DD270723A5 - Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain aus rohem Chymopapain. Erfindungsgemaess wird das rohe Chymopapain in Gegenwart eines Reduktionsmittels in Wasser oder einem Puffer geloest. Der klare Ueberstand der Loesung wird einer Gelchromatographie unterzogen, und die das aktive Enzym enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain mit hoher spezifischer Aktivität aus rohem Chymopapain mittels Gelchromatographie.
Chymopapain ist eine Thiolprotease, die zusammen mit dem Papain und der Papalyapeptidase die proteolytische (eiweißabbauende) Komponente des Papaya-Latex bildet. Papaya-Laiex wird aus der noch unreifen Frucht des in den Tropen vorkommenden Baumes Carica papaya gewonnen, indem die Frucht an mehreren Stellen angekratzt und der herausfließende milchartige Saft aufgefangen und dann getrocknet wird.
Das bekannteste und am besten untersuchte Enzym des Latex ist das Papain. Es wurde zuerst von Balls et al. (Balls, A. K., Lineweaver, H. und Thompson, R. R., Science 86,3794 (1937]) kristallisiert. Jansen und Balls wiesen nach (Jansen, E. P. und Balls, A. K., J. Biol. Chem. 137,459-460 [1941]), daß — wenn aus dem Extrakt des Papaya-Latex des Papain durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat entfernt wird—eine andere Thiolprotease in Lösung zurückbleibt. Dieses verhältnismäßig gut lösliche und bei pH 2 stabile Enzym erhielt die Bezeichnung Chymopapain. Durch Erhöhen der Ammoniumsulfatkonzentration kann auch dieses Enzym ausgefällt werden. Das auf diese Weise gewonnene „rohe Chymopapain" ist keine homogene Substanz, wie durch Gelelektrophorese und lonenaustauscherchromatographie nachgewiesen werden konnte (Kahn, I. U. und Polgar, L., Biochem. Biophys. Acta 760,350-356 (1983); europäische Patentschrift Nr.0065395).
Das Chymopapain wird in der klinischen Praxis verbreitet zur Behandlung des Bandscheibenbruches verwendet, da es in entsprechender Menge eingesetzt den Nucleus pulposus der Zwischenwirbelbandscheiben selektiv auflöst (US-PS 3320131). Außer den bei etwa 50% der behandelten Personen auftretenden leichteren Nebenwirkungen sind jedoch in etwa 1 % der Fälle schwere anaphylaktische Störungen zu beobachten (US-PS 4039682; Robinson, C. P., Drugs of Today, Vol. 19, No. 8 [1983], 454-460). Diese sind gemäß der bereits erwähnten europäischen Patentschrift Nr. 0065 395 auf eine der Eiweißkomponenten des heterogenen Chymopapains zurückzuführen. Diese Komponente gibt mit Bariumchlorid einen Niederschlag und kann durch lonenaustauschchromatographie entfernt werden. Nach der erwähnten Patentschrift ist die proteolytisch inaktive Substanz gefärbt und weist einen unangenehmen Geruch auf.
Ziel der Erfindung war die Ausarbeitung eines Verfahrens, das die Nachteile der bisher bekannten Verfahren nicht aufweist und in einfacher, billiger Weise die Herstellung von Chymopapain mit höherer spezifischer Aktivität ermöglicht.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die schädliche Komponente, die mit Bariumchlorid einen Niederschlag ergibt, mittels Gelchromatographie aus dem Chymopapain entfernt werden kann. Das ist technologisch einfacher, billiger und wenigstens zehnmal schneller als die herkömmliche lonenaustauschchromatographie. Die Erfindung beruht weiterhin auf der Erkenntnis, daß die partielle Inaktivierung des Chymopapains während der Gelchromatographie durch d;<n Zusatz von Reduktionsmitteln vermieden werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Chymopapain aus rohem Chymopapain. Für das Verfahren ist charakteristisch, daß das rohe Chymopapain in Gegenwart eines Reduktionsmitteis in Wasser oder einem Puffer gelöst, der klare Überstand der Lösung einer Gelchromatographie unterzogen wird und die das aktive Enzym enthaltenden
des pH-Wertes von 5-7 gelöst, der als Reduktionsmittel Cystein, Mercaptoäthanol oder Natriumsulfit enthält. Alschromatographische Säule findet zweckmäßig eine Säule aus Sephadex G-50 oder Sephadex G-25 Verwendung, die vorher miteinem Puffer oder einer Salzlösung, vorzugsweise mit cysteinhaltigem Phosphatpuffer, äquilibriert wird. Im Interesse einereffektiven Chromatographie wird die Säule so gewählt, daß sich Länge zu Durchmesser wie 5-50:1, vorzugsweise wie 20:1,verhalten.
