DD259419A5 - Verfahren zur Herstellung von neuen Expressionsplasmiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Expressionsplasmiden. Erfindungsgemaess wird in das groessere Fragment des Plasmids p RH W10, welches das DNA-Fragment der FormelHind IIISau 3ANco IG AGCTTAAAGATGTGTGATCTGCCTCAGAACCATGGCCTACTTAGCAGGA 50ACACCTT GGTGCTTCTGCACCAAATGAGGAGAATCTCCCCTTTCTTGTGT100CTCAAGGACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCAGGAGATGGTAAAAGGGAG150CCAGTTGCAGAAGGCCATGTCATGTCTGTCCTCCATGAGATGCTGCAGC200AGATCACACATCTTTAagcttSau 3Ats2,3 Hind IIIenthaelt das mit NcO I und AlU I erhaltene Fragment der FormelcCAT GGGCTAAGCAGGAACACCTTG 28NcoIGTGCTTCTGCACCAAATGAGCAGAATCTCCCCTTTCTTGTGTCTC 73AAGGACAGAAGAGACTTCAGGTTCCCCCAGGAGATGGTAAAAGGG113AGCCAGTTGCAGAAGGCCCATGTCATGTCTGTCCTGCATGAGATG163CTGCAGCAGATCTTCAGCCTGTTCCACACAGAGCGCTCCTCTGCT208GCCTGGAACATGACCCTCCTAGACCAACTCCACAGTGGAGTTGAT253CAGCAACTGGAACACCTGGAGACCTGGTTGCTGCAGGTAGTGGGA298GAAGGAGAATCTGCTGKGGCAATTAGCAGCCCTGCACTGACCTTG343AGGAGGTACTTCCAGGGAATCCGTGTCTAGCTGAAAGAGAAGAAA388TAGAGGGACTGTGCCTCGGAAGTTGTCAGAATCGAAATCATGAAA433TCCTTGTTCTTATCAACAAAGATCCAAGAAAGACTGAGAAGTAAA478GATAGAGACCTGGGCTCATCTTGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA530TAACACTTGCACATCTGACTCTGGTCAATTGAAAAGAGTGTTATTTGGGCTTTAATCAG 589AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGCTATATTAACCCAGTATATGTTA 648AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTGATTTAT 707TTATTCTTAGATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGGG 766TTTAGATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGctAluI,wobei X das Nucleotid G oder A darstellt, mittels Ligasereaktion eingefuegt wird, und die so erhaltenen Plasmide zur Replikation in E. coli HB 101 transformiert und kultiviert werden.
Description
ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200
AGATCACACA TCTTTAagct t '
Sau3A Hindlir
eingefügt, wird,
und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E. coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
Hierzu 7 Seiten Zeichnungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen Expressionsplasmiden codierend für neue Interferone vom Typ I.
Interferon ist ein Begriff, der geprägt wurde, um eine Auswahl von Proteinen zu beschreiben, die endogen zu menschlichen Zellen sind und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie teilweise überlappende und teilweise divergierende biologische Aktivitäten aufweisen. Diese Proteine modifizieren die körpereigene Immunantwort und man nimmt an, daß sie zu einem wirksamen Schutz gegen Viruserkrankungen beitragen. Die Interferone wurden beispielsweise in drei Klassen eingeteilt, nämlich in α-, β- und γ-lnterferon.
Von ß- und γ-lnterferon ist in menschlichem Organismus nur jeweils ein Subtyp bekannt (z. B. S. Ohno et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 78, 5305-5309 [1981]; Gray et al., Nature 295, 503-508 [1982]; Taya et al., EMBO Journal1/8,953-958 [1982]). Demgegenüber werden vom α-Interferon verschiedene Subtypen beschrieben (z. B. Phil. Trans. R. soc. Lond. 299,7-28 [1982]). Die reifen a-Interferone unterscheiden sich hierbei untereinander durch maximal 23% Divergenz und sind ca. 166 Aminosäuren lang. Bemerkenswert ist ferner ein Bericht über ein α-Interferon, das ein überraschend hohes Molekulargewicht von 26000, bestimmt durch SDS Polyacrylamid/Gelelektrophorese aufweist (Goren, P. et al. Virology 130,273-280 [1983]). Dieses Interferon wird IFN-a 26K genannt. Von ihm wurde festgestellt, daß es die bisher höchste spezifische antivirale und antizelluläre Aktivität aufweist. Die bekannten Interferone scheinen bei verschiedenen Krankheiten wirksam zu sein, zeigen aber eine geringe oder überhaupt keine Wirkung bei vielen anderen Krankheiten (z.B. Powledge, Bio/Technology, March 1984,215-228 „Interferon On Trial"). Interferone weisen zudem Nebenwirkungen auf. Beispielsweise wurde bei Prüfungen der Anticancer-Wirkung von rekombinantem -Interferon festgestellt, daß Dosen von etwa 50 Millionen Einheiten, die nach den Ergebnissen der Phase I Prüfungen für sicher galten, akute Verwirrungszustände, bis zur Arbeitsunfähigkeit führende Gelenkschmerzen, sehr starke Ermüdung, Appetitlosigkeit, Verlust der Orientierungsmöglichkeit, epileptische Anfälle und Lebertoxizität hervorriefen. 1982 verbot die französische Regierung Prüfungen mit IFN-a, nachdem Krebspatienten, die damit behandelt worden waren, tödliche Herzanffälle erlitten. Über mindestens zwei cardiale Todesfälle wurde auch bei kürzlich durchgeführten Prüfungen in Amerika berichtet. Es ist zunehmend deutlich geworden, daß zumindest ein Teil der Nebenwirkungen, wie Fieber und Unpäßlichkeit, in unmittelbarem Zusammenhang mit dem Interferonmolekül selbst steht und nicht auf Verunreinigungen zurückzuführen sind.
Aufgrund der großen Hoffnungen, die durch Interferon geweckt worden waren, und angeregt durch den Wunsch, neue Interferon-ähnliche Moleküle mit verminderten Nebenwirkungen zu finden, war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung solche neuen Substanzen aufzufinden und herzustellen.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Interferonähnlicher IV- jleküle mit verminderten Nebenwirkungen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher bestimmte Expressionsplasmide codierend für neue Interferone vom Typ I, welche ein Leader-Peptid enthalten können, und ihre N-glykosylierten Derivate (hier als omega-lnterferon oder LFN-omega bezeichnet). Die neuen Expressionsplasmide codieren für folgendes Polypeptid bzw. enthalten folgende Gensequenzen:
tid bzw. enthalten folgende Gensequenzen:
5 10 ' 15
Cys Asp Leu Pro GIn Asn His GIy Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu
TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG
20 25 30
VaI Leu Leu His Gin Met Arg Arg He Ser Pro Phe Leu Cys Leu
GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC
35 , 40 45
Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin- GIu Met VaI Lys GIy
AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG
50 55 60
Ser GIn Leu GIn Lys Ala His VaI Met Ser VaI Leu His GIu Met
AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG
65 70 75
Leu Gin Gin He Phe Ser Leu Phe His Thr GIu Arg Ser Ser AIa
CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT
80 85 90
AIa Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr GIy Leu His
GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT
95 100 105
Gin Gin Leu Gin His Leu GIu Thr Cys Leu Leu Gin VaI VaI GIy
CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA
110 115 120
GIu GIy GIu Ser Ala GIy Ala He Ser Ser Pro AIa Leu Thr Leu
GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG
125 ' 130 135
Arg Arg Tyr Phe Gin GIy He Arg VaI Tyr Leu Lys GIu Lys Lys
AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA
140 145 " 150
Tyr Ser Asp Cys AIa Trp GIu VaI VaI Arg Met GIu He Met Lys
TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA
155 160 165
Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin GIu Arg Leu Arg Set Lys
TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA
170 Asp Arg Asp Leu GIy Ser Ser r
GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT
In Position 111 kann die Sequenz GGG (codierend für GIy) durch GAG (codierend für GIu) ersetzt werden. Die bevorzugten Moleküle beinhalten ebenfalls Derivate, die an der Aminosäureposition 78 N-glykolysiert sind. Beispielsweise können die beiden vorstehend erwähnten omega-lnterferone das Leader-Peptid der Formel
Met AIa Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala AIa Leu VaI Met Thr Ser Tyr Ser Pro VaI GIy Ser Leu GIy
enthalten.
