DD276105A1

DD276105A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen das kartoffelblattroll-virus (potato leaf roll virus)

Info

Publication number: DD276105A1
Application number: DD32056888A
Authority: DD
Inventors: Frank Rabenstein; Eckhard Proll; Dieter Reichenbaecher; Johannes Richter; Anita Haase
Original assignee: Adl Der Ddr Inst Fuer Phytopat
Priority date: 1988-10-10
Filing date: 1988-10-10
Publication date: 1990-02-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen das Kartoffelblattroll-Virus (potato leaf roll virus, PLRV). Ziel der Erfindung ist die Herstellung von monoklonalen Antikoerpern definierter Spezifitaet und hoher Bindungsfaehigkeit in guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in an sich bekannter Weise Milzzellen von Maeusen, die mit PLRV immunisiert wurden, mit P3X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die Antikoerper-produzierenden Hybridzellen auswaehlt, die Spezifitaet der Antikoerper bestimmt, die reaktivsten und gegen verschiedene Antigendeterminanten gerichteten Antikoerper ermittelt, die spezifischen und zum Aufbau eines Testsystems zum Nachweis des PLRV in Pflanzenmaterial am besten geeigneten Hybridzellklone auswaehlt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung und nach Transplantation auf histokompatible Maeuse in der Aszitesform einsetzt. Die geeignetsten Hybridzellklone IfP-R10-B/G3, IfP-R10-A/A2 und IfP-R10-A/B10 wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie der AdW der DDR (Liste 1988) unter den Nummern ZIM-0123, ZIM-0119 und ZIM-0115 hinterlegt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pflanzliche Virusdiagnostik.

Description

-2- 278105

2. der zur Selektion der antikörperproduzierenden Hybridoma eingesetzte Enzymimmunoassay, der in folgenden Varianten durchgeführt wird:

a) gereinigtes PLRV, suspendiert in PBS-Puffer (pH 7,2), wird an Mikrotestplatten gebunden, danach werden die freien Bindungsstellen an der Plastoberfläche mit Rinderserumalbumin abgeblockt, im nächsten Schritt mit dem KulturOberstand der Hybridome und anschließend mit enzymmarkiertem Anti-Maus-Immunglobulln inkubiert

b) Anti-PLRV-lgG (gereinigt aus Kaninchenantiserum) wird an Mikrotestplatten gebunden, danach erfolgt eine Inkubation mit lyophilisierten PLRV-Infizlerten Kartoffelpreßsäften (als Negativkontrolle wird Saft aus gesunden Pflanzen verwendet), anschließend wird mit KulturOberstand der Hybridoma und danach mit enzymmarkiertem Anti-Maus-Immunglobulin inkubiert

3. daß die erfindungsgemäß eingesetzten Hybridzellinien monoklonal Antikörper gegen verschiedene Determinanten (Epitope) des PLRV sezernieren

4. daß diejenigen monoklonalen Antikörper ausgewählt werden, die gegen unterschiedliche Epitope gerichtet sind und gleichzeitig die größte relative Bindungsfähigkeit besitzen.

Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridzellklone wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR unter folgenden Nummern hinterlegt:

ZIM-0123:lfP-R10-B/G3 ZIM-0119:lfP-R10-A/A2 ZIM-0115:l!P-R10-A/B10.

Die durch die Erfindung hergestellten neuen monoklonalen Antikörper zeichnen sich durch die spezifische Erkennung von nativem PLRV In PflanzensSften aus und sind gegen die Antigendeterminanten A, B und C gerichtet. Die Antikörper eignen sich somit zum Aufbau von Testsystemen, in denen sie einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden,

AusfOhrungsbeispleJ

1. Immunisation von A/J-Mäusen

Etwa vier Wochen alte A/J-Mäuse wurden nach folgendem Schema mit einem gereinigten PLRV-Präparat immunisiert: Immunisation Tage verabreichte Mengen und Form

1. 0 60 Mg In FAkomplett i.p.

2. 28 60 Mg in FA inkomplett I. p. und s. c.

3. 100 10 μς I. v. und 20 μς i.p. ohne Fa

4. 123 15 pg I. v. ohne FA

5. 124 15pgi.v.und15Mgi.p.ohneFA 8. 125 20 Mg I. v. und 20 Mg I. p. ohne FA 7. 126 2OMgIp. ohne FA.

