator-Analoga mit einer modifizierten Kringle-Domäne.

Hintergrundtechnik

Blutgerinnung ist ein Prozeß, der auf einer komplexen Wechselwirkung verschiedener Blutbestandteile besteht, die letztendlich zu einem Fibrin-Netzwerk oder Gerinnsel führt. Der Abbau des Fibrin-Netzwerkes kann erreicht werden durch Aktivierung des Zymogens Plasminogen zu Plasmin. Plasmin ist eine Serinprotease, die direkt so wirkt, daß sie das Fibrin-Netzwerk abbaut und dadurch den Gerinnungsprozeß steuert. Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin wird normalerweise in vivo durch Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) katalysiert, eine Fibrinspezifische Serinprotease, von der man glaubt, daß sie der physiologische vaskuläre Aktivator von Plasminogen ist. Urokinaseplasminogenaktivator (u-PA) ist ein anderes Mitglied der Klasse von Plasminogenaktivatoren, die als Serinproteasen charakterisiert sind. t-PA und u-PA sind funktionell und immunologisch unterscheidbar.
t-PA zirkuliert normalerweise als eine einzelne Polypeptidkette Mr = 72.000 Daltons, die in eine zweikettige Form durch Spaltung einer Peptidbindung zwischen den Aminosäuren 275 (Arg) und 276 (Ile) umgewandelt wird. Die schwere Kette von t- PA (zwei Varianten mit Mr 40.000 und 37.000) ist abgeleitet vom Amino-Terminus, während die leichte Kette (Mr 33.000) abgeleitet ist vom Carboxy-terminalen Ende des t-PA-Moleküls. Diese Spaltung wird durch Trypsin oder Plasmin katalysiert und ist begleitet von einem Anstieg in der Aktivität, wie gemessen unter Verwendung synthetischer Substrate, und von einem Anstieg in der fibrinolytischen Aktivität. Einkettiger-t-PA wird aktiv bei Bindung an Fibrin, möglicherweise wegen einer konformationellen Änderung im Aktivator, die durch die Bindung an Fibrin induziert wird. Spaltung der zweikettigen Form kann verbunden sein mit schneller Clearance von t-PA aus dem Blutstrom, aber es sind widerstreitende Berichte hierüber veröffentlicht worden (siehe Wallen et al., Eur. J. Biochem. 132: 681-686, 1983) und der Clearance-Mechanismus ist schlecht verstanden.
Ein zweidimensionales Modell des potentiellen Vorläufer-t-PA- Proteins ist aufgestellt worden (Ny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 5355-5359, 1984). Aus diesem Modell ist bestimmt worden, daß die schwere Kette zwei dreifache Disulfidstrukturen enthält, die als "Kringles" bekannt sind. Ähnliche Kringle-Strukturen treten auch bin Prothrombin, Plasminogen und Urokinase auf, und man glaubt, daß sie wichtig für die Bindung an Fibrin sind (Ny et al., aaO). Man glaubt, daß der zweite Kringle (K2) von t-PA eine höhere Affinität für Fibrin besitzt als der erste Kringle (K1) (Ichinose, Takio und Fujikawa, J. Clin. Invest. 78 : 163-169, 1986; Verhe&ijlig;en et al., EMBO. J. 5: 3225-3530, 1986)
Zusätzlich enthält die schwere Kette von t-PA eine "Wachstumsfaktor"-Domäne, eine dreifache Disulfid-gebundene Struktur, die Homologie aufweist zu Epidermis-Wachstumsfaktor und zu ähnlichen Domänen in Protein C, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X. Es ist festgestellt worden, daß die Wachstumsfaktordomäne an der schnellen in-vivo-Clearance von t-PA beteiligt ist und daß Deletion der Wachstumsfaktordomäne weder die Bindung des resultierenden Moleküls an Fibrin verhindert noch seine Fähigkeit blockiert, Plasminogen zu aktivieren.
Die schwere Kette von t-PA enthält auch eine "Finger"-Domäne, die homolog ist zu den Fingerdomänen von Fibronectin. Fibronectin zeigt eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten, einschließlich Fibrinbindung; seine Fibrinbindungsaktivität ist korreliert worden mit vier oder fünf von seinen neun Fingerdomänen.
Die leichte Kette von t-PA enthält die aktive Stelle für Serinproteaseaktivität, die in hohem Maße homolog ist zu den aktiven Stellen anderer Serinproteasen.
Die Vorläuferform von t-PA umfaßt zusätzlich eine Prä-Region, flußabwärts gefolgt von einer Pro-Region, die zusammen als die "Präpro"-Region bezeichnet werden. Die Prä-Region enthält ein Signalpeptid, das für die Sekretion von t-PA durch vaskuläre Endothelialzellen wichtig ist (Ny et al., aaO.). Man glaubt, daß die Prä-Sequenz verantwortlich ist für die Sekretion von t-PA in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, ein notwendiger Schritt in der extrazellulären Sekretion. Man glaubt, daß die Pro-Region vom t-PA-Molekül im Anschluß an den Transport vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat abgespalten wird.
Die Verwendung von t-PA für die Fibrinolyse bei Tieren und Menschen hat ein Schlaglicht auf mehrere Unzulänglichkeiten des nativen Moleküls geworfen. Es ist gezeigt worden, daß die Halbwertszeit von t-PA in vivo bei Menschen so kurz wie drei Minuten ist (Nilsson et al., Scand. J. Haematol. 11 : 49-53, 1984). Injiziertes t-PA wird durch die Leber schnell ausgeschieden, und innerhalb von 30 Minuten ist der Großteil des injizierten Materials zu niedermolekularen Formen metabolisiert. Diese kurze Halbwertszeit kann die Wirksamkeit von t-PA als einem thrombolytischen Mittel durch das Erfordernis hoher Dosierungen einschränken. Typischerweise wird nativer t-PA mit einer Dosis von 30-150 mg pro Patient verabreicht und die niedrige Löslichkeit des Proteins erfordert Fusion über längere Zeit. Fuchs et al. (Blood 65 : 539-544, 1985) schlossen, daß infundierter t-PA von der Leber in einem von der proteolytischen Stelle unabhängigen Prozeß ausgeschieden wird und daß infundierter t-PA sich nicht im Körper akkumulieren wird, d. h., daß der Clearance-Mechanismus nicht saturiert werden kann. Außerdem sind Dosen von t-PA, die ausreichend sind, um Coronathromben aufzulösen, weit größer als normale physiologische Gehalte und können Aktivierung von Plasminogen im ganzen Körper bewirken, was zu systemischem Abbau von Fibrinogen führt (Sherry, aaO.), was zu gefährlichen Blutungsvorfällen führt. Diese systemische Aktivität beruht offensichtlich auf der niedrigen Spezifität der zweikettigen Form des Moleküls.
Verschiedene Forscher haben t-PA in dem Bestreben modifiziert, seine klinische Eignung zu erhöhen. Rosa und Rosa (Internationale Patentanmeldung WO 86/01538) modifizierten das Lys an Position 277 von t-PA, um die einkettige Form von t-PA zu stabilisieren. Ile(277)-t-PA, produziert in E. coli, erwies sich als weniger aktiv als ein einkettiges Molekül, verglichen mit nativem t-PA. Wallen et al. (aaO.) postulierten, daß dieser Lysinrest verantwortlich sein kann für die proteolytische Aktivität von einkettigen t-PA. Heynecker und Vehar (veröffentlichte Britische Patentanmeldung 2,173,804) offenbaren Aminosäuresubstitutionen um die Spaltungsstelle von t-PA herum. Es wurde gezeigt, daß ein abweichender t-PA, der Glu an Position 275 umfaßt, größere spezifische Aktivität besitzt, verglichen mit nativem t-PA. Diese abweichende t-PA bildete auch weniger Komplexe mit t-PA-Inhibitor. Es wurde auch gezeigt, daß die einkettige Form größere Affinität für Fibrin besitzt als die zweikettige Form. Robinson (WO 84/01786) verwendete enzymatische Mittel, um Kohlehydrat-Seitenketten von t-PA zu entfernen, um die Plasma-Halbwertszeit zu erhöhen. Van Zonneveld et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 4670-4674, 1986) offenbaren modifizierte Formen von t-PA, in denen Teile der schweren Kette deletiert worden sind. Robinson et al. (EP 207 589 A1) offenbaren mutante Formen von t-PA, in denen die Wachstumsfaktordomäne deletiert oder in anderer Weise modifiziert worden ist. Diese varianten Formen von t-PA überwinden jedoch die mit dem nativen Protein verbundenen Probleme nicht vollständig.
Es bleibt ein Bedürfnis auf diesem Gebiet bestehen nach einem Plasminogen-aktivierenden Protein mit einer langen Plasma- Halbwertszeit und einer erhöhten Affinität für Fibrin. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis, indem sie neuartige Derivate von Gewebeplasminogenaktivator zur Verfügung stellt, in denen die Kringle-1-Domäne ersetzt worden ist durch eine Kringle-Domäne, die von einem anderen Protein abgeleitet ist. Die hierin beschriebenen t-PA-Analoga stellen signifikante Vorteile gegenüber nativem t-PA zur Verfügung, wenn sie als therapeutische Mittel eingesetzt werden. Diese Vorteile schließen eine erhöhte Spezifität für Fibrin ein, d. h. eine erhöhte Affinität für Fibrin, was zu erhöhter Spezifität für Gerinnsel-Auflösung führt. Erhöhte Spezifität kann die systemischen Blutungswirkungen, die bei nativem t-PA beobachtet werden, verringern. Ersatz der Kringle-1-Domäne kann auch mit anderen Mutationen in t-PA kombiniert werden, um zusätzliche neuartige Analoga mit erhöhter klinischer Eignung bereitzustellen. Durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie wird eine konsistente und homogene Quelle für diese Proteine bereitgestellt. Die Proteine können verwendet werden, um bestehende Gerinnsel bei Herzanfall- und Schlaganfallopfern und bei anderen aufzulösen, bei dem die Notwendigkeit therapeutisch wünschenswert ist, die Bildung von Fibrin-Matrizes aufzulösen oder zu unterdrücken.

