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Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von
Mevalonsäure. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum
wirtschaftlichen Herstellen von Mevalonsäure mit hoher Aus
beute.
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Es ist bekannt, daß Mevalonsäure in Form einer Säure und in
Form eines Lactons existiert, die leicht ineinander
umgewandelt werden können. Soweit nicht anders angegeben, umfaßt der
Begriff "Mevalonsäure" hier beide dieser Formen.
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Mevalonsäure, die von Wright et al. das erste Mal isoliert
wurde [siehe Journal of the American Chemical Society, 78,
5273-5275 (1956)], ist als wichtiges Zwischenprodukt bei der
Synthese verschiedener Isoprenoide, wie Cholesterin, bekannt.
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Weiterhin spielt Mevalonsäure eine wichtige Rolle im
Metabolismus in Organismen. Beispielsweise fördert sie das
Wachstum verschiedener Mikroorganismen, Tiere und/oder Pflanzen.
Daher wird sie als Wachstumspromoter für Mikroorganismen,
Tiere und Pflanzen verwendet. Weiterhin wird Mevalonsäure als
eine Vorstufe für, beispielsweise Pyrethroid-Agrochemikalien,
Ubichinon, Dolichol und fettlösliche Vitamine verwendet.
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Es ist bevorzugt, natürliche (R-Form) Mevalonsäure für diese
Zwecke zu verwenden. Natürliche Mevalonsäure ist jedoch kaum
verfügbar. Daher wird bisher synthetische, racemische
Mevalonsäure verwendet.
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Ein bekanntes Verfahren für die Herstellung natürlicher
Mevalonsäure umfaßt die Verwendung eines Mikroorganismus, wie
Saccharomycopsis fibuligera, und somit das Anhäufen von
Mevalonsäure in einem Medium mit einer Ausbeute von höchstens
12 mg/ml (siehe offengelegtes japanisches Patent Nr.
216484/1988, Nr. 216485/1988, Nr. 216486/1988 und Nr.
216487/1988). Es wird jedoch gefordert, ein Verfahren
bereitzustellen, wodurch Mevalonsäure mit einer höheren Ausbeute
wirksamer angehäuft werden kann.
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Es ist auch gefordert, ein Verfahren hierfür zu entwickeln,
worin preiswerte Kulturmaterialien verwendet werden, da diese
bekannten Verfahren teure Materialien wie Malzextrakt und
Fleischextrakt erfordern.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
für die Herstellung von Mevalonsäure mit einer hohen Ausbeute
unter Verwendung preiswerter Kulturmaterialien zur Verfügung
zu stellen.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die vorstehende Aufgabe
durch Bereitstellen eines Verfahrens für die Herstellung von
Mevalonsäure durch Kultivieren eines
Mevalonsäure-produzierenden Mikroorganismus in einem Medium gelöst, worin das Medium
(A) 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile, von
Kasein abstammendes Pepton, wobei das Pepton einen
Aminostickstoffgehalt in dem gesamten Stickstoffgehalt von 20 bis 40
Gew.-% aufweist, und (B) 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf
trockene Bestandteile Maisquellwasser als organische
Stickstoffquellen enthält.
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Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung von
Mevalonsäure kann Mevalonsäure wirtschaftlich mit einer hohen
Ausbeute erhalten werden.
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Als das von Kasein abstammende Pepton [A], das in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Pepton
verwendet werden, solange es von verschiedenen Kaseinen abstammt.
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Beispielsweise können solche verwendet werden, die durch
Hydrolisieren von Calciumkaseinat oder Natriumkaseninat,
hergestellt aus Kuhmilch oder Ziegenmilch mit verschiedenen von
Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen abstammenden Proteasen,
wie Pepsin, Trypsin, Pankreatin oder Bromelain, einer Säure
oder einer Base hergestellt sind.
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Das vorstehend genannte Pepton wird erhalten durch Bewirken
der Hydrolyse auf solche Weise, daß der Aminostickstoffgehalt
in dem gesamten Stickstoffgehalt auf 20 bis 40 Gew.-%,
vorzugsweise 25 bis 35 Gew.-%, eingestellt wird.
