DD262873A1 - Verfahren zur gewinnung von verbenolen - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Verbenolen aus a-Pinenen mittels Mikroorganismen. a-Pinene werden mikrobiell zu Verbenolen transformiert, die als Insektenlockstoffe im biologischen Pflanzenschutz eingesetzt werden. Die Transformation wird unter K-, P- oder N-Limitations- bzw. -Mangelbedingungen mittels solcher Mikroorganismen durchgefuehrt, die Prozessen der Oxidation von Zuckern zu Zuckersaeuren bzw. Oxozuckersaeuren beispielsweise von Glucose zu Gluconsaeure, entstammen.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Verbenolen durch mikrobielle Oxidation von a-Pinenen.
Die Erfindung kann auf kontinuierliche oder semikontinuierliche Fermeni.ationsprozesse angewandt werden. Verbenole können als Insektenlockstoff im biologischen Pflanzenschutz Verwendung finden.
Verfahren zur Herstellung von Verbenolen sind bereits bekannt. Trans- wie auch cis-Verbenol können sowohl auf rein chemischem als auch auf mikrobieHem Wege durch Oxidation von a-Pinenen hergestellt werden. Die Nachteile chemischer Verfahren bestehen in deren Vielstufigkeit sowie in der Verwendung teurer und giftiger (G. H. Whitham, J. Chem. Soc. 1961,2232; M.A. Cooper et al., J. Chem. Soc. B 1967,1259) bzw. explosiver Oxidationsmittel (SU 456.806), der langen Reaktionszeiten (GB 2.07&223) und den geringen Ausbeuten an Verbenol (Span. 446.302).
Demgegenüber besitzen mikrobielle Verfahren den Vorzug der Verwendung relativ billiger, ungiftiger und nicht explosiver Biokatalysatoren.
Ein bekanntes mikrobieiles Verfahren geht von verschiedenen Monoterpenen aus (W. R.Abraham et al., Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 1986,24). Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß sowohl die Aufzucht der Mikroorganismen, als auch die Terpenoxidation unter sterilen Bedingungen erfolgen muß, die Bereitstellung der Biomasse immer noch relativ teuer ist, und daß eine Vielzahl von Nebenprodukten erhalten wird. Weitere Verfahren beschreiben die Oxidation von a-Pinenen mittels des Bakteriums Serratia marcescens (S.J.Wright et al., Appl. Mikrobiol. Biotechnol. Ϊ986,224) bzw. Aspergillus niger NCIM 612 (B. R. Prema und P. K. Bhattacharyya, Appl. Microbiol. 10,524 (1962). Diese Verfahren führen zwar zu trans- bzw. cis-Verbenol, haben aber den Nachteil, daß das gewünschte Produkt nur in Spurenmengen entsteht. Weitere Nachteile des Verfahrens bestehen im relativ hohen materiell-technischen Aufwand der sterilen Prozeßführung, insbesondere infolge der schwierigen Bereitstellung der für die Pinen-Oxidation erforderlichen Biomasse. Außerdem können die Pinene nur in sehr geringen Konzentrationen der fermentation zugeführt werden und die mikrobielle Oxidation dauert sehr lange.
Nach einem weiteren Verfahren werden demgegenüber mit Hilfe einer acidophilen Bakterienkultur unter insterilen Bedingungen im Verlaufe kurzer Reaktionszeiten wesentlich höhere Ausbeuten an Oxidationsprodukten erzielt. Hierbei handelt es sich um vorzugsweise trans-Verbenol, jedoch wurden auch eine Reihe anderer Oxidationsprodukte wie auch Folgeoxidationsprodukte des Verbenöls erhalten. Cis-Verbenol entsteht bei diesem Verfahren nicht. Die erreichte Produktkonzentration ist mit maximal 2,1 g/l relativ niedrig. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist der relativ hohe materiell-technische Aufwand zur Bereitstellung der erforderlichen Biomasse.
Ziel der Erfindung ist ein mikrobieiles Verfahren, mit dem es möglich ist, Verbenole in vergleichsweise hohen Ausbeuten und mit einem geringen Anteil an Nebenprodukten kostengünstig, insbesondere durch einen verringerten Aufwand zur Bereitstellung der Biomasse herzustellen.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren, das mittels geeigneter Prozeßführung und mikrobieller Biomasse mit hoher Selektivität bezüglich des Oxidationsvorganges a-Pinen in Verbenole umwandelt. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe so gelöst, daß die Pinen-Transformation in Anwesenheit utilisierbarer Kohlensioffsubstrate und unter K-, P- und/oder N-Limitations- oder Mangelbedingungen mittels Mikroorganismen, die Prozessen der Oxidation von Zuckern zu Zuckersäuren bzw. Oxozuckersäuren entstammen, durchgeführt wird. Hierbei handelt es sich z. B. um bereits ein- oder mehrfach im Oxidationsprozeß der Glucose zur Gluconsäure bzw. Oxogluconsäure verwendete Biomassen methylotropher Bakterienkulturen der Gattung Acetobacter oder von Bakterienkulturen der Gattungen Gluconobacter, Pseudomonas oder von Schimmelpilzen der Gattungen Aspergillus, Penecillium oder von Enterobacterium wie Serratia marcescens.