Offenbarung der Erfindung

Kurz gesagt, offenbart die vorliegende Erfindung Gewebeplasminogenaktivator-Analoga, bei denen die K1-Domäne von nativen t- PA durch eine andere Kringle-Domäne ersetzt ist, wobei die Kringle-Domäne die Bindung des Analogs an Fibrin mediatisiert. Der Kringle enthält sechs Cysteinreste und das Analog zeigt größere Spezifität für Fibrin als nativer t-PA. In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung kann die Kringle-Domäne aus 77-81 Aminosäuren bestehen und kann die Aminosäuresequenz umfassen:
Cys Lys Thr Gly X Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys,
wobei X Asp oder Asn ist.
Die hierin beschriebenen t-PA-Analoga können außerdem eine Substitution von wenigstens einer Aminosäure innerhalb der 13 Aminosäurereste der Spaltungsstelle enthalten, wobei diese Substitution zu einer erhöhten Resistenz gegenüber der Spaltung durch Plasmin führt. Zusätzlich können die hierin beschriebenen t-PA-Analoga eine Fingerdomäne enthalten, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den in den Fig. 19 (A)-(I) dargelegten Sequenzen besteht.
Zusätzlich können die hierin beschriebenen Analoga außerdem die K2-Domäne von nativem t-PA enthalten, die so modifiziert ist, daß sie Serin und Threonin an den Aminosäurepositionen 183 bzw. 186 enthält. Außerdem noch können den hierin beschriebenen Analoga eine Wachstumsfaktor-Domäne fehlen oder sie können eine Wachstumsfaktor-Domäne eines Proteins enthalten, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus nativem t-PA, Protein C, Faktor VII, Faktor IX und Faktor x besteht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Wachstumsfaktor-Domäne diejenige von nativem t-PA, wobei die Wachstumsfaktor-Domäne so modifiziert ist, daß wenigstens ein Cysteinrest durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Die Aminosäure ist vorzugsweise Serin oder Alanin.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die hierin beschrieben sind, sind die Cysteinreste an den Positionen 1 und 22 relativ zum N-Terminus der Kringle-Domäne und an den Positionen 1, 6, 18 oder 19 und irgendeiner von 29, 30 oder 31 relativ zum C-Terminus der Kringle-Domäne angeordnet.
DNA-Sequenzen, die die oben beschriebenen t-PA-Analoga kodieren, sowie Expressionsvektoren, die solche DNA-Sequenzen enthalten, sind ebenfalls offenbart. Bevorzugte Expressionsvektren in dieser Hinsicht sind Zem99-8000 oder Zem99-8100.
Mit solch einem Expressionsvektor transfizierte oder transformierte Wirtszellen sind ebenfalls offenbart. Die Wirtszelle kann E. coli oder eine Säugetierwirtszelle sein, wie etwa BHK- Wirtszellen.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein t-PA-Analog, wie hierin beschrieben, und ein physiologisch annehmbares Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfaßt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht die Präpro-t-PA-Kodierungssequenz, konstruiert aus cDNA und synthetisierten Oligonukleotiden, zusammen mit der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins. Zahlen oberhalb der Linien beziehen sich auf die Nukleotidposition und Zahlen unterhalb der Linien beziehen sich auf die Aminosäureposition.
Fig. 2 veranschaulicht die Konstruktion des Vektors Zem99.
Fig. 3 veranschaulicht die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz der K1-Domäne von Plasminogen.
Fig. 4 zeigt partielle Restriktionskarten der Klone #1-3 und #8-5, die Teile der Plasminogen-K1-Domäne kodieren.
Fig. 5 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pPKA.
Fig. 6 veranschaulicht die Konstruktion eines Vektors, der die Plasminogen-K1-Kodierungssequenz enthält.
Fig. 7 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid Zem99- 2020.
Fig. 8 veranschaulicht die Konstruktion der Plasmide Zem99- 8000 und Zem99-8100.
Fig. 9 und 10 zeigen die cDNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen von repräsentativen t-PA-Analoga.
Fig. 11 veranschaulicht die Konstruktion der pMH-Reihe von Plasmiden, die mutante DNA-Sequenzen umfassen, die t-PA-Analoga mit geänderten Spaltungsstellen kodieren.
Fig. 12 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids Zem182b.
Fig. 13 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid Zem219b.
Fig. 14 veranschaulicht die Konstruktion der Plasmide Zem99- 9100 und Zem99-9200.
Fig. 15 zeigt die mutierte t-PA-Sequenz in Plasmid Zem99- 9100, zusammen mit der Aminosäuresequenz des kodierten t-PA- Analogs. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäureposition.
Fig. 16 veranschaulicht die Nukleotidsequenz der mutanten DNA-Sequenz in Zem99-9200, zusammen mit der Aminosäuresequenz des kodierten t-PA-Analogs. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäureposition.
Fig. 17 zeigt eine grafische Darstellung des Plasmaspiegels gegen die Zeit für nativen t-PA und ein repräsentatives t-PA- Analog, die Ratten verabreicht wurden. (----) gibt nativen t- PA an, (----) Analog #8000.
Fig. 18 zeigt die Ergebnisse eines Gerinnselauflösungstests auf nativem t-PA und einem repräsentativen t-PA-Analog der vorliegenden Erfindung. (----) zeigt nativen t-PA, (----) Analog #8000.
Fig. 19(A)-(I) veranschaulicht die Aminosäuresequenzen der Fingerdomäne von nativem t-PA und von Consensus-Fingerdomänen
Fig. 20 veranschaulicht die Homologie unter Kringle-Domänen von Urokinase (U), nativem t-PA (tPA), Plasminogen (PL), Faktor XII (FXII) und Prothrombin (PT). (-) zeigt eine Lücke an, die eingeschoben ist, um die Sequenzübereinstimmung zu maximieren.

Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung

Vor der Darlegung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen von bestimmten hierin verwendeten Begriffen anzugeben.

Komplementäre DNA oder cDNA:

Ein DNA-Molekül oder eine DNA- Sequenz, die enzymatisch aus den in einer mRNA-Matrize vorhandenen Sequenzen synthetisiert worden ist, oder ein Klon eines solchen Moleküls.

DNA-Konstrukt:

Ein DNA-Molekül, oder ein Klon eines solchen Moleküls, entweder einzel- oder doppelsträngig, das durch menschlichen Eingriff modifiziert worden ist, um DNA-Segmente zu enthalten, die in einer Art und Weise kombiniert und nebeneinandergestellt sind, die ansonsten nicht in der Natur vorkommen würde.

Plasmid oder Vektor:

Ein DNA-Konstrukt, das genetische Information enthält, die für seine Replikation sorgt, wenn es in eine Wirtszelle inseriert wird. Die Replikation kann autonom sein oder durch Integration in das Wirtsgenom erreicht werden. Ein Plasmid enthält im allgemeinen wenigstens eine Gensequenz, die in der Wirtszelle exprimiert werden soll, sowie Sequenzen, die Funktionen kodieren, die solche Genexpression erleichtern, einschließlich Promotoren, Transkriptionsinitiationsstellen und Transkriptionsterminatoren. Es kann ein lineares Molekül oder ein geschlossenes, zirkuläres Molekül sein.

Präpro-Region:

Eine Aminosäuresequenz, die im allgemeinen an den Amino-Termini der Vorläufer bestimmter Proteine auftritt und im allgemeinen vom Protein, zumindest teilweise, während der Sekretion abgespalten wird. Die Präpro-Region umfaßt teilweise Sequenzen, die das Protein in den sekretorischen Weg der Zelle lenken, und enthält im allgemeinen eine Region, die reich an hydrophoben Aminosäuren ist.

Domäne:

Eine dreidimensionale, selbstorganisierende Anordnung von Aminosäuren eines Proteinmoleküls, die Strukturelement enthält, die für eine spezifische biologische Aktivität dieses Proteins erforderlich sind.

Biologische Aktivität:

Die Funktion oder der Satz von Funktionen, die (der) von einem Molekül in einem biologischen Zusammenhang ausgeübt wird (d. h. in einem Organismus, einer Zelle oder einer in-vitro-Reproduktion derselben). Biologische Aktivitäten von Proteinen können unterteilt werden in katalytische und Effektor-Aktivitäten. Katalytische Aktivitäten von fibrinolytischen Mitteln umfassen oft die Aktivierung anderer Proteine durch spezifische Spaltung von Vorläufern. Im Gegensatz dazu schließen Effektor-Aktivitäten spezifische Bindung des biologisch aktiven Moleküls an andere Moleküle, wie etwa Fibrin, oder an Zellen ein. Effektor-Aktivität erhöht oft, oder ist wesentlich für, katalytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen. Katalytische und Effektor-Aktivitäten können in einigen Fällen in derselben Domäne des Proteins liegen. Für Plasminogenaktivatoren ist die biologische Aktivität gekennzeichnet durch die Umwandlung des Pro-Enzmys oder Zymogens Plasminogen zu Plasmin, das seinerseits Fibrin-Matrizes abbaut. Weil Fibrin als ein Cofaktor bei der Aktivierung von Plasminogen durch t-PA wirkt, besitzt einkettiges t-PA relativ geringe Aktivität in der Abwesenheit von Fibrin.

Nativer t-PA:

Ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität von Gewebeplasminogenaktivator, wie isoliert aus menschlichen Melanomzellen (siehe EP 0041766 A2). Nativer t-PA besitzt die Aminosäuresequenz des Melanomzell-t-PAs oder kann geringfügige Variationen in der Sequenz enthalten. Solche Variationen, die zum Beispiel von genetischen Polymorphismen herrühren, werden die Struktur oder Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändern. Nativer t-PA kann aus Zellen isoliert werden, die ihn natürlicherweise produzieren, oder kann aus rekombinanten Zellen hergestellt werden, die mit einer DNA-Sequenz, die nativen t-PA kodiert, transfiziert oder transformiert worden sind. Die Aminosäuresequenz eines repräsentativen nativen t-PAs ist in Fig. 1 dargestellt.

t-PA-Analog:

