DD278818A1 - Verfahren zur biotechnologischen herstellung von pektatlyase (e.c.4.2.2.2.) aus erwinia carotovora - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Pektatlyase (E.C.4.2.2.2.) mittels eines speziell selektierten und angepassten Produktionsstammes des Bakterium Erwinia carotovora und diskontinuierlicher oder semikontinuierlicher Submerskultur in einem komplexen Kulturmedium sowie einer fuer die Enzymsynthese optimalen Prozessfuehrung. Das erfindungsgemaesse Kulturverfahren ergibt eine hohe Pektatlyaseaktivitaet im Kulturfiltrat, welches durch die Fermentation nur gering verfaerbt wird, keine Geruchsbildung aufweist, wenig schleimbildende Substanzen enthaelt und sich ohne Schwierigkeiten thermisch bzw. durch Ultrafiltration aufkonzentrieren laesst. Die Pektatlyase findet als Pflanzengewebe mazerierendes transeliminativ spaltendes pektolytisches Enzym in der Lebensmitteltechnologie und fuer wissenschaftliche Zwecke ein zunehmendes Interesse.
Description
Hierzu 1 Seite Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein verbessertes, industriell anwendbares biotechnologisches Verfahren zur Herstellung des pektinspaltenden Enzyms Pektatlyase mittels speziell selektierter und angepaßter Stämme des phytopathogenen Bakteriums Erwinia carotovora und eines geeigneten, ökonomisch vorteilhaften Kulturmediums.
Das Enzym Pektatlyase gewinnt, teilweise in Kombination mit Zellulase spaltenden Enzymen, in der Lebensmitteltechnologie zur Mazeration bzw. vollständigen Verflüssigung von pflanzlichem Gewebe, ein zunehmendes Interesse, wird aber auch als Biochemikalie für wissenschaftliche Untersuchungen (z. B. zur Isolierung pflanzlicher Protoplasten) eingesetzt.
Mögliche Anwendungsgebiete der Pektatlyase sind durch nachstehend aufgeführte Patentschriften belegt:
DD158 610: Verfahren zur enzymatischen Vorbehandlung von Hülsenfrüchten und stückigem Trockengemüse
DD 216 617: Verfahren zur enzymatischen Verflüssigung von Gemüse und Speisekartoffeln
DD 247 147: Verfahren und Vorrichtung zur Behandlung von Leguminosensamen und stückigem Gemüse
DD 247 923: Verfahren zur Herstellung von oligemeren 4-0-a-D-(4,5-Dehydrogalacturonosyl)-D-galacturonaten
bzw. -galacturonsäuren DDWPC12P/3069702: Applikation von Enzymkulturlösungen aus Erwinia carotovora für den Aufschluß von
Ceralienrohstoffen
Bei den bisher bekannten und teilweise angewendeten Verfahren:
DD AP 94 059: Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates
DDVVP158648: Verfahren zur Herstellung von Pektatlyase
VVP (V12N/266 6651): Verfahren zur mikrowellen Herstellung komplexer Enzymgemische zur Gewebemazeration
wurden als extrazellulär Pektatlyase bildende Mikroorganismen Bacillus polymyxa oder speziell selektierte Stämme des phytopathogenen Bakteriums Erwinia carotovora und als Kulturmedien halbsynthetische bzw. komplexe Nährlösungen verwendet. Erstere enthalten als Induktorun der Pektatlyase-Synthese und Ausschüttung bestimmte Aminosäuren und Pektin und sind aus wirtschaftlichen Gründen für eine Enzymherstellung im Labor- und nicht im technischen Maßstab geeignet. Das letzte Verfahren beruht auf der Verwendung von Abprodukten der kartoffelverarbeitenden Industrie (Kartoffelzollsaf» und Pulpe) als Induktoren der Pektatlyasebildung. Trotz der ökonomisch günstigen Parameter wirkt sich die sortenabhängige und verarbeitungsmäßig bedingte wechselnde Zusammensetzung dieser Abprodukte teilweise sehr nachteilig auf die Höhe der Enzymproduktivität aus. Diese relativ leicht verderblichen Bestandteile des Nährsubstrates sind saisonbedingt nur eine relativ kurze Zeitspanne verfügbar, wodurch keine ganzjährige Produktion gewähleistet ist. Außerdem wird durch den Fermentationsprozeß eine intensive Dunkelverfärbung des Kulturfiltrates bewirkt, die von einer starken und unangenehmen Geruchsbildung begleitet ist, wodurch eine zusätzliche aufwendige Reinigungsprozedur erforderlich wird. Versuche, die in den beiden Verfahren verwendeten Enzyminduktoren durch verfügbare komplexe Medien zu ersetzen, erbrachten mit diesem, speziell an das genannte Kartoffelmedium angepaßten Erwinia-Stamm, nur eine ungenügende geringe Pektatlyase-Ausbeute.