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Wenn der Gehalt des Aminostickstoffs die oben spezifizierte
Obergrenze übersteigt, würde das erhaltene Pepton häufig eine
große Menge von Unreinheiten, gebildet als Nebenprodukt der
Hydrolyse, enthalten. In diesem Fall würde die Ausbeute der
Mevalonsäure erniedrigt. Wenn der Gehalt des Aminostickstoffs
kleiner ist als die oben spezifizierte Untergrenze, würde die
Ausbeute der Mevalonsäure andererseits auch erniedrigt. Dies
könnte darauf zurückzuführen sein, daß das erhaltene Pepton
für Mikroorganismen weniger verfügbar ist.
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Das Medium enthält das von Kasein abstammende Pepton [A]
in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene
Bestandteile.
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Wenn der Gehalt des von Kasein abstammenden Peptons [A]
kleiner ist als die oben spezifizierte Untergrenze, kann die
Ausbeute der Mevalonsäure nicht erhöht werden. Wenn er
andererseits die vorstehend genannte Obergrenze übersteigt, würde
die übermäßig große Menge der Zellen einen Sauerstoffmangel
verursachen. In diesem Fall kann die Ausbeute der Mevalonsäure
nicht erhöht werden.
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Beispiele der Maisquellflüssigkeit [B], die in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind wie folgt:
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(1) Eine Eintauchflüssigkeit, erhalten durch Eintauchen von
wenigstens frischen und/oder trockenen Körnern von sogenanntem
Mais, d.h. einer Pflanze, die der Gattung Zea (Graminales,
Gramineae) angehört, in warmes Wasser bei 30 bis 70ºC,
vorzugsweise 40 bis 50ºC, mindestens 24 Stunden lang,
vorzugsweise mindestens 48 Stunden lang.
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(2) Ein Kulturmedium, erhalten durch Eintauchen mindestens
frischer und/oder getrockneter Körner des oben genannten Mais
in warmes oder heißes Wasser bei 30ºC oder mehr, vorzugsweise
50ºC oder mehr, für 5 Min oder 24 h, vorzugsweise 1 bis 12 h,
und dann Kultivieren von einem oder mehreren
Milchsäurebakterien, die beispielsweise der Gattung Streptokokkus,
Lactobazillus, Pediokokkus, Bifidobakterium oder Leukonostoc
angehören, auf herkömmliche Weise bei 20 bis 45ºC, vorzugsweise 30
bis 37ºC, für 3 bis 96 h, vorzugsweise 6 bis 48 h.
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Das Medium enthält diese Kornquellflüssigkeit [B] in einer
Menge von 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene
Bestandteile.
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Wenn der Gehalt der Maisquellflüssigkeit kleiner ist als die
oben spezifizierte Untergrenze, kann die Ausbeute der
Mevalonsäure nicht erhöht werden. Wenn er die oben spezifizierte
Obergrenze andererseits übersteigt, würde die übermäßig große
Menge von Zellen einen Sauerstoffmangel verursachen. In diesem
Fall kann die Ausbeute der Mevalonsäure nicht erhöht werden.
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In der vorliegenden Erfindung kann Mevalonsäure wirksamer
hergestellt werden durch Regulieren der Gesamtmenge des von
Kasein abstammenden Peptons [A] und der
Maisquellflüssigkeit [B] auf vorzugsweise 0,2 bis 11 Gew.-%, insbesondere
0,4 bis 5 Gew.-%.
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In der vorliegenden Erfindung kann das Medium, in dem der
Mevalonsäure-produzierende Mikroorganismus kultiviert wird,
dieselbe Zusammensetzung haben, wie bekannte, mit der Maßgabe,
daß zumindest das oben genannte, von Kasein abstammende Pepton
[A] und die Maisquellflüssigkeit [B] darin enthalten
sind. Beispielsweise kann ein Medium verwendet werden, das 5
bis 15 Gew.-% einer Kohlenstoffquelle, wie Glukose oder
Saccharose, 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene
Bestandteile des von Kasein abstammenden Peptons, 0,01 bis 10 Gew.-%,
bezogen auf trockene Bestandteile, der Maisquellflüssigkeit
und Wasser (Ausgleich) umfaßt.