Hervorzuheben Ist, daß die Boosterinjektionen ab 123. Tag (Start 4 Tage vor Fusionsbeginn) sämtlich ohne Freundsches Adjuvans (FA) verabreicht wurden.

2. Herstellung der Hybridzellen aus Milzzellen von A/J· Mäusen und X63-Ag 8.653 Myelomzellen.

Die Fusion von Milz· und Myelomzellen, Kultivierung von Hybridzollen, Kloniorung etc. erfolgte nach Standardmethoden entspr. KÖHLER, G., und MILSTEIN, C, Nature 256,435-497 sowie GODING, J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London (1983).

3. Selektion der Antikörper-produzlerenden Hybridzellen Variante a)

, Gereinigtes PLRV in einer Konzentration von 1 Mg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2 bzw. gereinigtes Gurkenmosalk-Virus (cucumber mosaic virus, CMV) als Negativkontrolle werden durch Inkubation von je ΙΟΟμΙ/well über Nacht im Kü' .!schrank an Mikrotestplatten gebunden. Der Inhalt der Testhöhlungen wird ausgeschüttet und diese dann für etwa 30 Min. mit einer 1%lgen Rinderserumalbuminlösung (RSA) erneut gefüllt. Die Verwendung von PLRV in PBS führt dazu, daß das Virus in seiner Struktur weitgehend erhalten bleibt. Eine Inkubation mit RSA bewirkt, daß eine unspezifisch« Bindung an Plaste verhindert wird, indem freie Bindungsstellen abgeblockt werden.

Nach der Blockierung erfolgt eine/ Inkubation mit 100μΙ Zellkulturüberstand von Hybridomen für 2Std. Der Nachweis der gebundenen monoklonalen Antikörper wird entsprechend etablierter Methoden durchgeführt (RABENSTEIN, F., et al., A.xh. Phytopathol. u. Pflanzenschutz 20,517-519)

Varianto b)

Aus Kaninchenantiserum gereinigte Antl-PLRV-Immunglobuline werden in einer Konzentration von 1 \ig/m\ in Coatingpuffer (0,05 M Natriumcarbonat mit 0,01 % Natriumazid, pH 9,6) gelöst und durch 4Std. Inkubation Im Kühlschrank an Mikrotestplatten gebunden. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Tween erfolgt eine Inkubation im Kühlschrank über Nacht mit PLRV-infizierten bzw. gesunden Kartoffelblattsäften. Der Saft wird mittels einer Walzenpresse hergestellt und Im Verhältnis 1:4 mit Extraktionspuffer (PBS mit 2% Polyvlnylpyrolidon und 0,2% RSA) gemischt. Dieses Gemisch wird In Ampullen abgefüllt und anschließend gefriergetrocknet. Die Verwendung von lyophlllslertem Pflanzenmaterial bietet den > Vorteil, daß während der ganzen Jahreszeit virushaitiges Testmaterial zur Verfügung steht.

Nach der Inkubation mit Pflanzensäften wird mit PBS-Tween gewaschen und mit 100μΙ Hybridomzellkulturüberstand für 2,5Std. inkubiert. Der Nachweis der gebundenen Antikörper erfolgt wie in Variante a).

Im Gegensatz zu früheren Fusionsexperimenten (z.B. R3) konnte unter Verwendung des oben beschriebenen Immunisationsschemas die Fusionsrate und die Am ihl positiver Hybridzellinien wesentlich erhöht werden (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Selektion PLRV-reaktiver Hybridomzellinien

Fuiion	Wachstum	positive Hybridoma	stabile Primärklone	unabhängige Zellinien
R3 R10	36/192 455/480	18 50	1 36	0 bisher 10

Wlhrend R3 keine verwertbaren Hybridomzellinien ergab, wurden aus R10 insgesamt 36 stabile Primärklone erhalten und In flüssigem Stickstoff gelagert. Von diesen 36 Hybrldzellklonen wurden im Screening 28 ausgewählt, die positive Werte in den Testvarianten a) und b) ergaben (/W-Werte größer als 0,25). Bisher konnten 10 unabhängige Hybridomzellinien nach Zellktonierung etabliert werden

Herstellung der Antikörper

Die ausgewählten Hybridzellklone wurden zur Herstellung der Antikörper gemäß üblicher Techniken (KENNETT, R. H., McKEARN,T. J., und BECHTOL, K. B., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new dimension in biological analysis, New York u. London 1981) eingesetzt. Beispielsweise wurden folgende in Tabelle 2 zusammengestellte monoklonale Antikörper erhalten. Von sieben Zellinien stellten wir nach allgemein bekannten Methoden AszitesflOssigkeiten her.

