CH663032A5 - Doppelstraengige dna, replizierbare plasmidische expressionstraeger zur mikrobiellen herstellung von hybrid human-leukozyten-interferon und transformierte mikroorganismen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft doppelsträngige DNA mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, kodierenden Strang sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Die neuen Leukozyten-Interferon-Proteine, die durch diese doppelsträngige DNA kodiert werden, bestehen aus 165 bis 166 Aminosäuren in einer Sequenz, die bezüglich Aminosäureidentität und -zahl aus Untersequenzen verschiedener natürlich vorkommender Human-Leukozyten-Interferone besteht, wobei die Aminosäuresequenz dieser Interferone in der Gesamtzusammensetzung von der Aminosäuresequenz natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone verschieden ist. Die Erfindung betrifft ferner replizierbare plasmidische Expressionsträger, die eine oben genannte doppelsträngige DNA enthalten, Mikroorganismen, die mit diesen Expressionsträgern transformiert sind sowie Verfahren zur Herstellung der Expressionsträger und der Mikroorganismen.

In jüngerer Zeit ist die rekombinante DNA-Technologie dazu herangezogen worden, die mikrobielle Herstellung einer Reihe verschiedener Leukozyten-Interferone zu veranlassen, deren Aminosäure-Sequenzen grössenordnungsmässig 70% Homologie, relativ zueinander, zeigen, wie von David V. Goeddel et al. (Nature 290, 20-26 [1981]) offenbart. Gene, die Aminosäuresequenzen verschiedener Leukozyten-Interferone verschlüsseln, die u.a. mit LeIF A, B, C, D, F, G bzw. H bezeichnet sind, werden aus dem von H. P. Koeffler und D. W. Golde (Science 200,1153-1154 [1978]), von David V. Goeddel und Sidney Pestka beschriebenen Zellstamm KG-1 erhalten. Der Zellstamm KG1 ist bei der American Type Culture Collection, ATCC-Zugangsnummer CRL 8031, hinterlegt worden. Solche Gene, in Plasmidträgern für bakterielle Expression geeignet verbreitet, können dazu verwendet werden, Wirtsbakterien, vorzugsweise E. coli K-I2, Stamm 294, American type culture collection-Zugangsnummer 31446, hinterlegt am 28. Oktober 1978, zu transformieren.

Das Zugpferd der rekombinanten DNA-Technologie ist das Plasmid, eine nichtchromosomale Schleife doppelsträngi-ger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, häufig in Viel-fach-Kopien pro Zelle. In der Plasmid-DNA ist die Information verschlüsselt, die zum Reproduzieren des Plasmids in Tochterzellen erforderlich ist (d.h. ein «Replicon») und gewöhnlich ein oder mehrere Auswahlcharakteristika, wie im Falle von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibioticis, die Klone der das Plasmid von Interesse enthaltenden Wirtszelle zu erkennen und bevorzugt in selektiven Medien zu züchten erlauben. Die Brauchbarkeit von Plasmiden liegt in der Tatsache, dass sie durch die eine oder die andere Restriktions-Endonuclease oder «Restriktions-Enzym» spezifisch gespalten werden können, die jeweils eine andere Stelle an der Plasmid-DNA erkennen. Danach können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid durch das Verbinden der Enden an der Spaltstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der Spaltstelle eingebaut werden. Die DNA-Rekombination erfolgt ausserhalb der Zelle, aber das anfallende «rekombinante» Plasmid kann nach einem als Transformation bekannten Verfahren in sie eingeführt werden, und grosse Mengen des heterologes Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ferner kann, wenn das Gen bezüglich Teilen des Plasmids, die die Transkription und Translation der verschlüsselten DNA-Botschaft steuern, geeignet eingesetzt ist, der sich ergebende Expressionsträger tatsächlich dazu verwendet werden, die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das eingesetzte Gen codiert, ein Verfahren, das als Expression bezeichnet wird.

Expression beginnt in einem Bereich, der als Promoter bekannt ist, der von RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird. In manchen Fällen, wie beim Tryptophan- oder «trp»--Promoter, der bei der praktischen Durchführung der Erfindung bevorzugt ist, überlappen sich Promoter-Bereiche mit «Operator»-Bereichen unter Bildung eines kombinierten Promoter-Operators. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Frequenz des Beginns einer Transkription an einem besonderen Promoter zu regeln. Die Polymerase geht an der DNA entlang und überträgt die im Codierstrang enthaltene Information vom 5'- zum 3'-Ende auf Messenger-RNA, die wiederum in ein Polypeptid übertragen wird, das die Aminosäuresequenz besitzt, die die DNA codiert. Jede Aminosäure wird durch ein Nucleotid-Triplett oder «Codon» in etwas verschlüsselt, was für die vorliegenden Zwecke als «Strukturgen» bezeichnet werden kann, d.h. dem Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts verschlüsselt. Nach der Bindung an den Promoter transkribiert die RNA-Polymerase zuerst Nucleotide, eine Ribosomen-Bindestelle verschlüsselnd, dann eine Translationsinitiation oder «Start»--signal (gewöhnlich ATG, das in der entstehenden Messen-ger-RNA zu AUG wird), dann die Nucleotid-Codons innerhalb des Strukturgens selbst. Sogenannte Stopp-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, worauf die Polymerase eine weitere Sequenz von Messenger-RNA bilden kann, die aufgrund der Anwesenheit des Stoppsignals von den Ribosomen unübersetzt bleiben. Ribosomen werden an die auf der Messenger-RNA vorgesehene Bindestelle gebunden, in Bakterien gewöhnlich, wenn die mRNA gebildet wird, und erzeugen selbst das verschlüsselte Polypeptid, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem zuvor genannten Stoppsignal. Das gewünschte Produkt wird gebildet, wenn die die Ribosomen-Bindestelle verschlüsselnden Sequenzen bezüglich des AUG-Initiatorcodons geeignet angeordnet sind und wenn alle übrigen Codons dem Initia-torcodon in Phase folgen. Das anfallende Produkt kann durch Lyse der Wirtszelle und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderem Bakterienprotein erhalten werden.

Nucleotid-Sequenzstudien von Genen, die die verschiedenen Leukozyten-Interferone verschlüsseln, lassen ein Mass an Allgemeinheit unter verschiedenen von ihnen im Hinblick auf die Gegenwart und Anordnung von Spaltstellen erkennen, die von bestimmten Restriktions-Endonucleasen erkannt werden. Erfindungsgemäss kann diese Allgemeinheit zur Bildung neuer Hybridgene durch DNA-Rekombination benutzt werden, die bei der mikrobiellen Erzeugung von Hybrid-Leuko-zyten-Interferonen brauchbar sind, von denen erwartet werden kann, dass sie in mehr oder weniger grossem Ausmass die antiviralen und andere Eigenschaften von Interferonen,

durch die elterlichen Gene verschlüsselt, zeigen. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können solche Hybrid-Leukozyten-Interferone verstärkte Aktivität relativ zu den durch die elterlichen Gene verschlüsselten entwickeln.

Die elterlichen Leukozyten-Interferon-Gene, die die Familie der hier betrachteten Leukozyten-Interferon-Proteine codieren, zeigen individuell natürliche allelomorphe Variationen. Diese Variationen können durch einen oder mehrere Aminosäure-Unterschied(e) in der Gesamtproteinsequenz oder durch Lücken, Substitutionen, Einfügungen, Umkehrungen oder zusätzliche Aminosäure(n) in der Sequenz nachgewiesen werden. Für jedes elterliche Leukozyten-Interferon, mit LeIF A bis LeIF J bezeichnet, fallen solche allelomorp-hen Variationen unter die Bezeichnung oder Definition und damit unter die Erfindung.

Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden näheren Beschreibung und den Figuren; von diesen zeigt:

Fig. la und lb Nucleotidsequenzen der Codierbereiche von 8 Leukozyten-Interferon-(«LeIF»-)K.omplementär-DNA-(«cDNA»-)Klonen. Von diesen ist eines, entsprechend mit

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LeiF E bezeichnet, ein offensichtliches «Pseudogen», das kein aktives Leukozyten-Interferon codiert, während ein weiteres, LeIF G, weniger als die volle Sequenz für die entsprechende Interferon-Art enthält. Das ATG-Translations-Start-kodon und das Stopp-Triplett für jedes LelF ist unterstrichen.

Fig. 2 Restriktions-Endonuclease-Karten von acht Arten LelF geklönter cDNAs (A bis H). Die Klone enthaltende Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailingmethode aufgebaut (D.V. Goeddel et al., Nature 287,411-416 [1980]). Daher können die cDNA-Inserte mit Pst I herausgeschnitten werden, d.h., jedes Ende eines jeden Inserts ist eine Pst I-Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle. Die Striche am Ende eines jeden cDNA-Inserts stellen die flankierenden Homopolymer-dC:-dG-Schwänze dar. Die Positionen von Pvu II-, Eco RI- und Bgl II-Restriktionsstellen sind angegeben. Schattierbereiche in der Figur stellen die Codiersequenzen ausgereifter LelFs dar; die schraffierten Bereiche zeigen Signal-Peptidcodierse-quenzen an; und die freien Bereiche zeigen nichtcodierende 3'- und 5'-Sequenzen.

Fig. 3a und 3b ist ein Vergleich der acht von den Nucleo-tid-Sequenzen vorausgesagten LelF-Proteinsequenzen. Es werden die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlenen einbuchstabigen Abkürzungen verwendet: A = Alanin; C = Cystein; D = Asparaginsäure; E = Glutaminsäure ; F = Phenylalanin ; G = Glycin ; H = Histi-din; I = Isoleucin; K= Lysin; L = Leucin; M = Methionin; N = Asparagin ; P = Prolin ; Q = Glutamin ; R = Arginin, S = Serin ; T = Threonin ; V=Valin ; W = Tryptophan und Y=Tyrosin. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäureposition (S bezieht sich auf Signalpeptid). Der Strich in der 165-Aminosäure-LeIF A-Sequenz an Position 44 wurde eingeführt, um diese Sequenz mit den 166 Aminosäuresequenzen der anderen LelFSs auszurichten. Die Sequenz von LeIF E wurde durch Ignorieren des Extra-Nucleotids (Position 187 der Fig. la) in seinem Codierbereich bestimmt. Die Sternchen bezeichnen In-Phase-Stopp-Codons. Allen LelFs (ausgenommen das Pseudogen LeIF E) gemeine Aminosäuren sind auch gezeigt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch in menschlichem Fibroblasten-Interferon vorhanden sind.

In Fig. la entsprechen die Nucleotide +1 bis 69 den Sl-bis S23-Aminosäuren der Fig. 3a. Das Codon TGT (Nucleotide 70 bis 72) der Fig. la entspricht Cystein (C, Aminosäure 1) der Fig. 3a. In Fig. 3a tritt die Pvu II-Restriktions-Endonu-clease-Spaltstelle zwischen den Codons für Aminosäuren 92 und 93 in LeIF A, B, D, F und G auf, d.h. zwischen den Nucleotiden 346 und 347 der Fig. la.

Fig. 4a und 4b vergleichen die Aminosäuresequenzen ausgereifter Leukozyten-Interferone A und D, wobei ein Fehlen der Aminosäure 44 in LeIF A durch Striche angezeigt ist. Nur solche LelF D-Aminosäuren, die sich von den entsprechenden Aminosäuren von LeIF A unterscheiden, sind dargestellt: Die Aminosäuresequenz von LeIF D ist sonst mit der von LeIF A identisch. Fig. 4b zeigt auch die relative Stellung von Bgl II- und Pvu II-Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen, zur Bildung bevorzugter Hybrid-Leukozyten-Gene nach der Erfindung verwendet, am entsprechenden Gen an.

Die Fig. 5 und 6 veranschaulichen die Ergebnisse von Vergleichstests eines bevorzugten Hybrid-Leukozyten-Interfe-rons («LeIF-A/D») auf Aktivität gegenüber Encephalomyo-carditis-Virus («EMC») und Vesicularstomatitis-Virus («VSV») in Mausezellen.

Die Fig. 7 und 8 zeigen die Ergebnisse eines Vergleichstests mit LeIF-A/D und anderen Interferonen gegenüber EMC-Virus-Infektionen in Mäusen bzw. Hamstern. Die Daten in Fig. 7 stammen aus Behandlungen i.p. 3 h vor der Infektion. Die Dosierungen von LeIF-A/D und LeIF-A sind wie an Wish-Zellen titriert.

Fig. 9a und 9b zeigen die DNA-Sequenzen von fünf LeiF-Proteinen einschliesslich die Typen I und J.

Bei den beschriebenen Arbeiten wurden zwei Mikroorganismen eingesetzt: E. coli x 1776, wie in der US-PS 4 190 495 beschrieben, und E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi~, hsr-, hsmk+), wie in der GB-PS 2 055 382Abeschrieben.

Beide sind bei der American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852-US, ATCC-Zugangsnummer 31537 und 31446, am 3. Juli 1979 bzw. 28. Oktober 1978 hinterlegt worden. Alle Arbeiten über rekombinante DNA erfolgten nach anwendbaren Richtlinien der National Institutes of Health.

Die Erfindung wird in ihren am meisten bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf E. coli beschrieben, nicht nur mit den oben beschriebenen Stämmen E. coli x 1776 und E. coli K-12, Stamm 294, sondern auch mit anderen bekannten E. coli-Stämmen, wie E. coli B, oder anderen Mikroben-Stämmen, von denen viele hinterlegt und (möglicherweise) von anerkannten Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen, wie der American Type Culture Collection, ATCC, erhältlich sind (vgl. die ATCC-Katalogaufstellung und auch die DE-OS 2 644 432). Diese weiteren Mikroorganismen umfassen z.B. Bazillen, wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, unter denen beispielsweise Salmonella typhimurium und Serratia marcescens erwähnt werden können, unter Verwendung von Plasmiden, die reduplizieren und heterologe Gensequenzen exprimieren können. Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, kann auch vorteilhaft als Wirtsorganismus bei der Herstellung der erfindungsgemässen Interferonproteine durch Expression von sie codierenden Genen unter der Kontrolle eines Hefepromoters verwendet werden.

Die LelF-Hybriden werden hergestellt, indem die Restrik-tions-Endonuclease-Spaltstellen, die gewöhnlich in den einzelnen elterlichen Genen liegen, und deren jedes Ende in Verbindung mit den gleichen Stellen in Träger-Expressions-Plas-miden (Vektoren) genutzt werden. Beispielsweise kann das grosse (etwa 3900 bp) Fragment eines Xba I-Pst I-Verdau-ungsprodukts des pLelF A trp 25-Expressionsplasmids mit Xba I-Pvu II- und Pvu II-Pst I-Verdauungsfragmenten der verschiedenen LelF-Elterngene zu Expressionsplasmiden verbunden werden, die das entsprechende Hybrid-LelF erhältlich machen.

Jedes LelF-Expressionsplasmid wurde unabhängig mit Verdauungsfragmenten aufgebaut, die aus verschiedenen LelF-Plasmiden isoliert waren, z.B. pLelF A trp 25,

pLelF B trp 7, pLelF C trp 35, pLelF D trp 11, pLelF F trp 1, pLelF G, pLelF H und pLeiF I usw., deren Aufbau in Nature 287,411 (1980) beschrieben ist, oder aus pBR322, dessen Aufbau in Gene 2,95 (1977) beschrieben ist. In bestimmten dieser Plasmide bezeichnet «trp» ein Tryptophanpromoter-Opera-tor-System, für bakterielle Expression am meisten bevorzugt, wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 36 776 beschrieben.

Direkte Expression eines ersten reifen Leukozyten-Interferons

Die Arbeitsweise, die befolgt wurde, um LeIF A direkt als reifes Interferon-Polypeptid auszudrücken, umfasste die Kombination von synthetischen (N-terminalen) und komplementären DNAs.

Eine Sau 3a-Restriktion-Endonuclease-Stelle wird passenderweise zwischen Codons 1 und 2 von Le-IF A angeordnet. Zwei synthetische Desoxyoligonucleotide wurden geschaffen, die ein ATG-Translations-Startcodon aufweisen, das Codon für Aminosäure 1 (Cystein) wieder herstellen und ein Eco RI-kohäsives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein 34 b.p. Sau 3a-Ava II-Fragment von pL31 geheftet. Das anfal-

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lende 45 b.p.-Produkt wurde an zwei weitere DNA-Fragmente gehängt, um ein 865-Basenpaar-synthetisch/natürli-ches Hybridgen aufzubauen, das Le-IF A codiert und durch Eco RI- und Pst I-Restriktionsstellen gebunden wird. Dieses Gen wurde zwischen Eco RI und Pst I-Stellen in pBR322 eingefügt, um das Plasmid pLe-IF AI zu ergeben.

Das Plasmid pGMl trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Fehlstelle ALE1413 (G.F. Miozzari et al., J. Bacterio-logy 133, 1457-1466 [1978]) und führt folglich zur Expression eines Fusionsproteins mit den erten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp-E-Polypeptids (nachfolgend im Zusammenhang als LE' bezeichnet) sowie das trp-D-Polypeptid in seiner Gesamtheit, alle unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems. 20 (ig des Plasmids wurden mit dem Restriktionsenzym Pvu II verdaut, das das Plasmid an fünf Stellen spaltet. Die Genfragmente wurden sodann mit EcoRI-Verknüpfern (bestehend aus einem selbst-komplementären Oligonucleotid der Sequenz pCAT-GAATTCATG) unter Bildung einer EcoRI-Spaltstelle für ein späteres Klonen zu einem Plasmid mit einer EcoRI-Stelle kombiniert. Die 20 jig der aus pGMl erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase in Gegenwart von 200 pico-Mol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oli-gonucleotids pCATGAATTCATG und in 20 jxl Ti-DNA-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6,0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCli, 5 mMol Dithiothreitol) bei 4 °C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 min auf 70 °C erwärmt, um das Binden aufzuhalten. Die Bindeglieder wurden durch EcoRI-Abbau gespalten, und die Fragmente, nun mit EcoRI-Enden, wurden mittels 5%-Polyacrylamidgel-Elek-trophorese (nachfolgend «PAGE») aufgetrennt und die drei grössten Fragmente vom Gel zunächst durch Anfärben mit Ethidiumbromid, Lokalisieren der Fragmente mit UV-Licht und Herausschneiden der interessierenden Teile aus dem Gel isoliert. Jedes Gelfragment wurde mit 300 |il 0,lxTBE in einen Dialysebeutel gebracht und bei 100 V 1 h in 0,lxTBE-Puffer der Elektrophorese unterworfen (TBE-Puffer enthält 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g NaîEDTA in 11 H2O). Die wässrige Lösung wurde aus dem Dialysebeutel geholt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2-molar an Natriumchlorid gemacht und die DNA nach Äthanol-Fällung in Wasser gewonnen. Das trp-Promoter-Operator-haltige Gen mit EcoRI-kohäsiven Enden wurde in der nachfolgend beschriebenen Arbeitsweise identifiziert, die den Einbau von Fragmenten in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid zur Folge hat, das nach dem Einbau von Promoter-Operator Tetracyclin-resistent wird.

Das Plasmid pBRHl (R.I. Rodriguez et al., Nucleic Acids Research 6,3267-3287 [1979]) drückt Ampicillin-Resistenz aus und enthält das Gen für Tetracyclin-Resistenz, da aber kein zugeordneter Promòter vorliegt, kommt diese Resistenz nicht zum Ausdruck. Das Plasmid ist folglich Tetracyclin-empfindlich. Durch Einführen eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Stelle kann das Plasmid Tetracyclinresistent gemacht werden.

Ein pBRHl wurde mit Eco RI verdaut und das Enzym durch Phenolextraktion und anschliessende Chloroform-Extraktion entfernt und nach Äthanolfällung in Wasser gewonnen. Das anfallende DNA-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen jeweils mit den drei oben erhaltenen DNA-Fragmenten kombiniert und mit Ti-DNA-Ligase, wie zuvor beschrieben, verknüpft. Die im Reaktionsgemisch vorliegende DNA wurde zum Transformieren eines angemessenen E. coli-K-12-Stammes 294 (K. Backman et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,4174-4198 [1976]) nach Standard-Techniken (V. Hershfield et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 71, 3455-3459 [1974]) verwendet und die Bakterien auf LB-Plat-ten aufgebracht, die 20 ug/ml Ampicillin und 5 }ig/ml Tetracyclin enthielten. Mehrere Tetracyclin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, Plasmid DNA isoliert und die Anwesenheit des gewünschten Fragments durch Restriktions-Enzym-analyse bestätigt. Das anfallende Plasmid wird mit pBRHtrp bezeichnet.

Ein Eco RI- und BamHI-Abbauprodukt des viralen Genoms oder Chromosomensatzes von Hepatitis B wurde nach herkömmlichen Massnahmen erhalten und zu EcoRI und BamHI-Stellen von Plasmid pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) zu dem Plasmid pHS32 geklont. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Dann wurde es mit 1 p.1 E. coli-Polymerase I, Klenow-Frag-ment (Boehringer, Mannheim) in 30 ml Polymerase-Puffer (50 mMol Kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mMol MgCh, I mMol ß-Mercaptoäthanol) mit 0,1 mMol dTTP und 0,1 mMol dCTP 30 min bei 0 °C, dann 2 h bei 37 °C behandelt. Diese Behandlung führt dazu, dass zwei der vier Nucleotide komplementär zu dem vorragenden 5'-Ende der Xbal-Spaltstelle aufgefüllt wurden in:

5' CT AGA 5' CT AG A

31 T 3 ' TCT

Zwei Nucleotide, dC und dT, wurden eingeführt und bildeten ein Ende mit zwei vorragenden 5'-Nucleotiden. Dieser lineare Rest von Plasmid pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Rückgewinnung in Wasser nach Äthanol-Fällung) wurde mit EcoRI gespalten. Das grosse Plasmid-Fragment wurde vom kleineren EcoRI-Xbal-Fragment durch PAGE getrennt und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNA-Fragment aus pHS32 (0,2 fxg) wurde unter Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen an das EcoRI-Taq I-Fragment des Tryptophan-Operons (ca. 0,01 |a.g), aus pBRHtrp stammend, gebunden.

Bei dem Verfahren zum Binden des Fragments von pHS32 an Eco RI-Taq I-Fragment, wie oben beschrieben, wird das vorragende Taq I-Ende an das verbleibende vorragende Ende von Xbal gebunden, obgleich es nicht vollständig nach Wat-son-Crick Basen-gepaart ist:

— T CTAGA— TCTAGA

—AGC TCT— —AGCTCT —

Ein Teil dieses Binde-Reaktionsgemischs wurde in E. coli 294-Zellen transformiert, wärmebehandelt und auf Ampicillin enthaltende LB-Platten gebracht. 24 Kolonien wurden ausgewählt, in 3 ml LB-Medium vermehrt und Plasmid isoliert. Bei sechs von ihnen wurde festgestellt, dass die Xbal-Stelle durch E. coli-katalysierte DNA-Reparatur und Replikation regeneriert war:

TCTAGA TCTAGA

AGCTCT " AG AT CT

Auch wurde gefunden, dass diese Plasmide sowohl mit EcoRI als auch mit Hpal spalteten und die erwarteten Restriktionsfragmente ergaben. Ein Plasmid, als pTrp 14 bezeichnet, wurde zur Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie nachfolgend erörtert.

Das Plasmid pHGH 107 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DNA-Fragmenten und 163 Aminosäurecodons, erhalten aus Komplementär-DNA, hergestellt über reverse Transkription von menschlicher Wachstumshormon-messenger-RNA. Dieses Gen enthält, obgleich die Codons der «Vor»-Sequenz von

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menschlichem Wachstumshormon fehlen, ein ATG-Transla-tions-Startcodon. Das Gen wurde aus 10 [ig pHGH 107 nach Behandlung mit EcORI und dann E. coli-Polymerase-I-Kle-now-Fragment und dTTP und dATP, wie oben beschrieben, isoliert. Nach Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolfällung wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

Das Human-Wachstumshormon («HGH»)-Gen-enthal-tende Fragment wurde durch PAGE isoliert, dann folgte Elektroelution. Das anfallende DNA-Fragment enthält auch die ersten 350 Nucleotide des Tetracyclin-resistenten Strukturgens, ihm fehlt aber das Tetracyclin-Promoter-Operator-System, so dass beim anschliessenden Klonen zu einem Expressionsplasmid die das Insert enthaltenden Plasmide durch die Wiederherstellung der Tetracyclin-Resistenz lokalisiert werden können. Da das EcoRI-Ende des Fragments durch die Klenow-Polymerase I-Arbeitsweise aufgefüllt worden ist, hat das Fragment ein stumpfes und ein kohäsives Ende, was die richtige Orientierung bei späterem Einschieben in ein Expressionsplasmid gewährleistet.

Sodann wurde das Expressionsplasmid pTrpl4 hergestellt, um das oben hergestellte HGH-Gen-haltige Fragment zu erhalten. So wurde pTrpl4 mit Xbal verdaut und die erhaltenen kohäsiven Enden nach der Klenow-Polymerase 5 I-Arbeitsweise unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP gefüllt. Nach der Phenol- und Chloroformextraktion und der Äthanolfällung wurde die anfallende DNA mit BamHI behandelt, und das anfallende grosse Plasmid-Frag-ment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das aus io pTrpl4 abgeleitete Fragment hatte ein stumpfes und ein kohäsives Ende, was die Rekombination in geeigneter Orientierung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, zuvor beschrieben, erlaubt.

Das HGH-Gen-Fragment und das pTrpl4AXba-BamHI-15 Fragment wurden kombiniert und unter ähnlichen Bedingungen, wie oben beschrieben, aneinandergehängt. Die aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden verbanden sich miteinander über die Verbindung über die stumpfen Enden unter Rückbildung sowohl der Xbal- als auch der EcoRI-Stelle:

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Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang

—TCTAG AATTCTATG— —TCTAGAATTCTATG—

-AGATC TTAAGATAC — —AGATCTTAAGATAC —

Xbal EcoRI

Dieser Aufbau bildet auch wieder das Tetracyclin-resistente Gen zurück. Da das Plasmid pHGH 107 Tetracyclin-Resistenz von einem Promoter vor dem HGH-Gen (dem Lac-Promoter) exprimiert, ermöglicht dieser Aufbau, mit pHGH 207 bezeichnet, die Expression des Gens für Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Opera-tors. So wurde das Bindegemisch in E. coli 294 transformiert und Kolonien auf LB-Platten, die 5 p.g/ml Tetracyclin enthielten, selektiert.

Das Plasmid pHGH207 wurde mit Eco RI verdaut und der trp-Promoter, ein 300 b.p. Eco RI-Fragment enthaltend, durch PAGE und anschliessende Elektroelution gewonnen. Das 300 b.p. Eco RI-Fragment enthält den E. coli-trp-Promo-ter, Operator und trp-Leaderribosomen-Bindestelle, ihm fehlt aber eine ATG-Sequenz für das Einführen der Translation. Dieses DNA-Fragment wurde in die Eco Rl-Stelle von pLe-IF A geklont.

Das eben erwähnte trp-Fragment ist ein Analogon des E. coli-Tryptophan-Operons, dessen sogenannter trp-Abschwächer beseitigt worden ist, um Expressionswerte kontrollierbar zu erhöhen. Expressionsplasmide, die das modifizierte trp-Regulon enthalten, können in Nährmedien, die zusätzliches Tryptophan in genügenden Mengen zum Unterdrücken des Promoter-Operator-Systems enthalten, bis auf vorbestimmte Werte vermehrt werden, dann von Tryptophan befreit werden, um das System von Repressor zu befreien, und die Expression des gewünschten Produkts veranlassen.

Im einzelnen wurden 250 ug Plasmid pL31 mit Pst I verdaut und das 1000 b.p.-Insert durch Gelelektrophorese an einem 6%-Polyacrylamidgel isoliert. Etwa 40 ug Insert wurden aus dem Gel elektroeluiert und in drei Teilmengen zu weiterem Aufschluss unterteilt: a) eine 16 |_ig-Probe dieses Fragments wurde mit 40 Einheiten Bgl II 45' bei 37 °C teilweise verdaut und das Reaktionsgemisch an einem 6%-Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 2 jxg des gewünschten 670 b.p.-Fragments wurden gewonnen, b) Eine weitere Probe (8 ug) des 1000 b.p.-Pst I-Inserts wurde mit Ava II und Bgl II behandelt. 1 [ig des angegebenen 150 b.p.-Fragments wurde nach Gelelektrophorese gewonnen, c) 16 (ig des 1000

30 b.p.-Stückes wurden mit Sau 3a und Ava II behandelt. Nach Elektrophorese an einem 10%-Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 jxg (etwa 10 pMol) des 34 b.p.-Fragments gewonnen. Die zwei angegebenen Desoxyoligonucleotide, 5'-dAATT-CATGTGT (Fragment 1) und 5'-dGATCACACATG (Frag-35 ment 2) wurden nach der Phosphotriester-Methode (Maxam und Gilbert, Methods Enzymol. 65,499-560 [1980]) synthetisiert. Das Fragment 2 wurde wie folgt phosphoryliert.

200 jxl (ca. 40 pMol) (y32P) ATP (Amersham, 5000 Ci/ mMol) wurden durchgetrocknet und erneut in 30 jil 60 mmol. 40 Tris-HCl (pH 8), 10 mmol. MgCh, 15 mmol. ß-Mercaptoätha-nol, 100 pMol DNA-Fragment und 2 Einheiten T4-Polynu-cleotidkinase enthaltend, suspendiert. Nach 15 min bei 37 °C wurde 1 (j.110 mmol. ATP zugesetzt und die Reaktion weitere

15 min ablaufen gelassen. Das Gemisch wurde dann 15 min 45 auf 70 °C erwärmt, mit 100 pMol 5'-OH-Fragment 1 und 10

pMol des 34 b.p.-Sau 3a-Ava II-Fragments zusammengebracht. Das Binden erfolgte 5 h bei 4 °C in 50 p.120 mmol. Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol. MgCh, 10 mmol. Dithiothreitol, 0,5 mmol. ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase. Das so Gemisch wurde an einem 6-Polyacrylamidgel elektrophore-tisch behandelt, und das 45 b.p.-Produkt durch Elektroelution gewonnen. 860 000 Cerenkov-cpm wurden gewonnen (ca. 30 ng, 1 pMol) kombiniert mit 0,5 (5 pMol) des 150 b.p.-Ava II-Bgl II-Fragments und 1 ug (2 pMol) des 670 55 b.p.-Bgl-II-Pst-I-Fragments. Das Binden erfolgte bei 20 °C

16 h unter Verwendung von 20 Einheiten T4-DNA-Ligase. Die Ligase wurde durch lOminütiges Erwärmen auf 65 °C inaktiviert. Das Gemisch wurde dann mit Eco RI und Pst I zum Beseitigen von Polymeren des Gens verdaut. Das

60 Gemisch wurde durch 6% Polyacrylamidgel-EIektrophorese gereinigt. 36 000 cpm (ca. 0,04 pMol, 20 ng) 865 b.p.-Produkt wurden isoliert. Die Hälfte hiervon (10 ng) wurde an pBR322 (0,3 [ig) zwischen Eco RI und Pst I-Stellen gebunden. Die Transformation von E. coli 294 ergab 70 Tetracyclin-resi-65 stente Ampicillin-empfindliche Transformanten. Aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNA wurde mit Eco RI und Pst I verdaut. 16 der 18 Plasmide hatten ein Eco RI-Pst I-Fragment von 865 b.p. Länge. 1 jig von einem von die-

7

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sen, pLe-IF Al, wurde mit Eco RI verdaut und an ein 300 b.p. Eco RI-Fragment (0,1 (ig), das E. coli-trp-Promoter und trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle enthielt, hergestellt wie oben beschrieben, gebunden. Den trp-Promoter enthaltende Transformanten wurden mit einer 32p-trp-Sonde nach der Grun-stein-Hogness-Kolonie-Screening-Methode identifiziert -Grunstein et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. [USA] 72, 3961 [1975]). Eine asymmetrisch angeordnete Xba-I-Stelle im trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinanten, in denen der trp-Promoter in Richtung des Le-IF-A-Gens orientiert war.

Extrakte wurden für den IF-Assay wie folgt hergestellt: 1 ml-Kulturen wurden in L-Brühe mit 5 |ig/ml Tetracyclin zu einem Asso von etwa 1,0 gezüchtet, dann in 25 ml M9-Medien mit 5 [ig/ml Tetracyclin verdünnt. 10 ml-Proben wurden durch Zentrifugieren gewonnen, wenn Asso 1,0 erreichte, und Zellkuchen wurden in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 mmol. Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol. EDTA suspendiert. 1 mg Lyso-zym wurde zugesetzt, und nach 5 min bei 0 °C wurden die Zellen durch Beschallung aufgebrochen. Die Proben wurden 10 min bei 15 000 UpM in einem Sorvall-SM-24-Rotor zentri-fugiert. Die interferon-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten wurde durch Vergleich mit Le-IF-Standards mit Hilfe des Hemmtests des cytopathischen Effekts (CPE) bestimmt. Zur Bestimmung der Zahl der IF-Moleküle pro Zelle wurde eine Le-IF-spezifische Aktivität von 4 x 10s Einheiten/mg verwendet (Rubinstein et al., Proc. Nati. Acad. Sei. (USA) 76,640 [1979]).

Der Klon pLe-IF-A-trp 25, in den der trp-Promoter in der gewünschten Orientierung eingesetzt worden war, ergibt hohe Aktivitätswerte (sogar 2,5 x 108 Einheiten/1). Das von E. coli K-12-Stamm 294/pLe-IF A-trp 25 gebildete IF verhält sich wie authentisches Human-Le-IF; es ist gegenüber einer Behandlung bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-Anti-human-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein wahrnehmbares Molekulargewicht von etwa 20 000.

Die Isolierung von cDNAs für weitere Leukozyten-Interfe-rone

DNA aus dem vollständig charakterisierten LeIF A cDNA-haltigen Plasmid wurde mit Pst I herausgeschnitten, elektrophoretisch isoliert und nach einer veröffentlichten Arbeitsweise (Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta. 442,324 [1976]) mit 32p markiert. Die radioaktiv markierte DNA wurde als Sonde für das Screening weiterer E. coli 294-Transforman-ten durch ein In-situ-Kolonie-Testverfahren, Grunstein et al., wie oben, verwendet. Kolonien wurden isoliert, die mit der Sonde in unterschiedlichen Mengen hybridisierten. Plasmid-DNA aus diesen Kolonien und die oben erwähnten 10 hybridisierenden Kolonien wurden durch Herausschneiden mit Pst isoliert und nach drei verschiedenen Methoden charakterisiert. Zuerst wurden diese Pst-Fragmente durch ihre Restrik-tions-Endonuclease-Abbaumuster mit den Enzymen Bgl II, Pvu II und Eco RI charakterisiert. Diese Analyse erlaubte die Klassifizierung von wenigstens 8 verschiedenen Typen (LeIF A, Le-IF B, Le-IF C, Le-IF D, Le-IF E, Le-IF F, Le-IF G und Le-IF H), was der Lokation verschiedener Restriktionsschnitte relativ zu der derzeit bekannten Vorsequenz und Codiersequenz von Le-IF A nahekommt. Einer von diesen, Le-IF D, ist vermutlich identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284, 316 (1980), beschriebenen.

Sodann wurden bestimmte der DNAs nach einem veröffentlichten Hybridisierungs-Auswahltest, Cleveland et al.,

Cell 20,95 (1980), auf ihr Vermögen zur selektiven Entfernung von Le-IF mRNA aus Poly-A-haltiger KG-l-Zell-RNA getestet. Bei diesem Test waren Le-IF A, B, C und F positiv. Drittens wurden die letzteren Pst-Fragmente in ein Expressionsplasmid insertiert, E. coli 294 mit dem Plasmid expri-miert und die Fragmente ausgedrückt. Die Expressionsprodukte, vermutlich Vor-Interferone, waren alle positiv beim CPE-Test auf Interferon-Aktivität, wenngleich nur am Rande aktiv im Falle des Le-IF-F-Fragments. Ausserdem wurden alle beschriebenen Le-IF-Typen in Sequenzen aufgeteilt.

Zweites reifes Leukozyten-Interferon

Die Sequenz des isolierten Fragments mit dem Gen für reifes Le-IF-B zeigt, dass die ersten 14 Nucleotide der Typen A und B identisch sind. Wir schlugen daher vor, ein Fragment aus pLe-IF A 25 zu isolieren, das den trp-Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle und den Beginn des Le-IF (A= B)-Gens trägt, und dieses mit dem übrigen Teil der B-Sequenz in einem Expressionsplasmid zu kombinieren.

Um das etwa 950 b.p. Sau 3-Pst I-Fragment aus der in Fig. 7a dargestellten Sequenz zu erhalten, waren mehrere Schritte nötig aufgrund des Vorliegens einer oder mehrerer störender Sau 3a-Restriktionsstellen, d.h.:

1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert:

a) 110 b.p. aus Sau 3a-Eco RI;

b) 132 b.p. aus Eco RI-Xba;

c) über 700 b.p. aus XBa-Pst.

2. Die Fragmente (la) und (lb) wurden gebunden und mit Xba und Bgl II geschnitten, um Selbstpolymerisation durch Sau 3a und Xba-Endstellen auszuschliessen (die relevante Sau 3a-Stelle war innerhalb einer Bgl Il-Steüe; Bgl II-Schnitte hinterlassen ein Sau 3a-kohäsives Ende). Ein 242 b.p.-Fragment wurde isoliert!

3. Die Produkte von (2) und (lc) wurden verbunden und mit Pst I und Bgl II geschnitten, wiederum, um Selbtspolyme-risation zu verhindern. Ein Fragment von etwa 950 b.p.,

Sau 3a-Pst I, wurde isoliert. Dieses Fragment umfasste den Teil des Le-IF-B-Gens, den Le-IF A nicht hatte.

4. Ein etwa 300 b.p.-Fragment (Hind Iii-Sau 3a) mit trp-Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle, ATG-Startsignal und Cysteincodon von Le-IF A wurde aus pLe-IF A 25 isoliert.

5. Ein etwa 3600 b.p.-Fragment Pst I-Hind III wurde aus pBr 322 isoliert. Dies umfasste das Replikon und codierte die Tetracylin-, nicht aber Ampicillin-Resistenz.

6. Die in den Stufen 3, 4 und 5 erhaltenen Fragmente wurden dreifach verbunden und mit diesem Plasmid E.

coli K-12-Stamm 294 transformiert.

Kleine Mengen Transformanten wurden minigetestet, Birnboim et al., Nucleic Acid Research 7, 1513 (1979), und Plasmid-Proben wurden mit Eco RI verdaut. Das verdaute Material lieferte 3 Fragmente, charakteristisch für

1. das Eco-RI-Eco RI-trp-Promoter-Fragment; 2. das innere Eco Ri Eco RI-Fragment von pL4; und 3. das Fragment vom Protein-Translations-Startsignal bis zur Eco RI-Spaltstelle von pL4.

Beim CPE-Test ergeben bakterielle Extrakte von Klonen, hergestellt in der obigen Weise, typischerweise Testwerte von etwa 10 x 106 Einheiten Interferon-Aktivität pro 1 bei Asso= 1. Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist 294/pLIF B trp 7.

Weitere reife Leukozyten-Interferone

Weitere Gen-Fragmente voller Länge, die andere Le-IF-Typen haben, können massgeschneidert und in Expressionsträger zur Expression, wie im Falle von Le-IF A, gebracht werden. Vollständige Sequenzaufklärung nach herkömmlichen Massnahmen wird zeigen, ob eine Restriktionsstelle nahe genug dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interferon-Typs liegt, um eine bequeme Zuflucht zu der Lösung zu ermöglichen, die Beseitigung der Vorsequenz durch Restriktionsschnitt und Ersatz der Codons aminoendständig zusammen mit der Vorsequenz verlorengegangenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNA-Fragments, wie oben beschrieben, anzuwenden. Geht dies nicht, kann die

5

10

15

20

25

30

35

40

45

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55

60

65

663 032

8

oben beschriebene Arbeitsweise von Kleid et al. angewandt werden. Kurz zusammengefasst gehört hierzu die Spaltung des die Vorsequenz enthaltenden Fragments genau vor dem Punkt, an dem der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar durch 5

1. Umwandeln der doppelsträngigen DNA in Einzelstrang-DNA in einem Bereich um diesen Punkt herum;

2. Hybridisieren des in Stufe 1 gebildeten Einzelstrang-Bereichs mit einer komplementären Starter-Sequenz von Einzelstrang-DNA, wobei das 5'-Ende des Starters dem Nude- io toid gegenüberliegt, das an die beabsichtigte Spaltungsstelle grenzt;

3. Wiederherstellung des Teils des zweiten Stranges, in Stufe 1 eliminiert, der in 3'-Richtung des Starters liegt, durch Reaktion mit DNA-Polymerase in Gegenwart von Adenin, is Thymin, Guanin und Cytosin enthaltenden Desoxynucleotid-triphosphaten und

4. Abbauen der verbleibenden Einzelstranglänge der DNA, die über den gewünschten Spaltungspunkt hinwegreicht. 20

Ein kurzes Stück synthetischer DNA, das am 3'-Ende des codierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann, z.B. durch Verbinden mit dem stumpfen Ende, an das anfallende massgeschneiderte Gen für die reifen Interferone gebunden werden, und das Gen in ein Exprès- 25 sionsplasmid eingesetzt und unter die Kontrolle eines Promoters und die zugehörige Ribosomen-Bindestelle gebracht werden.

Ähnlich wie oben wurden Genfragmente mit Codierung für Le-IF-C und Le-IF-D in geeigneter Weise für direkte bak- 30 terielle Expression aufgebaut. Die Expressionsstrategie für diese zusätzlichen Leukozyten-Interferone beinhaltete in jedem Falle den Rückgriff auf das ewa 300 b.p.-Fragment (Hind Iii-Sau 3a) mit dem trp-Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle, ATG-Startsignal und Cysteincodon von Le- 35 IF A von pLe-IF A25. Hiermit wurden Genfragmente aus weiteren Interferongenen kombiniert, die ihre jeweiligen Äminosäure-Sequenzen über das allen gemeine anfängliche Cystein hinaus codieren. Jedes anfallende Plasmid wurde zur Trànsformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet. Bin- 40 düngen zur Bildung der jeweiligen Gene waren wie folgt;

Le IF-C

Man isoliert die folgenden Fragmente aus pLe IF-C:

a) 35 b.p. von Sau 3a bis Sau 96 45

b) 900 b.p. Sau 96 bis Pst I

. ç) Man isoliert ein etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III-Sau 3a) âùs pLe IF A-25 wie in Teil N (4) oben.

d) Man isoliert das etwa 3600 b.p.-Fragment von Teil N (5) oben.

50

Konstruktion

1. Man verknüpft (a) und (c). Man spaltet mit Bgl II,

Hind III und isoliert das Produkt von etwa 335 b.p. (Basenpaaren).

2. Dreifachverkriüpfung von 1 + (b) + (d) und Transfor- 55 mieren von E. coli mit dem erhaltenen Plasmid.

Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLe IF C trp 35.

Le-IF D so

Man isoliert aus pLe IF-D:

a) 35 b.p. von Sau 3a bis Ava II

b) 150 b.p. von Ava II bis Bgl II

c) ca. 700 b.p. von Bgl II bis Pst I

Man isoliert aus pLe IF A25 : es d) 300 b.p. von Hind III bis Sau 3a

Man isoliert aus PBr 322:

e) etwa 3600 b.p. von Hind III bis Pst I

Konstruktion

1. Man verknüpft (a) + (b), spaltet mit Bgl II und reinigt: 185 b.p.-Produkt (1).

2. Man verknüpft 1)4- (d), spaltet mit Hind III, Bgl II und reinigt das ca. 500 b.p.-Produkt (2).

3. Man verbindet (2) + (c) + (e) und transformiert E. coli mit dem anfallenden Plasmid.

Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.

Le-IF F

Das Le-IF F enthaltende Fragment kann zur direkten Expression durch Wiederzusammensetzen zurechtgeschnitten werden, bequem gemacht durch die vollständige Homologie von Aminosäuen 1-13 von Le-IF B und Le-IF F. Ein trp-Pro-moter-haltiges Fragment (a) mit geeignet konfigurierten Enden wird aus pHGH 207, oben beschrieben, über Pst I und Xba I-Behandlung mit anschliessender Isolierung des ca. 1050 b.p.-Fragments erhalten. Ein zweites Fragment (b) wird als grösseres der Fragmente aus dem Pst I- und Bgl II-Äbbau des Plasmids pHky 10 erhalten, ein Derivat von pBR322, das eine Bgl Il-Stelle zwischen dem Tetracyclinresistenten Promoter und dem Strukturgen enthält. Fragment (a) enthält etwa die Hälfte des die Ampicillin-Resistenz codierenden Gens ; Fragment (b) enthält den Rest jenes Gens und das gesamte Gen für die Tetracyclin-Resistenz, ausgenommen den zugehörigen Promoter. Die Fragmente (a) und (b) werden über T4-Ligase kombiniert und das Produkt mit Xba I und Bgl II behandelt, um Dimerisierung zu beseitigen, was zu einem Fragment (c) mit dem trp-Promoter-Operator und Genen für Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz führt.

Ein Fragment (d) von etwa 580 b.p. wird über Ava II und Bgl II-Abbau von pLe IF-F erhalten. Es weist Codons für Aminosäuren 14-166 von Le-IF F auf.

Ein Fragment (e) (49 b.p.) wird durch Xba I und Ava II-Abbau von pLe-IF B erhalten. Fragment (e) codiert die Aminosäuren 1-13 von Le-IF F.

Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4-Ligase dreifach verbunden. Die aneinanderhängenden Enden der jeweiligen Fragmente sind so, dass das zusammengesetzte Plasmid korrekt gebildet wird, wobei das Tetracyclin-Resistenz-Gen unter die Kontrolle des trp-Promoter-Opera-tors zusammen mit dem Gen für reifes Le-IF F gebracht wird, so dass mit dem gewünschten Plasmid transformierte Bakterien auf Tetracyclin-haltigen Platten ausgewählt werden können. Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLelF F trp 1.

Le-IF-H

Das vollständige Le-IF H-Gen kann wie folgt zur Expression als ausgereiftes Leukozyten-Interferon konfiguriert werden:

1. Plasmid-pLe-IF-H wird dem Hae II- und Rsa I-Abbau Isolierung des 816-Basenpaar-Fragments, das von der Signal-peptid-Aminosäure 10 bis zum 3'-nichtcodierenden Bereich reicht, unterworfen.

2. Das Fragment wird denaturiert und der Reparatursynthese mit Klenow-Fragment unterworfen, Klenow et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 65,168 (1970), wobei das synthetische Desoxyribooligonucleotid-Starter 5'-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird. Diese allgemeine Arbeitsweise wird auch von Goeddel et al., US-SN 190 799 (25.9.1980), beschrieben.

3. Das anfallende Produkt wird mit Sau 3a gespalten, und ein 452-Basenpaar («bp»)-Fragment, das die Aminosäuren 1-150 darstellt, wird isoliert.

4. Sau 3a- und Pst I-Abbau von pLelF H und Isolierung des anfallenden 500 b.p.-Fragments liefert ein Gen, das die

9

663 032

Aminosäuren 150 bis zum Ende der codierenden Sequenz codiert.

5. Die in den Stufen (3) und (4) isolierten Fragmente werden zum folgenden Fragment miteinander verknüpft:

• 1 166 met cys asp Stop AT G TGT . . j . . . GAT TGA Pst I

Sau 3a das die 166 Aminosäuren von Le-IF H codiert.

6. pLelF A trp 25 wird mit Xba I aufgeschlossen, mit DNA-Polymerase I mit stumpfem Ende versehen und das Produkt mit Pst I abgebaut. Das grosse anfallende Fragment kann mit dem Produkt der Stufe (5) zu einem Expressionsplasmid verknüpft werden, das nach Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 oder anderen Wirtsbakterien reifes LeIF H zu exprimieren vermag.

LeIF-I

Die von Lawn et al., Cell 15,1157 (1978), konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen X Cha-ron 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen durch von Lawn et al., oben, und Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978), beschriebenen Arbeitsweisen durchsucht. Eine radioaktive LelF-Sonde, aus der cDNA, Klon LeIF A, stammend (Goeddel et al., Nature 287, 411 [1980]), wurde verwendet, um etwa 500 000 Plaques zu prüfen. Dabei wurden 6 LelF-Genom-Klone erhalten. Nach erneutem Screening und Plaque-Reini-gung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, zur weiteren Analyse ausgewählt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren können weitere Sonden vorteilhaft zur Isolierung zusätzlicher LelF-Klone aus dem Human-Genom verwendet werden. Diese wiederum können zur Herstellung weiterer Leukozyten-Interferon-Proteine gemäss der Erfindung eingesetzt werden.

1. Das 2000 Basenpaar-Eco RI-Fragment des Genom-Klons (X HLeIF2) wurde an der Eco Rl-Stelle in pBR325 nochmals kloniert. Das anfallende Plasmid LeIF I wurde mit Eco RI gespalten und das 2000 Basenpaar-Fragment isoliert.

5 Das Desoxyoligonucleotid dAATTCTGCAG (ein Eco RI > Pst I-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaar-Exo RI-Fragment geknüpft und das anfallende Produkt mit Pst I zu einem 2000 Basenpaar-Fragment mit Pst I-Enden gespalten. Dies wurde mit Sau 96 gespalten und ein 1100 io Basenpaar-Fragment isoliert, das ein Pst I-Ende und ein Sau 96-Ende aufweist.

2. Das Plasmid pLelF C trp 35 wurde mit Pst I und Xba I abgebaut. Das grosse Fragment wurde isoliert.

3. Das kleine Xba I-Pst I-Fragment von pLelF C trp 35 15 wurde mit Xba I und Sau 96 abgebaut. Ein 40 Basenpaar-

Xba I-Sau 96-Fragment wurde isoliert.

4. Die in den Stufen 1, 2 und 3 isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLelF I trp 1 verknüpft.

so LeIF-J

1. Das Plasmid pLelF J enthält ein 3800-Basen-Hind III-Fragment von Humangenom-DNA, das die LelF J-Gen-Sequenz aufweist. Ein 760 Basenpaar-Dde I-Rsa-I-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert.

25 2. Das Plasmid pLelF B trp 7 wurde mit Hind III und Dde I gespalten und ein 340 bP Hind III-Dde I-Fragment isoliert.

3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pst I gespalten, erhielt durch Inkubation mit DNA Pol I (Klenow-Fragment) ein

30 stumpfes Ende, wurde dann mit Hind III verdaut. Das grosse (ca. 3600 bp) Fragment wurde isoliert.

4. Die in den Stufen 1, 2 und 3 isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLelF J trp 1 verknüpft.

Die bei den folgenden Aufbauvorgängen eingesetzten 35 Methoden und Materialien waren wie in der obigen Beschreibung. Die folgende Tabelle 1 liefert die Einzelheiten für den speziellen Zusammenbau von Hybrid-LelF-Plasmiden:

Tabelle 1

LelF Amino- Exprès- Vorderteil Hinterteil anfallendes

Hybrid säuren sions- Fragment Amino- Fragment Amino- Expressions-

ins- Plasmid säuren säuren Plasmid gesamt* (Vektor)

AD 165 a DA 166 a AD 165

DA

166

AB

165

a

AF

165

a

AG

165

a

AI

165

a

Xba I-Pvu II von pLelF A trp 25 (285 bp) Xba I-Pvu II von pLelF D trp 11 (288 bp) Bgl II-Pst I grosses Fragment v. pLelF A trp 25

Bgl II-Pst I grosses Fragment pLelF D trp 11

Xba I-Pvu II v. LeIF A

trp 25 (285 bp)

Xba I-Pvu II v. LeIF A

trp 25 (285 bp)

Xba I-Pvu II v. LeIF A

trp 25 (285 bp)

Xba I-Bgl II partial von pLelF Atrp 25 (~ 455

bp)

1-91 Pvu II-Pst I von pLelF D

trp 11 (~ 550 bp) 1-92 Pvu II-Pst I von pLelF A

trp 25 ( ~ 550 bp) 1-62 Bgl II-Pst I von pLelF D trp 11 ( — 600 bp)

1-63 Bgl II partial-Pst I v. pLelF Atrp 25 ( — 700 bp)

1-91 Pvu II partial-Pst I von pLelF B trp 7 ( ~ 750 bp) 1-91 Pvu II Pst I von pLelF F

trp 1 (-700 bp) 1-91 Pvu II-Pst I von pLelF G

(-750 bp)

1-150 Bgl II-Pst I von LeIF I trp 1 (~ 650 bp)

93-

166

pLelF AD

trp (Pvu II)

92-

165

pLelF DA

trp (Pvu II)

64-

166

pLelF AD

trp (Bgl II)

63-

-165

pLelF DA

trp (Bgl II)

93-

166

pLelF AB trp

(Pvu II)

93-

■166

pLelF AF trp

(Pvu II)

93-

-166

pLelF AG trp

(Pvu II)

151

-165

pLelF AI trp

(Bgl II)

* ohne N-endständiges Methionin a grosses (ca. 3900 bp) Fragment von Xbal bis Pstl-Verdauung von pLelF A trp 25.

663 032

10

LeIF Amino- Exprès- Vorderteil Hinterteil anfallendes

Hybrid säuren sions- Fragment Amino- Fragment Amino- Expressions-

ins- Plasmid säuren säuren Plasmid gesamt* (Vektor)

BA

166

b

Hind III-Pvu II v. pLelF B trp 7 (-630 bp)

BD

166

b

Hind III-Pvu II v. pLelF B trp 7 (-630 bp)

BF

166

b

Hind III-Pvu II v. pLelF B trp 7 (—630 bp)

BG

166

b

Hind III-Pvu II v. pLelF B trp 7 (-630 bp)

DB

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D trp 11 (288 bp)

DF

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D trp 11 (288 bp)

DG

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D trp 11 (288 bp)

FA

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

FB

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

FD

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

FG

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

IA

166

a

Xba I-Bgl II von pLelF I trp 1 (-458 bp)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF A

92-

-165

pLelF BA trp

trp 25 (-550 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF D

93-

-166

pLelF BD trp

trp 11 (—550 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I vön pLelF F

93-

-166

pLelF BF trp

trp 1 (—700 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF G

93-

-166

pLelF BG trp

(-750 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II partial-Pst I von

93-

-166

pLelF DB trp

pLelF B trp 7 (-750 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF F

93-

-166

pLelF DF trp

trp 1 (-700 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF G

93-

-166

pLelF DG trp

(-750 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF A

92-

-165

pLelF FA trp

trp 25 (-550 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II partial-Pst I von

93-

-166

pLelF FB trp

pLelF B trp 7 (-750 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF D

93-

-166

pLelF FD trp

trp 11 ( — 550 bp)

(Pvu II)

-92

Pvu II-Pst I von pLelF G

93-

-166

pLelF FG trp

(-750 bp)

(Pvu II)

-151

Bgl II-Pst I v. pLelF A trp

152-166 pLelF IA trp

25 (-430 bp)

(Bgl II)

* ohne N-endständiges Methionin a grosses (ca. 3900 bp) Fragment von Xbal bis Pstl-Verdauung von pLelF A trp 25. b grosses (ca. 3600 bp) Fragment von Hind III bis Pstl-Verdauung von pBR322.

Unter weiterer Bezugnahme auf Tabelle 1 wurden die ersten vier beschriebenen Hybrid-LelFs aus zwei Lelf-Expressions-Plasmiden hergestellt. Eine Bgl Ii-Stelle, wie sie LelF A und D cDNAs gemein ist, wurde zum Aufbau eines Expressions-Plasmids pLelF trp AD (Bgl II) verwendet, was die 63 in Aminogruppen endenden Aminosäuren von LeIF A und die 102 als Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von LeIF D codiert. Die gleiche Stelle wurde beim Aufbau eines Expressions-Plasmids pLelF trp DA (Bgl II) verwendet, das 64 in Aminogruppen endende Aminosäuren von LeIF D und 102 in Carboxylgruppen endende Aminosäuren von LeIF A codiert. Die Pvu Ii-Stelle ist beim Aufbau der beiden anderen Hybrid-Interferon-Expressions-Plasmide verwendet worden: 91 in Aminogruppen endende Aminosäuren von A mit 74 in Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von D (pLelF trp AD [Pvu II]) und 92 in Aminogruppen endende Aminosäuren von LeIF D mit 74 in Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von LeIF A (pLelF trp DA [Pvu II]). Zusammengefasst :

pLelF AD trp (PvuII): Das grosse (ca. 3900 bp) Fragment eines Xba I- und Pst I-Abbaus von pLelF A trp 25 wurde mit einem 285 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF A trp 25 und einem ca. 550 bP Pvu II-Pst I-Fragment von pLelF D trp 11 verknüpft:

pLelF DA trp (Pvu II): Das grosse (ca. 3900 bp) Fragment von einem Xba I- und Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem 288 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF D trp 11 und einem ca. 550 bp Pvu II-Pst I-Fragment von pLelF A trp 25 verknüpft;

pLelF AD trp (Bgl II): Das grosse Fragment von einem Bgl II-, Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem ca. 600 bp Bgl II-Pst I-Fragment von pLelF D trp 11 verknüpft; und pLelF DA trp (Bgl II): Das grosse Fragment von einem Bgl II-, und Pst I-Abbau von pLelF D trp 11 wurde mit einem ca. 700 bp-Fragment, erhalten durch Pst I-Spaltung von pLelF A trp 25 und nachfolgende Bgl Ii-Verdauung, verknüpft.

Beim 5. angegebenen Hybrid:

pLelF AB trp (Pvu II) : Da sgrosse (ca. 3900 bp) Fragment von einem Xba I und Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem 285 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF A trp 25 und einem ca. 750 bp Pvu II-(partial)-Pst I-Fragment von pLelF B trp 7 verknüpft.

55 Ähnlich sind die anderen in Tabelle 1 wiedergegebenen Zusammensetzungen festgelegt. Als weiteres Beispiel kann man beim Aufbau eines LeIF C und/oder LelF H-Teil enthaltenden Hybrids Vorteil ziehen aus gemeinsamen Bbv I-Stellen, die etwa beim Nucleotid 294 (d.h. GCTGC) der 60 Gen-Sequenzen auftreten.

Ähnlich können Plasmide, die sich zur mikrobiellen Expression anderer neuer Hybrid-Leukozyten-Interferone eignen, durch geeignete Manipulation der alle oder Teile der Aminosäuresequenzen natürlich auftretender Leukozyten-65 Interferone codierenden Doppelstrang-DNA gebildet werden. So wird ein erstes Doppelstrang-DNA-Fragment gewählt, das das Aminoende einer ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferon-Aminosäuresequenz und, in

45

11

663 032

3'-Richtung fortschreitend, einen erheblichen Teil der Aminosäuresequenz codiert. Das Fragment weist eine Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle nahe den Codons für die Aminosäure «n» des ersten Leukozyten-Interferons auf, wobei n Aminosäuren einen erheblichen Teil der Aminosäuresequenz des ersten Interferons bilden. Die Spaltung mit der Restriktions-Endonuclease liefert ein Fragment mit dem Aminoende des ersten Interferons und Codons für etwa n Aminosäuren. Ein zweites Fragment mit allen oder einem Teil der Codons für die Aminosäure-Sequenz eines zweiten, anderen Leukozy-ten-Interferons wird gewählt, wobei das Fragment eine Spaltstelle für eine identische Restriktions-Endonuclease nahe Codons für jene Aminosäure des zweiten Interferons aufweist, deren Aminosäurezahl (vom Aminoende des zweiten Interferons fortschreitend) etwa 166-n ist. Die Spaltung des zweiten Fragments mit der Restriktions-Endonuclease liefert ein Produkt komplementär zu dem «n»-Endteil des Verdauungsprodukts des ersten Fragments, so dass das Verdauungsprodukt des zweiten mit dem des ersten verknüpft werden kann, unter Rückbildung der Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstelle und erneuter Bildung des Codons für die Aminosäure n des ersten Interferons, sofern bei der ersten Verdauung verlorengegangen. Das Produkt der Restriktions-Endonuclease-Verdauung des zweiten Fragments läuft vorzugsweise von dem Ende aus ab, das bei der Spaltung in 3'-Stellung durch Nucleotide anfällt, die das Carboxylende des zweiten Leukozyten-Interferons codieren.

Andererseits können Hybride, die erhebliche Teile der Aminosäure-Sequenzen von mehr als zwei natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferonen enthalten, gebildet werden, wobei dann z.B. das oben erwähnte zweite Fragment ausserdem dazu ausgewählt wird, eine zweite Restriktions-Endonu-clease-Stelle hinter der ersten zu enthalten, wobei die zweite Stelle identisch einer ähnlich gelagerten Stelle innerhalb eines Fragments ist, das das Carboxyl-Endteil eines dritten Leukozyten-Interferons codiert usw. In dem genannten Beispiel können die Produkte der aufeinanderfolgenden Restriktions-Endonuclease-Einsätze dreifach verknüpft werden, um ein Hybridgen zu bilden, das den Amino-Endgruppenteil eines ersten Interferons, den Mittelbereich der Aminosäuresequenz des zweiten und den Carboxyl-Endteil des dritten codiert (oder einer weiteren Variante des ersten, wobei das erste und das dritte Interferon gleich sind).

Vorzugsweise leitet sich das erste oben erwähnte Fragment von einem Expressions-Plasmid ab, d.h. einem solchen, bei dem Codons für den Amino-Endteil des ersten Leukozyten-Interferons als Vorgänger ein ATG- oer anderes Transla-tions-Initiations-Codon und einen Promoter oder Promoter-Operator-System haben. Im Ergebnis wird das Endprodukt der oben beschriebenen Manipulationen ein Plasmid sein, das das vom Hybridgen in Bakterien oder anderen mikrobiel-len, mit den Plasmid transformierten Organismen codierte Polypeptid zu exprimieren vermag. Weitere Massnahmen zur Gestaltung des Hybridgens für mikrobielle Expression liegen für den Fachmann auf der Hand.

Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung codieren die Hybridgene eine neue Leukozyten-Interferon-Aminosäure-Sequenz von etwa 165 bis 166 Aminosäuren, ein Konjugat wesentlicher Aminosäure-Sequenzen von zwei oder mehr verschiedenen Leukozyten-Interferonen darstellend, ausgewählt unter LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G und LeIF H, wie in Fig. 3a und 3b dargestellt. Am meisten bevorzugt weisen die neuen, von den Hybridgenen codierten Leukozyten-Interferone die genannten und wie in der Sequenz «alle» der Fig. 3a und 3b angegeben angeordneten Aminosäuren auf. Die Expressionsprodukte von Plasmiden, erfindungsgemäss hergestellt, können in herkömmlicher Weise auf antivirale Aktivität getestet werden, wie in den nachfolgend beschriebenen biologischen Aktivitätsbestimmungen.

Nachweis der antiviralen Aktivität

E. coli K-12 Stamm 294 wurden in herkömmlicher Weise unabhängig mit den Plasmiden pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF trp A/D (Bgl II) und pLelF trp D/A (Bgl II) transformiert. Die Transformanten wurden getrennt in 5 ml-Kulturen in L-Brühe mit 5 mg/ml Tetracyclin zu einem Assi/- Wert von 1,0 gezüchtet, dann in 1 1 M9-Medium mit 5 ,ug/ml Tetracyclin verdünnt. Die Zellen wurden geerntet, wenn Asso 1,0 erreichte, und die Zellen in 10 ml 15%iger Saccharose, 50 mmol. Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol. EDTA suspendiert. 10 mg Lysozym wurden zugesetzt, und nach 5 min bei 0 °C wurden die Zellen durch Schalleinwirkung aufgebrochen. Die Proben wurden 10 min bei 15 000 UpM in einem Sorvall-SM-24-Rotor zentrrfugiert. Die Interferon-Aktivität der überstehenden Flüssigkeiten wurde auf antivirale Aktivität getestet.

Die Ausbeuten pro 1 Kultur dieser Interferone, an einem menschlichen Zellstramm (Wish) titriert, sind in Tabelle 2 gezeigt, aus der klar wird, dass die LelF-A/D-Aktivität in grösserem Masse hervorgerufen wird als die anderer Interferone. Diesr Unterschied könnte auf der grösseren vorgegebenen Aktivität des LeIF-A/D- oder auf grösserer Ausbeute, ausgedrückt in mg Protein dieses Interferons, beruhen. Da die genetische Verbindung fr alle diese Interferone identisch war, erscheint es am wahrscheinlichsten, dass LelF-A/D praktisch eine grössere Aktivität als die anderen Interferone besitzt.

Tabelle 2

Ausbeute an Leukozyten-Interferonen aus Schüttelkolbenkulturen von E. coli

Art des Interferons Aktivität, Ausbeute/1

(Einheiten an Wish)*

A 8 X IO7

D 5 x IO6

AD (Bgl II) 2 x IO8

DA (Bgl II) 1 x 10"

* getestet durch Hemmung des cytopathischen Effekts an Wish-Zellen mit VSV als Testsubstanz

Die Wirksamkeit der verschiedenen Interferone in einer Reihe von Säugetier-Zellstämmen wurde bestimmt (vom Menschen Wish; von der afrikanischen grünen Meerkatze Vero; Hamster-Fibroblast BHK; Nierenzellen vom Kaninchen, RK-13; Maus L-929; und Rinderniere, MDBK-Zellen). Um die relative Aktivität der Interferone zu vergleichen, wurde ihre Aktivität an verschiedenen Zellen, relativ zu ihrer Aktivität an Wish-Zellen als 100 angesetzt, berechnet. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, das LeIF-A/D eine sehr hohe Aktivität in VERO und L-929-Zellen hat, während LeIF-D/A eine geringe Aktivität in diesen Zellstämmen hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kombination des N-Endteils von LeIF-A und des C-Endteils von LeIF-D innerhalb eines Moleküls (LeIF-A/D) zu der besonderen Wirksamkeit des Hybrid-Proteins beiträgt, die in verschiedenen Säugetierarten ihren Ausdruck findet. Weiter sind diese Eigenschaften nicht eine einfache Summierung der Eigenschaften der Ausgangs-Interferone. Dies zeigt sich deutlich im Fall der Aktivität an L-929-Zellen (Tabelle 3), inweichem Falle weder ein Gemisch aus LeIF-A und LeIF-D noch das andere Hybrid, LeIF-D/A, eine erhebliche Aktivität aufweist.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

663 032

Tabelle 3

Titration verschiedener Leukozyten-Interferone in Zellstämmen aus verschiedenen Säugetierarten

Leukozyten-Interferone*

Zellstamm A D A/D D/A A+D Leukozytenfilm in zentrifugiertem Blut

WISH

100

100

100

100

100

100

VERO

250

75

1670

20

200

200

BHK

400

200

833

2000

400

20

RK-13

12

500

6

N.D.

N.D.

120

L-929

150

5

3300

2

10

0,1

* Interferone, getestet gegen VSV-Infektion der verschiedenen Zellstämme. Aktivitäten ausgedrückt als Prozentsatz der in WISH-Zellen beobachteten Aktivität.

Die Aktivität von LeIF-A/D gegen andere Viren wurde auch untersucht. Die Daten in Fig. 5 zeigen antivirale Effekte gegenüber EMC-Virusinfektion von L-Zellen, und die Daten in Fig. 6 zeigen Effekte gegenüber VSV-Infektion von L-Zel-len. Aus diesen Daten wird klar, dass die grössere Aktivität von LeIF-A/D nicht auf ein Virus (VSV) beschränkt ist und die grössere Aktivität offenbar eine allgemeine Eigenschaft gegenüber vielen Viren ist. Natürliche Human-Leukozyten-film-Interferon-Präparate haben keine Wirkung gegenüber Mauszellen (siehe Tabelle 2). Die Aktivität von LeIF-A/D gegen EMC-Virusinfektion von CD-1-Mäusen wurde daher untersucht. Die Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, das LeIF-A/D extrem wirksam ist gegenüber letaler EMC-Virusinfektion und LeIF-A auch antivirale Aktivität hat, wie von der Aktivität in Zellstämmen (Tabelle 2) zu erwarten ist. Die Daten in Fig. 7 stammen aus Behandlungen i.p. 3 h vor der Infektion. Die Dosen an LeIF-A/D und LeIF-A sind wie an WISH titriert.

Letale EMC-Virusinfektion von Hamstern wird auch durch LeIF-A/D und LeIF-A (Fig. 8) beeinträchtigt, wobei ersteres das Wirksamste ist, und Leukozytenfilm-Interferon zeigt nur einen kleinen und statistisch insignifikanten Effekt. Im Falle von Fig. 8 wurden alle Interferone i.p. 3 h vor der Infektion in einer Dosis von 5 x 105 ug/kg, titriert an WISH-Zellen, gegeben.

Diese Ergebnisse zeigen an, dass die ausgeprägten antiviralen Effekte von LeIF-A/D bei einer Reihe von Säugetierarten nicht auf Zellkulturen beschränkt sind, sondern auch bei letalen Virusinfektionen beobachtet werden.

EMC-Virus kann als Modellsystem angesehen werden, wobei eine Demonstration der antiviralen Wirkung gegen dieses System eine Voraussage der antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie ermöglichen mag, z.B. die Picor-navirus-Familie, für die Maul- und Klauenseuche und Polio Vertreter sind. VSV-Virus kann als Modellsysem betrachtet werden, und eine Demonstration der antiviralen Wirkung gegen dieses mag eine Voraussage zur antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie gestatten, z.B. die Rhabdo-virus-Familie, deren wichtiger Vertreter Rabies ist.

Tabelle 4 enthält eine Zusammenstellung der Aktivitäten verschiedener LelF-Hybride an WISH- und MDBK-Zellen und deren Aktivitätsverhältnisse:

12

Tabelle 4

LelF Hbrid

Einheiten/1

Einheiten/1

Aktivitäts

(PvuII)

Kultur

Kultur verhältnis

WISH-Zellen

MDBK-Zellen

WISH/MDB

AB

2,4 Xl08

4x 107

6

AD

1,2 xlO8

2 xlO7

6

AF

6x 107

lxlO7

6

AG

4xl07

1,5 xlO7

2,7

AI

3,2 xlO7

1,2 xlO7

2,7

BA

1,5 xlO7

lxlO7

1,5

BD

6 xlO7

1,5 x 107

4

BF

1 x 106

3,5 x 105

0,3

BG

2 xlO7

6 xlO7

0,3

DA

3x10«

1,2 xlO8

0,025

DB

2x10«

5 xlO7

0,04

DF

2 xlO5

4x10«

0,05

DG

2xl05

1,5 xlO7

0,014

FA

2 xlO5

6xl07

0,003

FB

2x10«

8 x 107

0,025

FD

lxlO7

2xl07

0,5

FG

1 x 106

4 xlO7

0,025

IA

2,4 xlO6

6x 107

0,04

A*

8 xlO7

1,2 xlO8

0,7

B*

8 xlO7

4 xlO8

0,2

c*

2 xlO7

1,5 xlO7

1,3

D*

5x10«

2,5 xlO7

0,2

p*

2 xlO7

2 xlO8

0,1

I*

1,6 xlO7

1,2 xlO7

1,3

* Zu Vergleichszwecken

Parenterale Verabreichung 35 Die Hybrid-Leukozyten-Interferone können Personen, die Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen, und solchen, die immunsuppressive Bedingungen zeigen, parenteral verabreicht werden. Dosierung und Dosisrate können denen gleichen, die derzeit bei klinischen Untersuchungen von aus 40 Menschen stammenden Matrialien angewandt werden, z.B. etwa (1 bis 10) x 106 Einheiten täglich, und im Falle von Materialien grösserer Reinheit als 1%, ohne weiteres bis zu beispielsweise 5 x 107 Einheiten täglich. Vorläufige Hinweise bei der oben beschriebenen Affenuntersuchung lassen vermu-45 ten, das Dosierungen von bakteriell erhaltenem Le-IF zwecks grösserer Wirkung erheblich erhöht werden könnten, dank dem praktischen Fehlen von anderen menschlichen Proteinen als Le-IF, die in aus Leukozyten stammenden Materialien als Fieber erzeugende Stoffe wirken können und dabei nachtei-50 lige Effekte, z.B. Unwohlsein, Temperaturerhöhung usw., zeigen.

Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform für im wesentlichen homogenes bakterielles Le-IF in parenteraler Form, hier mit den nötigen Änderungen anzuwenden, können 55 3 mg Le-IF der spezifischen Aktivität von z.B. 2 x IO8 E/mg in 25 ml 5 n Serumalbumin (human) - USP gelöst werden, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter geführt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen unterteilt werden, von denen diese 6 x 10ö Einheiten reines Interferon, für 60 parenterale Verabreichung geeignet, enthält. Die Ampullen werden vor ihrer Verwendung vorzugswseise in der Kälte ( — 20 ° C) gelagert.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können nach bekannten Methoden zur Herstellung pharmazeutisch 65 brauchbarer Mittel zusammengestellt werden, wodurch das Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zusammengemischt Wird. Geeignete Träger und deren

Zusammenstellung sind in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben, dessen Offenbarung durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Solche Mittel enthalten eine wirksame

13 663 032

Menge des Interferon-Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Tägers zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Mittel, die sich zur wirksamen Verabreichung eignen.

G

7 Blatt Zeichnungen

Claims (19)

1. 663 032

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Doppelsträngige DNA mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon mit 165 bis 166 Aminosäuren, in einer Sequenz, die bezüglich Aminosäureidentität und -zahl aus Untersequenzen verschiedener natürlich vorkommender Human-Leukozyten-Interferone besteht, wobei die Aminosäuresequenz dieser Interferone in der Gesamtzusammensetzung von der Aminosäuresequenz natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone verschieden ist, kodierenden Strang.
2. 2. Doppelsträngige DNA gemäss Anspruch 1 mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, dessen N-termi-naler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 92 von LeIF-D und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 92 bis 165 von LeIF-A besteht, kodierenden Strang.
3. 3. Doppelsträngige DNA gemäss Anspruch 1 mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, dessen N-termi-naler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-D besteht, kodierenden Strang.
4. 4. Doppelsträngige DNA gemäss Anspruch 1 mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, dessen N-termi-naler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 63 von LeIF-D und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 63 bis 165 von LeIF-A besteht, kodierenden Strang.
5. 5. Doppelsträngige DNA gemäss Anspruch 1 mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, dessen N-termi-naler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 62 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 64 bis 166 von LeIF-D besteht, kodierenden Strang.
6. 6. Doppelsträngige DNA gemäss Anspruch 1 mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, dessen N-termi-naler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-B besteht, kodierenden Strang.
7. 7. Doppelsträngige DNA gemäss Anspruch 1 mit einem, ein hybrides Human-Leukozyten-Interferon, dessen N-termi-naler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-F besteht, kodierenden Strang.
8. 8. Replizierbarer plasmidischer Expressionsträger, enthaltend eine doppelsträngige DNA gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, der in einem transformierten Mikroorganismus das von der DNA kodierte hybride Human-Leukozyten-Interferon zu exprimieren vermag.
9. 9. Replizierbarer plasmidischer Expressionsträger gemäss Anspruch 8 aus der Gruppe pLelF AD trp (Bgl II), pLelF AD trp (Pvu II), pLelF DA trp (Bgl II), pLelF DA trp (Pvu II), pLelF trp AB (Pvu II) und pLelF trp AF (Pvu II).
10. 10. Mikroorganismen, die mit einem replizierbaren plasmidischen Expressionsträger gemäss einem der Ansprüche 8 oder 9 transformiert sind.
11. 11. Ein Bakterium als Mikroorganismus nach Anspruch
12. 10.
13. 12. Ein Stamm von E. coli als Mikroorganismus gemäss Anspruch 10.
14. 13. E. coli K-12 Stamm 294 ATCC Nr. 31446 als Mikroorganismus gemäss Anspruch 10.
15. 14. Ein Stamm von Bacillus subtilis als Mikroorganismus gemäss Anspruch 10.
16. 15. Ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae als Mikroorganismus gemäss Anspruch 10.
17. 16. Verfahren zur Herstellung einer doppelsträngigen

    DNA gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein erstes, doppelsträngiges DNA-Fragment mit Codons, die für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodieren, wobei das Fragment die Codons für den Amino-Endteil des Interferons enthält und, im Abstand davon in 3'-Richtung, eine erste Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle aufweist, ausgewählt wird,

    b) das Fragment mit der Restriktions-Endonuclease gespalten wird,

    c) ein zweites, doppelsträngiges DNA-Fragment, das für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines zweiten, anderen, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und eine identische Restriktions-Endonu-clease-Spaltstelle im wesentlichen identisch unter dem Gesichtspunkt der Aminosäurebezifferung der beiden Interferone angeordnet und ausserdem über die Stelle hinaus Codons für das Carboxyl-Endteil des zweiten Interferons aufweist, ausgewählt wird,

    d) das zweite Fragment mit der Restriktions-Endonu-clease gespalten wird und e) die Restriktions-Endonuclease-Verdauungsprodukte der Stufen b) und d), zur Wiederherstellung der Restriktions-Endonuclease-Stelle und Bildung eines Hybrid-Fragments mit, in der Sequenz, Codons für das Amino-Endteil des ersten Interferons und für das Carboxyl-Endteil des zweiten, verknüpft werden.
18. 17. Verfahren zur Herstellung eines replizierbaren plasmidischen Expressionsträgers gemäss einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein erstes, doppelsträngiges DNA-Fragment mit Codons, die für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodieren, wobei das Fragment die Codons für den Amino-Endteil sowie diesen vorangehend ein ATG- oder anderes Translations-Initiations-Codon sowie einen Promoter oder ein Promoter-Operator-System enthält und, im Abstand davon in 3'-Richtung, eine erste Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle aufweist, ausgewählt wird,

    b) das Fragment mit der Restriktions-Endonuclease gespalten wird,

    c) ein zweites, doppelsträngiges DNA-Fragment, das für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines zweiten, anderen, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und eine identische Restriktions-Endonu-clease-Spaltstelle im wesentlichen identisch unter dem Gesichtspunkt der Aminosäurebezifferung der beiden Interferone angeordnet und ausserdem über die Stelle hinaus Codons für das Carboxyl-Endteil des zweiten Interferons aufweist, ausgewählt wird,

    d) das zweite Fragment mit der Restriktions-Endonu-clease gespalten wird und .

    e) die Restriktions-Endonuclease-Verdauungsprodukte der Stufen b) und d), zur Wiederherstellung der Restriktions-Endonuclease-Stelle und Bildung eines Hybrid-Fragments mit, in der Sequenz, Codons für das Amino-Endteil des ersten Interferons und für das Carboxyl-Endteil des zweiten, verknüpft werden.
19. 18. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus mit einem replizierbaren plasmidischen Expressionsträger gemäss einem der Ansprüche 8 oder 9 transformiert und kultiviert.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65

    3

    663 032