Ziel der Erfindung ist ein verbessertes, industriell anwendbares biotechnologisches Verfahren zur Herstellung extrazellulärer Poktatlyase unter Verwendung eines dafür selektierten und angepaßten Stammes des kartoffelpathogenen Baktoriums Erwinia carotorova in Submerskultur in herkömmlichen Rührfermentoren mittels eines wenig aufwendigen und gut reproduzierbaren optimierten Fermentationsirozesses mit ökonomisch günstigen Kulturmedien aus weitgehend einheimischen und ständig verfügbaren Rohstoffen.
Da» Kulturfiltrat soll eine hohe Enzymaktivität besitzen, nur eine geringe Verfärbung und Geruchsbilciung aufweisen und keine die Aufarbeitung erschwerenden schleimigen Substanzen enthalten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die aufgezeigten Nachteile der bisherigen Verfahren zur Herstellung von Pektatlyase im technischen Maßstab zu beseitigen und mittels speziell selektierter und angepaßter Wildstämme von Erwinia carotovora in einem kurzzeitigen Ferment&tionsprozeß mit einem wirtschaftlich vorteilhaften Kulturmedium, bestehend aus weitgehend einheimischen und gut lagerfähigen Rohstoffen, eine saisonunabhängige und gut reproduzierbare Produktion mit einer erhöhten Ausbeute und einwandfreier Qualität zu gewährleisten. Erfindu'.gsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß aus einer Vielzahl von Einzelisolaten aus schwarzbeinigkeitskranken Kartoffelstengeln unterschiedlicher Sortenzugehörigkeit und Provenienz überraschenderweise ein Stamm des Erregers Erwinia carotorova mit den gewünschten Eigenschaften selektiert und durch laufende Anreicherungskulturen in seiner Leistungsfähigkeit weiter gesteigert werden konnte. Als wichtigstes Selektionsmerkmal diente die Höhe der Pektallyaseaktivität (S4dU · ml"') in einem flüssigen Kulturmedium, bestehend aus anorganischen Salzen, Soja-Extraktionsschrot, gemahlenen Zuckerrübenschnitzel oder (und) Trockenerbsen-Schalen sowie eine möglichst hohe Konstanz des Merkmals Pektatlyase-Produktion nach einer mehr oder woniger häufigen Passage der Stammkulturen auf einem Agarsubstrat. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Produktionsstamm (hinterlegt bei der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR im ZIMET Jena unter der Reg.-Nr. IMET 11 311) zur Erhaltung der Leistungsmerkmale und des guten Wachstums als „Frostkultui" bei einer Temperatur unter -30°C aufbewahrt und zur Anlage von Impfkulturen auf Agar-Schrägröhrchen überimpft oder auch direkt in das flüssige Kulturmedium für Vorkulturen übertragen.