Legende zu den Zeichnungen: .
Abbildung 1: Restriktionskarte des Klons E76E9
Abbildung 2: Restriktionskarte des Klons P9A2
Abbildung 3: DNA-Sequenz des Klons P9A2
Abbildung 4: DNA-Sequenz des Klons E76E9
Abbildung 5: Konstruktion des Expressionsklons pRHW12
Die neuen omega- Interferone und die hierfür codierenden DNA-Sequenzen erhält man wie folgt:
Eine humane B-Lymphom-Zellinie, z. B. Namalwa-Zellen (siehe G. Klein et al., Int. J. Cancer 10,44 [1972]), kann durch Behandlung mit einem Virus, z. B. Sendai Virus, zur gleichzeitigen Produktion von α-und ß-lnterferon angeregt werden. Wird hierbei die aus stimulierten Namalwa-Zellen gebildete mRNA isoliert, so kann diese als Template zur cDNA-Synthese dienen. Um die Ausbeute an Interferon-spezifischen Sequenzen beim Kloniervorgang zu erhöhen, wird die mRNA-Präparation über einen Zuckerdichtegradienten entsprechend der verschiedenen Länge der individuellen mRNA-Moleküle aufgetrennt.
Vorteilhafterweise wird die mRNA in dem Bereich um 12S (ungefähr 800 bis 1000 Basen Länge der mRNA) gesammelt. In diesem Bereich sedimentiert die für α- und ß-lnterferone spezifische mRNA. Die mRNA aus diesem Gradientenbereich wird durch* Präzipitation und Auflösen in Wasser konzentriert.
Die Erstellung einer cDNA Bibliothek folgt im wesentlichen literaturbekannten Methoden (siehe z.B. E.Dworkin-Rastl.
M.B.Dworkin und P. Swetly, Journal of Interferon Research 2/4,575-585 [1982]). Die mRNA wird durch Zusatz von oligo-dT geprimt. Anschließend wird durch Zusatz der vier Desoxynukleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und dem Enzym Reverse Transkriptase in einer entsprechend gepufferten Lösung die cDNA 1 Stunde bei 450C synthetisiert. Durch Chloroformextraktion und Chromatographie über eine Gelsäure, z. B. über Sephadex G 50, wird das cDNA/mRNA-Hybrid gereinigt. Die RNA wird durch Alkalibehandlung (0,3 Mol NaOH bei 500C, 1 Stunde) hydrolysiert, und die cDNA nach Neutralisieren mit saurer Natriumazetatlösung mit Äthanol präzipitiert. Nach Zusatz der vier Desoxynukleosidtriphosphate und
E. coli DNA-Polymerase I in entsprechender Lösung wird die Doppelstrangsynthese ausgeführt, wobei die cDNA zugleich als Template und als Primer durch Haarnadelstrukturbildung an ihrem 3'-Endefungiert (6 Stunden bei 15°C) (siehe A. Eftratiadis et al.. Cell 7,279 [1976]). Nach Phenoiextraktion, Sephadex G50 Chromatographie und Äthanolpräzipitation wird die DNA in geeigneter Lösung einer Behandlung mit der Einzelstrangspezifischen Endonuklease S1 unterzogen. Dabei werden die Haarnadelstruktur, sowie nicht in Doppelstrang umgesetzte cDNA abgebaut. Nach Chloroformextraktion und Präzipitation mit Äthanol wird die Doppelstrang-DNA (dsDNA) auf einem Zuckerdichtegradienten der Größe nach aufgetrennt. Für die folgenden Schritte des Klonierens wird bevorzugt nur dsDNA der Größe 600 bp und mehr verwendet, um die Wahrscheinlichkeit zu steigern, daß nur Klone erhalten werden, welche die komplette codierende Sequenz für die neuen Interferone enthalten. dsDNA von mehr als 600 bp Länge wird aus dem Gradienten durch Präzipitation mit Äthanol und Auflösen in Wasser konzentriert.
Um die entstandenen dsDNA-Moleküle zu vermehren, müssen diese zunächst in einem entsprechenden Vektor und anschließend in das Bakterium E. coli eingebracht werden. Der verwendete Vektor ist vorzugsweise das Plasmid pBR322
(F. Bolivar et al., Gene 2,95 [1977]). Dieses Plasmid besteht im wesentlichen aus einem Replikon und zwei Selektionsmarkern.
Diese verleihen dem Wirt Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin (Apr,Tcr). Das Gen für die ß-Lactamase (Apr) enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Pstl. pBR322 kann mit Pstl geschnitten werden. Die überhängenden 3'-Enden werden mit dem Enzym terminale Desoxynukleotid-Transferase (TdT) unter Vorlage von dGTP in entsprechend gepufferter Lösung verlängert. Gleichzeitig wird die dsDNA ebenfalls mit dem Enzym TdT unter Verwendung von dCTP an den 3'-Enden verlängert. Die Homopolymerenden von Plasmid und dsDNA sind komplementär und hybridisieren, wenn Plasmid DNA und dsDNA im entsprechenden Konzentrationsverhältnis und unter geeigneten Salz-, Puffer- und Temperaturbedingungen gemischt werden (T.Nelson et al.. Methods in Enzymology 68, 41-50 [1980]).
E. coli vom Stamm HB 101 (Genotyp F-, hsdS20 (r-B, m-B) recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-1 supE44, lambda-) wird zur Aufnahme der rekombinanten Vektor-dsDNA-Moleküle durch Waschen mit einer CaCI2-Lösung vorbereitet.