Es wurden gefunden, daß solche Biomassen aus Oxidationsprozessen von Zuckern zu Zuckersäuren eine für die Umsetzung von a-Pinenen zu Verbenolen nahezu optimales Oxidationspotential besitzen, das durch hohe Umsetzungsraten, eine begrenzte Weiteroxidation des gebildeten Verbenols und eine reduzierte Nebenproduktbildung charakterisiert ist. Durch den Einsatz dieser Biomassen werden die Ausbeute an Verbenolen gesteigert sowie höhere Produktkonzentrationen erzielt. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Maßnahmen ist die Einsparung des materiellen Aufwandes zur Erzeugung der Prozeßbiomasse, da diese als Abfallprodukt in der technisch vorgelagerten z. B. Gluconsäureproduktion anfällt.
Die Erfindung wird mit folgenden Beispielen erläutert:
a) Ein Rührkesselreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 1,21 wurde mit einer mineralischen Nährlösung und einer Bakteriennnasse beschickt, die einem Prozeß der Gluconsäuresynthese mittels Acetobacter methanolicus (IMET B 346)
entstammte
^ Nach Erreichen der für diese Kultur optimalen Parameter wurde unter insterilen Bedingungen ein Methanol-fed-batchüber2 Stunden durchgeführt.
Die Prozeßgrößen waren folgende:
Temp. = 33°C;pH = 4,2bis4,3; pO2 = 4 bis 7ppm;
Biomassekonzentration = etwa 8g Bakterientrockensubstanz (BTS)/!;
extrazelluläre Methanolkonzentration = 0 bis 2g/l,
extrazelluläre N-Konzentration = IOmg/1.
Die übrigen essentiellen Mineralstoffe waren für einen Zuwachs von 2 g BTS/! berechnet, und zwar betrug ihr Anteil in der Nährlösung:
| MgSO4-7 H2O | 53 mg/1 | ZnSO4-7 H2O | 0,52 mg/l |
| K2SO4 | 67 mg/1 | NaCI | 1,0 mg/l |
| H3SO4 85% | 93 mg/1 | Ca(NO3J2-4 H2O | 0,94 mg/l |
| CuSO4-5 H2O | 0,32 mg/1 | ||
| CoSO4-7 H2O | 0,08 mg/i | ||
| MnSO4-4 H2O | 0,5 mg/1 | ||
| H3BO3 | 0,1 mg/l | ||
| FeSO4-7 H2O | 0,82 mg/l | ||
| Na2MoO4-2 H2O | 0,08 mg/l |
Nach 2h wurde die Methanolkonzentration auf 5g/l erhöht und innerhalb von 100min in Portionen von etwa 2g insgesamt 30g a-Pinen in den Reaktor dosiert. Danach wurde die Fermentation abgebrochen. Der gesamte Reaktorinhalt wurde zentrifugiert und die biomassearme wäßrige Phase mittels eines mit Wasser wenig mischbaren Lösungsmittels, z. B.
Methylenchlorid, extrahiert.
Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde das Extraktionsmittel und nicht umgesetztes a-Pinen abdestilliert. Es verblieben 12,15g eines hellgelben Öls. Davon waren 10,2g (84%) trans-Verbenol. Als Nebenprodukte wurden identifiziert:
Verbenon (6%), trans-Pinocarveol (4%), trans-Sobrerol (4%).
Danach beträgt die auf umgesetztes a-Pinen bezogene Ausbeute an trans-Verbenol 47 % und die Syntheserate ν = 5,1 g/kg · h.
Demgegenüber wurde in Vorbereitung einer analogen Pinentransformation in demselben Reaktor (1,21) ein Methanol-fedbatch mit Acetobacter methanolicus (IMET B 346) auf einem Überschußmedium durchgeführt. Die Kultivierungsbedingungen waren folgende:
Temp. = 33°C;pH = 4,2 bis 4,8; pO2 = 0 bis5ppm;
Startkonzentration an Biomasse = 1 g BTS/I;
extrazelluläre Methanolkonzentration = 0 bis 1 g CH3OH/I;
extrazelluläre N-Konzentration = 300 bis 1200 mg N/l.
Das Kulturmedium enthielt alle für das Bakterium lebensnotwendigen Nährstoffe, und zwar ausreichend für einen Zuwachs von 10g BTS/I.
Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von 7g BTS wurde die Methanolkonzentration im Reaktor auf 5g CH3OH/I erhöht und unmittelbar darauf die Pinentransformation durchgeführt. Es wurden innerhalb von 20 Minuten 10,8g Pinen in Portionen zu 2g in den Reaktor dosiert. Danach wurde der Prozeß abgebrochen und der Fermentorinhalt wie unter a) aufgearbeitet. Neben nichtumgesetztem und zurückgewonnenen Pinen (70%) wurde eine Produktmenge von 2,1 g erhalten.