Erfindungsgemäß hat das Kulturmedium sowohl für die Vorkulturen als «"j."·1, .'ur die Produktionsansätze die gleiche Zusammensetzung und besteht aus den anorganischen Bestandteilen (NH4J2HPO.), KNO3, Na2SO4, CaCI2, AI2(SO4I3 und den organischen komplexen Komponenten Soja-Extraktionsschrot, Zuckorrübenmelosse sowie Zuckerrübentrockensch.iitzel und (oder) Samenschalen von Trockenerbsen. Dieses Kulturmedium ei nöglicht dem dafür selektierten genannten Stamm ein grtes Wachstum und bewirkt in einem kurzzeitigen und optimierten Fern 9ntationsprozeß eine hohe Pektatlyaseaktivität, wobei das Kulturfiltrat nur wenig verfärbt ist und keinen unangenehmen Geruch aufweist. Die Wasserstoffionenkonzentration (pH) des hitzesterilisierten Kulturmediums liegt im Bereich von pH 6,8-7,1 und bedarf während der Fermentation keiner Korrektur. Die Vorkultur I wird als Schüttelkultur (siehe Beispie! 1) in Erlenmeyer- oder Rundkolben in bekannter Weise bei einer Inkubationstemperatur zwischen 20 und 3O0C, vorzugsweise bei 250C durchgeführt. Die Kulturdauer beträgt 20-24 Std., wonach eine Bakteriendichte von 5 · 109-1 · 1O'°Bakt. · ml' erreicht werden. Zur Beimpfung nachfolgender Vorkulturen oder Produktionskulturen ist eine Impfmenge von 1:100 der zu beimpfenden Kulturen ausreichend. Die Vorkultur Il bzw. Ill erfolgt zweckmäßigerweise in normalen Rührfermentoren entsprechender Tankgröße. Bezüglich der Belüftung und der Rührintensität ist kein spezifisches Regime erforderlich (siehe Beispiel 2).
Die Hauptkultur (Produktionskultur) erfolgt entweder als diskontinuierliche Kultur (batch-Verfahren) oder vorteilhafter als semikontinuierliche Kuitur (fed batch-Verfahren) in normalen konventionellen Rührwerkfermentatoren, die mit Einrichtungen des MSR-Technik für Temperatur, Wasserstoffionenkonzentration, O2-Gehalt des Kulturmediums (pO2) und CO2-Gehalt der Abluft versehen sind. Die Synthese der Pektatlyase und deren Exkretion in das umgebende Medium wird durch eine spezifische Piozoßführung wesentlich gefördert, wobei die Limitierung des pO2 und ein optimaler Gehalt an CO; des Kulturmediums durch eine bestimmte Regelung des Lufteintrages und der Rührerdrehzahl zu einem bestimmten Zeitpunkt der logarithmischen Wachstumsphase den Hauptfaktor darstellt. Die Art und Weise der Prozeßführung sowie die Zusammensetzung des Kulturmediums ist ein wesentlicher erfindungsgemäßer Bestandteil des Verfahren*; zur Erzielung einer hohen und sicher reproduzierbaren Ausbeute an Pektatlyase. Die optimale Inkubationstemperatur beträgt 22,50C und ist nicht identisch mit derjenigen, die ein maximales Bakterienwachstum und Biomassebildung ermöglicht.
Der Endpunkt der Pektatlyase - Produktionsphase ist durch eine deutliche, schnell erfofgendo Veränderung der Parameter pO2, CO2-Abluft und bedingt der cH charakterisiert (siehe Beispiel 2,3 u. 4) und kann als Signal für den Fermentationsabbruch genutzt werden.