Kompetente E. coli HB101 werden mit der DNA gemischt, und nach Inkubation bei 00C wird die so erhaltene Plasmid-DNA durch Hitzeschock bei 420C für 2 Minuten transformiert (M. Dagert et al., Gene 6,23-28 [1979]). Anschließend werden die transformierten Bakterien auf Tetracyclin-haltigenAgarplatten (10 μg pro ml) plattiert. Auf diesem Agar können nur E. coli HB101 wachsen, die ein Vektor- oder rekombinantes Vektormolekül aufgenommen haben (Tcr).RekombinanteVektor-dsDNA Moleküle vermitteln dem Wirt den Genotyp ApsTcr, da durch das Einbringen der dsDNA in das ß-Lactamasegen die Information für die ß-Lactamase zerstört worden ist. Die Klone werden auf Agarplatten übertragen, die 50 μg/ml Ampicillin enthalten. Nur etwa 3% wuchsen an, was bedeutet, daß 97% der Klone die Insertion eines dsDNA Moleküls enthielten. Ausgehend von 0,5 μg dsDNA
wurden mehr als 30 000 Klone erhalten. 28 600 Klone davon wurden individuell in die Näpfe von Mikrotiterplatten übertragen, die Nährmedium, 10pg/ml Tetracyclin und Glyzerin enthielten. Nachdem die Klone darin angewachsen waren, werden die Platten zur Aufbewahrung bei —700C gehalten (cDNA-Bibliothek).
Zum Durchsuchen der cDNA-Bibliothek auf neue Interferon-Gene enthaltende Klone werden die Klone nach dem Auftauen auf Nitrozellulosefilter übertragen. Diese Filter liegen auf Tetracyclinhaligem Nähragar. Nach dem Anwachsen der Bakterienkolonien wird die DNA der Bakterien auf dem Filter fixiert.
Als Probe dient vorteilhafterweise das Insert des Klons pER33 (E. Rastl et al., Gene 21, 237-248 [1983] — siehe auch EP-A-0.115.613), das das Gen für IFN-a2-Arg enthält. Durch Nicktranslation wird dieses Stück DNA radioaktiv markiert, wobei DNA-Polymerase l,dATP, dGTP, dTTP und a-32-P-dCTP verwendet wird. Die Nitrozellulosefilter werden unter geeigneten, nicht stringenten Hybridisierbedingungen ohne Zugabe der radioaktiven Probe zunächst vorbehandelt und danach ca. 16 Stunden unter Zusatz der radioaktiven Probe hybridisiert. Danach werden die Filter ebenfalls unter nicht stringenten Bedingungen gewaschen. Durch die niedrige Stringenz der Hybridisierung und Waschung werden nicht nur lnterferon-a2-Arg-haltige Klone erfaßt, sondern auch andere Interferon-haltige Klone, deren Sequenzen beträchtlich von der der bisher bekannten Interferon-α abweichen können. Nach dem Trocknen werden die Filter auf einen Röntgenfilm exponiert. Eine Schwärzung, die deutlich über dem Niveau des Hintergrundes liegt, zeigt das Vorhandensein eines Klons mit Interferon-spezifischen Sequenzen an. Da die Radioaktivitätssignale unterschiedlicher Güte sind, werden die positiven Klone bzw. die positiv-verdächtig reagierenden Klone im Kleinmaßstab angezüchtet. Die Plasmid-DNA-Moleküle werden isoliert, mit der Restriktionsendonuklease Pstl verdaut und auf einem Agarosegel elektrophoretisch der Größe nach aufgetrennt (Birnboim et al., Nucl. Acid. Res. 7,1513 [1979]). Die DNAim Agarosegel wird nach der Methode von Southern (E. M. Southern, J. Mol. B.iol. 98, 503-517 [1975]) auf ein Nitrozellulosefilter übertragen. Die DNA dieses Filters wird mit der radioaktiven, IFN-Gen-haltigen, denaturierten Probe hybridisert. Als positive Kontrolle dient das Plasmid 1F7 (hinterlegt bei der DSM unter der DSM-Nummer 2362), das das Gen für Interferon-ci2-Arg enthält. Das Autoradiogramm macht deutlich, daß der Klon E76E9 und der Klon P9A2 eine Sequenz enthalten, welche unter nicht stringenten Bedingungen mit dem Gen des lnterferons-a2-Arg hybridisiert. Um die dsDNA Inserts der Klone E76E9 und P9A2 näher zu charakterisieren, werden die Plasmide dieser Klone in größerem Maßstab hergestellt. Die DNA wird mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut, so z. B. mit AIuI, Sau3A, BgIII, Hinfl, Pstl und Haelll. Die entstehenden Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Durch Vergleich mit entsprechenden Größenmarkern, so z. B. den Fragmenten, die durch Verdauung von pBR322 mit der Restruktionsendonuklease Hinfl bzw. Haelll entstehen, werden die Größen der Fragmente bestimmt. Durch Kartieren nach Smith und Birnstiel (H.O.Smith et al. Nucl. Acid. Res. 3,2387-2398 [1967]) wird die Reihenfolge dieser Fragmente bestimmt. Aus den so ermittelten Restriktionsenzymkarten (Abbildung 1 und 2) läßt sich überraschenderweise ableiten, daß es sich bei den Inserts der Klone E76E9 und P9A2 um bisher unbekannte Interferogene, nämlich um jene der omega-lnterferone, handelt. · ·
Diese Information über die omega-lnterferone wird benutzt, um das cDNA-lnsert mit geeigneten Restruktionsendonukleasen zu verdauen. Die entstehenden Fragmente werden in die dsDNA-Form (replikative Form) des Bakteriophagen M13 mp9 ligiert (J.Messing et al., Gene 19,269-276 [1982]) und mitderSanger'schen Dideoxymethode sequenziert (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 74,5463-5467 [1977]). Die Einzelstrang-DNA der rekombinanten Phagen wird isoliert. Nach dem Binden eines synthetischen Oligomers werden in vier separaten Ansätzen Zweitstrangsynthesen unter Verwendung des großen Fragments der DNA-Polymerase I aus E. coli (Klenow-Fragment) durchgeführt. Zu jeder der vier Teilreaktionen wird eines der vier Didesoxynukleosidtriphosphate (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) zugegeben. Das führt zu statistisch verteilten Kettenabbrüchen an jenen Stellen, an denen sich in der Template-DNA die zu dem jeweiligen Didesoxynukleosidtriphosphat korn ple'mentäre Base befindet. Außerdem wird zusätzlich radioaktiv markiertes dATP verwendet. Nach Beendigung der Synthesereaktionen werden die Produkte denaturiert, und die Einzelstrang-DNA-Fragmente der Größe nach in einem denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt (F. Sanger et al., FEBS Letters 87,107-111 [1978]). Danach wird das Gel auf einen Röntgenfilm exponiert. Aus dem Autoradiogramm läßt sich die DNA-Sequenz des rekombinanten M13 Phagen ablesen. Die Sequenzen der Inserts der verschiedenen rekombinanten Phagen werden mittels geeigneter Computerprogramme verarbeitet (R. Staden, Nucl. Acid. Res. 10,4731-4751 [1982]).
Abbildung 1 und 2 zeigen die Strategie des Sequenzierens. Abbildung 3 zeigt die DNA-Sequenz des Inserts des Klons P9A2, Abbildung 4 die des Klons E76E9. Der nicht kodierende DNA-Strang ist in 5'-> 3' Richtung gezeigt, zusammen mit der daraus abzuleitenden Aminosäuresequenz.
