DD262874A1 - Verfahren zur mikrobiellen transformation von alpha-pinenen zu verbenolen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Transformation von a-Pinenen zu Verbenolen. Die Erfindung beinhaltet die Herstellung von Verbenolen, die als Insektenlockstoffe im biologischen Pflanzenschutz eingesetzt werden. Die Transformation der Pinene wird mittels Methanol verwertender acidophiler bzw. neutrophiler Bakterien bzw. Hefen in Anwesenheit von Methanol und Zuckern oder Zuckersaeuren unter K-, P- und/oder N-Limitations- oder -Mangelbedingungen durchgefuehrt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Verbenolen durch mikrobielle Oxidation von a-Pinenen.
Die Erfindung kann auf kontinuierliche oder semikontinuierliche Fermentationsprozesse angewandt werden. Verbenol wird als Insektenlockstoff im biologischen Pflanzenschutz eingesetzt.
Verfahren zur Herstellung von Verbenolen sind bereits bekannt. Trans- wie auch cis-Verbenol können sowohl auf rein chemischem als auch auf mikrobiellem Wege durch Oxidation von a-Pinenen hergestellt werden. Die Nachteile chemischer Verfahren bestehen in der Vielstufigkeit sowie in der Verwendung teurer und giftiger (G. H. Whitham, J.Chem. Soc. 1961,2232; M. A. Cooper et al., J. Chem. Soc. B 1S67,1259) bzw. explosiver Oxidationsmittel (SU 456.806), den langen Reaktionszeiten (GB 2.078.223) und den geringen Ausbeuten an Verbenol (Span. 446.302).
Demgegenüber besitzen mikrobielle Verfahren den Vorzug der Verwendung billiger, ungiftiger und nicht explosiver Biokatalysatoren. Ein mikrobielles Verfahren geht von verschiedenen Monoterpenen aus (W.R.Abraham et al. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 1986,24). Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß unter sterilen Bedingungen gearbeitet werden muß und daß eine Vielzahl von Nebenprodukten erhalten wird. Weitere Verfahren beschreiben die Oxidation von a-Pinenen mittels des Bakteriums Serratia marcescens (S.J.Wright et al. Appl. Mirkobiol. Biotechnol. 1986,224) bzw. Aspergillus niger NCIM 612 (B.R.Prema und P. K. Bhattacharyya, Appl. Microbiol. 10,524 [1962]). Diese Verfahren führen zwar zu trans-bzw. cis-Verbenol, haben aber den Nachteil, daß das gewünschte Produkt nur in Spurenmengen entsteht. Weitere Nachteile der Verfahren bestehen darin, daß steril gearbeitet werden muß, daß die Pinene nur in sehr geringen Konzentrationen der Fermentation zugeführt werden können und die mikrobielle Oxidation sehr lange dauert.
Andere bekannte mikrobielle Verfahren zur Terpen-Oxidation haben analoge Mängel der geringen Selektivität und der Bildung einer breiten Produktpalette in geringer Konzentration (J. M. Brand et al., Nature [London] 254 [5496], 136 [1975]). Nach einem weiteren Verfahren wurden demgegenüber mit Hilfe einer acidophilen Bakterienkultur unter insterilen Bedingungen im Verlaufe kurzer Reaktionszeit wesentlich höhere Ausbeuten an Oxidationsprodukten erzielt. Hierbei handelt es sich um vorzugsweise trans-Verbenol, jedoch werden auch eine Reihe anderer Oxidationsprodukte wie auch Folgeoxidationsprodukte der Verbenole erhalten. Cis-Verbenol entsteht bei diesem Verfahren nicht. Die erreichte Produktkonzentration ist mit maximal 2,1 g/l relativ niedrig.
Ziel der Erfindung ist ein mikrobielles Verfahren, mit dem es möglich ist, Verbenole kostengünstig in vergleichsweise hohen Ausbeuten und mit einem geringen Anteil an Nebenprodukten herzustellen.
-2- ZtJZ 5/4 Wesen der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren, das mittels geeigneter Prozeßführung und Mikroorganismen mit hoher Selektivität bezüglich des Oxidationsvorganges α-Pinene in Verbenole umwandelt. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Transformation der Pinene mittels Methanol verwertender acidophiler bzw. neutrophiler Bakterien oder Hefen in Anwesenheit von Methanol und Zuckern bzw. Zuckersäuren und unter K-, P- und/oder N-Limitations- oder -Mangelbedingungen durchgeführt wird.