Erfindungsgemäß wird durch die Anwendun g der semikontinuierli "hen Kultur (fed-Batch-Verfahren) eine wesentliche Produktionssteigerung erreicht: Nach einer normalen „Startkultur" werden srn Ende der Pektatlyase-Bildungsphase (22-24 Stunden Fermentationsdauer) 0,7 bis 0,8 Volumenanteile der Kulturlösung geerntet und erneut mit frischen sterilisiertem komplexen Kulturmedium auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt, wobei ohne erkennbare lag-Phase der Pektatlyasebildung ein starkes Wachstum und Enzymbildung einsetzt (siehe Beispiel 3) und bereits nach 10-12 Std. Fermentation wieder das Maximum an gebildetem Enzym in der Kulturlösung vorhanden ist. Überraschenderweise wird dabei die Pektatlyase-Ausbeute bis mindestens zur 4.-5. Wiederholung von Lauf zu Lauf gesteigert, wobei eine nicht erklärbare Anpassung der Bakterien angenommen werden muß. Damit kann die Gesamtausbeute an Pektatlyase im gleichen Zeitraum gegenüber dem Batch-Verfahren wesentlich gesteigert werden, außerdem entfällt hierbei die Anzucht der Vorkulturen. Die Aufarbeitung der fermentierten Kulturlösung erfolgt in der bekannten Art und Weise und ist mit keinen besonderen Schwierigkeiten verbunden, da der verwendete Bakterienstamm keine hindernden Schleimsubstanzen bildet und das Haupterizym Pektatlyase relativ wenig empfindlich gegenüber den angewendeten Aufbereitungsmethoden ist. Durch Zentrifugieren entsteht ein weitgehend klare» Kulturfiltrat, welches durch Vakuumkonzentration auf die 10-20fache Konzentration eingeengt werden kann. Dieses Vakuumkonzentrat ist bei Temperaturen von 0 bis 4"C bis zu 12 Monaten ohne größere Verluste an Enzymaktivität haltbar. Wesentliche Vorteile bietet dto energiesparende und schonende Einengung des Kulturfiltrates durch eine Ultrafiltration mit Zelluloseazetat-Membranen bis zur Enzymaktivität von 800U · ml"1, wodurch eine weitgehende Entsalzung und Befreiung von anderen niedermolekularen Stoffen erfolgt. Dieses Ultrafiltrations-Konzentrat läßt sich durch Lyophilisation zu einem nahezu unbegrenzt haltbaren Trockenpräparat verarbeiten. Durch eine Zugabe von in der Lebensmitteltechnologie zugelassenen Enzymstabilisatoren (beispielsweise NaHCO3 + CaCI2) ist das durch Ultrafiltration gewonnene Enzymkonzentrat ebenso gut lagerfähig wie das thermisch eingeengte Enzymkonzentrat.
Methodik
Bestimmung der Enzymaktivität von Pektatlyase:
Einheit [U) = Bildung von 1 μΜ ungesättigter Oligouronsäure · mP1 · min ' (T = 250C) Messung: Zunahme der Extinktion bei 235 nm
(McI. Extinktionskoeffizient [ε) = 4800) Substrat: 0,1 % Pektinsäure+1O4 M CaCI2 in 0,1 M TrispufferpH8,0
Zusammensetzung der Kulturmedien:
KulturmedienfürStammkulturen: Nähragarl 34,000g
Pektin(Ao.C) 5,000g
Kartoffelsaft 300,0 ml
H2O 700,0 ml
cH = pH 6,8-7,0
Sterilisation: 30min., 105°C(2x)
Produktionskulturmedium: (NH4I2HPO4 1,800g
(Komplexmedium) KNO3 0,750g
(PKME.cX) Na2SO4-IOH2O 0,200 g
MgSO4 -7 H2O 0,150 g
CaCI2SiCC. 0,050 g
Soja-Extr.-Schrot 15,fl00g
Melasse 15,000g
Zuckerrübentrockenschnitzel 3,750 g
(Erbsen-Samenschalen) (10,000) g
Wasser 1000 ml
Sterilisation: 20-30minbei 120°C
cH: nach Sterilisation auf pH 7,0-7,1 einstellen
Beispiel 1 Submerskultur und Pektatlyasebildung im Labormaßstab a) Vorkultur
Der Leistungsstamm wird als „Frostkonserve" in Abschmelzampullenbei -30 bis -350C aufbewahrt. Das Beimpfen der Vorkultur erfolgt direkt mit diesen oder vorzugsweise nach einer Passage über das Kulturmedium für Stammkulturen in Agar-Schrägröhrchen.