Die isolierte cDNA des Klons E76E9 für omega(Glu)-lnterferon ist 858 Basenpaare lang und besitzt eine 3' nicht translatierte Region. Die Region, die für reifes omega(Glu)-lnterferon kodiert, reicht von dem Nukleotid 9 bis zum Nukleotid 524. Die isolierte cDNAdes Klons P9A2 für omega(Gly)-lnterferon ist 877 Basenpaare lang, wobei die für reifes omega-lnterferon kodierende Sequenz von dem Nukleotid 8 bis zum Nukleotid 523 reicht. Die 3' nicht translatierte Region reicht im Fall des P9A2 bis zum poly-A-Abschnitt. ·
Die für reifes omega-lnterferon kodierenden DNA-Sequenzen sind in den Klonen E76E9 und P9A2 komplett enthalten. Sie beginnen am N-terminalen Ende mit den Aminosäuren Cystein-Asparaginsäure-Leucin. Überraschenderweise sind die beiden reifen omega-lnterferone 172 Aminosäuren lang, was deutlich von der Länge von den bisher bekannten Interferonen, z. B. 166 (bzw. 165) Aminosäuren bej a-lnterferonen abweicht. Überraschenderweise besitzen die beiden omega-lnterferone eine potentielle N-Glykosylierungsstelle an der Aminosäureposition 78 (Asparagin-Methionin-Threonin).
Ein Vergleich der DNA der Klone E76E9 und P9A2 zeigt einen Unterschied. Das für die Aminosäure 111 kodierende Triplett im Klon E76E9 ist GAG und kodiert für Glutaminsäure, während dieses Triplett im Klon P9A2 GGG ist, und für Glycin Kodiert. Die beiden omega-lnterferon-Proteine unterscheiden sich daher in einer Aminosäure und werden mit omega(Glu)-lnterferon (E76E9) und omega(Gly)-lnterferon (P9A2) bezeichnet.
Der Vergleich der beiden omega-lnterferone mit den bisher bekannten menschlichen α-Interferon Subtypen ergibt folgendes Bild:
| omega | alpha | |
| Länge des Proteins in Aminosäuren | 172 | 166(*) |
| potentielle N-Glyko- sylierungsstellean Position | 78 | — (*·) |
*) Interferon alpha A besitzt nur 165 Aminosäuren
**) Interferon alpha H besitzt eine potentielle N-Glykosylierungsstelle an Position 75 (D. Goeddel et al.. Nature 290,20-26 [1981 ]). '
E. coli HB101 mit dem Plasmid E7j5E9und E. coli 101 mit dem Plasmid P9A2sind bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM Göttigen) unter der Nummer DSM 3003 respektive DSM 3004 am 3.JuIi 1984 hinterlegt worden. Zum Beleg, daß die neu aufgefundenen Klone eine Interferon-ähnliche-Aktivität produzieren, wird beispielsweise der Klon E76E9 kultiviert und das Lysat des Bakteriums nach dessen Wachstum in einem Plaque-Reduktions-Test überprüft. Das Bakterium produzierte erwartungsgemäß Interferon-ähnliche Aktivität (siehe Beispiel 3). Erfindungsgemäß können die so isolierten Genein dem Expressionsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21,237-248 (1983) und EP-A-0.115-613—hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983) exprimiert werden, da dieser Vektor alle Regulationselemente enthält, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen. Erfindungsgemäß wurde also in dem Plasmid pBR322 das plasmideigene kürzere EcoRI/BamHI-Fragment durch die DNA-Sequenz der Formel
EcoRI Sau3A qaattcacgctGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA 5 9
.mRNA-Start . Met
ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116
RBS · Hindlll Cys Asp TGT GAT C IFN-omega-Gen — >
Sau3A
ersetzt. .
Um das erfindungsgemäße Ziel zu erreichen, wird gemäß Abbildung 5 beispielsweise wie folgt verfahren:
I. Herstellung der hierfür erforderlichen einzelnen DNA-Fragmente: Fragments
Zur Herstellung des Fragments a) wird ein Plasmid, das ein Gen für IFN-omega enthält, z. B. das Plasmid P9A2, mit der Restrictionsendonuclease Avail verdaut. Nach Chromatographie und Reinigung des erhaltenen cDNA-lnserts wird dieses mit den Restrictionsendonucleasen Ncol und AIuI zweifach weiterverdaut und anschließend mittels Chromatographie und Elektroelution isoliert. Dieses Fragment enthält den größten Teil des entsprechenden omega-lnterferon-Gens. So weist beispielsweise das omega(Gly)-lnterferon-Gen des Klons P9A2 folgende Struktur auf:
5 10 15
His GIy Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu
C ι CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28
Nc ο I
20 25 30
VaI Leu Leu His Gin Met Arg Arg He Ser Pro Phe Leu Cys Leu
GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 7 3
35 40 45
Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin GIu Met VaI Lys GIy AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG
50 55 60
Ser GIn Leu GIn Lys Ala His VaI Met Ser VaI Leu His GIu Met
AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG
65 70 75
Leu Gin Gin He Phe Ser Leu Phe His Thr GIu Arg Ser Ser AIa
CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT
80 85 90
AIa Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr GIy Leu His
GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT
95 100 105
Gin Gin Leu Gin His Leu GIu Thr Cys Leu Leu Gin VaI VaI GIy
CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA
110 115 _ 120
GIu GIy GIu Ser Ala GIy Ala He Ser Ser Pro AIa Leu Thr Leu
GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG
125 . . 130 135
Arg Arg Tyr Phe Gin GIy He Arg VaI Tyr Leu Lys GIu Lys Lys
AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA
140 - 145 150
Tyr Ser Asp Cys AIa Trp GIu VaI VaI Arg Met GIu He Met Lys
TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA
155 160 165
Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin GIu Arg Leu Arg Ser Lys
TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA
170 Asp Arg Asp Leu GIy Ser Ser
GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA
TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 6 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC TTT ACATTGTATTAAGAT AACAAAACATGf TCAGJct 80
AIuI " ·
Fragment b _ .
Zur Herstellung des Fragments b) wird das Plasmid P9A2 mit der Restriictionsendonuclease Avail verdaut. Nach Chromatographie und Reinigung des erhaltenen cDNA-lnserts wird dieses mit der Restrictionsendonuclease Sau3A weiterverdaut und das gewünschte 189bp lange Fragment mittels Chrornatographie und Elektroelution isoliert. Dieses weist folgende Struktur auf:
5 10 15
Asp Leu Pro Gin Asn His GIy Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu JGATCTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG Sau3A Ncol
20 25 30
VaI Leu Leu His Gin Met Arg Arg He Ser Pro Phe Leu Cys Leu GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC
35 40 45
Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin GIu Met VaI Lys GIy AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 13
50 55 60
Ser GIn Leu GIn Lys Ala His VaI Met Ser VaI Leu His GIu Met ACG CAG TTG CAG AAG GGC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG
Leu Gin Gin He
CTG CAG CA|g ate' - '
Sau3A Fragmente .