Ein Protein mit der charakteristischen biologischen Aktivität von Plasminogenaktivatoren, wie oben definiert, das weiter gekennzeichnet ist durch das Vorhandensein einer spezifischen, künstlich induzierten Mutation in der Aminosäuresequenz. Die DNA-Sequenz, die ein t-PA-Analog kodiert, wird als eine "mutante DNA-Sequenz" bezeichnet und wird im allgemeinen in der Form einer cDNA vorliegen. Der Ausdruck spezifische, künstlich induzierte Mutation" schließt Deletionen, Insertionen und Substitutionen in der Aminosäuresequenz ein, die durch Manipulation einer klonierten DNA-Sequenz eingeführt werden können. Im allgemeinen wird die biologische Aktivität der t-PA-Analoga zu derjenigen von nativem t-PA meßbar verändert sein.
Wie oben diskutiert, enthält nativer t-PA zwei dreifache Disulfid-gebundene Regionen, die als Kringle-Domänen bekannt sind, hierin im weiteren als "K1" und "K2" bezeichnet. Diese Domänen sind homolog zu ähnlichen Domänen, die in Prothrombin, Plasminogen, Urokinase und anderen Proteinen zu finden sind, und man glaubt, daß sie an der Bindung von t-PA an Fibrin beteiligt sind. Es ist gezeigt worden, daß die K2-Domäne die stimulatorische Wirkung von Fibrin auf die Aktivierung von Plasminogen durch nativen t-PA mediatisiert. Die K1-Domäne von nativem t-PA kann charakterisiert werden durch die Lage und Beziehungen der Cysteinreste. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist der K1 von nativem t-PA definiert als derjenige Teil des Proteins von Cys(92) bis Cys(173). Diese Domäne schließt vier andere Cysteinreste ein, wobei die sechs Cysteine in drei intramolekularen Disulfidbindungen angeordnet sind. Bindungen verknüpfen die Cysteine 92 und 173, 113 und 155 und 144 und 168.
Die Disulfid-gebundene Struktur, die oben beschrieben ist, ist charakteristisch für Kringle-Domänen, die in anderen Proteinen zu finden sind, einschließlich Plasminogen, Faktor XII und Prothrombin. Positionen von Cysteinresten sind hoch konserviert. Es gibt auch eine starke Bevorzugung für die Sequenz Tyr-Arg-Gly, Tyr-Asp-Gly oder Tyr-Gln-Gly an der Position, die den Resten 100-102 von nativem t-PA entspricht, Gly an der Position, die dem Rest 110 entspricht, Trp an der Position, die dem Rest 116 entspricht, Leu an der Position, die dem Rest 138 entspricht, und Trp an der Position, die dem Rest 154 entspricht. Es gibt auch eine Homologieregion, die sich über die Reste 142-148 von nativem t-PA erstreckt.
Fig. 20 veranschaulicht die Homologie unter Kringle-Domänen von Urokinase, nativem t-PA, Plasminogen, Faktor XII und Prothrombin. Insbesondere gibt es eine Bevorzugung für Tyr-Arg- Gly, Tyr-Asp-Gly oder Tyr-Gln-Gly an Position 9 bis 11 vom N- Terminus; einen Gly-Rest an Position 19 vom N-Terminus; ein Trp an Position 25 vom N-Terminus; ein Leu an einer der Positionen 44 bis 47 vom N-Terminus; ein Trp unmittelbar N-terminal zum Cys an Position 18 oder 19 vom C-Terminus; Arg-Asn- Pro-Asp unmittelbar C-terminal zum Cys, angeordnet an Position 29-31 vom C-Terminus; und irgendeines von Asn-Tyr, Asn-Phe oder Ala-Phe, angeordnet unmittelbar N-terminal zum Cys an Position 29-31 vom C-Terminus.
Die Erfinder haben herausgefunden, daß durch Ersetzen der K1- Domäne von nativem t-PA durch eine Kringle-Domäne, die abgeleitet ist von einem anderen Protein, die Fibrin-Affinität und Spezifität für Gerinnselauflösung des resultierenden Proteins signifikant erhöht werden. Geeignete Ersatz-Kringle-Domänen schließen die K1-, K2-, K3-, K4- und K5-Domänen von Plasminogen, die K2-Domäne von nativem t-PA, die K1- und K2-Domäne von Prothrombin und die Kringle-Domäne von Faktor XII ein. Es ist bevorzugt, die K1-, K4- oder K5-Domäne von Plasminogen einzusetzen, wobei die K1-Domäne besonders bevorzugt ist. Eine cDNA-Teilsequenz, die Plasminogen kodiert, ist von Malinowski et al., Biochemistry 23 : 4243, 1984, offenbart. Diese Sequenz kann als eine Sonde verwendet werden, um einen Vollängen-Klon zu erhalten. Die Aminosäuresequenzen von Kringle-Domänen von Plasminogen sind offenbart von Sottrup-Jensen et al., Prog. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis 3 : 191-209, 1978; Lerch et al., Eur. J. Biochem. 197 : 7-13, 1980; und DeMarco et al., J. Biol. Chem. 257 : 12716-12721, 1982. Die Aminosäuresequenz der Faktor XII-Kringle-Domäne ist offenbart von McMullen und Fujikawa, J. Biol. Chem. 260 : 5328-5341, 1985. DNA-Sequenzen, die die verschiedenen Kringle-Domänen kodieren, können durch enzymatische Verdauung von cDNA erhalten werden oder können vorzugsweise aus synthetisierten Oligonukleotiden auf der Basis der bekannten Aminosäure- oder DNA-Sequenzen konstruiert werden. Verfahren zum Synthetisieren von DNA sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Alternativ können geeignete Oligonukleotide aus synthetisierten Oligonukleotiden auf der Basis der bekannten Aminosäure- oder DNA-Sequenzen konstruiert werden. Verfahren zum Synthetisieren von DNA sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Alternativ können geeignete Oligonukleotide von kommerziellen Lieferanten bezogen werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, diese neuartigen Proteine durch die Verwendung rekombinanter DNA-Technologie herzustellen, unter Verwendung von cDNA-Klonen oder Genom-Klonen als Ausgangsmaterialien. Geeignete DNA-Sequenzen können auch gemäß Standardverfahren synthetisiert werden. Es ist bevorzugt, cDNA-Klone zu verwenden, weil durch den Einsatz der Vollängen-cDNA, die nativen t-PA kodiert, als Ausgangsmaterial zur Herstellung von modifiziertem t-PA Introns entfernt werden, so daß alle Exons des nativen t-PAs vorhanden zueinander richtig orientiert sind. Die cDNA kann auch als eine Matrize für Deletion, Alteration oder Insertion von Sequenzen über Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese verwendet werden.
Zusätzlich zu nativem t-PA können Varianten von t-PA, einschließlich derjenigen, die zuvor beschrieben sind, gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, um eine modifizierte Kringle-Domäne zu enthalten. Auf diese Weise können Vorteile der modifizierten Kringle-Domäne mit den Vorteilen der t- PA-Varianten kombiniert werden, um besonders brauchbare Produkte zu ergeben. Zum Beispiel kann, wie im Detail in den folgenden Beispielen beschrieben ist, die K1-Domäne eines t-PA- Analogs, das gegenüber Spaltung durch Plasmin resistent ist, modifiziert werden, was zu einem in hohem Maße gerinnselspezifischen Plasminogenaktivator führt. t-PA-Analoge, die gegen Spaltung durch Plasmin resistent sind, wurden durch Änderung der Aminosäuresequenz um die Arg(275)-Ile(276)-Spaltungsstelle von nativen t-PA erzeugt. Solche Alterationen erfolgen in der Form von Aminosäure-Substitutionen und -Additionen, im allgemeinen innerhalb von dreizehn Aminosäureresten der Spaltungsstelle. Einige dieser Alterationen führen zu t-PA-Analoga, die durch Thrombin gespalten werden können. Wie ebenfalls hierin beschrieben, kann die K1-Modifikation mit Modifikationen in der Finger-Domäne kombiniert werden, was ebenfalls zu einem hochspezifischen Aktivator führt; oder die Wachstumsfaktor- Domäne eines t-PA-Analogs mit einer modifizierten Kringle-Domäne kann modifiziert oder deletiert werden, um die Plasma- Halbwertszeit zu erhöhen. Eine bevorzugte Modifikation der Wachstumsfaktor-Domäne ist der Ersatz von einem oder mehreren der Cysteinreste durch eine andere Aminosäure. Zusätzlich kann die native t-PA-Wachstumsfaktor-Domäne durch Wachstumsfaktor- Domänen aus Proteinen mit langen Plasma-Halbwertszeiten ersetzt werden. Ersatz-Wachstumsfaktor-Domänen können zum Beispiel von Protein C, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X abgeleitet werden. DNA-Sequenzen, die diese Proteine kodieren, sind beschrieben worden (siehe zum Beispiel Hagen et al., EP 200 421; Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4673- 4677, 1985; Kurachi und Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6461-6464, 1982; und Leytus et al., Biochemistry 25 : 5098- 5102, 1986)
Andere bevorzugte Modifikationen schließen die Modifikation von Kohlehydrat-Bindungsstellen ein, um die Glykosylierungsmuster der t-PA-Analoga zu verändern. Nativer t-PA enthält eine Kohlehydrat-Additionsstelle in der K2-Domäne, die in variierendem Umfang glykosyliert ist (Pohl et al., Biochemistry 21 : 3701-3707, 1984), was zu Heterogenität bei der Herstellung des Proteins führt. Diese Heterogenität kann eliminiert werden, indem die Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Ersetzen von Gly und Ser an den Positionen 183 bzw. 186 durch Ser und Thr verändert wird. Diese Veränderungen ermöglichen die Herstellung eines gleichförmigeren und löslichen Produktes. Es ist auch festgestellt worden, daß durch Blockieren der Glykosylierung auf der K1-Domäne die Plasma-Halbwertszeit von t-PA erhöht wird. Dies wird vorzugsweise durch Ersetzen von Ser (119) durch Met erreicht. Es ist daher bei den t-PA-Analoga der vorliegenden Erfindung wünschenswert, die K1-Domäne zu verändern, um die Glykosylierung zu blockieren, wenn die K1- Domäne des Analogs im übrigen eine Kohlehydrat-Additionsstelle enthält.
Rekombinante DNA-Technologie ermöglicht die geeignete Steigerung der Fibrinbindungs-Domäne von nativen t-PA. t-PA-Analoga mit Kringle-Substitutionen, wie oben beschrieben, können außerdem durch die Insertion von zusätzlichen Kringle-Strukturen, die Addition von Finger-Domänen oder die Substitution der Finger-Domäne modifiziert werden. Diese Methodik liefert ein Mittel zum Auswählen der optimalen Kombination von funktionellen Domänen, die in nativem t-PA oder verwandten Proteinen anzutreffen sind, und stellt somit fibrinolytische Mittel mit gesteigerter biologischer Aktivität im Hinblick auf Fibrinbindung und Spezifität von Serinprotease-Aktivität zur Verfügung.
Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen werden durch ortspezifische Mutagenese unter Verwendung der klonierten t-PA-DNA-Sequenz oder eines Teils derselben als eine Matrize eingeführt. Techniken für Oligonukleotid-gerichtete invitro-Mutagenese sind allgemein auf diesem Gebiet bekannt. Ein bevorzugtes derartiges Verfahren ist dasjenige von Zoller und Smith, DNA 3 : 479-488, 1984. Die mutierte Sequenz wird dann an den Rest der t-PA-Kodierungssequenz gebunden und die rekonstruierte (mutante) Kodierungssequenz wird dann in einen Expressionsvektor inseriert. Die mutanten Sequenzen können in verschiedenen Wirtszellen exprimiert werden, einschließlich Säugetierzellen, Hefe und anderen Pilzen und Bakterien.
Die Produktion von rekombinatem t-PA in Bakterien, Hefe und Säugetierzellen ist von zum Beispiel Goeddel et al. (EP 93619 A1), Meyhack und Hinnen (EP 143 081 A2) und Gill (EP 174 835 A1) offenbart. Verfahren zum Transfizieren von Säugetierzellen und zum Transformieren von Bakterien und Pilzen mit fremder DNA sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Geeignete Expressionsvektoren werden einen Promotor, der in der Lage ist, die Transkription eines fremden Gens in einer Wirtszelle zu steuern, und eine funktionale Transkriptions-Terminationsstelle umfassen.
In einigen Fällen ist es bevorzugt, daß Expressionsvektoren außerdem einen Replikationsursprung sowie Sequenzen umfassen, die Expressionsniveaus steuern und/oder verstärken, in Abhängigkeit von der ausgewählten Wirtszelle. Geeignete Expressionsvektoren können von Plasmiden, RNA- und DNA-Viren und zellulären DNA-Sequenzen abgeleitet werden oder können Elemente von jedem enthalten.
Bevorzugte prokaryontische Wirte zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Stämme der Bakterien Escherichia coli, obgleich Bacillus und andere Gattungen ebenfalls brauchbar sind. Techniken zum Transformieren dieser Wirte und zum Exprimieren fremder DNA-Sequenzen, die in ihnen kloniert sind, sind auf diesem Gebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vektoren, die zum Exprimieren fremder DNA in bakteriellen Wirten verwendet werden, werden im allgemeinen einen selektionierbaren Marker, wie etwa ein Gen für Antibiotikaresistenz, und einen Promotor enthalten, der in der Wirtszelle funktioniert. Geeignete Promotoren schließen die Trp-(Nichols und Yanofsky, Meth. in Enzymology 101 : 155, 1983), lac-(Casadaban et al., J. Bact. 143: 971-980, 1980), TAC-(Russell et al., Gene 20 : 231-243, 1982) und Phage λ-Promotorsysteme ein. Plasmide, die zum Transformieren von Bakterien brauchbar sind, schließen pBR322 (Bolivar et al., Gene 2: 95-113, 1977), die pUC-Plasmide (Messing, Meth. in Enzymology 101 : 20-77, 1983; und Vieira und Messing, Gene 19 : 259-268, 1982), pCQV2 (Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2: 1-10, 1983) und Derivate derselben ein.
Eukaryontische Mikroorganismen, wie etwa die Hefe Saccharomyces cerevisiae, oder Fadenpilze, einschließlich Aspergillus, können ebenfalls als Wirtszellen verwendet werden. Besonders bevorzugte Spezies von Aspergillus schließen. A. nidulans, A. niger, A. oryzae und A. terreus ein. Techniken zum Transformieren von Hefe sind beschrieben zum Beispiel von Beggs (Nature 275 : 104-108, 1978). Aspergillus-Spezies können gemäß bekannten Verfahren transformiert werden, zum Beispiel demjenigen von Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1740- 1747, 1984). Expressionsvektoren zur Verwendung in Hefe schließen YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1979), YEp13 (Broach et al., Gene 8 : 121-133, 1979), pJDB248 und pJDB219 (Beggs, aaO.) und Derivate derselben ein. Solche Vektoren werden im allgemeinen einen selektionierbaren Marker umfassen, wie etwa den Nährstoffmarker TRPI, der Selektionierung in einem Wirtsstamm, der eine trp1-Mutation trägt, ermöglicht. Bevorzugte Promotoren zur Verwendung in Hefe-Expressionsvektoren schließen Promotoren für Hefe-Glykolyse-Gene (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 : 12073-12080, 1980; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1 : 419-434, 1982; Kawasaki, U.S.-Patent Nr. 4,599,311) oder Alkohol-Dehydrogenase-Gene (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., Hrg., S. 335, Plenum, New York, 1982; und Ammerer, Meth. in Enzymology 101: 192-201, 1983) ein. Um die Reinigung eines modifizierten t-PA- Proteins, das in einem Hefe-Transformanten produziert ist, zu erleichtern und richtige Disulfidbindungsbildung zu erhalten, kann die t-PA-Präpro-Sequenz durch eine Signalsequenz aus einem Hefegen ersetzt werden, das ein sekretiertes Protein kodiert. Eine besonders bevorzugte Signalsequenz ist die Präpro-Region des MFα1-Gens (Kurjan und Herskowitz, Cell 30 : 933- 943, 1982; und Singh (EP 123 544)).
Höhere eukaryontische Zellen können ebenfalls als Wirtszellen bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung dienen. Kultivierte Säugetierzellen, wie etwa die BHK-, CHO-, NS-1-, SP2/0- und J558L-Zellinien, sind bevorzugt. Diese und andere Zellinien sind in weitem Umfang zum Beispiel von der American Type Culture Collection erhältlich. Eine besonders bevorzugte adhärente Zellinie ist die BHK-Zellinie tk ts13 (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1106-1110, 1982), hierin im weiteren als "tk BHK-Zellen" bezeichnet. Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierzellen umfassen einen Promotor, der in der Lage ist, die Transkription eines fremden Gens, das in eine Säugetierzelle eingeführt ist, zu steuern. Besonders bevorzugte Promotoren schließen den SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 : 854-64, 1981), den MT-1-Promotor (Palmiter et al., Science 222 : 809-814, 1983) und den Mäuse-Kappa- Gen-Promotor (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7041-7045, 1984) ein. Ebenfalls enthalten in den Expressionsvektoren ist ein Transkriptionsterminator, der flußabwärts der Insertionsstelle für die zu exprimierende DNA-Sequenz angeordnet ist. Ein bevorzugter Terminator ist der Terminator des Gens für das menschliche Wachstumshormon (hGH) (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719-3730, 1981). Zusätzlich werden Vektoren Verstärkersequenzen enthalten, die für die bestimmte Wirtszellinie geeignet sind.
Zur Expression von mutanten t-PAs in kultivierten Säugetierzellen werden Expressionsvektoren, die klonierte t-PA-Sequenzen enthalten, mit geeigneten Transfektions-Techniken in die Zellen eingeführt, wie etwa Calciumphosphat-mediatisierte Transfektion (Graham und Van der Eb, Virology 52 : 456-467, 1973; wie modifiziert von Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 3567-3570, 1980; oder wie beschrieben von Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 422, 1982) oder Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1 : 841-845, 1982). Eine kleine Fraktion der Zellen integrieren DNA in das Genom der Wirtszelle oder halten die DNA in nicht-chromosomalen Kernstrukturen. Die Transfektanten können durch Cotransfektion mit einem Gen identifiziert werden, das einen selektionierbaren Phänotyp verleiht (ein selektionierbarer Marker). Bevorzugte selektionierbare Marker schließen das DHFR-Gen, das Zellresistenz gegen Methotrexat (MTX), einen Inhibitor der Nukleotidsynthese, verleiht; oder das bakterielle Neomycin-Resistenzgen ein, das Resistenz gegen das Medikament G-418, einen Inhibitor der Proteinsynthese, verleiht. Nachdem die Wirtszellen die DNA aufgenommen haben, wird Medikamentenselektion angewendet, um auf eine Population von Zellen zu selektionieren, die den selektionierbaren Marker auf Niveaus exprimieren, die hoch genug sind, um Resistenz zu verleihen. Selektionierbare Marker können auf demselben Vektor wie die Sequenz, die das t-PA-Analog kodiert, getragen werden, oder sie können auf einem separaten Vektor getragen werden, in Abhängigkeit von der eingesetzten Transfektionsvorschrift.
Die t-PA-Analoga der vorliegenden Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlungen von Thrombose verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden die t-PA-Analoga in Kombination mit einem Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfassen, wie etwa sterilem Wasser oder steriler physiologischer Kochsalzlösung, und können auch geeignete Bindemittel- und/oder Lösungsmittel umfassen. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können für Gebrauch abgepackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor Verabreichung mit einer sterilen wäßrigen Lösung kombiniert wird.
Typischerweise wird eine wäßrige Lösung, die 3 g Mannit und 106 Einheiten des t-PA-Analogs enthält, unter sterilen Bedingungen hergestellt. 1 ml-Aliquote dieser Lösung werden in kleine Ampullen pippetiert, die dann lyophilisiert und zugeschmolzen werden. Für die Injektion wird das lyophilisierte Material mit 2 ml sterilem Wasser kombiniert, wobei das Wasser in einer zugeschmolzenen Ampulle bereitgestellt wird. Verabreichung erfolgt vorzugsweise durch Injektion. Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden typischerweise in Dosen von etwa 6 mg bis etwa 30 mg pro Patient verabreicht, in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten und der Natur des aufzulösenden Thrombus. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf den obigen Bereich beschränkt und die Dosis kann abhängig von den Umständen variiert werden. Die Bestimmung der richtigen Dosis wird für den Fachmann auf diesem Gebiet klar sein.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Konstruktion eines Vollängen-t-PA-Klons