Die Vorkultur I wird als Schüttelkultur mit nachstehenden Parametern angelegt:
Kulturgefäße: Vorzugsweise Erlenmeyer-Kolben 100ml oder Langhals-Rundkolben 750 ml
Kulturmedium: Produktionskulturmedium (25 bzw. 200ml)
Temperatur: 250C
Inkubationsdauer: 20-24 Std.
Bakteriendichte: 5· 108bis1 1010Bakt.mr'
b) Hauptkultur Fermentortyp: Nutzvolumen: Kulturmedium: Inokulum: Temperatur: Belüftung: Rührerdrehzahl: PU2:
Fermentationsdauer: Verlauf der Fermentation: Es bedeuten:
Kulturfiltrat:
Farbe:
Geruch:
Pektatlyase-Aktivität:
Laborfermentor LF 2 (ZWG Mytron Heiligenstadt)
3000 ml
Produktionskulturmedium pH 7,0
25 ml Bakteriensuspension von Vorkultur I
22,5CC
3^i Luft h"1
4 Std. 600, dann 500 rpm
nicht geregelt
24 Std.
siehe Fig.
A = Pektatlyase-Aktivität
B = O2-GehaltinderKulturlösung IpO2)
C = CO2-Gehalt der Abluft
D = Wasserstoffionenkonzentration (pH)
Bei 5000 g 20 min zur Abtrennung der Bakterien und Restbestandteilen des Kulturmediums
zentrifugiert.
leicht gelb-bräunlich, ziemlich klar
fast neutral
39,4 U ml '
Beispiel 2 Submerskultur und Pektatlyasebildung im halbtechnischen Maßstab Nach der Optimierung der Zusammensetzung des Kulturmediums und der Prozeßführung des Ferrrentationsvorganges im Labormaßstab wurde das Verfahren im halbteunnischen Maßstab im 3-m3-Rührwerksfermentor überprüft.
a) Vorkultur I
Wie im Beispiel 1 beschrieben.
b) Vorkultur Il
Rührwerksfermentor üblicher Bauart und einem Tankgesamtvolumen von 30 L
20,0L
Produktionskulturmedium (PKM E.c.X), pH 7,0)
200 ml Bakteriensuspension aus Vorkultur I
250C
300Lh1
300 rpm
22 h
3,5-109Bakt.mr'
21,3UmP'
Fermentor: Nutzvolumen: Kulturmedium: Inokulum: Temperatur: Belüftung: Rührerdrehzahl: Inkubationsdauer: Bakteriendichte: Pektatlyase-Aktivität: c) Hauptkultur Fermentor: Nutzvolumen: Kulturmedium:
Inokulum:
Temperatur:
Belüftung:
Rührerdrehzahl:
Fermentationsdauer:
Verlauf der Fermentation:
Kulturfiltrat:
Farbe:
Geruch:
Pektatlyase-Aktivität:
Rührwerksfermentor herkömmlicher Bauart mit einem Gesamtvolumen von 3 m3
2000L
ProdukuonsküUüiiiiBuium iPKfvl E.c.X)
Sterilisation: 30min 1200C
cH = pH 7,0
20 L Bakteriensuspension aus Vorkultur Il
22,5 0C
25m3Luft h~'für5h,dann 10cm3·h~'
150 rpm für 5 h, dann 100 rpm
nicht geregelt
24 Std.
siehe Fig.
Die Bakterienmasse und Rest der Nährlösungsbestandteile ließen sich ohne Schwierigkeiten
im Seperator abtrennen.
hell gelb-bräunlich, ziemlich klar
fast neutral
43,3UmI"1
Beispiel 3 Semikontinuierliche Kultur (Fed-batch-Kultur) im Labormaßstab Die Eignung der semikontinuierlichen Kultur zur Pektatlyase-Produktion wurde im Laborfermenter LF 2 überprüft. Nach dem Erreichen der stationären Phase der Pektatlyasebildung wurden 75% (2 250ml) der fermentierten Kulturlösung abgelassen und durch die gleiche Menge an frischer steriler Nährlösung (Produktionskulturmedium) ersetzt.