Zur Herstellung des Fragments c) wird das Plasmid pER33 (siehe E. Rastl-.Dworkin et al., Gene 21,237-248 [1983] und EP-A-0.115.613) mit den Restrictionsenzymen EcoRI und Pvull zweifach verdaut. Das nach Agarosegei-Fraktionierung und Reinigung erhaltene 389bp lange Fragment, welches den Trp-Promotor, die ribosomale Bindungsstelle und das Startcodon enthält, wird anschließend mit Sau3A verdaut. Das gewünschte 108bp lange Fragment erhält man durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Elutip-Säulenreinigung. Dieses weist folgende Struktur auf:
EcoRI Sau3A
qaattcacgctjGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA" 5
,mRNA-Start Met
ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG
RBS Hindlll
Cys Asp '
TGT lgat c Sau3A
Die Fragmente b und c werden mitT4-Ligase ligiert und nach Zerstörung des Enzyms mit Hindlll geschnitten. Diesesligierte Fragment weist folgende Struktur auf:
HindIII Sau3A Ncql
aJAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50
ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGÄGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG.TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200
AGATCACACA TCTTTAlaqct t Sau3A Hindlir
Alternativ kann dieses für die Herstellung des PlasmidspRHWIO notwendige DNA-Fragment auch durch die Verwendung von zwei synthetisch hergestellten Oligonukleotiden erzeugt werden: Das Oligonukleotid der Formel
5'-AGCTTAAAGATGTGt-S' .
bleibt an seinem 5'-Ende dephosphoryliert
Das Oligonukleotid der Formel
5'-GATCACACATCTTTa-S'
wird mittels der T4-Polynukleotidkinase und ATP am 5'-Ende kinasiert.
Beim Hybridisieren beider Oligonukleotide erhält man folgendes kurzes DNA-Fragment:
5'-AGCTTAAAGATGTGT 3'
3'- ATTTCTACACACTAGp 5'
Es entsteht dadurch an einem Ende der für Hindlll typische 5'-Überhang und am anderen Ende der für Sau3A typische 5'-Überhang.
Das Fragment b) wird unter Verwendung von Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Fragment b) und das oben beschriebene Fragment werden zusammengebracht und mittels T4-Ligase miteinander verbunden.
Da die Ligase mindestens ein 5'-Phosphat-haltiges Ende benötigt, können nur das synthetische DNA-Stück mit Fragment b) oder aber 2 synthetische Fragmente an ihren Sau3A-Enden verknüpft werden. Da sich die beiden resultierenden Fragmente in ihrer Länge unterscheiden, können sie durch selektive Isopropanolfällung getrennt werden. Das so gereinigte Fragment wird mittels
T4-Polynukleotidkinase und ATP phosphoryliert. .
a) Herstellung des PlasmidspRHWIO:
Man linearisiert das Expressionsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-284 [1983] und EP-A-0.115.613 — hinterlegt bei der DSM unter der DSM-Nummer 2773) mit Hindlll und behandelt anschließend mit Kalbsdarmphosphatase. Nach Isolierung und Reinigung der so erhaltenen DNA wird diese dephosphoryliert und anschließend mit ligierten Fragmenten b und c (nach deren Hindlll-Verdauung) ligiert. Anschließend wird E. coli HB101 mit der erhaltenen Ligierungsmischung transformiert und auf LB-Agar plus 50μg/ml Ampicillin kultiviert. Das die gewünschte Struktur aufweisende Plasmid erhielt die Bezeichnung pRHW10 (siehe Abbildung 5), welches nach seiner Replication als Zwischenprodukt zur Herstellung von weiteren Plasmiden diente.
b) Herstellung des PlasmidspRHW12:
Zu dem mit BamHI geschnittenem Plasmid pRHWIO gibt man das Klenow-Fragmentder DNA-Polymerase I und die 4 Deoxynucleosidtriphosphate. Das nach Inkubation erhaltene linearisierte, mit stumpfen Enden versehene Plasmid wird gereinigt und anschließend mit Ncol geschnitten. Das größere Fragment, welches mittels Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Elutip-Reinigung gewonnen wird, wird mit dem Fragment a ligiert. Anschließend wird die Ligierungsmischung mit E. coli HB101 transformiert und auf LB-Agar plus 50μg/ml Ampicillin kultiviert. Das die gewünschte Struktur aufweisende Plasmid erhielt die " Bezeichnung pRHW12 (siehe Abbildung 5), welches das gewünschte omega(Gly)-lnterferon exprimiert. Beispielsweise enthält 1 der so erhaltenen Bakterienkultur (optische Dichte: 0,6bei600nm) 1 χ 106 Internationale Einheiten an Interferon.
c) Herstellung des Plasm ids pRHW11
Zu dem mit BamHI geschnittenem Plasmid pRHWIO gibt man das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und die 4 Desoxynucleosidtriphosphate. Das nach Inkubation erhaltene linearisierte, mit geraden Enden versehene Plasmid wird gereinigt und anschließend mit Ncol geschnitten. Das größere Fragment, welches mittels Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und' Elutip-Reinigung gewonnen wird, wird mit dem aus dem Plasmid E79E9 analog gewonnenem Fragment a, in welchem lediglich das
für die 111.Aminsoäure(Gly) codierende GGG-Codon durch dasGAG-Codon (GIu) ersetzt ist, ligiert. Anschließend wird die erhaltene Ligierungsmischung mit E. coli HB101 transformiert und auf LB-Agar kultiviert. Das die gewünschte Struktur aufweisende Plasrnid erhielt die Bezeichnung pRHW11 (siehe analog Abbildung 5), welches das gewünschte omega(Glu)-Interferon exprimiert.
Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sollen, beschreiben die Erfindung im Detail.
a) Herstellung der cDIMA-Bibliothek
mRNA aus Sendai-Virus-stimulierten Zellen wird als Ausgangsmaterial zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek nach literaturbekannten Methoden verwendet^ Dworkin-Rastl et al., Journal of Interferon Research VoI 2/4,575-585 [1982]). Die angefallenen 30000 Klone werden individuell in die Näpfe von Mikrotiterplatten übertragen. Folgendes Medium wird zum Wachstum und Einfrieren der Kolonien verwendet: lOgTrypton
5 g Yeast Extract
5g NaCI
0,51 g Na-Citrat x 2 H2O *
7,5 g K2HPO4 x 2 H2O
1,8 g KH2PO4
0,09 g MgSO4 x 7 H2O
0,9 g (NH4I2SO4
44 g Glyzerin
0,01 g Tetracyclin χ HCI ad 1 I H2O
Die Mikrotiterplatten mit den individuellen Klonen werden über Nacht bei 370C inkubiert und danach bei -70°C aufbewahrt.