Die Sequenz eines nativen Human-t-PA-cDNA-Klons ist berichtet worden (Pennica et al., Nature 301 : 214-221, 1983). Die Sequenz kodiert ein Präpropeptid mit 32-35 Aminosäuren, gefolgt von einem 527-530 Aminosäure langen reifen Protein.
Ein cDNA-Klon, der die Kodierungssequenz für reifen t-PA umfaßt, wurde unter Verwendung von mRNA aus der Bowes-Melanom- Zellinien (R&ijlig;ken und Collen, J. Biol. Chem. 256 : 7035-7041, 1981) als Ausgangsmaterial konstruiert. Diese cDNA wurde dann verwendet, um das Plasmid pDR1296 zu konstruieren. Escherichia t-Stamm JM83, transformiert mit pDR1296, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 53347 hinterlegt worden.
Weil die Präpro-Sequenz im cDNA-Klon pDR1296 nicht vorhanden war, wurde sie aus synthetisierten Oligonukleotiden konstruiert und anschließend an die cDNA gebunden. In der synthetisierten t-PA-Präpro-Sequenz wurden Spaltungsstellen für Bam HI und Nco I unmittelbar 5' zum ersten Codon (ATG) der Präpro-Sequenz eingeführt und eine Bgl II(Sau 3A, Xho II)- Stelle wurde am 3'-Ende der Präpro-Sequenz beibehalten. Der natürlich auftretenden Präpro-Sequenz fehlt eine geeignete Restriktionsstelle nahe der Mitte; die Sequenz GGAGCA (die für die Aminosäuren -20 und -19, Gly-Ala, kodiert) kann jedoch zu GGCGCC geändert werden, um eine Nar 1-Stelle bereitzustellen, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern.
Um die Präpro-Sequenz zu konstruieren, wurden die folgenden Oligonukleotide unter Verwendung eines DNA-Synthesizers Applied Biosystems Modell 380-A synthetisiert:
Im Anschluß an die Reinigung wurden die Oligomere ZC131 und ZC132 anneliert, um eine Überlappung von 12 Basenpaaren herzustellen (Abschnitt 1). Die Oligomere ZC133 und ZC134 wurden in ähnlicher Weise anneliert (Abschnitt 2). Die Oligomere wurden in Pol I-Puffer (Bethesda Research Labs) vermischt, für 5 Minuten auf 65ºC erhitzt und langsam für 4 Stunden auf Raumtemperatur abgekühlt, um zu annelieren. Zehn Einheiten DNA- Polymerase I wurden zugegeben und die Reaktion verlief für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Mischungen wurden einer Elektrophorese auf einem 8%igem Polyacrylamid-Harnstoff-Sequenzierungsgel bei 1.000 Volt für 2½ Stunden unterzogen, um die Reaktionsprodukte nach Größe zu fraktionieren. Die Fragmente mit der richtigen Größe (diejenigen, in denen die Polymerasereaktion bis zur Vervollständigung abgelaufen war) wurden aus dem Gel ausgeschnitten und extrahiert.
Nach dem Annelieren wurde Abschnitt 1 mit Bam HI und Nar I geschnitten und in mit Bam HI + Nar I geschnittenen pUC8 (Vieira und Messing, Gene 19 : 259-268, 1982; und Messing, Meth. in Enzymology 101 : 20-77, 1983) kloniert. Abschnitt 2 wurde erneut anneliert und mit Nar I und Bgl II geschnitten und in mit Bam HI + Nar I geschnittenen pUC8 kloniert. Kolonien wurden mit den geeigneten markierten Oligonukleotiden gescreent. Plasmide, die durch Koloniehybridisierung als positiv identifiziert worden waren, wurden sequenziert, um zu verifizieren, daß die richtige Sequenz kloniert worden war.
Abschnitt 1 wurde dann aus einer Bam HI + Nar I-Doppelverdauung des geeigneten pUC-Klons gereinigt. Abschnitt 2 wurde aus einer Nar I + Xho II-Verdauung gereinigt. Die zwei Fragmente wurden an der Nar I-Stelle verknüpft und in mit Bam HI geschnittenen pUC8 kloniert.
Die t-PA-Sequenz von pDR1296 wurde dann mit der synthetisierten Präpro-Sequenz in der folgenden Art und Weise verknüpft (Fig. 2). Plasmid pIC19R (Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984) wurde mit Sma I und Hind III verdaut. Die ori-Region von SV40 von Kartenposition 270 (Pvu II) bis Position 5171 (Hind III) wurde dann an den linearisierten pIC19R ligiert, um Plasmid Zem67 herzustellen. Dieses Plasmid wurde dann mit Bgl II geschnitten und die Terminatorregion aus dem menschlichen Wachstumshormon-Gen (De Noto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719- 3730, 1981) wurde als ein Bgl II-Bam HI-Fragment inseriert, um Plasmid Zem86 herzustellen. Die synthetisierte t-PA-Präpro- Sequenz wurde aus dem pUC8-Vektor durch Verdauung mit Bam HI und Xho II entfernt. Dieses Fragment wurde in mit Bgl II verdautes Zem86 inseriert, um Plasmid Zem88 herzustellen. Plasmid pDR1296 wurde mit Bgl II und Bam HI verdaut und das t-PA-cDNA- Fragment wurde isoliert und in mit Bgl II geschnittenes Zem88 inseriert. Das resultierende Plasmid wurde mit "Zem94" bezeichnet.
Der Vektor Zem99, der den MT-1-Promotor, die vollständige t- PA-Kodierungssequenz und den hGH-Terminator umfaßt, wurde dann in der folgenden Art und Weise zusammengebaut (Fig. 2). Ein Kpn I-Bam HI-Fragment, das den MT-1-Promotor umfaßte, wurde aus MThGH111 (Palmiter et al., Science 222 : 809-814, 1983) isoliert und in pUC18 inseriert, um Zem93 zu konstruieren. Plasmid MThGH112 (Palmiter et al., aaO.) wurde mit Bgl II verdaut und erneut ligiert, um die hGH-Kodierungssequenz zu eliminieren. Der MT-1-Promotor und hGH-Terminator wurden dann als ein Eco RI-Fragment isoliert und in pUC13 inseriert, um Zem4 zu konstruieren. Zem93 wurde dann durch Verdauung mit Bam HI und Sal I linearisiert. Zem4 wurde mit Bgl II und Sal I verdaut und der hGH-Terminator wurde gereinigt. Die t-PA-Präpro- Sequenz wurde aus dem pUC8-Vektor als ein Bam HI-Xho II-Fragment entfernt. Die drei DNA-Fragmente wurden dann verknüpft und ein Plasmid mit der Struktur von Zem97 (Fig. 2) wurde ausgewählt. Zem97 wurde mit Bgl II geschnitten und das Xho II- t-PA-Fragment aus Zem94 wurde inseriert. Der resultierende Vektor ist Zem99.

