DD276601A3 - Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Streptokinase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen Streptokinase. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Antikoerpern hoher Spezifitaet und Affinitaet bei guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren der Herstellung der monoklonalen Antikoerper basiert auf der in vitro oder in vivo Kultivierung der Hybridome H-BL-STREPKI/1 bis /4 (ZIM-0234, ZIM-0275, ZIM-0274 und ZIM-0273). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist der Einsatz der monoklonalen Antikoerper fuer die quantitative Bestimmung der Streptokinase sowie fuer ihre affinitaetschromatographische Reinigung.
Description
ZiT quantitativen Bestimmung mittels radio- oder enzymimrnunologischer Methoden sind bisher nur konventioneile Antiseren, die durch Immunisierung von Versuchstieren hergestellt wer'ien können, benutzt worden. Diese konventionellen Antisoren besitzen eine Reihe von Nachteilen, so sind die Antisersn von differenten Tieren nicht identisch, im Gegenteil, es können beträchtliche Unterschiede hinsichtlich des Gehaltes an Antikörpern, in quantitativer und qualitativer Hinsicht, bestehen. Diese Schwankungen und die Chargenabhängiakeit der Antisere,·; erlauben keine durchgehende Standardisierung.
Monoklonal Antikörper, die von permanent wachsenden und produzierenden Hybridometi sezerniert werden, stehen in praktisch ausreichender Menge und über einen theoretisch unbegrenzten Zeitraum zur Verfügung, so daß sich auf ihrer Grundlage reproduzierbare und standardisierbare Immurassays aufbauen lassen.
Es ist bereits bekannt, wie monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die Prinziplösung dor Hybridomherstellung wutdo von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, |1975), S.49ri) beschrieben.
Es sind aber bisher keine monoklonalen Antikörper gegen Sireptokinnso hergestellt worden.
Die Erfindung hat das Ziel, oin Verfahren zur Herstellung monoklomlor Antikörper anzugeben, das in laicht beherrschbaror Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper gegen die Streptokinase gostaltet.
Die monoklonalen Antikörper sollen sich sowohl zum qualitativen Nachweis als auch zur quantitativen Bestimmung der Streptokinase eignen. Weiterhin sollen sie für die affinitätschromatographische Isolierung und Hochroinigung nach Ankopplung an einen feston Träger geeignet sein.
Durch die Bereitstellung solcher Antikörper soll die Produktionskontrolle und die Reinigung der Streptokinase verbessert werden.
Der Erfindung liegt die Autgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Vorfahren zur Herstellung monoklonalor Antikörper gegen Streptokinase anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in tuchnisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter der Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit Streptokinase spezifisch reagieren -nd sich zu de'on quantitativen Bestimmung und zu deren Isolierung eignen.
Dio Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Vorfahren isolierte Streptokinase als Immunogen verwendet wird. Vorzugsweise worden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse zur Immunisierung verwendet. Die Hyperimmunisierung dor Tiere wird durch r ührmaligo Gabe des Immunogens induziort.
Aus den Milzen derartig hyporimmunisierter Mä'uso werden die Lymphozyten in an sich bukanntor Weise sopariort.
Dio B-Lymphozyton diosos Zellgomischos werdon mit murinen Myolnmzollon fusioniert. Dio gooignoton Maus-Myolomzollen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY ot al., J. Immunol. 123, Γ.979), S. 1548) werdon in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälbersorum (FKS) goiogon.
Dio Fusion wird durch Polyothylonglykol odor durch Feldsprur.gtechnik ousgolöst.
In oinom Kulturmedium, wolchos Hypoxanthin, Aminopturin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Scionco 145,11964], S.709), wordon dio gobildoton Hybrid/ollen von don nicht (usioniorton Myolomzolion abgetrennt und orfindungsgomäß Zollklono soloktiort, dio Antikörper .tor gowünschton Spozifität und dor nndoron gowünschton Eigonschafto.i sozornioron. Dio Soloktion nrfolgt in dor Woiso, daß dio Zollon unmittelbar nach dor Fusion in oino Violzahl von separaton 200pl-Kulturen aufgeteilt wordon.
Dio Üborstando dor dio oufwaclisondon Hybrid/ollon enthaltenden Kulturen wordon auf dio Anwesenheit von Antikörpern gotostot, dio an foslphasonadsorbiorto Stroptokinaso binden. Hiorzu wordon dio Kulturüborotändo mit oinom entsprechenden Enzymimmunassay gotostot. Durch Gogentostung mit oinor Palette von andoron Substanzen wird dio Spozifität für din Streptokinase nochgowioson.
Unter don antikörporproduziorondon Hybridomon worden dann in oinom /vynüen Selckiioi'ssciifiii diojüriige;:! :y!>;idomo ausaewöh!·., dornn Antikörper auch mit Streptokinase auf Immunoblois rnaginrnr«, Deiu wi.-d die Siroptokinaso mit
Natriumdodecylsulfat bei 100 C behandelt und anschließend auf Polyacrylamidgelen (7,5-12%) elektrophoretisch aufgetrennt.
Anschließend werden die Proteine durch Elektroblotting auf Nitrozellulosemembranen übertragen und nach Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen der Nitrozellulose durch Albumin mit den Hybridomüberstanden inkubiert. Die Entwicklung der gebundenen Antikörper erfolgt durch Peroxidase-gekoppelte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper und entsprechende Farbstoffe. Nur die in diesem Test positiven Hybridorne wurden weitergezogen.