Tabelle 2: Reaktionsfähigkeit ausgewählter monoklonaler Antikörper im Testsystem Variante b)

	Bezeichnung	ZIM-	Titer nach Variante b)	Aszites-
	des		Kultur·	flüssigkeit
mAk	Zellklons	Liste	überstand	10»
PLRV-1	IfP-R 10-A/A2	0119	2»	10«
PLRV-2	IfP-R 10-A/B10	0115	2"	—
PLRV-3	lfP-R10-A/B12	_	2'	-
PLRV-4	IfP-R 10-B/C5	—	2⁴	10»
PLRV-5	IfP-R 10-B/C11	0120	2"	—
PLRV-6	IfP-R 10-B/E2	_	2⁵	10⁷
PLRV-7	HP-R10-B/E3	_	2"	10³
PLPV-8	IfP-R 10-B/E11	0122	2«	10»
Pf HV-9	lfP-R10-B/G3	0123	2»	10*
PLRV-10	lfP-R10-C/G2	0121	2«

5. Kreuzreaktivität und Bindungscharakteristik

Die monoklonalen Antikörper (mAk) PLRV-1 bis PLRV-10 reagierten Im indirekten ELISA der Varianten a) und b) positiv mit PLRV, nicht jedoch mit barley yellow dwarf virus, einem anderen Luteovirus. Polygonale Mausantiseren ergaben Kreuzreaktionen zwischen PLRV und dem zur Luteovirusgruppe gehörenden beet mild

yellowing virus (BMYV). Dieses Ergebnis weist auf gemeinsame Antigendeterminanten hin (siehe auch RICHTER, J., et al.,

Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz 19 [1983], 419-422). Eine solche Kreuzreaktivität zeigten unter den genannten Testbedingungen nur die mAk PLRV-1, PLRV-S und PLRV-10,

während alle anderen Antikörper (siehe Tabelle 2) »Ich durch eine spezifische Reaktion mit PLRV auszeichneten.

PIe Bindungscharakteristika der mAk PLRV-1 bis PLRV-10 wurde nach der bekannten Methode von JORDAN, R., und AEBIG, J., Acta Horticulture 164 (1985), 385-393 bestimmt. Danach zeigten die Antikörper PLRV-1, PLRV-2, PLRV-5, PLRV-7, PLRV-9

und PLRV-10 eine hohe relative Bindungsstärke zum PLRV.

6. Konjugation mit alkalischer Phosphatase

Gemäß gebräuchlicher Methoden, beispielsweise nach CLARK, M. F., und ADAMS, A. J., J. gen. Virol. 34 (1977), erfolgte eine Konjugation der gereinigten mAk mit alkalischer Phosphatase.

7. Epitopanalyse

Die Analyse wurde mit einem gereinigten PLRV-Präparat durchgeführt. Erfolgte eine Hemmung der Bindungsfähigkeil von mAk-Enzymkonjugation durch einen im Überschuß zugegebenen nichtmarkierten zweiten mAk, so wurde geschlußfolgert, daß beide Antikörper um die gleiche Antigendeterminante konkurrieren unu dasselbe Epitop auf dem Hüllprotein des PLRV orkennen. Unter den sechs ermittelten mAk mit einer hohen relativen Bindungsstärke (siehe 5.) erkennen PLRV-5, PLRV-7 und PLRV-9 die gleiche Antigendeterminante (A), wobei PLRV-9 die höchste relative Bindungsstärke besitzt. Eine weitere Determinante (B) wird von den Antikörpern PLRV-1 und PLRV-10 erfaßt, während PLRV-2 mit der Determinante C reagiert. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Antigendeterminanten A, B und C auf dem PLRV nachgewiesen worden können, die von den mAk PLRV-9, PLRV-1 und PLRV-2 mit der jeweils höchsten relativen Bindungsstärke erfaßt werden. Diese Antikörper, die von den Zellinien IfP-R 10 B/G3, IfP-R 10-A/A2 und IfP-R 10-A/B 10 produziert werden, eignen sich somit zum • Aufbau von Testsystemen, in denen sie einzeln oder in Kombination elngosetzt werden können.