Als Methanol verwertende acidophile Mikroorganismen werden beispielsweise Bakterien der Gattung Acetobacter, insbesondere Acetobacter mehtanolicus IMET B 346 und als Methanol verwertende neutrophile Mikroorganismen werden z. B.
Bakterien der Gattung Pseudomonas eingesetzt.
Methanol verwertende Hefen können beispielsweise Candida boidinii spez., Pichia pinus spez. oder Hansenuia polymorpha spez. sein. Die erfindungsgemäß eingesetzten Zucker bzw. Zuckersäuren können Glucose bzw. Gluconsäure sein.
Die im Verfahren eingesetzten Methanolmengen betragen 0,05 bis 10g/l, die eingesetzten Zucker- bzw. Zuckersäuremengen 1
Insgesamt wird durch die erfindungsgemäße Kopplung von Zuckergaben bzw. Gaben an Zuckersäuren und der Realisierung von N-, K- und/oder P-Limitation bzw. -Mangel sowohl eine Steigerung der Verbenolausbeute bezogen auf die verbrauchte Pinenmenge als auch eine Steigerung der Raum- und Zeitausbeute sowie eine Erhöhung der Produktendkonzentration im Vergleich zu Transformationen ohne Gaben an Zucker bzw. Zuckersäuren und bei einem Überschuß an K-, P-und N-Salzen erreicht.
Diese Prozeßführung läßt sich sowohl auf die Darstellung von trans- als auch cis-Verbenol anwenden.
Die Erfindung wird mit folgendem Beispiel näher erläutert.
a) In einem Rührkesselreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 1,21 wurde eine fed-batch-Fermentation mit dem Methanol verwertenden acidophilen Bakterium Acetobacter methanolicus (IMET B 346) unter insterilen Bedingungen bei folgenden Parametern durchgeführt:
Temperatur = 33°C; pH = 4,2-4,8; pO2 = 0-5ppm; Startkonzentration = 1 g Bakterientrockensubstanz (BTS)/I; extrazelluläre Methanolkonzentration = 0-1 g CH3OH/!.
Das Kulturmedium enthielt alle für das Bakterium lebensnotwendige Nährstoffe, und zwar—; außer im Falle des N — ausreichend für einen Zuwachs von 10g BTS/I. Die vorgelegte N-Menge war nur für einen Zuwachs von 5g BTS/I kalkuliert. Während der Fermentation wurde stetig die Konzentration an N und an Biomasse kontrolliert. Die extrazelluläre N-Konzentration betrug nach Erreichen einer Biomassekonzentration von 6g BTS/I weniger als 10mg/l. Diese Konzentration wird als günstig für die Durchführung der Pinentransformation angesehen. Deshalb wurden Methanol und Glucose in einer Menge von jeweils 5g/l vorgelegt und unmittelbar darauf innerhalb von 60 Minuten in Portionen von etwa 2 g ingesamt 25,0g a-Pinen in den Reaktor dosiert. Danach wurde die Fermentation abgebrochen, der gesamte Fermentorinhalt zentrifugiert und die biomassearme wäßrige Phase mittels eines wenig wasserlöslichen Lösungsmittels, z. B. Methylenchlorid, extrahiert. Nach dem Trocknen der Extrakte über Natriumsulfat wurde das Extraktionsmittel und unumgesetztes a-Pinen (etwa 50% des eingesetzten) abdestilliert. Das zurückgewonnene Pinen wurde in weiteren Umsetzungen verwendet. Als Produkt verblieben 7,0g eines Öls, das sich aus trans-Verbenol (70%), Verbenon (10%), trans-Pinocarveol (5%), trans-Sobrerol (5%) und a-Campholenaldehyd (5%) zusammengesetzt.