In einem dritten Selektionsschritt werden die monoklonalen Antikörper getestet, ob sie zur Isolierung der Streptokinase geeignet sind. Dazu werden die zu testenden Kulturüberstände in die Vertiefungen von Polystyrenmikrotiterplatten gegeben, die mit Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern beschichtet worden waren. Nach Zugabe von radiomarkierter Streptokinase werden die /ur Isolierung fähigen Antikörper identifiziert und die Hybridome weiterkultiviert.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monokionalen Antikörper stabil in hoher Konzentration sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome erhalten die Bezeichnung H-BL-STREPKI/1 bis 4.
Die Herstellung der monoklonalen Antikörper H-BL-STREPKI/1 bis 1 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder /n-v/Vo-Kultur der Hybridome H-BL-STREPKI/1 bis 4 ausgerichtet ist.
Die Hybridome H-BL-STREPKI/1 bis 4 werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw. liegen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monokionalen Antikörper BL-STREPKI/1 bis 4 haben die Registriernummern ZlM-0234, ZIM-0275, ZIM-0274 und ZIM-0273 im Zentralinsitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Die wichtigsten Eigenschaften der Serie monoklonalor Antikörper sind in T libelle 1 zusammengefaßt.
Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse werden mit 100pg gereinigter Streptokinase mit Komplettem Freund'schen Adjuvans i. m. immunisiert. Die Hyperirnmunisierung erfolgt durch dreimalige Gabe des Antigens ohne KFA. Vie' Tage nach der letzten Immunisierung wird die Mi'z entnommen und eine Einzelzellsuspension hergestellt.
Die Lyrnphozyten werden durch Elektrofusion mit mit P3-X63 Ag 8.653-Myolomzellen fusoniert und in HAT-Medium in 8 Mikrogewebekulturplatten (96 Kavitäton) ausgesät.
Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen worden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die an festphasengebundene Streptokinase bindnn. Dazu werden Mikrotiterplattun aus F'olystyren mit Streptokinase POpg/r il) beschichtet. Durch Gegentotlung mit Extrakten aus verschiedenen Bakteriemitammen sowie einer Palette von humanen Serumproteinen wird die Spozifität überprüft.
Unter (Jon antikörperproduzierenden Hybridomen werden dann diejenigen aufgedeckt und ausgewählt, deren Antikörper mit Epitopen reagieren, die auch nach Denaturierung der Streptokinase mit Natriumdodecylsulfat und Elektroblotting des an PAGE aufgetrennten Enzyms auf Nitrozellulosemembranen noch vorhandon sind. Die Entwicklung der gebundenen monoklonalen Antikörper erfolgt dabei durch Peroxidase-gekoppelte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper.
In einem dritten Selektionsschritt werden die monoklonalen Antikörper getostot, ob sie zur Isolierung der Streptokinase geeignet sind. Dazu wurden die zu tastenden K.ulturüberstände in die Vertiefungen von Polystyrenmikrotiterplatten gegeben, die mit Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern beschichtet worden waren. Nach Zugabo von radiomarkiortei Streptokinase werden die zur Isolierung fähigen Antikörper identifizierung und die Hybridomo vveiterkultiviert.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Mybridcme werden rekloniert und hochprodukte Subklone selektiert, die die gewünschten mor.oklonolcn Antikörper stabil in hoher Konzentration sezornieron. Die so erhaltenen Hybridome erhalten die Bezeichnung H-BL-STREPKI/1 h: 4.
Tabeile 1
Charakteristika der monoklonalen Antikörper BL-STREPKI/1 bis 4
| Eigenschaft | Monoklonaler Antikörper BL-STREPKI/ | 2 | 3 | 4 |
| 1 | IgG 1 | IgGI | IgM | |
| Isotyp | igG3 | |||
| Eignung als | ja | ja | ja | |
| Dotoktionsantikörper | ja | ja | ja | ia |
| Fangontikörpor | ja | |||
| Roaktion mit Strop'.ok. | ia | ja | ja | |
| nativ | ja | ja | ja | ia |
| NDSdonnturiort | ja | |||
| Affinität | 1500 | 2,0 | 0,5 | |
| K(x 10'1/MoI) | 1000 |
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Streptokinase, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridome H-BLSTREPKI/1, H-BL-STREPKI/2, H-BL-STREPKI/3 und H-BL-STREPKI/4 (KMU) kultiviert b'.w. durch Transplantation in syngene Mäuse in an sich bekannter Weise vermehrt und die monoklonalen Antikörper BL-STREPKI/1 bis 4 (ZIM-0234, ZIM-0275, ZIM-0274 und ZIM-0273) daraus gewonnen werden.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Vorfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit Streptokinase reagieren. Die monoklonalen Antikörper können zur quantitativen Bestimmung von Streptokinase, aber auch zur affinitätschromatographischen Isolierung und Hochruinigung dieses Enzyms eingesetzt werden.
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| DD31669688A DD276601A3 (de) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Streptokinase |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
| DD276601A3 true DD276601A3 (de) | 1990-03-07 |
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| Country | Link |
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1988
- 1988-06-13 DD DD31669688A patent/DD276601A3/de not_active IP Right Cessation
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