und 13,33Pa, vorzugsweise 6,665Pa, in an sich bekannter Weise entfernt.
chromatographischen Peak, das auf das aktive Enzym folgt.
bekannten Verfahren. Deshalb ist das Verfahren auch für die großbetriebliche Durchführung wesentlich geeigneter als dielonenaustauschchromatographie, die etwa 40 Stunden dauert. In dieser langen Zeit wird das Enzym unvermeidlich geschädigt.
das Enzym auf chemischem Wego—durch phyclologisch unschädliche, ionische Reduktionsmittel—zu schützen. Da die
ist—zu einer wesentlichen Abschwächung der Nebenwirkungen führt.
2,5g rohes Chymopapain werden in 135ml 1OmMoI Cystein enthaltendem Phosphatpuffer (3mMol, pH6,5) gelöst. Wenn die
einem Puffer Chromatographien, der 3mMol Phosphat und 1 mMol Cystein enthält und einen pH-Wert von 6,5 aufweist. Daserste Peak (in Fig. 1 mit A bezeichnet) enthält das Chymopapain, etwa 1,3g.
100 μ! einer mit Acetonitril bereiteten ZGN-Lösung von 1 mg/ml Konzentration.
2,8 ml 0,1 M Acetatpuffer des pH· Wertes 5,5, der 1 mMol EDTA enthält,
100μΙ Chymopapain.
meßbare Änderung der optischen Dichte (Extinktion) angegeben, die 1 mg Chymopapain pro ml Reaktionsgrimisch hervorruft.
(5 χ 100cm). Spezifische Aktivität: 70.
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß eine kurze und schnelle Säule verwendet wird (10 χ 16cm). Hier tritt keine Trennung der mit Bariumchlorid einen Niederschlag ergebenden Substanz von dem Chymopapain ein. Spezifische Aktivität: 42.
sondern bei 2-1O0C vorgenommen wird. Spezifische Aktivität: 65
wird. Spezifische Aktivität: 53.
3mM, sondern 1OmM beträgt. Spezifische Aktivität: 63
"dan arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß statt des Phosphatpuffers mit pH 6,5 ein Acetatpuffer mit dem pH-Wert 5,5 verwendet wird. Spezifische Aktivität:
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß der Puffer nicht 1 mM Cystein, sondern 5mM Cystein enthält. Spezifische Aktivität:
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß man der die aktive Substanz enthaltenden Fraktion (Peak A) bezogen auf die vorhandenen Eiweiße 10Ma.-% Cystein zusetzt. Spezifische Aktivität:
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Woise mit dem Unterschied, daß man als Reduktionsmittel statt des Cysteine Natriumsulfit verwendet. Spezifische Aktivität:
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß von allen drei chromatographischen Peaks eine Probe von je 1 ml Volumen genommen wird und zu jeder Probe 0,2 ml η Ssfcsäure und 0,2 ml 12%ige Bariumchloridlösung gegeben werden. Ein Niederschlag entsteht nur in der Fraktion B.
Die Aktivität des als Referenz verwendeten Präparates Chimodiactin" (Smith Laboratories Inc., USA) wird auf die in Beispiel 1 angegebene Weise gemessen. Sie beträgt
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von Chymopapain aus rohem Chymopapain, dadurch gekennzeichnet, daß das rohe Chymopapain in Gegenwart eines Reduktionsmittels in Wasser oder einem Puffer aufgelöst, der klare Überstand der Lösung einer Gelchromatographie unterzogen wird und die das aktive Enzym enthaltenden Fraktionen gesammelt und gefriergetrocknet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reduktionsmittel Cystein, Mercaptoäthanol oder Natriumsulfit verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer ein Phosphat- oder Acetatpuffer eines zwischen 5 und 7 liegenden pH-Wertes verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als chromatographische Säule Sephadex G-50 oder Sephadex G-25 verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis zwischen Länge und Durchmesser der verwendeten Säule zwischen 5:1 und 50:1, vorzugsweiie bei 20:1, liegt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefriertrocknung in an sich bekannter Weise, vorzugsweise bei 400C und einem Druck von 6,665Pa, durchgeführt wird.
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|---|---|---|---|---|
| US5468480A (en) * | 1989-04-28 | 1995-11-21 | The Boots Company Plc | Pharmaceutical composition of purified chymopapain |
| CN1320111C (zh) * | 2004-08-09 | 2007-06-06 | 王美岭 | 一种制备木瓜凝乳酶的方法 |
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