Beispiel 2: Konstruktion einer DNA-Sequenz, die die K1-Domäne von Plasminogen kodiert

Plasmid pK1 umfaßt eine Kodierungssequenz für die K1-Domäne von Plasminogen, deren Sequenz in Fig. 3 dargestellt ist. Es wurde aus einer Reihe von 11 Oligonukleotiden konstruiert, die mit "PK1-1, PK1-2, PK1-3----PK1-12" bezeichnet sind, deren Sequenzen in Tabelle 1 dargestellt sind.

TABELLE 1

Oligonukleotid Sequenz

Die Kodierungssequenz für die Nukleotide 1 bis 182 der Plasminogen-K1-Domäne wurde aus den Oligonukleotiden PK1-1 bis PK1-7 in der folgenden Art und Weise konstruiert. Jeweils 100 pmol der Oligonukleotide PK1-1, PK1-2, PK1-3 und PK1-4 wurden an ihren 5'-Termini phosphorliert. Die phosphorlierten Oligonukleotide wurden mit jeweils 100 pmol von PK1-5, PK1-6 und PK1-7 vermischt. Die Mischung wurde mit Ethanol gefällt und der Niederschlag wurde in H&sub2;O erneut suspendiert und für drei Minuten bei 90ºC erhitzt. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehengelassen, dann auf Eis gegeben. Zu der abgeschreckten Mischung wurden 10 ul 660 mM Tris-HCl, pH 7,6, enthaltend 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 ul 0,1 M Dithiothreit, 10 ul 5 mM ATP und 1.000 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase zugegeben. Die Mischung wurde 15 Stunden bei 14ºC inkubiert. Ethanol wurde zugegeben und der Niederschlag wurde in 20 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) erneut suspendiert, gefolgt von der Zugabe eines gleichen Volumens von Alkali-eintragendem Puffer (20 mM NaCl, 2 mM EDTA, 80% Formamid, 0,1% Xylolcyanol und 0,1% Bromphenolblau). Die Mischung wurde für 3 Minuten bei 90ºC erhitzt und auf einem 6%igen Polyacrylamidgel, das 8,4 M Harnstoff enthielt, für eine Stunde bei 300 Volt einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und eine 250 bp-Bande wurde durch elektrophoretischen Transfer auf DEAE-Cellulosepapier gewonnen (Dretzen et al., Anal. Biochem. 112 : 295-298, 1981). Die gewonnene DNA wurde in 100 ul TE-Puffer löslich gemacht und das Fragment wurde mit "PK1-n" bezeichnet. PK1-n wurde am 3'-Terminus C-getailt, indem 10 ul der PK1-n-Lösung mit 2 ul 100 mM Natriumcacodylat- 25 mM HEPES, pH 7,6, 6,2 ul 1 mM dCTP, 10 Einheiten terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase und 5 ul H&sub2;O kombiniert wurden. Die Reaktionsmischung wurde bei 37ºC für 10 Minuten inkubiert, dann mit Phenol: Chloroform (1 : 1) extrahiert.
Ein ul 3'-oligo(dG)-getailter pUC9 (erhalten von Pharmacia) wurde mit Sma 1 gespalten. Das linearisierte, getailte Plasmid wurde zum C-getailten PK1-n zugegeben. Die Mischung wurde dann mit Ethanol gefällt und die DNA wurde in 0,5 ul 2 M KCl und 9,5 ul TE-Puffer erneut suspendiert und bei 65ºC für 10 Minuten inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zur abgekühlten Mischung wurden 5 u1 0,2 Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 0,1 N MgCl&sub2; und 0,1 M Dithiothreit, 20 ul 2,5 mM dNTPs, 10 ul 5 mM ATP, 53 ul H&sub2;O, 5 Einheiten DNA-Polymerase 1 (Klenow- Fragment) und 300 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase zugegeben (Endvolumen 100 ul). Die Mischung wurde bei 14ºC für 12 Stunden inkubiert, dann verwendet, um E. coli JM83 zu transfizieren.
Die transfizierten JM83-Zellen wurden mit PK1-6 unter Verwendung des Verfahrens von Wallace et al. (Nuc. Acids Res. 9: 879-894, 1981) sondiert. Zwanzig positive Klone wurden sequenziert und zwei wurden ausgewählt, #1-3, enthaltend Basenpaare 1-170, und #8-5, enthaltend Basenpaare 68-186 (siehe Fig. 4).
Bezugnehmend auf Fig. 5 wurde Klon #1-3 mit Eco RI und Fok 1 verdaut und ein 130 bp langes Fragment, das eine Kpn I-Stelle enthielt, wurde gewonnen. In ähnlicher Weise wurde Klon #8-5 mit Fok I und Hind III verdaut und ein 90 bp langes Fragment wurde gewonnen. Die zwei Fragmente wurden mit mit Eco RI und Hind III verdautem pUC12 verknüpft und das resultierende Plasmid wurde mit "pPKA" bezeichnet. Das Plasmid enthielt somit eine DNA-Sequenz, die den Nukleotiden 1-182 der Plasminogen- K1-Sequenz entspricht.
Der Rest der K1-Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonukleotide PK1-9, PK1-10, PK1-11 und PK1-12 konstruiert. Jeweils ein pmol der Oligonukleotide wurde am 5'-Ende phosphorliert und die kombinierten Oligos wurden mit 40 ng von mit Bam HI und Sph 1 verdautem M13tg130 RF (erhalten von Amersham) vermischt. Zu dieser Mischung wurden 4 ul 660 mM Tris-HCl, pH 7,6, enthaltend 66 mM MgCl&sub2;, und 22 ul H&sub2;O zugegeben. Die Lösung wurde für drei Minuten bei 90ºC erhitzt, und man ließ sie über einen Zeitraum von einer Stunde auf Raumtemperatur abkühlen. Vier 121 0,1 M Dithiothreit, 4 ul 5 mM ATP und 300 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase wurden zugegeben und die Mischung wurde für 12 Stunden bei 14ºC inkubiert. Der resultierende Phagenklon, bezeichnet mit "M13PKB RF" (Fig. 6), enthielt die Nukleotide 183 bis 250 der K1-Sequenz.
Der Zusammenbau der vollständigen K1-Kodierungssequenz ist in Fig. 6 dargestellt. Plasmid pPKA wurde mit mit Mlu 1 und Sau 3AI verdaut und ein 176 bp langes Fragment wurde gewonnen. M13PKB RF wurde mit Sau 3AI und Eco RI verdaut und ein 88 bp langes Fragment wurde gewonnen. Diese Fragmente wurden mit Mlu 1 und Eco RI verdautem M13um20 RF (erhalten von IBI) verknüpft und das resultierende Plasmid wurde mit "M13um20-PK1" bezeichnet.
Die PK1-Kodierungssequenz wurde dann in die t-PA-cDNA als ein Ersatz für die t-PA-Kringle-1-Sequenz inseriert (Fig. 7 und 8). Die t-PA-Sequenz wurde zunächst mutagenisiert, um Mlu I- und Eco RV-Stellen zu inserieren. Plasmid pDR1496 wurde mit Sph I und Xba 1 verdaut und das 2,1 kb lange Fragment, das die alpha-Faktor- und t-PA-Sequenzen umfaßte, wurde isoliert. (S. cerevisiae-Stamm E8-11c, der mit pDR1496 transformiert ist, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 20728 hinterlegt worden.) Dieses Fragment wurde mit mit Sph I und Xba I verdautem M13tg130 (RF) verknüpft und die resultierende Phage wurde mit "M13tg130-W" bezeichnet. Einzelsträngige Phagen-DNA wurde dann an ein Oligonukleotid (&sup5;'GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC³') anneliert, und Mutagenese wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt. Die mutagenisierte Phage wurde mit "M13tg130-PKA1" bezeichnet. Einzelsträngige DNA von M13tg130-pKA wurde isoliert und mit einem Oligonukleotid mit der Sequenz &sup5;'CTC AGA GCA TTC CAG GAT ATC GCA GAA CTC³' mutagenisiert. Einzelsträngige DNA wurde aus der mutagenisierten Phage hergestellt und sequenziert. Ein Klon, der eine Mlu I- Stelle am 5'-Ende und eine Eco RV-Stelle am 3'-Ende der Kringle-1-Kodierungssequenz enthielt, wurde ausgewählt und mit "M13tg130-PKA2" bezeichnet (Fig. 7).
Replikativform-DNA wurde aus M13tg130-PKA2 hergestellt und wurde mit Bgl II und Apa I verdaut. Das Fragment, das die Mlu I- und Eco RV-Stellen enthielt, wurde gewonnen und mit mit Bgl II und Apa I verdautem Zem99 verknüpft, wie dargestellt in Fig. 7. Das resultierende Plasmid wurde mit "Zem99-2020" bezeichnet.
Die PK1-Sequenz wurde dann in die t-PA-cDNA inseriert. M13um20-PK1 RF wurde mit Mlu I und Eco RV verdaut und das 336 bp lange Fragment wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde mit mit Mlu I und Eco RV verdautem Zem99-2020 verknüpft, um Zem99- 8000 zu konstruieren (Fig. 8). Die mutante t-PA-Kodierungssequenz von Zem99-8000 und die kodierte Aminosäuresequenz sind in Fig. 9 dargestellt. E. coli, das mit Zem99-8000 transformiert ist, ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI), unter Zugangsnummer FERM P-9272 hinterlegt worden.
Die Plasmide Zem99-8000 und pSV2-dhfr (Subramaniet al., aaO.) wurden verwendet, um tk BHK-Zellen mit dem Verfahren von Loyter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 422, 1982) zu cotransfizieren. Transfektanten wurden mit dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert. Das mutante t-PA-Protein, bezeichnet als "#8000", wurde affinitätsgereinigt auf einer Säule, die einen Antikörper zu nativem t-PA enthielt.