Anlage der Startkultur: wie im Beispiel 1 beschrieben
Temperatur: 22,5°C
Belüftung: 30LLufth"'
Rührerdrehzahl: 500 rpm
Der Endpunkt der Pektatlyase-Bildung ist durch einen rapiden Abfall des CO2-Gehaltes der Abluft gekennzeichnet. Der zeitliche Verlauf der Pektatlyasebildung und der jeweilige CO2-Gehalt der Abluft ist aus der Fig. 3 zu ersehen. Bemerkenswert ist die Zunahme der Pektatlyase-Aktivität in der Kulturlösung nach dem II. und III. Lauf.
Claims (6)
- Erfindungsansprüche:1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Pektatlyase (E.C.4.2.2.2.) aus Erwinia carotova, dadurch gekennzeichnet, daß ein spezifischer Stanm des pflanzenpathogenen Bakteriums Erwinia carotovora, hinterlegt bei der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen in der DDR im ZIMET Jena unter der Reg.-Nr. IMET 11311, in diskontinuierlicher oder semikontinuierlicher Submerskultur in einem komplexen Kulturmedium kultiviert wird und das Enzym extrazellulär in die Kulturlösung ausscheidet.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein volkswirtschaftlich vorteilhaftes komplexes Kulturmedium, bestehend aus weitgehend einheimischen und gut lagerfähigen Bestandteilen (NH4J2HPO4, KNO3, Na2SO4, MgSO4, CaCI2, AI2(SO4)3 sowie Soja-Extraktionsschrot, Zuckerrübenmelasse, Zuckerrübenschnitzel oder (und) Samenschalen von Trockenerbsen, eine hohe und gut reproduzierbare Pektatlyase-Ausbeute ermöglicht und das Kulturfiltrat nur eine geringe Verfärbung und keine Geruchsbildung aufwe ist.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichr et, daß durch eine optimale Prozeßführung mittels Limitierung des Sauerstoffgehaltes sowie ein ir optimalen CO2-Konzentration in der Kulturlösung zu einem bestimmten Zeitpunkt in der lo^arithmischen Wachstumsphase die Synthese und Exkretion der Pektatlyase gefördert wird.
- 4.· Verfahren nach Punkt 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer diskontinuierlichen Kultur die Fermentation nach 20 bis 24 Stunden beendet ist, aber auch eine semikontinuierliche Kultur mit dem gleichen selektierten Erwinia-Stamm im gleichen komplexen Kulturmedium erfolgen kann.
- 5. Verfahren nach Punkt 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das von Schleirrutoffen nahezu freie Kulturfiltrat durch Vakuumkonzentrierung, vorzugsweise jedoch durch Membranfiltration (Ultrafiltration) ohne bemerkenswerte Aktivitätsverluste auf das 20 bis 40fache aufkonzentriert werden kann.
- 6. Verfahren nach Punkt 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Ultrafiltration weitgehend entsalzte und von niedermolekularen Begleitstoffen befreite Enzymkonzentrat durch Zusatz von unbedenklichen Enzymstabilisatoren (NaHCO3 + CaCI2) ohne Aktivitätsverluste aufbewahrt werden kann.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD88324052A DD278818B3 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von pektatlyase (e.c.4.2.2.2.) aus erwinia carotovora |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD88324052A DD278818B3 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von pektatlyase (e.c.4.2.2.2.) aus erwinia carotovora |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD278818A1 true DD278818A1 (de) | 1990-05-16 |
| DD278818B3 DD278818B3 (de) | 1993-03-11 |
Family
ID=5605801
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD88324052A DD278818B3 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von pektatlyase (e.c.4.2.2.2.) aus erwinia carotovora |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD278818B3 (de) |
-
1988
- 1988-12-27 DD DD88324052A patent/DD278818B3/de active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD278818B3 (de) | 1993-03-11 |
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