b) Hybridisierungsprobe
Als Ausgangsmaterial für die Hybridisierungsprobe dient das rekombinante Plasmid pER33 (E. Dworkin-Rastl et al., Gene 21, 237-248 [1983]). Dieses Plasmid enthält die kodierende Region für das reife Interferon IFN-a2arg plus 190 Basen der 3' nichttranslatierten Region. 20Mg pER33 werden mit 30 Einheiten Hindill Restriktionsendonuklease in 200μΙ Reaktionslösung (1OmM Tris-HCI pH —7,5,1OmM MgCI2,1 mM Dithiotreitol (DTT), 5OmM NaCI) 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zusatz von V2BV010,5 M Äthylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) und Erhitzen auf 70°C für 10 Minuten beendet. Nach Zusatz von V4VoI 5 x Puffer (80% Glyzerin, 4OmM Tris-Essigsäure pH = 7,8,5OmM EDTA, 0,05% Natriumdodecylsulfat [SDS], 0,1 % Bromphenolblau) werden.die entstandenen Fragmente der Größe nach elektrophoretisch in einem 1%Agarosegel getrennt (Gel- und LaufpufferITBE]: 10,8g/l Trishydroxymethylaminomethan [TrisBase], 5,5g/l Borsäure, 0,93g/l EDTA). Nach Inkubation des Gels in einer 0,5 Mg/ml Ethidiumbromidlösung werden die DNA-Banden im UV-Licht sichtbar gemacht, und der Gelbereich, der das IFN-Gen-hältige DNA Stück (ca. 800bp lang) enthält, ausgeschnitten. Durch Anlegen einer Spannung wird die DNA in V10 χ TBE-Puffer elektroeluiert. Die DNA Lösung wird einmal mit Phenol und viermal mit Äther extrahiert und die DNA durch Zusatz von Viovol 3 M Natriumacetat (NaAc) pH — 5,8 und 2,5 vol EtOH aus der wäßrigen Lösung bei -20°C präzipitiert. Nach dem Abzentrifugieren wird die DNA einmal mit 70% Äthanol gewaschen und 5 Minuten im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 50μΙ Wasser aufgenommen (ca. 50pg/Ml). Diese DNA wird durch Nicktranslation (modifiziert nach T. Maniatis et al.. Molecular Cloning, ed. CSH) radioaktiv markiert. 50 μΙ Inkubatipnslösung enthalten: 50mMTrispH = 7,8, 5mM MgCI2,1OmM Mercaptoäthanol, 100ng Insert-DNAvon pER33,16pg DNasel, 25μΜοΙ αΑΤΡ,25μΜοΙ dGTP, 25μΜοΙ dTTP, 20μΰί a32P-dCTP (>3000Ci/mMol) sowie 3 units DNA-Polymerase I (E. coli). Die Inkubation erfolgte bei 14°Cfür45 Minuten. Die Reaktion wird durch Zusatz von 1 vol 5OmM EDTA, 2% SDS, 1OmM Tris pH = 7,6 Lösung und Erhitzen auf 700C für 10 Minuten beendet. Die DNA wird durch Chromatographie über Sephadex G-100 in TE-puffer (1OmM Tris pH = 8,0,1 mM EDTA) von nicht eingebauter Radioaktivität getrennt. Die radioaktiv markierte Probe weist eine spezifische Aktivität von ca. 4 χ 107cpm^g auf.
c) Screening der Klone auf IFN-Gen-haltige Inserts
Die in den Mikrotiterplatten eingefrorenen Bakterienkulturen werden aufgetaut (a). Ein Stück Nitrozellulosefilter der entsprechenden Größe (Schleicher und Schüll, BA85,0,45μηι Porengröße) wird auf LB-Agar aufgelegt (LB-Agar: 10g/I Trypton, 5g/l Yeast Extrakt, 5g/l NaCI, 15g/l Bacto Agar, 20mg/ITetracyclin-HCI). Mit einem den Mikrotiterplatten angepaßten Stempel werden die individuellen Klone auf das Nitrozellulosefilter übertragen. Die Bakterien wachsen über Nacht bei 37°C zu etwa 5 mm Durchmesser großen Kolonien. Zum Zerstören der Bakterien und Denaturieren der DNA werden die Nitrozellulosefilter der Reihe nach auf einem Stapel mit folgenden Lösungen getränkte Whatman 3MM Filter gelegt: 1) 8 Minuten auf 0,5 M NaOH, 2) 2 Minuten 1 M Tris pH = 7,4,3) 2 Minuten 1 M Tris pH = 7,4 und 4) 4 Minuten 1,5 M NaCI, 0,5 M Tris pH = 7,4, Die Filter werden luftgetrocknet und dann 2 Stunden bei 8O0C gehalten. Die Vorbehandlung der Filter erfolgte 4 Stunden bei 650C in der Hybridisierlösung, bestehend aus 6 χ SSC(I χ SSC entspricht 0,15 M NaCI;0,015MTrinatriumcitrat;pH = 7,0),5 χ Denhardt's Lösung (1 χ Denhardt's Lösung entspricht 0,02% PVP (Polyvinylpyrrolidon); 0,02% Ficoll (MG: 40000D); 0,02% BSM (Bovine Serum Albumine) und 0,1% SDS (Sodium dodecylsulfate). Ca 1 χ 106cpm pro Filter der in b) hergestellten Probe werden durch Kochen denaturiert und der Hybridisierlösung zugesetzt. Hybridisierung erfolgt 16 Stunden bei 65"C. Das Waschen der Filter erfolgt bei 65°C viermal 1 Stunde mit 3 χ SSC/0,1 % SDS. Die Filter werden luftgetrocknet, mit Saran Wrap bedeckt und auf Kodak X-OmatS Film exponiert.
Von den positiv oder positiv verdächtig reagierenden Kolonien werden 5ml Kulturen in L-Broth (10g/l Trypton, 5g/l Yeast Extract, 5g/l NaCI, 20mg/l Tetracyclin χ HCI) über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Plasmid-DNA wird modifiziert nach Birnboim und DoIy (Nucl. Acid Res. 7,1513, [1979]) isoliert. Die Zellen von 1,5 ml Suspension werden abzentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge) und bei 00C in 100μΙ Lysozymlösung bestehend aus 5OmM Glucose, 1OmM EDTA, 25mM Tris-HCI pH = 8,0 und 4mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden 2 Volumteile eiskalter 0,2 M NaOH, 1%SDS Lösung zugegeben und weitere 5 Minuten inkubiert. Dann werden 150μΙ eiskalte Kaliumacetatlösung pH = 4,8 zugesetzt und 5 Minuten inkubiert. Die ausgefallenen Zellbestandteile werden abzentrifugiert. Die DNA-Lösung wird mit 1 Volumteil Phenol/ CHCI3 (1:1) extrahiert und die DNA durch Zugabe von 2 Volumteilen Äthanol ausgefällt. Nach dem Abzentrifugieren wird das Pellet einmal mit 70% Ethanol gewaschen und 5 Minuten im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 50μΙ (TE)-Puffer gelöst. ΙΟμΙ davon werden in 50μΙ Reaktionslösung (1OmM Tris-HCI pH = 7,5,1OmM MgCI2,5OmM NaCI, 1 mM DTT) mit 10 Einheiten Pstl-Restriktionsendonuklease 1 Stunde bei 37°C verdaut. Nach Zusatz von V25 Volumteilen 0,5 M EDTA sowie 1A Volumteilen 5x Puffer (siehe Beispiel 1 b) wird 10 Minuten bei 7O0C erhitzt und die DNA anschließend in einem 1% Agarosegel (TBE-puffer) elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA im Agarosegel wird nach der Methode von Southern (E. M. Southern, J. Mol. Biol, 98, 503-517 [1975]) auf ein Nitrozellulosefilter übertragen. Die DNA im Gel wird durch einstündige Inkubation des Gels mit einer 1,5 M NaCI/0,5M NaOH Lösung denaturiert. Anschließend wird 1 Stunde mit einer 1 MTris χ HCIpH = 8/1,5 M NaCI Lösung neutralisiert. Die DNA wird mit 10 χ SSC(1,5M NaCI,0,15M Natriumeitrat, pH = 7,0) auf das Nitrozellulosefilter übertragen. Nach vollendetem Transfer (ca. 16 Stunden) wird das Filter kurz in 6 x SSC Puffer gespült, dann luftgetrocknet und abschließend 2 Stunden bei 8O0C gebacken. Das Filter wird 4 Stunden mit einer 6 χ SSC/5 x Denhardt's Lösung/0,1 %SDS (siehe Beispiel 1c) bei 65°C vorbehandelt. Zirka 2 χ 108cpm derHybridisierungsprobe (siehe Beispiel 1 b) werden durch Erhitzen auf 1000C denaturiert und anschließend in die Hybridisierlösung eingebracht. Die Hybridisierdauer beträgt 16 Stunden bei 650C. Anschließend wird das Filter 4x1 Stunde bei 65°C mit einer 3 x SSC/0,1 % SDS-Lösung gewaschen. Nach dem Lufttrocknen wird das Filter mit Saran Wrap bedeckt und auf Kodak X-OmatS Film exponiert.