Beispiel 3: Herstellung von #8100

Eine zweite Plasminogen-K1-Sequenz, die Asn an Position 96 kodiert, wurde konstruiert (Fig. 8). Zem99-8000 wurde mit Bam HI verdaut und das Fragment, das die Bgl II-Stelle enthielt, wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde mit mit Bam HI geschnittenem M13mp18 verknüpft, um M13-8000R zu konstruieren. Ein Oligonukleotidprimer (Sequenz &sup5;TTT TTA CCA TTA CCG GTC TT³') wurde an einzelsträngigen M13-8000R anneliert und Mutagenese wurde gemäß Routineverfahren durchgeführt. Klone wurden gescreent und sequenziert und doppelsträngige DNA, bezeichnet mit "M13-8000RF", wurde aus einem positiven Klon hergestellt. Diese Phage wurde mit Bgl II und Apa 1 verdaut und das t-PA- Fragment wurde isoliert und mit mit Bgl II und Apa I geschnittenem Zem99 verknüpft. Das resultierende Plasmid wurde mit "Zem99-8100" bezeichnet. Die t-PA-Kodierungssequenz, die in Zem99-8100 vorliegt, und die kodierte Aminosäuresequenz sind in Fig. 10 dargestellt. E. coli RR1, transformiert mit Zem99- 8100, ist beim Fermentation Research Institute unter Zugangsnummer FERM P-9315 hinterlegt worden.
Um das mutante 8100-Protein zu exprimieren, wurden Zem99-8100 und pSV2-dhfr verwendet, um tk BHK-Zellen mit dem Verfahren von Loyter (aaO.) zu cotransfizieren. Transformanten wurden mit dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert. Das Protein wurde affinitätsgereinigt, wie oben beschrieben.

Beispiel 4 - Substitutionen der K1-Domäne in t-PA-Analoga, die gegenüber Spaltung durch Plasmin resistent sind

A: Mutagenese

Für ortsspezifische Mutagenese der Spaltungsstelle wurde ein 472 bp langes Eco RI-Fragment, das die t-PA-Sequenz von bp 802 bis bp 1274 umfaßte, aus Zem99 isoliert und in die Eco RI- Stelle von M13mp18 (Replikativform) kloniert. Die rekombinante Phage wurde in E. coli (JM101) transfiziert und anti-sense- Strang-DNA wurde isoliert.
Ortsspezifische Nutagenese wurde dann auf der einzelsträngigen anti-sense-Matrizen-DNA unter Verwendung einer der Mutagenese- Primer, die in Tabelle 2 dargestellt sind, und ZC87 (&sup5;'TCC CAG TCA CGA CGT³') als zweiten Primer durchgeführt. Die Oligonukleotide ZC487, 488, 489 und 620 ändern das Phe an Position 274 zu Glu, Gly, Arg bzw. Pro. Die Oligonukleotide ZC797, 874, 1013 und 1027 ändern das Arg an Position 275 zu Gly, Leu, Pro bzw. Asp. Oligonukleotid 621 führt ein Leu anstelle des Lys an Position 277 ein. Oligonukleotid 928 ändert das Ile an Position 276 zu Pro. Oligonukleotid 875 ändert Arg(275) zu Leu und Oligonukleotid 927 ändert Phe(274) zu Pro im Mutanten, in dem zuvor Lys(277) zu Leu umgewandelt worden ist. So können die Oligonukleotide 875 und 927 verwendet werden, um Doppelmutationen zu erzeugen. Zwanzig pmol phosphorlierter Mutagenese-Primer und zwanzig pmol des zweiten Primers wurden mit 1 pmol einzelsträngiger Matrize in 10 ul 20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT kombiniert und bei 65ºC für 10 Minuten inkubiert, dann 5 Minuten bei Raumtemperatur, und auf Eis gegeben. Zehn ul 20 mm Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM ATP, 10 mM DTT, enthaltend 1 mM dNTPs, 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase und 3,5 Einheiten DNA-Ligase wurden zur annelierten DNA zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 15ºC inkubiert. Die DNA wurde dann in kompetente E. coli JM101 transfiziert und die Zellen wurden auf YT-Agar plattiert und bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde dann auf Nitrocellulose überführt und bei der Tm-4ºC des Mutagenese-Primers für 1 Stunde in 6 X SSC, 10 X Denhardt's vorhybridisiert und an ³²P-markiertem Mutagenese- Primer bei Tm-4ºC in derselben Lösung hybridisiert. Nach drei Waschungen bei Tm-4ºC wurden die Filter über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt. Zusätzliche Waschschritte wurden bei 5ºC höheren Inkrementen durchgeführt, wie erforderlich, um mutante Plaques zu identifizieren. Die mutierten Inserts wurden mit dem Didesoxyverfahren sequenziert. TABELLE 2

B: Vektorkonstruktion

Expressionsvektoren für die geänderten Sequenzen wurden dann konstruiert (Fig. 11). Plasmid Zem86 (beschrieben in Beispiel 1) wurde mit Hind III verdaut und die Enden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) eingefüllt. Die linearisierte DNA wurde dann mit Eco RI verdaut; und ein 350 bp langes Fragment, das die SV40-ori-Sequenz umfaßte, wurde gelgereinigt und mit mit Sma I + Eco RI verdautem pUC13 ligiert. Der resultierende Vektor wurde mit "pDR3001" bezeichnet. Plasmid pDR3001 wurde mit Sal I und Eco RI verdaut; und das 350 bp lange Fragment, das die SV40-ori- und Polylinker-Sequenzen umfaßte, wurde gelgereinigt. Zem86 wurde teilweise mit Eco RI verdaut und vollständig mit Xho I verdaut, um die SV40-ori- Sequenz zu entfernen. Das SV40-Fragment aus pDR3001 wurde dann mit dem linearisierten Zem86 verknüpft. Das resultierende Plasmid wurde mit "pDR3002" bezeichnet (Fig. 11).
Die unmittelbar flußaufwärts des ATG-Startcodons der t-PA-Sequenz in Zem94 gelegenen Sequenz wurde durch ortsspezifische Mutagenese geändert, was zur Positionierung von Hind III- und Bam HI-Stellen benachbart zum ATG führte. Die resultierende Nukleotidsequenz enthält ein Adenin in der -3-Position. Einzelsträngige M13-Matrizen-DNA wurde hergestellt, indem ein 800 bp langes Hind III-Eco RI-Fragment aus Zem94, das Polylinker-, Präpro- und einen Teil der reifen t-PA-Sequenzen umfaßte, in M13mp19 inseriert wurde. Ortsspezifische Mutagenese wurde im wesentlichen durchgeführt, wie von Zoller et al. beschrieben (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983), unter Verwendung des Oligonukleotids ZC444 (&sup5;'CAT CCA TGG TGG ATC CAA GCT TGG C³') als Mutagenese-Primer Oligonukleotid ZC87 (&sup5;'TCC CAG TCA CGA CGT³') wurde als zweiter Primer verwendet. Die mutierten Inserts wurden mit dem Didesoxyverfahren sequenziert und ein Klon, in dem Polylinker-Sequenzen deletiert worden waren und die Bam HI-Stelle am 5'-Ende der Präpro-Sequenz wiederhergestellt worden war, wurde ausgewählt. Dieser Phagenklon wurde mit Bam HI und Eco RI verdaut und die 5'-t-PA-Sequenz wurde isoliert. Zem99 wurde mit Eco RI verdaut und das Fragment, das den 3'-Teil der t-PA-Sequenz und den hGH-Terminator umfaßte, wurde isoliert. Zwei Fragmente wurden dann mit mit Bam HI + Eco RI verdautem plCl9H (Marsh et al., Gene 32 : 481- 486, 1984) in einer dreiteiligen Ligation verknüpft. Ein Plasmid, das die t-PA-Fragmente in der richtigen Orientierung enthielt, wurde ausgewählt und mit "Zem182" bezeichnet. Plasmid Zem182 wurde teilweise mit Eco RI verdaut und die Enden wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) eingefüllt. Das linearisierte Plasmid wurde gelgereinigt und unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase rezirkularisiert. Ein Plasmid, in dem die Eco RI-Stelle am 3 -Ende des hGH-Terminators zerstört war, wurde ausgewählt und mit "Zem182b" bezeichnet (Figur 12).
Replikativform(RF)-DNA wurde aus der mutagenisierten Phage, die in Beispiel 4A beschrieben ist, hergestellt und die modifizierten t-PA-Sequenzen wurden als Eco RI-Fragmente gereinigt. Plasmid Zem182b wurde mit Eco RI verdaut, die Vektorsequenzen, die die 5'- und 3'-Teile der t-PA-Kodierungssequenz enthielten, wurden mit alkalischer Intestinalphosphatase vom Kalb behandelt und die modifizierten t-PA-Sequenzen wurden inseriert. Die resultierenden Plasmide wurden mit Bam HI und Xba 1 verdaut und die t-PA-Fragmente wurden in mit Bam HI + Xba 1 geschnittenen pDR3002 inseriert. Die resultierenden Vektoren wurden mit "pMH7" bis "pMH20" bezeichnet (Tabelle 3 und Fig. 11). TABELLE 3
Protein Sequenz der Aminosäuren 273-279
Nativer t-PA
Die Aktivierungsstellenmutationen von pMH10, pMH13 und pMH17 werden mit der 8100-Mutation, die in Beispiel 3 offenbart ist, kombiniert, um t-PA-Analoga mit beträchtlich erhöhter Spezifität der Gerinnselbildung und Lyse herzustellen. Vektoren, die Kodierungssequenzen für diese Analoga enthalten, werden konstruiert, indem in einer dreiteiligen Ligation das Vektorfragment aus mit Bam HI und Xba I verdautem Zem219b, das Bam HI- Apa I-Kringle-Fragment aus Zem99-8100 und das Apa I-Xba 1-Aktivierungsstellenfragment aus dem geeigneten pMH-Vektor kombiniert wurden. Die resultierenden Plasmide werden verwendet, um tk BHK-Zellen durch Elektroporation zu transfizieren. Nach Selektion und Scale-up werden die mutanten Proteine gereinigt und charakterisiert.

Beispiel 5 - t-PA-Analoga mit Substitutionen in den K1- und Finger-Domänen

Ersatz der t-PA-Finger-Domäne durch eine Consensus-Finger-Region führt zur Eliminierung von potentiellen proteolytischen Spaltungsstellen bei Arg-27 und Lys-49. Acht Finger-Ersatzsequenzen wurden konstruiert, auf der Basis einer Analyse der Finger-Domänen von Fibronectin und t-PA. Die Aminosäuresequenzen dieser "Consensus"-Finger-Domänen sind in Fig. 19 und Tabelle 4 dargestellt.
Die Consensus-Fingersequenzen wurden aus Oligonukleotiden konstruiert, wie unten beschrieben, dann in die t-PA-Kodierungssequenz inseriert. Um diese Insertion zu erleichtern, wurde eine Kpn I-Stelle flußabwärts (3') der Region, die die Wildtyp-Finger-Domäne kodiert, eingeführt. Verdauung der resultierenden Sequenz mit Bgl II und Kpn I führte zur Deletion der Finger-Domäne