Das Öl setzte sich wie folgt zusammen:
trans-Verbenol (40%), Verbenon (24%), trans-Pinocarveol (10%), trans-Sobrerol (10%), a-Campholenaldehyd (10%) und Spuren anderer Oxidationsprodukte.
Die hier erreichte Ausbeute von 28% trans-Verbenol (bezogen auf umgesetztes a-Pinen) beträgt nur 60% des unter den erfindungsgemäßen Bedingungen erzielten Wertes, wobei der materielle und zeitliche Aufwand der Biomassenanzucht die Ökonomie das Beispiel b) wesentlich belasten. Die Verbenolsyntheserate liegt mit ν = 2,1 g/kg · h ebenfalls wesentlich niedriger als in a).
Der Rührkesselreaktor wurde mit 1,21 N-freier Lösung bestehend aus essentiellen Mineralstoffen gemäß Beispiel 1 a und einer Bakterienmasse, entsprechend einer Konzentration von 5g BTS/I beschickt. Die Biomasse entstammte einem steril geführten Prozeß der Oxogluconsäuresynthese mittels Gluconobacter oxidans 1804. Nach Erreichen der für diese Kultur optimalen Parameter wurde ein Glucon-fed-batch unter insterilen Bedingungen für etwa 2 h durchgeführt. Die Prozeßparameter waren folgende:
Temp. = 3O0C; pH = 5,0 bis 5,5; pO2 = 3 bis 5ppm;
extrazelluläre Glucosekonzentration = 0,5 bis 2g RS/I.
— J — £D£ O/»J
Nach 2h wurde die Glucosekonzentration auf 5g RS/I erhöht und innerhalb von 20 min in Portionen von 2g insgesamt 14g a-Pinen in den Reaktor gegeben. Danach wurde die Fermentation abgebrochen und der Fermentorinhalt wie im Beispiel 1 aufgearbeitet. Es wurde eine Produktmenge von 3,1 g erhalten, die sich wie folgt zusammensetzte:
trans- und cis-Verbenol (71 %), Verbencn (22%) und Anteile einiger nichtidentifizierter Oxidationsprodukte.
Die Ausbeute an Verbenolen(bezogen auf umgesetztes a-Pinen,betrug 31 % und die Svntheserate an Verbenolen 5,5 g/kg · h.
Demgegenüber lag die Ausbeute an Verbenolen im Ergebnis von Pinentransformationen mit frischer, auf Überschußmedium angezüchteter Gluconobacterbiomasse zwischen 10 und max. 20% der umgesetzten Pinenmsnge, wobei weiterhin eine ganze Reihe von anderen Oxidationsproduktenwie z. B. die unter Beispiei 1 b aufgeführten erhalten wurden.
Der Rührkesselreaktor wurde mit einer N-freien Lösung, bestehend aus essentiellen Mineralstoffen gemäß Beispiel 1 und einer Biomasse entsprechend einer Konzentration von 3g TS/I beschickt. Die Biomasse entstammte einer sterilen Giuconsäurefermentation mittels Aspergillus nigerspez.
Nach Erreichen der Prozeßparameter und Vorlage von 15g Glucose/! wurde unter insterilen Bedingungen eine Pinentransformation durchgeführt, indem im Verlaufe von 4h in Portionen von etwa 2g insgesamt 10g/1,2l Arbeitsvolumen in den Reaktor gegeben wurde. Die Prozeßparameter waren:
Temp. = 29CC; pH = 5 bis 7; pO2 = 2 bis 5ppm.
Die zu Beispiel 1 analoge Aufarbeitung ergab eine Produktmenge von 1,8 g mit einem Anteil an Verbenolen von 85%. Die übrigen Oxidationsprodukte wie insbesondere Verbenon überstiegen in summa nicht den Anteil von 15%. Die auf umgesetztes Pinen bezogene Ausbeute an trans- und cis-Verbenol betrug 35% gegenüber durchschnittlich 18% bei Verwendung von frisch angezüchteter Biomasse der gleichen Kultur.
Claims (3)
- Patentanspruch:1. Verfahren zur Gewinnung von Verbenolen aus a-Pinenen mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pinen-Transformation in Anwesenheit ultiüsierbarer Kohlenstoffsubstrate und unter K-, P- und/oder N-Umitations- oder-Mangelbedingungen mit Hilfe von Mikroorganismen, die Prozessen der Oxidation von Zuckern zu Zuckersäuren bzw. Oxozuckersäuren entstammen,• durchgeführt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen methylotrophe Bakterien der Gattung Acetobacter oder Bakterien der Gattung Gluconobacter, Pseudomonas oder Schimmelpilze der Gattung Aspergillus, Penecillium oder Enterobacterien,wie Serratia marcescens sein können.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Mikroorganismen aus Prozessen der Oxidation von Glucose zu Gäuconsäure oder Oxogluconsäure, von Mannose zu Mannonsäure oder anderen analogen Prozessen entstammen.
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Country Status (1)
| Country | Link |
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| DD (1) | DD262873A1 (de) |
-
1987
- 1987-07-31 DD DD30556287A patent/DD262873A1/de not_active IP Right Cessation
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