Eine 100ml Kultur des KlonsE76E9 wird in L-Broth (10g/l Trypton, 5g/l Yeast Extract, 5g/l NaCI, 5g/l Glucose, 20mg Tetracyclon χ HCI pro I) bei 370C bis zu der optischen Dichte A6oo = 0,8 angezüchtet. Die Bakterien werden 10 Minuten mit 7000rpm abzentrifugiert, einmal mit einer 50mMTris χ HCI pH = 8,0,3OmM NaCI Lösung gewaschen und in 1,5ml Waschlösung resuspendiert. Nach Inkubation mit 1 mg/ml Lysozym bei 00C eine halbe Stunde lang, wird die Bakteriensuspensiön fünfmal gefroren und getaut. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation mit 40000 rpm eine Stunde lang pelletiert. Der Überstand wird sterilfiltriert und auf Interferonaktivität geprüft. Als Test verwendet man den Plaque Reduktionstest mit V3-Zellen und Vesicular Stoamtitis Virus (G. R.Adolf et al., Arch. Virol. 72,169-178 [1982]). Überraschenderweise produziert der Klon bis zu 9000IU Interferon pro Liter Ausgangskultür.
Vorbemerkung:
Die Herstellung der Expressionsplasmide wird in Abbildung 5 dargestellt (nicht maßstabgerecht), ferner werden alle Restrictionsenzymverdauungen nach den Angaben der Enzymhersteller durchgeführt.
a) Herstellung des PlasmidspRHW 10 '·-
100μg des Plasmids P9A2 werden mit 100 Einheiten der Restriction-Endonuclease Avail (New Englands Biolabs) verdaut. Nach der Verdauung wird das Enzym durch Erhitzen auf 700C inaktiviert und die erhaltenen Fragmente an einem 1,4%igen Agarose Gel mitTBE-Puffer (TBE-Puffer: 10,8g/l Tris-Base, 5,5g/l Borsäure, 0,93g/l EDTA) entsprechend ihrer Größe fraktioniert. Die Bande, welche das ganze cDNA-lnsert enthält, wird elektroeluiert und an einer Elutip-Säule (Schleicher & Schuell) gereinigt. Von den erhaltenen 20Mg werden 6M9 mit der Restriction-Endonuclease Sau3a (20 Einheiten in insgesamt 100μΙ Lösung) weiter verdaut.
Die Fragmente trennt man mittels 2%igen Agarose Gel in TBE-Puffer. Nach Färben mit Ethidium Bromid (EtBr) wird das 189bp lange DNA-Stück elektroeluiert und wie oben beschrieben gereinigt (= Fragment b in Abbildung 5).
Um das Interferongen mit einem Promotor, einer ribosomalen Bindungsstelle und einem Startcodon zu verknüpfen, wird das entsprechende DNA-Stück aus dem ExpressionsplasmidpER 33 (E. Rastl-Dworkin et al. ,Gene 21,237-248 [1983]) isoliert. Hierzu werden 50Mg pER33 mit den Restrictionszymen EcoRI und Pvull zweifach verdaut und die erhaltenen Fragmente entsprechend ihrer Größe an einem 1,4%igen Agarose-Gel in TBE-Puffer fraktioniert. Das 389 bp lange DNA-Stück, welches den Trp-Promotor, die ribosomale Bindungsstelle und das Startcodon enthält, wird elektroeluiert und über eine Elutip-Säule gereinigt. Das so erhaltene Fragment wird anschließend mit Sau3A verdaut, und das gewünschte 108bp lange Fragment erhält man mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, Elektro-elution und Elutip-Säulenreinigung in einer Ausbeute von ungefähr 100 ng (= Fragmentec
in Abbildung 5). . '
20 ng des Fragmentes b werden mit 20ng des Fragmentes c in einem Volumen von 40μΙ unter Verwendung von 10 Einheiten T4-Ligase in einer Lösung, welche 5OmM Tris/Cl = pH = 7,5,1OmM MgCI2,1mM DTT und 1 mM ATP enthält, bei 14°C 18 Stunden lang ligiert. Anschließend wird das Enzym durch Erhitzen auf 7O0C zerstört und die erhaltene DNA mit Hindill in einem Gesamtvolumen von 50μΙ geschnitten.
10μg desExpressionsplasmidspER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21,237-248 [1983]) linearisiert man mit Hindill meinem Gesamtvolumen von 100μΙ. Nach 2 Stunden bei 37°C wird 1 Volumen 2x Phosphatase Puffer (2OmM Tris/Cl pH = 9,2,0,2mM EDTA) zusammen mit einer Einheit Kalbsdarmphosphatase (CIP) hinzugegeben. Nach 30 Minuten bei 45°C gibt man eine weitere Einheit CIP zu und inkubiert nochmals 30 Minuten lang. Die so erhaltene DNA wird durch zweimalige Phenolextraktion, einmalige Chloroformextraktion und durch Fällung mittels Zugabe von 0,3 M Natriumacetat (pH = 5,5) und 2,5 VoI Äthanol gereinigt.
Anschließend wird dephosphoryliert, um beim nächsten Ligierungsschritt die Religierung des Vektors zu verhindern.
100ng deslinearisierten pER103und die ligierten Fragmente b unccfnach der Hindlll-Verdauung) werden in eine Lösung von 100μΙ, welche Ligase Puffer enthält, eingetragen und bei 14°C 18 Stunden lang mit T4-DNA-Ligase ligiert.
