DD277086A1 - Verfahren zur herstellung bispezifischer monoklonaler antikoerper - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen monoklonalen Antikoerpern, d. h. Antikoerpern mit zwei unterschiedlichen Bindungsstellen gegen verschiedene Antigene bzw. Antigendeterminanten. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Hybrid-Hybridomen unter Nutzung eines Zellsortierers, wobei die Hybrid-Hybridome zur Gewinnung bispezifischer Antikoerper eingesetzt werden koennen. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Hybridzellen, die unterschiedliche Antikoerper produzieren, in an sich bekannter Weise mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, anschliessend fusioniert, die fusionierten, heterofluoreszenten, Zellen mit einem Fluoreszenzaktivierten Zellsortierer selektiert, die selektierten Zellen einige Tage in Kulturmedium kultiviert, danach erfindungsgemaess mit einem DNS-Farbstoff markiert und die Zellen mit einem erhoehten DNS-Gehalt mit dem Zellsortierer selektiert, kloniert und die Tetradome, die bispezifische Antikoerper produzieren, auswaehlt und danach in an sich bekannter Weise in der Zellkultur und auf Maeusen zur Antikoerpergewinnung weitervermehrt. Das Verfahren wird am Beispiel von Tetradomklonen, die bispezifische Antikoerper gegen alkalische Phosphatase und Lipoprotein LDL (Low Density Lipoprotein) synthetisieren, demonstriert. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschl. der Medizin.
Description
wurden in der Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter folgenden Nummer hinterlegt:
T11-C9E7 ZIM-0425
T11-C9F2 ZIM-0424
T11-C9H4 ZIM-0423
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
1. Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen Apoprotein BaIs Bestandteil des Lipoproteins LDL (Low Density Lipopro'.ein) produzieren, wurden in der Zellkultur mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC (Fluoreszein-Isothiozyanat) markiert, der eine grüne Fluoreszenz ergibt. Andere Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen das für Immuntests verwendete Enzym AP (alkalische Phosphatase) produzieren, wurden in der Zellkultur mit dem Fluoreszenzfarbstoff TRITC (Trimethyl-Rhodamin-Isothiozyanat) markiert, der eine rote Fluoreszenz ergibt.
Die gefärbten antikörper-produzierenden Hybridzellen wurden in der Zellkultur mit Hilfe von PEG (Polyäthylenglykol) fusioniert.
2. Zellen mit der rot-grünen Doppelfluoreszenz wurden mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers Ii-ACS II, Becton Dickinson) herausselektiert, in die Zellkultur aufgenommen und 3-7 Tage kultiviert.
3. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit dem DNS-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 markiert, und die Zellen mit einem DNS-Gehalt, der größer als der DNS-Gehalt der Elternzellen in der mitotischen Phase des Zellzyklus ist, wurden mit Hilfe eines FACS herausselektiert und in der Zellkultur kloniert.
4. Alle daraus entstandenden Klone wurden auf ihre Produktion von Antikörpern gegen LDL und AP getestet. Diejenigen Klone, die Antikörper gegen beide Antigene produzieren, wurden anschließend auf die Produktion von bispezifischen Antikörpern geprüft. Dazu wurde an einem festen Träger (Mikrotestplatt) gereinigtes LDL adsorbiert und danach mit den zu testenden Kulturüberständen und AP inkubiert. Anschließend wurde die AP-Nachweisreaktion mit dem entsprechenden Substrat durchgeführt, das durch die Enzyrnreaktion in ein farbiges Produkt umgewandelt wird.
5. Die Tetradome, die in dem Doppelspezifitätstest positiv reagierten, wurden in bekannter Weise in flüssigem Stickstoff eingefroren bzw. in der Zellkultur und in inzuchlmäusen zur Antikörpergewinnung weitervermohrt.
Die spezifischen Tetradomklone wurden in der Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie· unter folgenden Nummern hinterlegt:
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Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper durch Markierung von zwei Hybridzellinien, die unterschiedliche Antikörper produzieren, mit unterschiedlichen Fluores' )nzfarbstoffen, anschließende Fusion und Selektion der fusionierten, heterofluoreszenten, Zellen mit einem Fluoreszenzaktivierten Zellsortierer, dadurch gekennzeichnet, daß man die selektierten Zellen einige Tage in Kulturmedium kultiviert, mit einem DNS-Farbstoff markiert und die Zellen mit einem erhöhten DNS-Gehalt mit dem Zellsortierer selektiert, Moniert und die Tetradome, die bispezifische Antikörper produzieren, auswählt und danach in an sich bekannter Weise in der Zellkultur und auf Mäusen zur Antikörpergewinnung weitervermehrt.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern. Anwendungsgebiet eier Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschl. der Medizin.Charakteristik der bekannten technischen LösungenAntikörper mit Doppelspezifität lassen sich auf chemischem Wege durch reduktive Spaltung der bivalenten Antikörpermoleküle in monovalente Fragmente und anschließende oxidative Vereinigung verschiedener monovalenter Fragmente gewinnen (A.NISONOFF und M.M.RIVERS, Arch, ßiochem. Biophys. 93,460,1961).Eine prinzipiell andere Methode basiert auf der Produktion der bispezifischen monoklonalen Antikörper durch hybridisierte Hybridome (Tetradome). Dabei werden zwei Hybridzellinien, die verschiedene monoklonale Antikörper produzieren, in der Zellkultur fusioniert und die hybridisierten Zellen selektiert. Die auf diesem Wege gewonnenen Tetradome produzieren neben monospezifischen auch bispezifische Antikörper, die sich gegenüber den mit chemischen Methoden erzeugten durch wesentlich höheren Homogenität und Nativität auszeichnen. Die Selektion dor fusionierten von den nichtfusionierten Zellen stellt bei dieser Methode das größte technisch Problem dar.Eine der meistangewendeten Selektionsmethoden besteht darin, daß beide für die Fusion vorgesehene Hybridomzcllinicn durch zellzüchterische Manipulationen mit einem jeweils anderen Enzymdefekt versehen werden und nach der Fusion die fusionierten Zellen mittels zwei entsprechender Selektionsmedien selektiert werden (C. MILSTEIN und A. C. CUELLO: Nature 305,537,1983; U.D.SPAERZ und M.J.3EVAN: Proc. Natl. Acad. Sei. USA83,1453,1986).Die andere Methode nutzt die Vorteile des Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers, um die fusionierten Zellen zu identifizieren und diese herauszuselektieren. Dabei werden zwei Hybridzellinien, die unterschiedliche Antikörper produzieren, mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, anschließend fusioniert und die fusionierten, heterofluorc ,zenten Zellen mil einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer selektiert (L. KARAWAJEW, B. MICHEEL, O. BEHRSING und M. GAFSTEL: J. mmunol. Methods 96,265,1987; Patent DD 245902). Diese Methode erfordert verglichen mit dem Einsatz von Selektionsmedien erheblich weniger Arbeitsaufwand, hat jedoch Nachteil, daß damit Heterokarione gewonnen werden von denen sich nur ein Teil zu stabilen Hybrid-Hybridomen entwickelt. Die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung einer Hybridzelle aus einem Heterokarion hängt von mehreren wenig untersuchten Faktoren ab und kann unter Umständen sehr gering sein.Ziel der ErfindungDie Erfindung hat das Ziel, Hybrid-Hybridome, die zur Gewinnung bispezifischer Antikörper eingesetzt werden können, mit einem effektiven Verfahren unter Nutzung eines Zellsortierers herzustellen.Darlegung des Wesens der ErfindungDas erfindungsgemäße Verfahren zur Hurstellung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst in an sich bekannter Weise Hybridzellen, die unterschiedliche Antikörper produzieren, mit unterschiedlichen Fluoreszenfarbstoffen markiert, anschließend fusioniP't und die fusionierten, heterofluoreszenten Zellen mit einem Fluoreszenzaktivierten Zoilsortioror selektiert. Danach werden die selektierten Zellen erfindungsgemäß 3-7 Tage in einem Kulturmedium kultiviert und mit einom DNS-Farbstoff markiert. Die Zellen mit einem erhöhten DNS-Gehalt werden dann mit dem Zellsortierer selektiert. Moniert und die Tetradomo, die bispezifische Antikörper produzieren, werden ausgewählt und in der Zellkultur bzw. auf Mäusen zur Antikörpergowinnung weit srvormehrt. Das orfindungsgemäße Verfahren, dessen Kernstück die DNS-Markierung mit einem Fluoreszonzfarbstoff und eine Zellselektierung entsprechend dem DNS-Gehalt darstellt, erhöht wesentlich die Effektivität der Gewinnung der Totradome mit Hilfe des Zollsoritorors. Das oifindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend am Beispiel von Tetradomklonen, die bispezifische Antikörper gegen aikalischo Phosphataso und Lipoprotoin LDL (Low Density Lipoprotein) synthetisieren, demonstriert. Die erhaltenen Klone
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