DD259206A1 - Ir- mehrkanalbildaufnahme- und verarbeitungssystem - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen Antikörpern, die mit Fluoreszeinisothiozyanat (FITC), das sich leicht an Protein Koppeln lässt, und mit Meerrettich-Peroxidase (POD), das als Marker in Enzymimmuntests eingesetzt wird, reagieren. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung der bispezifischen monoklonalen Antikörpern aus fusionierten Zelllinien. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, das man Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen FITC und POD produzieren, in der Zellkultur mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, anschließend fusioniert, die entstandenen Hybrid-Hybridome mit Hilfe eines Fluoreszensaktivierten Zellsortierers (FACS) selektiert, die Hybrid-Hybridome, die bispezifische Antikörper produzieren, auswählt und erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen bispezifischen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Der spezifische Hybrid-Hybridomklon T4-B3 wurde im Zentralinstitut für Molekularbiologie (Liste 1987) unter der Nummer DDR-0197 hinterlegt. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschl. der Medizin.
Description
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2. Zellen mit Doppelfluoreszenz (Hybrid-Hybridome) wurden mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACSIII, Becton Dickinson) herausselektiert, in der Zellkultur kloniertund weitervermehrt.
3. Alle Hybrid-Hybridomklone wurden auf ihre Produktion von Antikörpern gegen FITC und POD getestet. Diejenigen Klone, die Antikörper gegen beide Antigene produzieren, wurden anschließend auf die Produktion von bispezifischen Antikörpern geprüft. Dazu wurde an einen festen Träger (Polyvinylchlorid-Folie) FITC-markiertes Rinderserumalbumin adsorbiert und danach mit den zu testenden Kulturüberständen inkubiert. Nach entspr. Waschprozedur wurde mit POD inkubiert und dann die POD-Nachweisreaktion mit dem entspr. Substrat durchgeführt, das durch die Enzymreaktion in ein farbiges Produkt umgewandelt wird.
4. Die Hybrid-Hybridome, die spezifische Antikörper produzieren, wurden in bekannter Weise in flüssigem Stickstoff eingefroren und in der Zellkultur und nach Transplantation auf Mäusen in der Aszitesform zur Antikörpergewinnung eingesetzt.
5. Bispezifische Antikörper wurden von den in der Aszitesf lüssigkeit ebenfalls vorhandenen monospezifischen Antikörpern durch Chromatografie über Hydroxylapatit abgetrennt.
Claims (1)
- Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern, die sowohl mit Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) als auch mit Meerrettich-Peroxidase (POD) reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß man Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen FITC produzieren, und Hybridzellen, die Monoklonale Antikörper gegen POD produzieren, in der Zellkultur mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die gefärbten Hybridzellen in der Zellkultur fusioniert, die gebildeten Hybrid-Hybridomzellen mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers selektiert, die Hybrid-Hybridome, die bispezifische Antikörper produzieren, auswählt, kultiviert und auf Mäuse transplantiert und für die Gewinnung der bispezifischen monoklonalen Anti-FITC-anti-POD · Antikörper durch Kultivierung bzw. Transplantation den Hybrid-HybridomklonT4-B3 (ZIM-Liste 1987: DDR-0197) einsetzt.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern, die eine Bindungsstelle für Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) und eine zweite Bindungsstelle für Meerrettich-Peroxidase (POD) besitzen. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschl. der Medizin.Charakteristik der bekannten technischen LösungenAntikörper mit Doppelspezifität werden durch biochemische (NISONOFF, A. u. M.M.RIVERS, Arch. Biochem. Biophys. [1961], 460) und zelltechnische Methoden hergestellt. Die zelltechnischen Verfahren beruhen auf der Fusion von zwei Zelltypen, die unterschiedliche Antikörper synthetisieren. Die Selektion der Hybridzellen, die Antikörper mit Doppelspezifität produzieren, erfolgt entweder durch spezielle Zellkulturmedien (MILSTEIN, C. u. C. CUELLO, Nature 305 [1983], 537) oder durch die einfachere Isolierung mit Hifle eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) (Patentanmeldung WPC 12 N/2867434). Antikörper mit Bispezifität lassen sich für die unterschiedlichsten immunologischen Verfahren einsetzen. Der Anteil der z.Z. zur Verfügung stehenden bispezifischen Antikörper ist außerordentlich gering.Ziel der ErfindungDie Erfindung hat das Ziel, aus fusionierten Zellinien bispezifische Antikörper zu gewinnen, die über eine Bindungsstelle mit FITC, das sich leicht an die verschiedensten Proteine koppeln läßt, und über die andere Bindungsstelle mit dem in Enzymimmuntests eingesetzten Markerenzym POD reagieren.Darlegung des Wesens der ErfindungDas erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern gegen FITC und POD ist dadurch gekennzeichnet, daß man Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen FlTC und POD produzieren, mit unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoffen markiert und in der Zellkultur fusioniert. Die Hybrid-Hybridome, die Doppelfluoreszenz aufweisen, werden mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) herausselektiert, kloniert und in der Zellkultur vermehrt. Die Klone werden mit immunologischen Tests auf ihre Antikörperproduktiongetestet, und diejenigen Hybrid-Hybridoklome, die Antikörper mit Doppelspezifität für FITC und POD produzieren, werden ausgewählt, weitervermehrt und ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff zur Antikörperproduktion in der Zellkultur oder nach Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform eingesetzt.Der für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingsetzte Hybrid-Hybridomklon T4-B3 wurde im Zentralinstitut für Molekularbiologie (Liste 1987) unter der Nummer DDR-0197 hinterlegt.Bispezifische Anti körper, die mit FITC und POD reagieren, existierten bisher nicht. Diese, durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Antikörper lassen sich für die unterschiedlichsten Nachweisverfahren einsetzen. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.Ausführungsbeispiel.1 Hybridzellen, die monpklonale Antikörper gegen FITC produzieren, wurden in der Zellkultur mit dem Fluoreszenzfarbstoff TRITC (Tetramethyl-Rhodaminisothiozyanat) markiert, der eine rote Fluoreszenz ergibt. Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen POD produzieren, wurden in der Zellkultur mit FITC markiert, das eine grüne Fluoreszenz ergibt. Die gefärbten Antikörper produzierender Hybridzellen wurden in der Zellkultur mit Hilfe von PEG (Polyäthylenglykol) fusioniert. Die Tatsache, daß FITC von den Antikörpern des einen Fusionspartners als Antigen erkannt wird und gleichzeitig als fluoreszierender Markierungsfarbstoff eingesetzt wurde, störte den Versuchsablauf nicht.
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