8. Virusnachweis In Pflanzenproben

Die mAk PLRV-1, PLRV-2 und PLRV-3 wurden beispielsweise zum Virusnachweis in Kartoffelpflanzen eingesetzt, die Im Rahmen eines Resistenzprüfprogrammes künstlich im Gewächshaus mit PLRV infiziert wurden. Die Testdurchführung

erfolgte nach Variante b). Jedoch kamen anstelle von Kulturüberständen gereinigte mAk in einer Konzentration von δμς/ηηΙ zum EinsaU. Zu Vergleichszwecken wurde ein Standardtest (direkter DAS-ELlSA) unter Verwendung eines polyklonalen Enzymkonjugates durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3: Nachweis des PLRV in einer infizierten Kartoffelprobe

Verdünnung	monoklonaler Antikörper	PLRV-2	PLRV-9	polyklonaler
des Blatt		1,85	2,15	DAS-
extraktes	PLRV-1	1,40	1,88	ELISA
1:20	0,69»	0,65	0,99	1,56
1:80	0,52	0,26	0,45	0,97
1:320	0,31			0,18
1:1280	0,09	0,01	0,01	0,08
Gesundkon
trolle 1:20	0,03		0,02

* Extinktion bei 405nm nach einer Std. Subatratlnkubalion

Die Ergebnisse sind Mittelwerte aus 3 getrennten Experimenten mit jeweils 2 Wiederholungen und stellen die Eignung der mAk zum Nachweis des PLRV in Pflanzenmaterial unter Beweis. Die Verwendung von PLRV-9 in du beschriebenen Testvariante ergibt sogar bessere Resultate als ein polyklonales Enzymkonjugat.

In weiteren Experimenten wurde die Eignung des mAk PLRV-9 (Konzentration 5pg/ml) zum Nachwels des PLRV in Kartoffelkeimen untersucht. Die Testdurchführung erfolgte ebenfalls nach Variante b). Anstelle von Blattextrakten wurden jedoch Extrakte von Dunkelkeimen eingesetzt. Die Inkubationsdauer von PLRV-9 betrug 3Std. und die des Anti-Mausenzymkonjugates 2 Std. Die Ergebnisse der Prüfung von 20 Keimproben sind in Tabelle 4 dargestellt. Zum Vergleich wurde die Prüfung mit einem polyklonalen DAS-ELISA durchgeführt.

Tabelle 4: Nachweis des PLRV in Kartoffelkeimen

Proben	mAk PLRV-9	polyklonaler
Nr.	(5pg/ml)	DAS-ELISA
1	0,02·	0,02
2	0,01	0,02
3	0,03	0,05 .
4	0,08	0,08
5	0,05	0,04
6	0,03	001
7	0,00	0,05
8	0,00	0,01
9	0,63	1,12
10	0,58	0,31
11	0,19	0,14
12	2,14	2,12
13	2,29	2,24
14	2,02	1,94
15	1,33	1,79
16	0,18	0,24
17	0,63	0,96
18	0,18	0,25
19	0,82	1.27
20	0,08	0,03