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Dieses Medium kann weiterhin beispielsweise andere organische
Stickstoffquellen, oberflächenaktive Stoffe, wie
nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, die fähig sind, die Zellwand
des Mikroorganismus aufzuschließen, Phosphate und anorganische
Salze, wie Kaliumsalze, Magnesiumsalze und Calciumsalze,
enthalten. Die Menge jeder dieser Additive kann vorzugsweise von
0,01 bis 5 Gew.-% reichen.
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Weiterhin kann das Medium synthetische Polymere und
Silikonschaumverhütungsmittel enthalten.
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Der Mevalonsäure-produzierende Mikroorganismus, der in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein
Mikroorganismus sein, solange er im wesentlichen Mevalonsäure
produzieren kann. Beispielsweise können vorzugsweise solche, die
in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 216487/1988
beschrieben sind, wie zu Saccharomycopsis fibuligera gehörende
Stämme, vorzugsweise verwendet werden, um dadurch Mevalonsäure
wirksam herzustellen.
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Die Methode zum Kultivieren des Mevalonsäure-produzierenden
Mikroorganismus in dem Medium in der vorliegenden Erfindung
ist nicht besonders begrenzt, aber es kann irgendeine bekannte
Kulturmethode verwendet werden. Beispielsweise kann
vorzugsweise ein Verfahren, das in dem offengelegten japanischen
Patent Nr. 216484/1988 beschrieben ist, welches das
Kultivieren eines Mikroorganismus bei 20 bis 40ºC, vorzugsweise 25 bis
35ºC, unter Schütteln oder Belüften und Rühren bei 100 bis 500
rpm, vorzugsweise 200 bis 400 rpm, und mit einer
Belüftungsrate von 0,2 bis 1,5 vvm (Volumen der Luft/Volumen des
Kulturmediums/min), vorzugsweise 0,5 bis 1,0 vvm, umfaßt,
verwendet werden, um dadurch den Mikroorganismus wirksam zu
kultivieren.
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Es ist weiterhin bevorzugt, den Mikroorganismus für eine
bestimmte Zeit unter Schütteln und/oder Belüften und Rühren zu
kultivieren, ein Medium, das eine Kohlenstoffquelle enthält,
dem Kulturmedium einmal oder mehrere Male zuzufügen und das
Kultivieren weiter fortzusetzen, um somit Mevalonsäure
wirksam herzustellen.
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Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
hergestellte Mevalonsäure kann auf bekannte Weise gereinigt werden.
Beispielsweise kann die Reinigung wie folgt durchgeführt
werden. Nach Abschluß der Kultivierung werden die Zellen aus
dem Kulturmedium mit einer bekannten Methode, wie
Zentrifugation oder Filtration durch eine organische synthetische
Membran, wie ein Membranfilter, entfernt. Als nächstes wird
das Kulturmedium mit einem herkömmlichen Verfahren gereinigt,
beispielsweise Reinigung unter Verwendung einer
Umkehrosmosemembran, Kieselgel, eines Ionenaustauschharzes oder eines
porösen Polymerharzes, Lösungsmittelextraktion unter
Verwendung von Ethylacetat oder Methylethylketon, Destillation unter
vermindertem Druck, molekulare Destillation oder
Kristallisation.
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Um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, sind
die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele angegeben.
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In den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen wurde
Mevalonsäure mit der folgenden Methode bestimmt.
[Bestimmung von Mevalonsäure]
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1,0 ml einer Probe wurde in einem Reagenzglas gesammelt und
durch Zufügen von 5 oder 6 Tropfen 50 % (W/W) Phosphorsäure
angesäuert.
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Als nächstes wurde 1 g wasserfreies Na&sub2;SO&sub4; zugefügt. 2,0 ml
Ethylacetat wurden weiterhin zugefügt, und das erhaltene
Gemisch wurde 30 s gerührt.
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Das Gemisch wurde in einem Rotator mit einem Radius von 14 cm
bei 2500 rpm zentrifugiert. Die obere Ethylacetatphase wurde
in ein anderes Reagenzglas A eingeführt und zur Trockenheit
verdampft.
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Der unteren wäßrigen Phase wurden 2,0 ml Ethylacetat zugefügt,
wonach 30 s gerührt wurde.
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Das Gemisch wurde ähnlich zentrifugiert. Die obere
Ethylacetatphase wurde in das Reagenzglas A eingeführt und zur
Trockenheit verdampft.
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Dasselbe Verfahren wurde wiederholt, um insgesamt 6 ml der
getrockneten Ethylacetatphase zu ergeben.
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Dieses trockene Produkt wurde in 1 ml Isopropanol, enthaltend
10 mg/ml γ-Valerolacton (ein Produkt von Aldrich Chemical Co.)
als Bezugselement, aufgelöst und einer
Hochdruckflüssigchromatographie ausgesetzt. Die
Hochdruckflüssigchromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
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Säule: Nucleosil 5 N (CH&sub3;)&sub2; (ein Produkt von M. Nagel.,
Bundesrepublik Deutschland), 4,6 x 250 mm, 40ºC.
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Mobile Phase: n-Hexan/Isopropanol (9/1), 2,0 ml/min.
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Detektor: Differentialrefraktometer
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Injektion: 5ul.
Beispiel 1
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5 ml eines Mediums, umfassend 10 Gew.-% Glukose, 0,5 Gew.-%,
bezogen auf trockene Bestandteile, von Kasein abstammendes
Pepton (Aminostickstoffgehalt: 31 Gew.-%), 1,0 Gew.-% (0,5
Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile)
Maisquellflüssigkeit (Eintauchflüssigkeit, 5ºC, 50 h, enthaltend 50 Gew.-%
Feuchtigkeit), 0,1 Gew.-% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 Gew.-% MgSO&sub4; . 7H&sub2;O,
1,0 Gew.-% CaCO&sub3; und Wasser (Ausgleich), wurden in ein
Reagenzglas eingeführt [24 (Durchmesser) x 200 mm] und bei
121ºC 15 min sterilisiert.
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Eine Platindrahtöse voll Saccharomycopsis fibuligera IFO 0107
(IFO bedeutet ein Stamm, konserviert im Institut für
Fermentation, Osaka), wurde in das oben genannte Medium eingeimpft und
darin bei 28ºC und 300 rpm unter Schütteln kultiviert.
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Am dritten und vierten Tag der Kultivierung wurden dem Medium
0,5 g-Mengen einer 50 Gew.-% wäßrigen Lösung von Glukose
zugefügt, und die Kultivierung wurde bis zum 12. Tag fortgesetzt.
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Die Menge der so hergestellten Mevalonsäure in dem
Kulturmedium, bestimmt gemäß der oben beschriebenen Methode, betrug
14,1 mg/ml.
Vergleichsbeispiele 1 bis 5
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Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der
Ausnahme, daß das von Kasein abstammende Pepton durch die in
Tabelle 1 aufgeführten ersetzt wurde. Dann wurde die Menge der
hergestellten Mevalonsäure in dem Kulturmedium ähnlich
bestimmt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 1
Peptonquelle
Mevalonsäure (mg/ml)
Vergl.bsp.
Tiergewebe
Gelatine
Reis
Baumwollsamen
Sojaprotein
Bemerkung: Jedes Pepton ist ein Produkt von Oriental Yeast Co., Ltd.
Vergleichsbeispiel 6
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Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der
Ausnahme, daß 1,0 Gew.-% Maisquellflüssigkeit durch 0,25 Gew.-%
Hefeextrakt (ein Produkt von Difco Laboratories, Inc.) ersetzt
wurde. Somit wurden in dem Medium 12,1 mg/ml Mevalonsäure
hergestellt.
Vergleichsbeispiele 7 und 8
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Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der
Ausnahme, daß kein Maisquellwasser eingesetzt wurde, während
nicht 0,5 Gew.-%, sondern 1,0 Gew.-% von Kasein abstammendes
Pepton verwendet wurde (Vergleichsbeispiel 7); oder mit der
Ausnahme, daß kein von Kasein abstammendes Pepton verwendet
wurde, während nicht 1,0 Gew.-%, sondern 2,0 Gew.-%
Maisquellflüssigkeit verwendet wurden (Vergleichsbeispie1 8). Als
Ergebnis wurden 0,7 mg/ml (Vergleichsbeispiel 7) und 11,4 mg/ml
(Vergleichsbeispiel 8) Mevalonsäure hergestellt.