200μΙ kompetente E. coli HB101 (E. Dworkin et al., Dev. Biol. 76,435-448 [1980]) werden Γηίΐ20μΙ der Ligierungs-Mischung vermischt und 45 Minuten lang auf Eis inkubiert. Danach wird die DNA-Aufnahme durch einen Hitzeschock von 2 Minuten bei 42°C vollendet. Die Zellsuspension wird weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert und schließlich auf LB-Agar(10g/ITrypton,5g/l Hefeextrakt, 5g/l NaCI, 1,5% Agar), welcher 50mg/l Ampicillin enthält, aufgebracht. Die Plasmide, die in den erhaltenen 24 Kolonien enthalten sind, werden nach der Methode von Birnboim und DoIy (siehe Nucl. Acid. Res. 7,1513-1523 [1979]) isoliert. Nach der Verdauung mit verschiedenen Restrictionsenzymen weist ein Plasmid die gewünschte Struktur auf. Dieses erhielt die f- azeichnung pRHWIO (siehe Abbildung 5). U
b) Herstellung des PlasmidspRHW12
Ca. 10 μ9 des Plasmids pRHW 10 werden mit BamHI geschnitten. Anschließend wird das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und die 4 Deoxynucleosid-triphosphate zugegeben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das erhaltene linearisierte und mit geraden Enden versehene Plasmid wird durch Phenolextraktion und durch Fällung gereinigt und anschließend mit der Restrictions-Endonuclease Ncol in einem Volumen von 100μΙ geschnitten. Das größere Fragment wird mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, Elektroelution und Elutip-Reinigung.gewonnen. Das Fragment a) (siehe Abbildung 5) erhält man durch Verdauung von 4μg Avall-Fragment, welches das P9A2-cDNA-lnsert enthält (siehe oben) mit Ncol und AIuI, wobei man ungefähr 2pg an Fragment a) erhält.
Im letzten Ligierungsschritt wird das Fragment a) und das hinzugegebene mit BamHI/Ncol zweifach verdaute pRHW10 in einem Volumen von 10μΙ ligiert. Wobei jede DNA jeweils 10ng eingesetztwerden. Die Ligierung einer aufgefüllten BamHI-Schhittstelle an eine durch AIuI geschnittene DNA ergibt wieder eine BamHI-Schnittstelle.
Die erhaltene Ligierungsmischung wird mit kompetenten E. coli HB101 wie oben beschrieben transformiert. Von den erhaltenen 40 Kolonien wählt man eine aus, diese erhält die Bezeichnung pRHW 12.
Das Plasmid wird isoliert und das EcoRI/BamHI-lnsert nach der Methode von Sanger (F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sei 74, 5463-5467 [1979]) sequenziert. Dieses weist die erwartete Sequenz auf.
c) Herstellung des Plasmids pRHW 11
Diese erfolgt analog Beispiel 1 b. 1 \ig des Plasmids pRHW 10 wird mit BamHI verdaut. Die klebrigen (sticky) Enden der erhaltenen DNA werden mittels des Klenow-Frägments der DNA-Polymerase I und der 4 Deoxynucleosid-triphosphate stumpf gemacht, anschließend wird die linearisierte DNA mit Ncol geschnitten. Das größere Fragment wird mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, Elektroelution und Elutip-Säulenchromatographie gewonnen.
Das Ncol-Alul-Fragment isoliert man aus dem Klon E76E9 analog Beispiel 1 b. Anschließend ligiert man 10 ng des Vektor-Teils mit 10ng des cDNA-Teils in einem Volumen von 10μΙ unter geeigneten Bedingungen und unter Verwendung von 1 Einheit T4-Ligase. Nach Transformation der erhaltenen DNA-Mischung in E. coli HB101 und Selection der erhaltenen 45 Kolonien auf Ampicillin enthaltenden LB-Platten wird ein Klon ausgewählt, welche die Bezeichnung pRHW11 erhält. Nach Züchtung des entsprechenden Klons isoliert man die Pläsmid-DNA. Deren Struktur wird durch die Anwesenheit von mehreren spezifischen Restriction-Endonuclease-Schnittstellen (AIuI, EcoRI, Hindlll, Ncol, Pstl) belegt.
d) Expression der Interferon-Aktivität durch E. coli HB101 enthaltend das Plasmid pRHW12
100ml der Bakterienkultur werden bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 600 nm in M 9 minimal Medium, welches alle Aminosäuren ausgenommen Trypthophan (20μg/ml pro Aminosäure), 1 pg/ml Thiamin, 0,2% Glucose und 20μg/ml lndol-(3)-acrylsäure (IAA), den Induktor des Tryphtophan-Operons enthält, inkubiert. Anschließend werden die Bakterien durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 7000 rpm) pelletiert, einmal mit 5OmM Tris/Cl pH = 8,3OmM NaCI gewaschen und schließlich in 1,5ml desselben Puffers suspendiert. Nach 30rninütiger Inkubation mit 1 mg/ml Lysozym auf Eis werden die Bakterien 5x gefroren und aufgetaut. Die Zelltrümmer entfernt man durch 1 stündige Zentrifugieren bei 40000 rpm. Der Überstand wird steril filtriert und auf Interferon-Aktivität im Plaque-Reduction-Assay unter Verwendung von menschlichen A549 Zellen und Encophalo-myocarditisvirus geprüft.
Ergebnis: 11 der hergestellten Bakterienkultur enthält 1 χ 106 Internationale Einheiten an Interferon (A. Billiau, Antiviral Res. 4, 75-98 [1984]).
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung der Expressionsplasmide pRHW11 und pRHW12, dadurch
gekennzeichnet, daß in das durch Restrictionsendonucleaseverdauung mit BamHI, Auffüllen der Schnittstellen mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I und den 4
Deoxynucleosidtriphosphaten sowie anschließendem Schneiden mit Ncol erhaltene größere Fragment des Plasmids pRHWIO, welches in der Hindlll-Stelledes Plasmids pER103 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr.2773) das DNA-Fragment der Formel
Deoxynucleosidtriphosphaten sowie anschließendem Schneiden mit Ncol erhaltene größere Fragment des Plasmids pRHWIO, welches in der Hindlll-Stelledes Plasmids pER103 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr.2773) das DNA-Fragment der Formel
Hindlll Sau3A Ncol
aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50
ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200
AGATCACACA TCTTTAaqct t
Sau3A Hindlll
Sau3A Hindlll
enthält,
das durch Verdauen des Avall-Fragmentes des Klones P9A2 (hinterlegt bei der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr. 3004) bzw. des Klones E76E9 (hinterlegt bei der ' Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr.3003) mit Ncol und AIuI erhaltene Fragment der Formelj
Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr. 3004) bzw. des Klones E76E9 (hinterlegt bei der ' Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr.3003) mit Ncol und AIuI erhaltene Fragment der Formelj
c CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28
Ncol
GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG· CGC TCC TCT GCT 208 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 GAA GGA GAA TCT GCT GXG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 - TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802
AIuI
wobei X das Nucieotid G oder A darstellt,
mittels Ligasereaktion eingefügt wird, .
und die so erhaltenen Plasmide zur Replikation in E. coli HB101 transformiert und kultiviert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Plasmids pRHW12 der Klon P9A2, in dem X das Nucieotid A darstellt, verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Plasmids pRHW11 der Klon E76E9, in dem X das Nucieotid G darstellt, verwendet wird.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Plasmids pRHWIO in das Plasmid pER103 (hinterlegt bei-der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der DSM Nr. 2773) in die Hindlll-Stelle mittels Ligasereaktion das DNA-Fragment der Formel
Hindlll Sau3A Ncol
aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50
Family
ID=
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