A. Insertion einer Kpn I-Stelle zwischen der Finger- und der Wachstumsfaktor-Domäne

Um eine Kpn I-Stelle nach der Finger-Domäne in t-PA zu plazieren, wurde eine Nutagenese mit Oligonukleotid ZC986 (&sup5;'TTT GAC AGG TAC CGA GTG GCA³') durchgeführt. DNA eines Phagen-N13- Klons, der das 5'-Bam HI-Eco RI-Fragment der nativen t-PA-cDNA enthielt, wurde hergestellt. 100 ul der DNA-Lösung wurden verwendet, um E. coli RZ1032 in 100 ul YT-Medium, ergänzt mit 0,1 ug/ml Uridin, zu infizieren. Diese Kultur wurde bei 37ºC, unter kräftigem Rütteln, über Nacht inkubiert. Züchten der M13 in RZ1032 erzeugt Uridin enthaltende Phage, die in RZ1032, aber nicht in JM101 lebensfähig ist.
Die Zellen wurden abgeschleudert und der Phagen-Überstand wurde verwendet, um E. coli RZ1032 erneut zu infizieren. Dieser zweite Durchgang wurde durchgeführt, um jegliche von JM101 abgeleitete Phage herauszuverdünnen, die kein Uracil enthielt. Wieder wurden die Zellen abgeschleudert und die Phage wurde auf JM101 und RZ1032 plattiert. Normale Lebensfähigkeit wurde auf RZ1032-Platten beobachtet (wobei Phage bei 10&sup9; pfu/ml angezeigt wurde), aber keine Plaques wurden auf JM101-Zellen beobachtet. Ein komplementärer Strang, geprimet mit dem Mutagenese-Oligonukleotid, wurde dann in vitro produziert. Der neue Strang, der die Mutation enthielt, enthielt Thymidin und war daher in JM101 lebensfähig; die Wildtyp-Matrize war dies nicht.
Matrizen-DNA wurde durch PEG-Fällung des Phagen-Überstandes, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung, hergestellt. Ein ug dieser Matrizen-DNA wurde mit 10 ug Oligonukleotid ZC986 hybridisiert durch kurzes Kochen, Inkubieren bei 65ºC für 5 Minuten und anschließendes langsames Herunterbringen der Temperatur auf 4ºC vor Zugabe von 10 ul 0,2 M HEPES, pH 7,8, 2 ul 1-0 mm DTT, 1 ul 1 M MgCl&sub2;, 20 ul 2,5 mm von jedem dNTP, 10 ul 10 mm ATP, 1 ul 2,5 U/ul Klenow und 2 ul 1 U/ul T&sub4;-DNA-Ligase, Endvolumen eingestellt auf 100 ul mit H&sub2;O. Nach Extension bei 37ºC für 2 Stunden wurde die DNA in kompetente JM101 transfiziert. Eine Kontrollextension (minus Oligonukleotid) wurde durchgeführt, um die Menge an Hintergrund, die durch Extension produziert wird, durch Priming auf kontaminierenden RNA- oder DNA-Spezies zu vergleichen. Die Transfektion produzierte Null Plaques mit nicht-mutagenesierter Matrize, 150 auf Kontrollextension (minus Oligonukleotid) und 300 mit mutagenesierter Matrize.
Die Platten wurden durch Hybridisieren eines Plaque-Lifts mit ³²P-markiertem Mutagenese-Oligonukleotid und Waschen in 3 M TMACl (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1585-1588, 1985) bei Tm-5ºC für 30 Minuten und auch durch Sequenzierung zufällig ausgewählter Plaques gescreent. Ein positiver Klon wurde erhalten.

B. Produktion von Finger-Ersatzdomänen

Die Consensus-Fingerregion-Ersatzsequenzen, die in Tabelle 4 und Fig. 19 dargestellt sind, wurden konstruiert. TABELLE 4 Finger Kodierte Aminosäuresequenz Oliuonukleotide*
t-PA-Wildtyp: Consensus 1:
*A = ZC1116/1117 D = ZC1122/1123
B = ZC1118/1119 E = ZC1124/1125
C = ZC1120/1121 F = ZC1126/1127 TABELLE 5
Die acht Consensus-Sequenzen wurden aus den angegebenen Oligonukleotiden erzeugt. Die Oligonukleotide (Tabelle 5) wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesizers Applied Biosystems Modell 380A hergestellt. Zunächst wurden die zwölf Oligonukleotide kinasiert und gleichzeitig an eine niedrigspezifische Aktivität mit γ-³²P-ATP markiert, indem jedes mit Polynukleotid-Kinase bei 37ºC für ½ Stunde inkubiert wurde. Dann wurden die angegebenen acht Kombinationen (ABC, DEF, ABF, AEC, AEF, DBF, DEC und DBC) hergestellt, indem die geeigneten Oligonukleotide vermischt wurden, DNA-Ligase zugegeben wurde und bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert wurde. Die Produkte dieser Reaktion wurden auf einem 6% Polyacrylamid-8 N Harnstoff-Sequenzzierungsgel aussortiert. Die Banden, die der DNA entsprechen, die für Vollängen-Finger-Domänen kodiert, wurden herausgeschnitten und die DNA wurde in 2,5 M Ammoniumacetat eluiert. Die DNA wurde ethanolgefällt und erneut in Wasser bis zu einer Konzentration von 1 pmol/ul eluiert.
RF-DNA wurde aus dem positiven Klon, der in Beispiel 5A beschrieben ist, hergestellt und das Bam HI-Eco RI-t-PA-Fragment wurde gereinigt. Plasmid Zem219a (beschrieben in Beispiel SD unten) wurde mit Xba I verdaut und dann teilweise mit Eco RI verdaut. Das 1010 bp lange Fragment, das die 3'-t-PA-Kodierungsregion enthielt, wurde gereinigt. Plasmid Zem219b (beschrieben in Beispiel 5D unten) wurde mit Bam HI und Xba I verdaut und an das &sup5;'-t-PA-Fragment (Bam HI-Eco RI) und das 1010 bp lange Eco RI-Xba I-Fragment ligiert. Der resultierende Vektor, bezeichnet mit "Zem238", enthält eine Kpn I-Stelle nach der Finger-Domäne Zem238 wurde mit Bgl II und Kpn I verdaut, gelgereinigt, um die Wildtyp-Finger-Domäne zu entfernen, und mit jeder der acht Consensus-Sequenzen ligiert, um die Expressionsvektoren 238-Fcon 1 bis 238-Fcon 8 zu erzeugen.

C. t-PA-Analoga mit einer substituierten K1-Domäne in Kombination mit einer Consensus-Finger-Domäne

Einzelsträngige M13-8100-DNA wird als eine Matrize zur Mutagenese mit Oligonukleotid ZC986 (Beispiel 5A) verwendet, um eine Kpn 1-Stelle am 3'-Ende der Fingerregion zu inserieren, wie oben beschrieben. Ein richtiger Klon (M13-8100-K) wird durch Sequenzierung identifiziert und die RF-DNA wird mit Kpn I und Xba I verdaut, um das mutante K1-Fragment zu isolieren. Das mutante K1-Fragment wird dann in die mit Kpn I und Xba I verdauten Plasmide 238-Fcon 1 bis 238-Fcon 8 inseriert. Resultierende Plasmide 8100-F1 bis 8100-F8 werden in tk BHK-Zellen durch Elektroporation transfiziert. Die mutanten Proteine werden gereinigt und charakterisiert.

D. Konstruktion von Zem219b

Plasmid pSV2-DHFR (Subramani et al., aaO.) wurde mit Cfo I verdaut und das Fragment, das die DHFR-cDNA und die 3'-gebundenen SV40-Sequenzen enthielt, wurde isoliert, repariert und an Bam HI-Linker ligiert. Nach Verdauung mit Bam HI wurde ein ungefähr 800 bp langes Fragment, das die gesamte cDNA und die SV40-Terminator-Region enthielt, gereinigt und an mit Bam HI verdauten pUC8 ligiert. Zem67 (Beispiel 1) wurde mit Bgl II verdaut und mit dem Bam HI-DHFR-SV40-Fragment ligiert, um Plasmid Zem176 zu erzeugen. Plasmid Zem93 wurde mit Sst I verdaut und erneut ligiert, um Plasmid Zem106 zu erzeugen, in dem ungefähr 600 bp Sequenz 5' zum MT-1-Promotor eliminiert waren. Plasmid Zem106 wurde mit Eco RI verdaut und an das Eco RI- Fragment ligiert, das das DHFR-Gen aus Plasmid Zem176 enthielt. Das resultierende Plasmid wurde mit "Zts13" bezeichnet. Plasmid Zts13 wurde mit Bam HI verdaut und an das Bam HI-Fragment aus Plasmid Zem99 ligiert, das die gesamte t-PA-Kodierungsregion und hGH-Terminatorsequenz enthielt. Das resultierende Plasmid wurde mit "Zts15" bezeichnet. Zts15 wurde teilweise mit Bam HI verdaut, repariert, erneut ligiert und transformiert, um Plasmid Zem219 zu erzeugen, in dem die 3'-Bam HI- Stelle zerstört war. Plasmid Zem219 wurde teilweise mit Xba 1 verdaut, repariert, erneut ligiert und transformiert, um Plasmid Zem219a zu erzeugen, in dem die 3'-Xba I-Stelle zerstört war. Plasmid Zem219a wurde mit Bam HI und Xba I verdaut, die Vektorsequenzen aus den t-PA-cDNA-Sequenzen weggereinigt und mit einem oligomeren Bam HI-Xba I-Adaptor ligiert, um den Expressionsvektor Zem219b zu erzeugen (Fig. 13), in den mutante Bam HI-Xba I-t-PA-Sequenzen inseriert wurden.

Beispiel 6 - t-PA-Analog mit einer substituierten K1-Domäne und ohne eine Wachstumsfaktor-Domäne

Eine mutante Sequenz, der die Wachstumsfaktor-Domänen-Kodierungssequenz fehlt, wird durch Deletions-Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotid ZC820 (&sup5;'GTA GCA CGT GGC CCT GGT TTT GAC AGG CAC TGA GTG³') und der einzelsträngigen Phage-Matrize M13-8100 konstruiert. Ein richtiger Klon wird durch Sequenzierung identifiziert und mit "M13-8100-820" bezeichnet. RF-DNA von M13-8100-820 wird mit Bam HI und Xba I verdaut und das doppelt mutagenisierte DNA-Fragment wird isoliert. Zem219b wird mit Bam HI und Xba 1 verdaut und das große (Vektor-)Fragment wird isoliert und mit dem mutanten Fragment mit T&sub4;-DNA- Ligase verknüpft. Nach Transformation wird ein richtiger Klon (8100-820) identifiziert und durch Elektroporation in tk BHK- Zellen transfiziert. Das mutante Protein wird gereinigt und charakterisiert.

Beispiel 7 - t-PA-Analoga mit einer substituierten K1-Domäne und einer modifizierten Wachstumsfaktor-Domäne

A. Ersatz von Cys (83)

Die t-PA-Kodierungssequenz in Zem99 wurde mutagenisiert, um ein Serin an Position 83 zu kodieren (Aminosäurenummern beziehen sich auf die in Fig. 1 dargestellte Sequenz). Zem99 wurde mit Bam HI verdaut und ein 2,4 kb langes Fragment, das die t- PA-Kodierungssequenz und den hGH-Terminator umfaßt, wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit mit Bam HI verdautem M13mp18 verknüpft (erhalten von Pharmacia Japan Co.) und die resultierende rekombinante Phage wurde verwendet, um E. coli JM103 zu transfizieren. Ein Phagenklon mit der gewünschten Insertion wurde mit "M13mp18/Bam-Zem99" bezeichnet.
Für ortsspezifische Mutagenese wurde ein Oligonukleotid (Sequenz &sup5;'CT GGT ATC GAT TTC ACA GCT CTT CCC AGC A³') synthetisiert und als ein Mutagenese-Primer verwendet. Das Oligonukleotid wurde an einzelsträngigen M13mp18/Bam-Zem99 anneliert. Mutagenese wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt und einzelsträngige DNA wurde zur Sequenzierung isoliert. Die Replikativform der mutagenisierten Phage, bezeichnet mit "M13- 9100RF", wurde mit Bgl II und Hind III verdaut. Ein 2,3 kb langes Fragment, das die t-PA-Sequenz enthielt, wurde gewonnen und mit Zem99 verknüpft, das mit Bgl II und Hind III verdaut worden war (Fig. 14), und die DNA wurde verwendet, um E. coli TB1 zu transformieren. Ein Plasmid mit der gewünschten Sequenzänderung wurde gewonnen und mit "Zem99-9100" bezeichnet (Fig. 14). Die mutierte t-PA-Sequenz von Zem99-9100 und die kodierte Aminosäuresequenz sind in Fig. 15 dargestellt.
Plasmide Zem99-9100 und pSV2-dhfr wurden verwendet, um tk BHK- Zellen mit dem Verfahren von Loyter et al. (aaO.) zu transfizieren. Transformanten wurden einer Klonierung mit dem Grenzverdünnungsverfahren unterzogen. Das mutante Protein, bezeichnet mit "9100", wurde aus den Zellkulturmedien durch Affinitätsreinigung gereinigt.
Ein E. coli-TB1-Transformant, der Plasmid Zem99-9100 enthielt, ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI) unter Zugangsnummer FERM P-9269 hinterlegt worden.