Danach beträgt die auf die umgesetzte Pinenmenge bezogene Ausbeute an Verbenol 38,6% und die Syntheserate ν = 4,1vg Verbenol/kg.
b) Wird dagegen Acetobacter methanolicus (IMET B346) in demselben Reaktor auf einem methanolhaltigen N-Überschußmedium kultiviert, z. B. mit einem N-Angebot für einen Zuwachs von 10gBTS/l und die Transformation von 10,8g a-Pinen mittels einer analogen Biomassekonzentration wie in a) über einen Zeitraum von 20 Minuten in Anwesenheit von 4g Methanol/l jedoch ohne Glucosevorlage durchgeführt, kann nach der Aufarbeitung des Fermentorinhaltes neben unumgesetztem Pinen (70%) nur eine maximale Prodgktmenge von 2,1 g erhalten werden. Das gelbliche Öl setzte sich aus 40% trans-Verbenol, 24% Verbenon, 10% trans-Pinocarveol, 10% trans-Sobrerol, 10%a-Campholenaldehyd und Spuren anderer Gxidationsprodukte zusammen. Die hier erreichte Ausbeute von 28% trans-Verbenol (bezogen auf umgesetztes a-Pinen) liegt also ebenso wie dessen Syntheserate von ν = 2,1 g/kg · h wie auch die erzielte Verbenolmenge wesentlich niedriger als bei Anwendung der erfindungsgemäßen Prozeßführung.
c) Die Verwendung einer insterilen Anzucht von Acetobacter methanolicus (IMET B 346) auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle bei der Pinenoxidation zu Verbenol war nicht möglich.
In einem Rührkesselreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 1,21 wurden nacheinander 2 Methanol-fed-batch-Versuche mit einer mehtylotrophen Hefe der Art Candida boidinii unter sterilen Bedingungen beifolgenden Parametern durchgeführt:
Temp. = 300C, pH = 4,2; pO2 = 0-5 ppm;
Startkonzentration an Hefemasse = 3g Hefetrockensubstanz (HTS)/I;
extrazelluläre Methanolkonzentration = 2-5g CH3OH/!.
Das Kulturmedium enthielt alle für die Hefe lebensnotwendigen Nährstoffe, und zwar außer im I.Versuch im Falle des N, ausreichend für einen Zuwachs von etwa 10g HTS/I. Pie vorgelegte N-Menge war im I.Versuch für einen Hefezuwachs von 3g HTS/I kalkuliert, im 2. Versuch für 10g HTS/I.
Während der Versuche wurden jeweils die N- und Hefekonzentration gemessen. Nach Erreichen einer Hefekonzentration von etwa 6g HTS/I lag im I.Versuch die extrazelluläre N-Konzentration unter 10mg N/l; im 2.Versuch lag sie bei etwa 400mg N/l. Diese Konzentrationen stellten zugleich die Startparameter für die Pinentransformation dar, die im Verlaufe von jeweils 10 Minuten als
Pinen-fed-batch unter insterüen Bedingungen durchgeführt wurden, und zwar im 1. Versuch nach Vorlage von 5g Glucose/I und unter den Bedingungen des N-Mangeis, im 2. Versuch in Abwesenheit von Glucose und bei N-Überschuß. Es wurden 10,8g a-Pinen in Portionen zu 2 g in den Reaktor dosiert. Nach der Transformation wurde der Reaktorinhalt wie in Beispiel 1 aufgearbeitet. In Tabelle 1 ist die Produktionszusammensetzung sowie die Syntheserate an Verbenolen aus beiden Versuchen gegenübergesteili.
Tab. 1: Ergebnisse der Oxidation von a-Pinen mittels Candida boidinii spez. unter verschiedenen Versuchsbedingungen
Versuch
Beding.
| Anteil an | andere | Ausbeute | Syntheserate | |
| cis/trans | Verbenon | Produkte | an | von |
| Verbenol | Verbenol | |||
| N-Mangel | 61,9 | % | 10 | % | g/kg-h | |
| 1 | +Glucose | 28 | 28 | 3,92 | ||
| N-U ber- | 32,3 | 15 | ||||
| 2 | schuß | 52,7 | 11 | 0,39 | ||
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Kopplung von Glucosegabe und N-Mangel in Anwesenheit von Methanol hat eine wesentliche Steigerung der Verbenolausbeute und der Syntheserate an Verbenol zur Folge.
