DD245902A1 - Verfahren zur gewinnung von bispezifischen monoklonalen antikoerpern - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen monoklonalen Antikoerpern. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von monoklonalen Antikoerpern mit zwei unterschiedlichen Bindungsstellen gegen verschiedene Antigene bzw. Antigendeterminanten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Hybridzellen, die unterschiedliche monoklonale Antikoerper produzieren, in der Zellkultur mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, anschliessend fusioniert, die gebildeten Tetradome mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer selektiert, die Tetradome, die bispezifische Antikoerper produzieren, auswaehlt, in der Zellkultur und auf Maeusen zur Antikoerpergewinnung weitervermehrt. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Medizin, Biologie, Veterinaermedizin, Landwirtschaft und Biotechnologie.
Description
Ausführungsbeispiel
1) Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen denTumormarker AFP (Alpha-Fetoprotein) produzieren, wurden in der Zellkultur mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC (Fluoreszein-Isothiozyanat) markiert, der eine grüne Fluoreszenz ergibt. Andere Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen das für Immuntests verwendete Enzym POD (Meerrettich-Peroxidase) produzieren, wurden in der Zellkultur mit dem Fluoreszenzfarbstoff TRITC (Tetramethyl-Rhodamin-Isothiozyanat) markiert, der eine rote Fluoreszenz ergibt.
Die gefärbten Antikörper-produzierenden Hybridzellen wurden in der Zellkultur mit Hilfe von PEG (Polyäthylenglykol) fusioniert.
2) Zellen mit Doppelfluoreszenz (Tetradome), die Genmaterial aus beiden Hybridzellen enthalten müssen, wurden mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS III, Becton Dickinson) herausselektiert, in der Zellkultur kloniert und weitervermehrt.
3) Alle Tetradomklone wurden anschließend auf ihre Produktion von Antikörpern gegen AFP und POD getestet. Diejenigen Klone, die Antikörper gegen beide Antigene produzieren, wurden anschließend auf die Produktion von bispezifischen Antikörpern geprüft. Dazu wurde an einen festen Träger, PVC (Polyvinylchlorid)-Folie gereinigtes AFP adsorbiert und danach mit den zu testenden Kulturüberständen inkubiert. Nach ensprechender Waschprozedur wurde anschließend mit POD inkubiert und danach die POD-Nachweisreaktion mit dem entsprechenden Substrat durchgeführt, das durch die Enzymreaktion in ein farbiges Produkt umgewandelt wird.
4) Die Tetradome, die in dem Doppelspezifitätstest positiv reagierten, wurden in bekannter Weise in flüssigem Stickstoff eingefroren und in der Zellkultur und in Inzuchtmäusen zur Antikörpergewinnung weitervermehrt. DerTetradomklonT1-F2/B1 wurde am
unter der Nummer im RGW-Referenzzentrum für Zellinien am Friedrich-Löffler-Institut Insel Riems hinterlegt.
Claims (1)
- Erfindungsanspruch:Verfahren zur Gewinnung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei Hybridzellinien, die unterschiedliche monoklonale Antikörper produzieren, in der Zellkultur mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die gefärbten Hybridzellen in der Zellkultur fusioniert, die gebildeten Tetradome mit Hilfe eines Fluoreszenzaktivierten-Zellsortierers selektiert, die Tetradome, die bispezifische Antikörper produzieren, auswählt und in bekannter Weise kultiviert und auf Mäusen transplantiert.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern mit Doppelspezifität, d. h. mit einer Bindungsstelle gegen ein Antigen oder eine Antigendeterminante und einer zweiten Bindungsstelle gegen ein zweites Antigen bzw. eine zweite Antigendeterminante.
Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, Veterinärmedizin, Landwirtschaft, Biologie und Biotechnologie.Charakteristik der bekannten technischen LösungenAntikörper mit Doppelspezifität lassen sich auf biochemischem Wege durch reduktive Spaltung der bivalenten Antikörpermoleküle in monovalente Fragmente und anschließende oxidative Vereinigung verschiedener monovalenter Fragmente gewinnen (A.NISONOFF und M.M.RIVERS, Arch. Biochem. Biophys. 93,460, 1961). Diese Methode ist auch auf monoklonale Antikörper anwendbar. Monoklonale Antikörper mit Doppelspezifität wurden auch mit Hilfe der Hybridomtechnologie gewonnen.Hybridzellen, die einen spezifischen monoklonalen Antikörper produzieren und die durch zellzüchterische Manipulationen mit einem Enzymdefekt versehen wurden, werden dazu mit Milzzellen von immunisierten Mäusen in der Zellkultur fusioniert. Auf Grund des Enzymdefektes können die fusionierten Zellen (Tridome) mit Hilfe eines Spezialmediums selektiert werden. Durch spezifische immunologische Tests wurden die Tridome selektiert, die bispezifische Antikörper produzieren (CMILSTEIN, CCUELLO: Nature 305,537,1983; J. MARTINIS, G. S. DAVID, R. M. BARTHOLOMEUS u. R. WANG, S. 129 in Basic Biology auf New Developments in Biotechnology, Hrsg. A. Holloender et al., Plenum Publ. Corp. 1983). Weiterhin wurden zwei Hybridzellinien, die verschiedene monoklonale Antikörper produzieren und die jeweils mit einem anderen Enzymdefekt versehen wurden, in der Zellkultur fusioniert. Mit den entsprechenden zwei Selektionsmedien wurden die fusionierten Zellen (Tetradome) selektiert und mit immunologischen Tests die Tetradome herausgesucht, die bispezifische Antikörper produzieren (K. G. BURNETT, J. F. KULL u. J. MARTINIS, vorgestellt auf dem 5th International Congress of Immunology, 21.-27.8.1983, Kyoto, Japan).Der Nachteil dieser Methoden besteht in der langwierigen Selektionsprozedur für die Tridome bzw. Tetradome, da die Induzierung der Enzymdefekte bei den verwendeten Fusionspartnern mit einem erheblichen Arbeits- und Zeitaufwand verbunden ist.Ziel der ErfindungDie Erfindung hat das Ziel, bispezifische Antikörper aus fusionierten ZeIlinien zu gewinnen, wobei die Zellfusion und die Selektion der fusionierten Zellen über einen effektiveren und schnelleren Weg durchgeführt werden sollen.Darlegung des Wesens der ErfindungDas erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern gegen 2 unterschiedliche Antigene ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hybridzellinie, die einen bestimmten monoklonalen Antikörper produziert, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und diese mit einer anderen Hybridzellinie, die einen anderen monoklonalen Antikörper produziert und mit einem unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoff markiert wurde, in der Zellkultur fusioniert. Tetradome (= Hybrid-Hybridome), die Doppelfluoreszenz aufweisen, werden über einen Fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) herausselektiert, kloniert und in der Zellkultur vermehrt. Die Klone werden mit immunologischen Tests auf ihre Antikörperproduktion getestet, und diejenigen Tetradomklone, die Antikörper mit Doppelspezifität produzieren, werden ' ausgewählt, weitervermehrt und danach in flüssigem Stickstoff gelagert, in bekannter Weise kultiviert und auf Mäusen in der Aszitesform transplantiert. Das erfindungsgemäße Verfahren, dessen Kernstück die Fluoreszenzfarbstoff-Markierung darstellt, erfordert erheblich weniger Arbeitsaufwand als die bisher bekannten Verfahren. Es ist für die verschiedensten Antigene anwendbar.Mit den erfindungsgemäß hergestellten Antikörpern mit Doppelspezifität lassen sich die bisherigen immunologischen Nachweis- und Reinigungsverfahren qualitativ verbessern. Sie bieten ebenfalls Möglichkeiten einer therapeutischen Anwendung.
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