B. Ersatz von Cys(84)

Die t-PA-DNA-Sequenz wurde mutagenisiert, um Serin an Aminosäure 84 mit Hilfe ortsspezifischer Mutagenese unter Verwendung des Oligonukleotids &sup5;'CCT GGT ATC GAT TTC ACT GCA CTT CCC³' zu kodieren. Das Oligonukleotid wurde an M13mp18/Bam-Zem99 anneliert und Mutagenese wurde unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Einzelsträngige mutagenisierte Phage wurde sequenziert und ein Klon mit der gewünschten Sequenzänderung wurde ausgewählt. Replikativform-DNA wurde hergestellt (bezeichnet mit "M13-9200RF") und mit Bgl II und Hind III verdaut. Das 2,3 kb lange t-PA-Fragment wurde isoliert und mit dem mit Bgl II + Hind III geschnittenen Zem99 verknüpft. Der resultierende Vektor wurde mit "Zem99-9200" bezeichnet (Fig. 14). Die geänderte t-PA-Kodierungssequenz von Zem99-9200 und die kodierte Aminosäuresequenz sind in Fig. 16 dargestellt.
Zem99-9200 und pSV2-dhfr wurden verwendet, um tk BHK-Zellen mit dem Verfahren von Loyter (aaO.) zu cotransfizieren. Transformanten wurden einer Klonierung mit dem Grenzverdünnungsverfahren unterzogen. Das mutante Protein (9200) wurde durch Affinitätsreinigung gereinigt.
Ein E. coli-RR1-Transformant, der Plasmid Zem99-9200 enthielt, ist beim FRI unter Zugangsnummer FERM P-9274 hinterlegt worden.

C. Kombination von Cys-Ersatz und K1-Substitution

Einzelsträngige DNA wurde aus M13-9200 isoliert und wurde unter Verwendung des Oligonukleotids &sup5;'GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC³' mutagenisiert, um eine Mlu 1-Stelle einzuführen. Die mutagenisierte Phage wurde mit "M13-92.05 PKA1" bezeichnet. RF-DNA wurde aus der mutanten Phage hergestellt und wurde mit Bgl II und Mlu I verdaut und das 264 bp lange Fragment wurde gewonnen. Zem99-8000 wurde mit Mlu I und Apa I verdaut und das 1126 bp lange Fragment wurde gewonnen. Diese zwei Fragmente wurden mit mit Bgl II und Apa I verdautem Zem99 verknüpft und das resultierende Plasmid wurde mit "Zem99-9280" bezeichnet. Dieses Plasmid kodierte somit einen mutanten t-PA mit Ser an Aminosäure 84 und der K1-Domäne von Plasminogen mit Asp an Position 96.
Ein zweiter Vektor, der eine mutante t-PA-Sequenz enthielt, die ein t-PA-Analog mit Ser an Aminosäure 84 und der K1-Domäne von Plasminogen mit Asn an Position 96 kodierte, wurde konstruiert. RF-DNA aus M13-92.05 PKA1 wurde mit Bgl II und Mlu I verdaut und das 264 bp lange Fragment wurde gewonnen. Zem99- 8100 wurde mit Mlu I und Apa I verdaut und das 1126 bp lange Fragment wurde gewonnen. Diese zwei Fragmente wurden mit mit Bgl II und Apa I verdautem Zem99 verknüpft und das resultierende Plasmid wurde mit "Zem99-9281" bezeichnet.

Beispiel 8 - Modifikation von Kohlehydrat-Bindungsstellen in t-PA-Analoga

Ein Oligonukleotid-Primer (&sup5;'ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA³') wurde hergestellt, um Gly(183) und Ser(186) durch Ser bzw. Thr zu ersetzen. Ortsgerichtete Mutagenese wurde gemäß Standardverfahren auf der Matrize M13mp18/Bam-Zem99 (Beispiel 7) durchgeführt. Einzelsträngige mutierte Phagen-DNA wurde hergestellt und sequenziert. Ein Klon mit der gewünschten Sequenzänderung wurde mit "M13-6000" bezeichnet.
RF-DNA von M13-6000 wurde isoliert, mit Bgl II und Apa I verdaut und ein Fragment mit ungefähr 1,4 kb wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit mit Bgl II und Apa I verdautem Zem99 verknüpft, um den Vektor Zem99-6000 herzustellen. E. coli RR1, transformiert mit Zem99-6000, ist hinterlegt worden beim Fermentation Research Institute unter Zugangsnummer FERM P-9126.
Einzelsträngige M13-6000-DNA wurde mutagenisiert, um eine Eco RV-Stelle in die mutante t-PA-Sequenz einzuführen. Mutagenese wurde mit dem Ein-Primer-Verfahren unter Verwendung des Oligonukleotids &sup5;'CTC AGA CGA TTC CAG GAT ATC GCA GAA CTC³' durchgeführt. Die mutagenisierte Phage wurde mit "M13-6000PKA2" bezeichnet. RF-DNA von M13-6000PKA2 wurde mit Eco RV und Apa I verdaut und das 890 bp lange Fragment wurde gewonnen. Zem99- 8000 wurde mit Bgl II und Eco RV verdaut und das 500 bp lange Fragment wurde gewonnen. Diese zwei Fragmente wurden mit mit Bgl II und Apa I verdautem Zem99 verknüpft und das resultierende Plasmid wurde mit "Zem99-8060" bezeichnet.

Beispiel 9: Proteincharakterisierung

Mutantes Protein #8000 wurde auf Plasma-Halbwertszeit getestet und die Ergebnisse wurden mit einer Kontrollprobe mit nativem t-PA (produziert in rekombinanten BHK-Zellen) verglichen. Zu testende Proteine wurden in einer Kochsalzlösung löslich gemacht. Die Lösungen wurden in die Oberschenkelvene von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (jeweils 230 g bis 270 g) mit einer Dosis von 0,4 mg/kg Körpergewicht injiziert. Blutproben (0,5 ml) wurden aus den Drosselvenen entnommen, auf 3,8% Zitronensäure eingestellt, zentrifugiert und das Plasma wurde entfernt. Plasmagehalte von t-PA-Protein wurden mit einem Sandwich-Enzymimmunoassay bestimmt. Fig. 17 zeigt eine grafische Darstellung von Blutspiegelkurven für nativen t-PA und Protein #8000.
Veränderungen in den Blutspiegeln wurden mit einem Zwei-Kammer-Modell analysiert (Shargel, L. und Yu, A.B.C., Hrg., AD- Dlied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, Appleton-Century- Crofts, N.Y., 1980, S. 38-48). Halbwertszeiten wurden für die Alpha- und Beta-Phasen der Clearance bestimmt und der nach hinten extrapolierte Abschnitt der Beta-Phase mit der Ordinate (B) und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurden ebenfalls bestimmt. Die für die verschiedenen Proteine erhaltenen Werte sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6 Protein
Nativer t-PA
t-PA-Analog #8000 wurde auf Gerinnselauflösungsaktivität unter Verwendung von nativen rekombinanten t-PA als einer Kontrollsubstanz getestet. Ein Seidenfaden, 3 cm lang, wurde in einen Atom-Venenkatheter (4Fr 3,5 cm) eingeführt und der Katheter wurde mit einer Injektionsspritze verbunden. Menschliches Citratblut wurde hergestellt, indem Blut und eine Lösung von 3,8% Natriumcitrat in einem 9 : 1-Verhältnis vermischt wurden. Das Citratblut (0,5 ml) wurde mit ¹²&sup5;I-Fibrinogen (25 u Ci in 50 ul physiologischer Kochsalzlösung), 50 ul 0,25 M CaCl&sub2; und Thrombin (5 U/10 ul Lösung) kombiniert. Sechzehn u1 der resultierenden Lösung wurden in den Katheter injiziert, und man ließ den Katheter bei Raumtemperatur für 60 Minuten stehen. Der Seidenfaden wurde dann aus dem Katheter entfernt und mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Die an den Faden gebundene Reaktivität (der Anfangsfibrinthrombuswert) wurde bestimmt. Der Faden wurde dann in einen Carotidarteriovenen(A-V)-Shunt bei einer männlichen Sprague-Dawley-Ratte, die zwischen 200 und 300 Gramm wog, eingeführt. Ein ml-Proben des Proteins in einer Kochsalzlösung, die 50 Einheiten Heparin pro ml enthielt, wurden in die Oberschenkelvene des Tieres injiziert. Nach zwei Stunden wurde der Seidenfaden aus dem Shunt entfernt und die Radioaktivität (Restfibrinthrombuswert) wurde bestimmt. Das Restthrombusverhältnis wurde mit der Gleichung bestimmt:
Restthrombusverhältnis = Restfibrinthrombuswert/Anfangsfibrinthrombuswert·100
Fig. 18 ist eine grafische Darstellung der unter Verwendung verschiedener Dosen von nativem t-PA und Analog #8000 erhaltenen Ergebnisse. Die Daten zeigen, daß das mutante Protein gegenüber nativem t-PA in der Fähigkeit überlegen ist, Gerinnsel in vivo aufzulösen.
Aus dem vorstehenden wird man anerkennen, daß, obgleich spezielle Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Veranschaulichungszwecken beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist die Anmeldung nicht eingeschränkt, mit Ausnahme durch die beigefügten Ansprüche.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den Ansprüchen und/ oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims

1. Ein t-PA-Analog, in dem die K1-Domäne von nativem t-PA ersetzt ist durch die Plasminogen-K1-Domäne.

2. Ein t-PA-Analog nach Anspruch 1, wobei die Plasminogen-K1- Domäne die Aminosäuresequenz umfaßt:

Cys Lys Thr Gly X Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys,

wobei X Asp oder Asn ist.

3. Eine DNA-Sequenz, die ein t-PA-Analog nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.

4. Ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 3 enthält.

5. Ein Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei der Vektor Zem99-8000 oder Zem99-8100 ist, konstruiert, wie in den Fig. 7 oder 8 dargestellt.

6. Eine mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 4 oder 5 transformierte Wirtszelle.

7. Eine Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle E. coli oder eine Säugetier-Wirtszelle ist.

8. Ein Verfahren zur Herstellung eines t-PA-Analogs, das die Schritte umfaßt: (1) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der DNA enthält, die ein t-PA-Analog nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, und (2) Sammeln des resultierenden t-PA-Analogs.

9. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein t-PA-Analog nach Anspruch 1 oder 2 und ein pharmakologisch annehmbares Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfaßt.