DE68919085T2 - Verfahren zur herstellung eines polypeptids welches als menschlicher neutrophiler chemotaktischer faktor aktiv ist. - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines polypeptids welches als menschlicher neutrophiler chemotaktischer faktor aktiv ist.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen neutrophilen chemotaktischen Faktor-Polypeptids aus transformierten Zellen, die einen Expressionsvektor zur Erzeugung dieses Polypeptids beherbergen.
  • Der menschliche neutrophile chemotaktische Faktor (nachstehend als NCF abgekürzt) ist ein physiologisch aktives Polypeptid, das eine wichtige Rolle bei Entwicklungsmechanismen und homeostatischen Mechanismen, wie Wanderung (homing) von T-Lymphozyten in die Thymusdrüse und die Lymphknoten, und bei der Modulation von Immunantworten spielt. Es wurde berichtet, daß der NCF die biologischen Aktivitäten, Neutrophile und Lymphozyten anzuziehen und diese Zellen zu aktivieren, besitzt (Yoshimura, T. et al., J. Immunol., 139, 788, 1987; Walz, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 755, 1987; Gregory, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 833, 1988). Diese Entdeckungen zeigen an, daß NCF ein nützliches immuntherapeutisches Mittel für Patienten mit malignen Tumoren und Immundefekterkrankungen ist.
  • Mandecki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3543-3547 (1985) beschreiben die chemische Synthese, Clonierung und Expression eines Gens, das einen Polypedptidteil von menschlichem C5a codiert, in Escherichia coli. Andererseits beschreibt Marston, Biochem. J. 240, 1-12 (1986) die Isolierung und Reinigung von vielen Polypeptidarten aus Einschlußkörpern unter Verwendung von Denaturierungsmitteln, wie Harnstoff und Guanidinhydrochlorid. Diese Druckschriften offenbaren jedoch nichts über das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen NCF-Polypeptids.
  • Den genannten Erfindern gelang die Produktion von menschlichem NCF durch die rekombinante DNA-Technik unter Verwendung von E. coli als Wirtszelle und ebenfalls die Isolierung des Polypeptids aus der löslichen Fraktion des Transformantenhomogenats, und eine Patentanmeldung zu dieser Erfindung wurde bei dem USPTO am 2. Mai 1988 als Ser. Nr. 189,164 entsprechend der WO 89/10962 eingereicht.
  • Ferner erforschten die Erfinder das einfache und effiziente Verfahren zur Herstellung des menschlichen NCF-Polypeptids aus dem Transformantenhomogenat. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß eine große Menge des menschlichen NCF-Polypeptids, das in E. coli-Zellen, die einen Expressionsvektor, der das Polypeptid codiert, beherbergen, durch rekombinante DNA- Technik produziert wurde, hauptsächlich in einer Präzipitatfraktion verteilt wird, die durch Zentrifugation aus dem Transforamantenhomogenat gewonnen wird, und daß das aktive menschliche NCF-Polypeptid effizient aus der vorstehenden Präzipitatfraktion einfach durch Behandlung mit einem Denaturierungsmittel für Proteine, wie Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, und Entfernen des Denaturierungsmittels, beispielsweise durch Dialyse, gewonnen werden kann.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer großen Menge des aktiven menschlichen NCF-Polypeptids aus dem Transformantenhomogenat bereitzustellen.
  • Der Erfindung liegt auch die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und effizientes Verfahren zur Reinigung des aktiven menschlichen NCF-Polypeptids aus der Präzipitatfraktion des Transformantenhomogenats bereitzustellen.
  • Die Aminosäuresequenz des menschlichen NCF-Polypeptids wird durch die in Tabelle 1 gezeigte Formel [I] wiedergegeben.
  • Um diese Erfindung ausführlicher zu beschreiben, wird die Präzipitatfraktion des Transformantenhomogenats mit dem Proteindenaturierungsmittel, beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, bevorzugt in einer Endkonzentration von mehr als 4 M, bevorzugter 6 bis 10 M, aufgelöst und anschließend das Denaturierungsmittel beispielsweise durch Dialyse entfernt, welche bevorzugt gegen 10 bis 50 mM Phosphat oder Tris-HCl-Puffer (pH 6-8) durchgeführt wird. Dann wird nur das im wesentlichen unlösliche Material, das den modifizierten NCF enthält, erneut ausgefällt. Durch Entfernen des so erhaltenen Präzipitats kann eine Lösung, die eine große Menge des löslichen aktiven menschlichen NCF-Polypeptids enthält, leicht erhalten werden.
  • Vor der Trennung der Präzipitatfraktion aus dem Tranformantenhomogenat wird bevorzugt eine Behandlung für das Zusammenbrechen von Nucleinsäuren in dem Transformantenhomogenat durch Spaltung mit Desoxyribonuclease durchgeführt.
  • Das aus der vorstehenden Präzipitatsfraktion gewonnene lösliche aktive NCF- Polypeptid kann weiter gereinigt werden, beispielsweise durch eine Kombination der Behandlung zum Aussalzen, Anionen- und/oder Kationenaustauschchromatographie, Ultrafiltration, Gelfiltration, Dialyse, Elektrophorese, Affinitätschromatographie unter Verwendung spezieller Antikörper usw.
  • Das menschliche NCF-Polypeptid in transformierten Zellen wird durch Züchten der mit dem Expressionsvektor, der mit der das menschliche NCF-Polypeptid codierenden DNA konstruiert wurde, transformierten Zellen gebildet. Das heißt zuerst kann das Expressionsplasmid zur Erzeugung des menschlichen NCF-Polypeptids konstruiert werden, beispielsweise gemäß Referenzbeispiel 2, mit der DNA, die das Polypeptid codiert, das isoliert wird, beispielsweise nach dem in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Verfahren oder durch Totalsynthese unter Verwendung herkömmlicher Methoden. Als zweite Stufe kann eine transformierte Zelle zur Erzeugung des menschlichen NCF-Polypeptids durch Einschleusen des vorstehenden Expressionsplasmids gemäß dem Verfahren von Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972) erhalten werden. Als abschließende Stufe kann das menschliche NCF-Polypeptid durch Züchten der so erhaltenen transformierten Zellen unter geeigneten Kulturbedingungen produziert werden. Zusätzlich kann das Transformantenhomogenat durch Zerstören von Zellen, beispielsweise durch Spaltung mit Lysozym und Einfrieren/Auftauen, Beschallen oder unter Verwendung einer French Presse, hergestellt werden.
  • Die chemischen und biologischen Eigenschaften des gemäß der Beispiele hergestellten NCFs waren mit denjenigen des menschlichen NCF-Polypeptids, das aus der löslichen Fraktion des Transformantenhomogenats gemäß dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren mittels Peptidkartierungsanalyse durchgeführt, durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie nach Spaltung jedes menschlichen NCF-Polypeptids mit Protease und durch den neutrophilen chemotaktischen Assay, gemessen in einer Boyden-Chemotaxis-Kammer mit vielen Kavitäten (Neuro Probe, Inc., USA), identisch.
  • Zur Vereinfachung der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet.
  • A: Adenin
  • C: Cytosin
  • G: Guanin
  • T: Thymin
  • I: Inosin
  • dATP: Desoxyadenosintriphosphat
  • dCTP: Desoxycytosintriphosphat
  • dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
  • dTTP: Desoxythymidintriphosphat
  • ATP: Adenosintriphosphat
  • DNA: Desoxyribonucleinsäure
  • cDNA: komplementäre DNA
  • kbp: Kilobasenpaare
  • SD Sequence: Shine-Dalgarno-Sequenz
  • kD: Kilodalton
  • SDS: Natriumlaurylsulfat
  • In der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen ist die durch einen Einzelstrang gezeigte Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz eines Sinnstranges und das linke Ende ist ein 5'-Terminus und das rechte Ende ein 3'- Terminus. In der Aminosäuresequenz ist das linke Ende ein N-Terminus und das rechte Ende ein C-Terminus.
  • Die folgenden Beispiele und Referenzbeispiele erläutern die Erfindung ausführl icher.
  • Es ist jedoch zu verstehen, daß die Erfindung in keiner Weise auf diese Beispiele beschränkt ist.
  • Zum besseren Verständnis der folgenden Referenzbeispiele sind die Schemata 1 bis 3 der Beschreibung beigefügt.
  • Schema 1 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pHNP101 (Referenzbeispiel 2);
  • Schema 2 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsvektors pEP205 (Referenzbeispiel 3);
  • Schema 3 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pHIPH383a (Referenzbeispiel 4).
    • Beispiel 1 Produktion eines menschlichen NCF-Polypeptids
  • Die transformierten Zellen zur Produktion des menschlichen NCF-Polypeptids, E. coli HB101/pHNP101, erhalten in Referenzbeispiel 2-(2), wurden in der LB-Brühe [Zusammensetzung: 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% Natriumchlorid (pH 7,5)] über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Die Kultur wurde in 100fache Volumina des Nährmediums [Zusammensetzung: 1,5% Natriumphosphat, dibasisch, 12-Wasser, 0,3% Caliumphosphat, monobasisch, 0,1% Ammoniumchlorid, 2 mg/Liter Vitamin B&sub1; , 0,5% Casaminosäure, 2 mM Magnesiumsulfat, 0,1 mM Calciumchlorid, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% Natriumchlorid und 0,4% Glycerin] supplementiert mit 3-Indolacrylsäure in einer Konzentration von 20 ug/ml inokuliert. Die Züchtung wurde 28 Stunden lang bei 35ºC durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 0,02% Lysozym, suspendiert. Die Zellsuspension wurde in Eiswasser 30 Minuten lang stehengelassen.
  • Ferner wurden das Einfrieren in Trockeneis/Ethanol und Auftauen bei 37ºC wiederholt, um die Zellen aufzubrechen. Das so erhaltene Zellhomogenat wurde mit Magnesiumchlorid und Desoxyribonuclease I (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) in Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 2 E/ml versetzt. Nach 30minütiger Inkubation bei 0ºC wurde das unlösliche Pellet durch Zentrifugation gewonnen und zweimal mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 0,75 M Harnstoff und 1% Triton X-100, gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde mit 6 M Guanidinhydrochlorid in 5 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) aufgelöst. Der geklärte Extrakt wurde durch Zentrifugation gewonnen und gegen 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) (nachstehend als PB bezeichnet) dialysiert. Nach der Zentrifugation zur Entfernung des während der Dialyse gebildeten Präzipitats wurde das Dialysat auf eine CM-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia, Schweden), die zuvor mit PB äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wurde mit PB gewaschen und mit einem linearen Gradienten einer Natriumchloridmolarität von 0 M bis 0,5 M in PB eluiert. Die das menschliche NCF-Polypeptid enthaltenen Fraktionen wurden gewonnen und vereinigt und durch Ultrafiltration eingeengt. Ferner wurde das Konzentrat einer Gelfiltration auf einer Toyopearl HW-55-Säule (TOSOH Co., Japan) unterworfen, wodurch das hochgereinigte menschliche NCF-Polypeptid erhalten wurde.
  • Durch Analyse mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde keine Verunreinigung in dem hochgereinigten menschlichen NCF-Polypeptidpräparat nachgewiesen.
    • Beispiel 2 Produktion des menschlichen NCF-Polypeptids
  • Der hochgereinigte NCF wurde durch Auflösen des gewaschenen Pellets aus dem Transformantenhomogenat, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 8 M Harnstoff in 5 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) und unter anschließender Verwendung des gleichen Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten.
    • Referenzbeispiel 1 Clonierung der cDNA, die den menschlichen NCF codiert
  • Die cDNA-Bank wurde durch Insertion der cDNA, die mit einer polyadenylierten mRNA als Matrize, erhalten aus normalen menschlichen Monocyten, die mit Lipopolysaccharid in einer Konzentration von 10 ug/ml 6 Stunden lang stimuliert worden waren, synthetisiert wurde, in die EcoRI-Spaltstelle des Phagenvektors λ gt10 konstruiert. Eine halbe Million einzelner Plaques wurde bezüglich der Hybridisierung mit zwei Arten chemisch synthetisierter mit [³²P]-markierten Oligonucleotidsonden der folgenden Formeln [C] und [D] abgesucht:
  • Bei dem ersten Absuchen wurden 13 vermutlich positive Clone erhalten. Aus diesen positiven Clonen wurden ein Clon (mit der Bezeichnung r-MDNCF 2-1) bei dem zweiten Absuchen unter Verwendung einer anderen Sonde ausgewählt.
  • Die Phagen-DNA in r-MDNCF 2-1 wurde in das pUC19-Plasmid subcloniert. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pU19-1.7-5 bezeichnet.
  • Die clonierte cDNA in einem rekombinanten Plasmid pU19-1.7-5 enthält eine Nucleotidsequenz, die den menschlichen NCF, der in Tabelle 2 gezeigt ist, codiert.
    • Referenzbeispiel 2 Produktion des menschlichen NCF-Polypeptids
  • Das menschliche NCF-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I] in Tabelle 1 wurde nach den folgenden Methoden produziert.
    • (I) Konstruktion eines Expressionsplasmids pHNP101
  • Aus dem rekombinanten Plasmid pUC19-1.7-5, in das die menschliche NCF-cDNA insertiert wurde, wie in Referenzbeispiel 1 erwähnt, wurde ein DNA-Fragment, das das Polypeptid entsprechend den Aminosäuren von der 18. Position bis zu der 97. Position vom N-Terminus des menschlichen NCF-Vorläufer-Polypeptids (entsprechend der Basensequenz von Base Nr. 52 bis Nr. 291 in Tabelle 2) der Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen PstI und EcoRI isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde dann in einen Phagenvektor M13mp18 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) in einer Region zwischen der Restriktionsspaltstelle von PstI und der von EcoRI in der Polylinkersequenz cloniert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Phagen-DNA wurde eine spezifische Basensequenz, die 5'-TTTAAATTATG-3', zwischen dem Codon entsprechend Arg in der Position 27 vom N-Terminus des menschlichen NCF-Vorläufer-Polypeptids und dem Codon entsprechend Ser in der Position 28 durch die Technik der ortsspezifischen Mutagenese nach dem Verfahren von Kunkel et al. (Methods in Enzymol., 154, 367, 1987) insertiert. Die ortsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung eines in vitro Mutagenese-Kits Muta-Gene gemäß den Angaben des Herstellers (Bio-Rad Labs., USA) durchgeführt. E. coli JM105 wurde mit der rekombinanten Phagen-DNA infiziert und wurde dann bebrütet, um den rekombinanten Phagen zu gewinnen. Dann wurde E. coli CJ236 mit den wie vorstehend erhaltenen rekombinanten Phagen infiziert und in 2xTY Medium [Zusammensetzung: 1,6% Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid] supplementiert mit Uridin und Chloramphenicol in einer Konzentration von 1 ug/ml bzw. 20 ug/ml 5 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet. Die einzelsträngige Phagen-DNA, die die Uracile enthielt, wurde aus dem Kulturmedium isoliert.
  • Getrennt davon wurde ein mutagener Oligodesoxyribonucleotid-Primer bestehend aus 33 Basen der folgenden Formel [E] chemisch synthetisiert.
  • Das 5'-Ende des mutagenen Primers wurde zuvor phosphoryliert. Der phosphorylierte Primer wurde mit der vorstehend hergestellten einzelsträngigen Phagen-DNA, die Uracile enthielt, in Reassoziierungspuffer [20 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,4), enthaltend 2 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid] durch 10minütige Inkubation bei 70ºC und anschließendes Abkühlen auf 30ºC mit einer Geschwindigkeit von 1ºC pro Minute reassoziiert. Dann wurde der Primer mit T4-DNA-Polymerase in einem Synthesepuffer [10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,4 mM jedes Desoxynucleosidtriphosphat (dGTP, dATP, dCTP, dTTP), 0,75 mM ATP, 3,75 mM Magnesiumchlorid und 1,5 mM Dithiothreit] verlängert, um einen komplementären Strang zu synthetisieren, und die Enden wurden mit T4-DNA-Ligase durch aufeinanderfolgende Inkubation auf Eis für 5 Minuten, bei 25ºC für 5 Minuten und bei 37ºC für 90 Minuten ligiert. Die Reaktion wurde durch Gefrieren auf -20ºC gestoppt. Die kreisförmige doppelsträngige DNA (Heteroduplex) wurde in E. coli JM105 Zellen eingeschleust, und sie wurden gezüchtet, um die mutagenisierte doppelsträngige replikative Form der DNA zu isolieren. Die Nucleotidsequenz der mutagenisierten DNA wurde durch Sequenzieren der aus dem Kulturmedium isolierten einzelsträngigen DNA bestätigt.
  • Die so erhaltene mutagenisierte doppelsträngige DNA wurde mit den Restriktionsendonucleasen DraI und EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment zu isolieren, das den Hauptteil der codierenden Region für das menschliche NCF- Polypeptid enthielt. Das isolierte DNA-Fragment wird nachstehend als NCF- (DraI-EcoRI)-Fragment bezeichnet.
  • Das NCF-(DraI-EcoRI)-Fragment wurde durch T4-DNA-Ligase mit einem chemisch synthetisierten Oligodesoxynucleotidadaptor der folgenden Formel [F]
  • ligiert.
  • Das so erhaltene ligierte DNA-Fragment wird als NCF-(DraI-XhoI)-Fragment bezeichnet.
  • Getrennt davon wurde ein Expressionsplasmid pEP205, wie in Referenzbeispiel 3 erwähnt, mit den Restriktionsendonucleasen DraI und XhoI gespalten und das so erhaltene größere DNA-Fragment, einschließlich eines Ampicillinresistenzgens und eines Replikationsorigins (nachstehend als EP205-Vektor- DNA-Fragment bezeichnet), wurde isoliert, und dieses EP205-Vektor-DNA-Fragment wurde durch T4-DNA-Ligase mit dem zuvor hergestellten NCF-(DraI-XhoI)- Fragment ligiert, um ein Expressionsplasmid pHNP101 zur Produktion des menschlichen NCFs zu konstruieren (siehe Schema 1).
    • (2) Transformation von Escherichia coli
  • Das so erhaltene Expressionsplasmid pHNP101 wurde in E. coli HB101 auf folgende Weise eingeschleust. E. coli HB101 wurde in die LB-Brühe [Zusammensetzung: 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% Natriumchlorid (pH 7,5)] inokuliert und über Nacht bei 30ºC gezüchtet. Ein Milliliter der so erhaltenen Kultur wurde in 100 ml LB-Brühe inokuliert und bei 30ºC weiter gezüchtet bis die Trübung des Kulturmediums bei 600 nm etwa 0,6 erreicht hatte. Nach 30minütigem Stehenlassen in Eiswasser wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Sie wurden in 50 ml 50 mM Calciumchlorid resuspendiert und 60 Minuten lang in Eiswasser stehengelassen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und erneut in 10 ml 50 mM Calciumchlorid, enthaltend 20% Glycerin, suspendiert.
  • Diese Zellsuspension wurde mit dem Expressionsplasmid pHNP101 versetzt, vermischt und nacheinander in Eiswasser 20 Minuten lang und bei Raumtemperatur 60 Minuten lang inkubiert. Dann wurde die LB-Brühe der Zellsuspension zugesetzt, und es wurde unter Schütteln bei 37ºC 60 Minuten lang bebrütet. Ein Aliquot der so erhaltenen Zellsuspension wurde auf die LB-Agarplatten (1,5% Agar), enthaltend Ampicillin in einer Konzentration von 25 ug/ml, aufgebracht. Nach Bebrüten bei 37ºC über Nacht wurden Ampicillin-resistente Kolonien ausgewählt, um die Transformanten zu erhalten. Einer der Transformanten wurde als E. coli HB101/pHNP101 bezeichnet, und er wurde zur Produktion des menschlichen NCF-Polypeptids verwendet.
    • (3) Produktion des menschlichen NCF-Polypeptids
  • E. coli HB101/pHNP101, erhaltend wie vorstehend, wurde in der LB-Brühe über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Die Kultur wurde in loofache Volumina des in Beispiel 1 erwähnten Nährmediums supplementiert mit 3-Indolacrylsäure in einer Konzentration von 20 gg/ml inokuliert. Die Züchtung wurde 28 Stunden lang bei 35ºC durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 0,1% Lysozym und 30 mM Natriumchlorid, suspendiert. Die Suspension wurde in Eiswasser 30 Minuten stehengelassen. Dann wurden das Einfrieren in einem Trockeneis/Ethanolbad und das Auftauen bei 37ºC wiederholt, um die Zellen aufzubrechen. Nach Zugabe von 1/50 Volumen 10%iges Ethyleniminpolymeres wurde ein geklärter Zellextrakt durch Zentrifugation erhalten. Dieser Zellextrakt wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer 70%igen Sättigung versetzt, und das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Präzipitat wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und wurde gegen 5 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (pH 6,5) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule aus Sephacryl 5-200 aufgebracht, und die die Polypeptide mit etwa 6 bis 10 kD enthaltenen Fraktionen wurden gewonnen und vereinigt. Die Molekülgrößen der Polypeptide in jedem Eluat wurden durch eine Analyse mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemessen. Die vereinigte Fraktion wurde gegen den in Beispiel 1 erwähnten PB dialysiert. Dann wurde das Dialysat auf eine Säule aus CM-Sepharose CL-6B, die zuvor mit PB äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wurde mit PB gewaschen und mit einem linearen Gradienten aus Natriumchlorid in einer Molarität von 0 M auf 0,5 M in PB eluiert. Die das menschliche NCF-Polypeptid enthaltenden Fraktionen wurden gewonnen und vereinigt und durch Ultrafiltration eingeengt. Ferner wurde das Konzentrat einer Gelfiltration auf einer Toyopearl HW-55 Säule unterworfen, wodurch das hochgereinigte menschliche NCF-Polypeptid erhalten wurde.
    • Referenzbeispiel 3 Konstruktion eines Expressionsvektors pEP205
  • Das Plasmid pBR322 wurde mit den Restriktionsendonucleasen Ava-I und PvuII gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment (Größe etwa 3,7 kbp) wurde isoliert. Nach Auffüllen seiner kohäsiven Enden zu glatten Enden mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) in Gegenwart von dGTP, dATP, dCTP und dTTP wurden beide Enden durch die T4-DNA-Ligase ligiert, wodurch ein neuer Plasmidvektor mit der Bezeichnung pBRS6 konstruiert wurde, von dem eine Genregion zur Regulierung der Kopienzahl, die in der Nähe des Replikationsorigin des Plasmids pBR322 angeordnet ist, deletiert wurde.
  • Der Plasmidvektor pBRS6 wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI gespalten, und ein kleineres DNA-Fragment, das eine stromaufwärtige Region des Ampicillinresistenzgens (Größe etwa 0,75 kbp) enthielt, wurde isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als das Amp-(PstI-EcoRI)-Fragment bezeichnet.
  • Dieses Amp-(PstI-EcoRI)-Fragment wurde in einen Phagenvektor M13mp18, wie in dem Beispiel erwähnt, cloniert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Phagen-DNA wurde eine Base (T) in der Nucleotidsequenz des Amp- (PstI-EcoRI)-Fragments in eine andere Base (C) durch ortsspezifische Mutagenese gemäß dem in Referenzbeispiel 2 erwähnten Verfahren verändert, um die spezifische Nucleotidsequenz (AAATTT), die durch die Restriktionsendonuclease DraI erkennbar ist, zu beseitigen.
  • Die einzelsträngige, die Uracile enthaltene, Phagen-DNA wurde aus dem Kulturmedium von E. coli CJ236, das mit der vorstehenden rekombinanten Phagen- DNA infiziert worden war, isoliert. Als Mutageneseprimer wurde das Oligodesoxyribonucleotid der folgenden Formel [G] chemisch synthetisiert.
  • Der phosphorylierte Primer wurde mit der Uracil enthaltenen DNA-Matrize reassoziiert. Gemäß dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde die gewünschte mutagenisierte doppelsträngige DNA isoliert.
  • Die so erhaltene mutagenisierte doppelsträngige DNA wurde mit den Restriktionsendonucleasen PstI und EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment entsprechend dem vorstehend erwähnten Amp-(PstI-EcoRI)-Fragment, aber ohne die Erkennungssequenz für die Spaltung durch die Restriktionsendonuclease DraI zu enthalten, zu isolieren (nachstehend als das mutierte Amp-(PstI-EcoRI)- Fragment bezeichnet). Das mutierte Amp-(PstI-EcoRI)-Fragment wurde mit dem größeren DNA-Fragment, das aus dem Vektor pBRS6 durch Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI isoliert wurde, ligiert, um einen neuen Vektor zu konstruieren, bei dem die Erkennungssequenz für die DraI Spaltung in dem Ampicillinresistenzgen des Plasmidvektors pBRS6 beseitigt war. Dieser neue Vektor wird als pBRS601 bezeichnet.
  • Ferner wurde dieser neue Vektor pBRS601 mit der Restriktionsendonuclease DraI gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment wurde mit dem SmaI Linker (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) durch die T4-DNA-Ligase ligiert, um einen neuen Plasmidvektor zu konstruieren. Der so erhaltene neue Plasmidvektor ist ein Derivat des Plasmids pBRS6 und enthält keine Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonuclease DraI. Dieser neue Plasmidvektor wird als pBRS602 bezeichnet.
  • Die Nucleotidsequenz des SmaI Linkers ist nachstehend gezeigt.
  • Ferner wurde dieser neue Vektor pBRS602 mit den Restriktionsendonucleasen AatII und SalI gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment wurde isoliert (nachstehend als das pBRS602-(AatII-SalI)-Fragment bezeichnet).
  • Getrennt davon wurde ein Expressionsplasmid pHIPH383a zur Produktion von menschlichem Interleukin-1α, wie in Referenzbeispiel 4 erwähnt, mit den Restriktionsendonucleasen AatII und SalI gespalten, und das so erhaltene DNA- Fragment, das die Sequenz für den E. coli-Tryptophanpromoter und die codierende Region für menschliches Interleukin-1α enthielt, wurde isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als Trp-Promoter/IL-1α-DNA-Fragment bezeichnet.
  • Dieses Trp-Promoter/IL-1α-DNA-Fragment wurde mit dem pBRS602-(AatII-SalI)- Fragment durch die T4-DNA-Ligase ligiert, wodurch ein neues Expressionsplasmid konstruiert wurde (siehe Schema 2).
  • Dieses neue Expressionsplasmid wird als pEP205 bezeichnet.
    • Referenzbeispiel 4 Konstruktion eines Expressionsplasmids pHIPH383a
  • Die clonierte cDNA, die das menschliche Interleukin-1α-Vorläufer-Polypeptid codiert, wurde nach dem in der europäischen Patentpublikation Nr. 0188920 beschriebenen Verfahren isoliert.
  • Aus dem rekombinanten Plasmid pHL4, das die Vorläufer cDNA für menschliches Interleukin-1α (Furutani, Y., et al., Nucleic Acids Res., 13, 5869, 1985) enthielt, wurde die cDNA-Insertion durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI isoliert, und weiter wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BstNI gespalten, um ein DNA-Fragment (Größe 411 bp), enthaltend einen Mittelteil der codierenden Region für das reife menschliche Interleukin-1α, zu isolieren. Das isolierte DNA-Fragment entspricht der Nucleotidsequenz von Base Nr. 398 bis Nr. 808 in Tabelle 5, die in der europäischen Patentpublikation Nr. 0188920 gezeigt ist.
  • Dieses DNA-Fragment wurde stufenweise durch die T4-DNA-Ligase mit chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptoren der folgenden Formeln [H] und [J] ligiert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als das SD-IL-1-Fragment bezeichnet.
  • Der synthetische Oligodesoxyribonucleotidadaptor [H] wurde durch aufeinanderfolgende Ligierung der folgenden fünf Arten von DNA-Fragmenten der Formeln [a] bis [e] hergestellt.
  • Eine Basensequenz der Formel [J] lautete wie folgt:
  • Getrennt davon wurde ein Expressionsvektor pEP302 (Furutani, Y., et al., Nucleic Acids Res., 13, 5869, 1985) mit den Restriktionsendonucleasen HpaI und BamHI gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment, das die E. coli-Tryptophanpromotersequenz und ein Ampicillinresistenzgen enthielt, wurde isoliert (nachstehend als das EP302 Vektor-DNA-Fragment bezeichnet).
  • Das EP302-Vektor-DNA-Fragment wurde durch die T4-DNA-Ligase mit dem vorstehend hergestellten SD-IL-1-Fragment ligiert, um ein Expressionsplasmid pHIPH383a zur Produktion des reifen menschlichen Interleukin-1α-Polypeptids zu konstruieren (siehe Schema 3). Tabelle 1 Formel [I] Tabelle 2 Nucleotidsequenz der menschlichen NCF-Vorläufer-cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz Schema 1 Konstruktion eines Expressionsplasmids pHNP101 Menschlicher NCF-cDNA-Clon: pUC19-1.7-5 Spaltung mit PstI und EcoRI PstI-EcoRI-DNA-Fragment Clonierung in den M13mp18-Vektor Infektion von E. coli JM105 Rekombinanter Phage Infektion von E. coli CJ236 Züchtung in Uridin-haltigem Medium Uracil enthaltende DNA-Matrize Reassoziierung eines 33-mer Mutageneseprimers [E] Uracil enthaltende DNA-Matrize Primerextension mit T4-DNA-Polymerase Ligierung der Enden mit T4-DNA-Ligase Heteroduplex Transformation von E. coli JM105 Mutierte doppelsträngige DNA Spaltung mit DraI und EcoRI NCF-(DraI-EcoRI)-Fragment Fortsetzung Schema 1 (Fortsetzung) NCF-(DraI-EcoRI)-Fragment Synthetische DNA [F] Ligierung mit T4-DNA-Ligase NCF-(DraI-XhoI)-Fragment Expressionsvektor pEP205 Spaltung mit DraI und XhoI EP205 Vektor-DNA-Fragment Expressionsplasmid pHNP101 Schema 2 Konstruktion eines Expressionsvektors pEP205 Plasmid pBR322 Spaltung mit AvaI und PvuII Größeres DNA-Fragment (3,7 kbp) Auffüllen der kohäsiven Enden zu glatten Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) Ligierung mit T4-DNA-Ligase Plasmidvektor pBRS6 Spaltung mit EcoRI und PstI Amp-(PstI-EcoRI)-Fragment Clonierung in den M13mp18-Vektor Infektion von E. coli JM105 größeres pBRS6 Fragment* Rekombinanter Phage Infektion von E. coli CJ236 Züchtung in Uridin-haltigem Medium Uracil enthaltende DNA-Matrize Reassoziierung eines Oligonucleotid-Mutageneseprimers [G] Uracil enthaltende DNA-Matrize Primerextension mit T-DNA-Polymerase Ligierung der Enden mit T4-DNA-Ligase Heteroduplex Fortsetzung Schema 2 (Fortsetzung) Herteroduplex Transformation von E. coli JM105 Mutierte doppelsträngige DNA Spaltung mit PstI und EcoRI Mutiertes Amp-(PstI-EcoRI) Fragment gößeres pBPS6 Fragment* Ligierung mit T4-DNA-Ligase Plasmidvektor pBRS601 Spaltung mit DraI Größeres DNA-Fragment [SmaI Linker] Plasmidvektor pBRS602 Spaltung mit AatII und SaII pBRS602 (AatI-SalI)-Fragment Expressionsplasmid pHIPH383a Spaltung mit AatII und SaII Trp-Promoter/IL-1α-DNA-Fragment Expressionsvektor pEP205 Schema 3 Konstruktion eines Expressionsplasmids pHIPH383a Menschliche IL-1α-cDNA: pHL4 Spaltung mit PstI cDNA-Insertion Spaltung mit EcoRI und BstNI Synthetischer DNA Adaptor EcoRI-BstNI-Fragment Ligierung mit T4-DNA-Ligas S Expressionsvektor pEP302 SD-IL-1-Fragment Spaltung mit HpaI und BamHI EP302 Vektor-DNA-Fragment Expressionsplasmid pHIPH383a

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung eines aktiven rekombinanten menschlichen neutrophilen chemotaktischen Faktor-Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz der Formel
dadurch gekennzeichnet, daß man Escherichia coli-Zellen, die einen Expressionsvektor, einschließlich einer Basensequenz, die das Polypeptid codiert, beherbergen, züchtet,
die Zellen aufbricht, wodurch ein Transformant-Homogenat gebildet wird,
ein Präzipitat aus dem Transformant-Homogenat isoliert, und
das Präzipitat mit Harnstoff oder Gunanidinhydrochlorid behandelt, um das Präzipitat auf zulösen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid mehr als 4 M beträgt.
DE68919085T 1988-08-29 1989-08-29 Verfahren zur herstellung eines polypeptids welches als menschlicher neutrophiler chemotaktischer faktor aktiv ist. Expired - Lifetime DE68919085T2 (de)

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