Extinktion bei 405 nm nach einer Std. SubitratlnV.ubatlon

Claims

Verfahren zur Herstellung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen das Kartoffelblattroll-Virus (potato leaf roll virus, PLiHV) durch Immunisation von Mäusen mit PLRV, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion PLRV-reaktiver Hybridzellklone, Auswahl der spezifischen, bindungsstärksten und gegen unterschiedliche PLRV-Determinanten gerichteten, zum Aufbau eines Testsystems zum Nachweis des PLRV in Pflanzenmaterialien am besten geeigneten Antikörperproduzierenden Hybridzellklone und ihre Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäusen in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation die Hybridzellklone lfP-R10-B/G3 (ZIM-Üste 1988 = ZIM-0123), lfP-R10-A/A2 (ZIM-Liste 1988 = ZIM-0119) und IfP-RIO-A/ B10 (ZIM-üste 1988 = ZIM-0115) eingesetzt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Antigendeterminanten des Kartoffelblattroll-Vlrus (potato leaf roll virus, im folgendon mit PLRV abgekürzt). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Diagnose von Pflanzenviren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das PLRV ist ein aphidenübertragbares Pflanzenvirus, das zur Gruppe der Luteoviren gehört. Es verursacht eine Erkrankung an Kartoffelpflanzen, die mit Ertragseinbußen von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung verbunden sein können. Für die Virusdiagnose werden Enzymlmmunoassays angewandt. Infolge der geringen Konzentration, die Luteoviren in ihren Wirten erreichen, erfordert die Virusreinigung und Herstellung von diagnostischen Antiseren einen hohen Aufwand an Oerütetochnik, Material und Zeit (PROLL, E., et. al., Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz 20 (19841,1-13). Monoklonal Antikörper besitzen dagegen neben ihrer ausgezeichneten Spezifitftt die Eigenschaft, daß sie in Q oßer Menge produziert werden können, ohne jedesmal gereinigtes Antigen zur Verfugung haben zu müssen. Die Herstellung von zwei mAk gegen PLRV gelang bereits Martin und Stace-Smith (1984) (MARTIN, R. R., und STACE-SMITH, R., Can. J. Plant Pathol. β (1984), 206-210). Diese mAk reagierten unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen IgG als coating· Antikörper in einem indirekten DAS-ELISA antigenspezifisch, zeigten aber z.T. auch eine unspezifische Bindung an die Plastoberfläche von ELiSA-Testplatten. Nach Enzymmarkierung verloren sie vollständig ihre Aktivität und waren somit nicht in einem direkten DAS-ELISA einsetzbar.

Weitere zehn monokonale Antikörper wurden in Großbritannien gegen ein Isolat des PLRV hergestellt (MASSALSKI, P.R., und HARRISON, B. D., J. gen. Virol. 68 (1987], 1813-1821). Dieso monoklonalen Antikörper konnten zur Unterscheidung von Isolaten des PLRV eingesetzt werdon, die z.T. durch ausschließlich vegetative Vermehrung des Wirtes die Fähigkeit zur Übertragung durch Blattläuse verloren hatten. Die Herstellung neuer spezifischer Antikörper mit besseren, den schon vorhandenen monokicnslsn Ä.v.'körpern fehlenden Eigenschaften, ist zum Aufbau routinemäßig einsetzbarer Testsysteme wünschenswert.

Ziel def Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen PLRV mit hoher Spezifität und starker BindungsfähijKoit in guten Ausbeuten herzustellen. Diese Antikörper sollen zum Aufbau eines Testsystems geeignet sein, das zum Nachweis dos PLRV verwendet werden kann. Der Virusnachweis soll sowohl im Blattmaterial als auch in Kartoffelkeimen möglich sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

De· erflndungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen antigene Determinanten des PLRV ist dadurch gekennzeichnet, daß mnn zunächst In an sich bekannter Weise Milzzollen von Mäusen (z. B. von A/J- oder Balb/c-Mäusen), die mit PLRV nach einem bestimmten Schema Immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653-Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die fusionierten Zollen in Gewebekulturplatten aussät, mit Hilfe «ines Selektionsmediums die Hybridzellen selektiert, mit Hilfe eines indirekten Enzymimmunoassays, der in zwei Varianten durchgeführt wird, diejenigen Hybridomzellen nachweist, die Antikörper gegen natives oder gereinigtes PLPV produzieren, die Spezifität bestimmt, danach die spezifischen Monierten Hybridomzellinlen, weiche monoklonale Antikörper mit der größten Bindungsfähigkeit gegen Antigendeterminanten des PLRV produzieren auswählt, weitervermahrt und ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff, erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation auf histokompatible Mäuse in der Aszitesform einsetzt. Die monoklonalen Antikörper, die im Aszites oder in gesammelten Kulturüberständen enthalten sind, werden in an sich bekennter Weise durch Ammoniumsulfatfällung und Chromatografie an DEAE-Cellulose gereinigt und können dann mit einem ,Enzym oder anderen Marker konjugiert werdon.
Wesentliche Bestandteile der Erfindung sind:

1. da» eingesetzte Immunisationsschema, das die B-Lymphozyten der Milz in einen für dio Zellfusion günstigen Zustand bringt und somit ur Herstellung von Hybridzellen führt, die monoklonale Antikörper mit hoher Bindungsfähigkeit produzieren