Es wurden analog zu Beispiel 2 nacheinander 2 Methanol-fed-batch-Versuche nebst anschließender Pinentransformation mittels einer neutrophilen methylotrophen Bakterienkultur der Gattung Pseudomonas bei folgenden Parametern durchgeführt:
Temp. = 32°C; pH = 6,6; pO2 = 0-5ppm;
Startkonzentration an Biomasse = 1 g BTS/I;
extrazelluläre Methanolkonzentration = 0-1 g CH:SOH/I
Die Kulturanzucht wurde unter sterilen, die Pinentransformation unter insterüen Bedingungen durchgeführt.
Die Biomassekonzentration lag in beiden Versuchen zum Zeitpunkt der mit analogen Pinenmengen wie im Beispiel 2 durchgeführten Pinentransformation zwischen 8 und 9g BTS/I, die extrazelluläre N-Konzentration unter 10mg N/l (Versuch 1) bwz. bei 500 mg N/! (Versuch 2).
Im I.Versuch wurde 5g Gluconsäure vorgegeben. Die Transformationsdauer betrug 8 Minuten. Die Aufarbeitung des Reaktorinhalts erfolgte wie im Beispiel 1.
In Tabelle 2 ist die Produktzusammsnsetzung sowie die Syntheserate an Verbenolen aus beiden Versuchen gegenübergestellt.
Tab. 2: Ergebnisse der Oxidation von a-Pinen mittels einer Pseudomonas spez. unter verschiedenen Versuchsbedingungen
| Versuch | Beding. | Verbenol | Anteil an | andere | Ausbeute | Syntheserate |
| Verbenon | Produkte | an | von | |||
| Verbenol | ||||||
| 73,3 | % | 8 | % | g/kg-h | ||
| 1 | N-Mangel | 18,7 | 34 | 7,4 | ||
| + Giucon- | ||||||
| säure | 22 | 25,2 | ||||
| 2 | N-Uberschuß | 52,8 | 12 | 1,35 | ||
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Kopplung von Gluconsäuregabe und N-Mangel in Anwesenheit von Methanol hat eine wesentliche Steigerung der Verbenolausbeute und der Syntheserate an Verbenol zur Folge.
Claims (6)
- Patentanspruch:1. Verfahren zur mikrowellen Transformation von a-P:nenen zu Verbenolen, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation der Pinene mittels Methanol verwertender acidophiler bzw. neutrophiler Bakterien oder Hefen in Anwesenheit von Methanol und Zuckern bzw. Zuckersäuren und unter K-, P- und/oder N-Limstations- oder -Mangelbedingungen durchgeführt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methanol verwertenden acidophilen Bakterien zu Gattung Acetobacter. die Methanol verwertenden neutrophilen Bakterien zur Gattung Pseudomonas gehören.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Verwendung des Bakterienstammes Acetobacter methanolicus IMET B 346.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methanol verwertenden Hefen Candida boidinii spez., Pichia pinus spez. oder Hansenula polymorpha spez. sein können.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Zucker bzw. Zuckersäuren Glucose bzw. Gluconsäure sind,
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pinen-Transformation in Anwesenheit von 0,05 bis 10g/I Methanol und 1 bis 10g/i Zucker bzw. Zuckersäuren durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30556387A DD262874A1 (de) | 1987-07-31 | 1987-07-31 | Verfahren zur mikrobiellen transformation von alpha-pinenen zu verbenolen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30556387A DD262874A1 (de) | 1987-07-31 | 1987-07-31 | Verfahren zur mikrobiellen transformation von alpha-pinenen zu verbenolen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD262874A1 true DD262874A1 (de) | 1988-12-14 |
Family
ID=5591216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD30556387A DD262874A1 (de) | 1987-07-31 | 1987-07-31 | Verfahren zur mikrobiellen transformation von alpha-pinenen zu verbenolen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD262874A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992003128A1 (en) * | 1990-08-22 | 1992-03-05 | Riace Establishment | Pharmaceutical compositions with mucolytic and antitussive activity containing (-)-trans-sobrerol |
-
1987
- 1987-07-31 DD DD30556387A patent/DD262874A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992003128A1 (en) * | 1990-08-22 | 1992-03-05 | Riace Establishment | Pharmaceutical compositions with mucolytic and antitussive activity containing (-)-trans-sobrerol |
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