DD284049A5 - Verfahren zur herstellung von makrolidverbindungen und pestizide zusammensetzungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Makrolidverbindungen der Formel * worin die Substituenten R1 bis R6, Y1, Y2 und X die in der Beschreibung angegebene Bedeutung haben, die antibiotische Wirksamkeit aufweisen und zur Bekaempfung von Nematoden, Akarinen, Insekten oder anderen Schaedlingen eingesetzt werden koennen. Formel (I){Makrolidverbindungen-Herstellung, antibiotisch wirksam; Bekaempfung Nematoden; Akarinen; Insekten; Schaedlinge}

Description

Verfahren zur Herstellung von Makrolidverbindungen und pestizide Zusammensetzungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuartiger Makrolidverbindungen und die sie enthaltenden Zusammensetzungen«

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In GB-PS 2166436 wird die Herstellung einer Klasse von Substanzen beschrieben_f die als Antibiotika S541 bezeichnet wird, die aus den Fermentationsprodukten einer neuartigen Streptomyces sp. isoliert werden kann. In 6B-PS 2176182 und EP-PS 215654 werden Derivate von Antibiotika S541 beschrieben« die durch chemische und biochemische Methoden aus Antibiotika S541 hergestellt werden. Es wurde jetzt eine weitere Gruppe von Verbindungen gefunden« die aus in den genannten GB-PS beschriebenen Verbindungen hergestellt werden können.

Ziel der Erfindung

Durch die Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen« die eine antibiotische Wirksamkeit besiezen« bereitgestellt. Sie sind besonders nützlich als Zwischenverbindungen bei der Herstellung weiterer Verbindungen mit antibiotischer Wirksamkeit*

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirkender Verbindungen zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß werden somit Verbindungen der Formel (JL)

(D

sowie deren Salze zur Verfügung gestellt, worin R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe darstellt, dl·? jeweils durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, oder R ist eine Gruppe -(CH₂JnR oder eine Gruppe -CH(CH₃)R (wobei η Null oder 1 ist und R eine unter CHO und COpH ausgewählte

Gruppe ist); „ ,

R^ R"⁵

Y -CH₀- ist, Y -CH- ist und X -C- darstellt (wobei

2 8

R ein Wasserstoffatom oder feine Gruppe OR darstellt (dabei

ist OR eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte Hydroxylgruppe mit bis zu 25 Kohlenstoffatomen) und R ein Wasserstoff-

2 3

atom darstellt, oder R und R stellen zusammen mit Kohlenstoffatom, an das sie geknüpft sind, >C=O, >CsCH_o oder

9 9

>C=NOR dar (dabei ist R ein Wasserstoffatom, eine C* g-Alkyl·gruppe oder eine C, g-Alkenylgruppe) und die Gruppe >C=N0R

befindet sich in der E-Konfiguration], oder -Y-X-Y- stellt -CH=CH-CH- oder -CH₂-CH=C- dar;

Ii R

R eine Gruppe OR mit der oben erläuterten Bedeutung darstellt, und R ein Wasserstoff atom darstellt, oder R⁴ i.nd R⁵ stellen zusammen mit dem Kohlenstoffdtom, an das sie geknüpft

Qo Q_n q

sind, >C=0 oder >C=NOR^7d dar (wobei R^7d die für R^y oben erläuterte Bedeutung hat); und

R stellt ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe dar.

Die Gruppe R kann, wenn sie in Verbindungen der Formel (I) vorhanden ist, folgendes darstellen: eine Acylgruppe, z.B. eine Gruppe der Formel R¹⁰CO- oder R¹⁰OCO- oder R¹⁰OCS- (wobei R eine aliphatische, araliphatische oder aromatische Gruppe, z.B. eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Cycloalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist), eine Formylgruppe, eine Gruppe R mit der gleichen wie oben für R erläuterten Bedeutung, eine Gruppe R SO₂- (wobei R¹² eine C^-Alkyl- oder C₆__1Q-Arylgrup-! pe ist), eine Silylgruppe, eine cyclische oder acyclische Ace- ι talgruppe, eine Gruppe -C0(CH₉)nC0_oR (wobei R ein Wasser- \

10 i

stoffatom oder eine Gruppe mit der oben für R erläuterten | Bedeutung ist, und η Null, 1 oder 2 darstellt) oder eine Grup- ,' pe R R NCO- (wobei R und R unabhängig voneinander ein

Wasserstoffatom oder eine C, .-Alkylgruppe darstellen können), i

Wenn R oder R Alkylgruppen sind, können sie zum Beispiel i C₁ n-Alkylgruppen sein, z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, η-Butyl, i-Butyl, t-Butyl oder n-Heptyl, die Alkylgruppen kön- ; nen auch substituiert sein. Wenn R eine substituierte Alkylgruppe ist, kann sie beispielsweise durch eine oder mehrere (z.B. zwei oder drei) Halogenstome (z.B. Chlor- oder Bromatome) oder eine Carboxy-, C₁ /.-Alkoxy- (z.B. Methoxy, Ethoxy), Phen-

11

oxy- oder Silyloxygruppe substituiert sein. Wenn R eine substituierte Alkylgruppe ist, kann sie durch eine Cycloalkylgruppe, beispielsweise Cyclopropylgruppe, substituiert sein. Wenn R¹⁰ und R¹¹ Alkenyl- oder Alkynylgruppen sind, haben sie

vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatome, und wenn R und R Cycloalkylgruppen sind, können sie beispielsweise C^ ,„-Cycloalkyl-, wie C-jT-Cycloalkyl-, z.B. Cyclopentylgruppen sein.

Wenn R und R Aralkylgruppen sind, so besitzen sie in der Alkylkomponente vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomn, und die Arylgruppe(n) kann (können) carbocyclisch oder heterocyclisch sein und vorzugsweise 4 bis 15 Kohlenstoffatome, z.B. Phenyl, : enthalten. Beispiele solcher Gruppen sind Phen-C,_₆-Alkyl, | z.B. Benzylgruppen.

Wenn R und R Arylgruppen sind, können sie carbocyclisch \ oder heterocyclisch sein und vorzugsweise 4 bis 15 Kohlenstoff-ι atome, z.B. Phenyl, besitzen. j

fl 12

Wenn R eine Gruppe R SO₂- ist, kann sie beispielsweise eine

Methylsulfonyl- oder p-Toluensulfonylgruppe sein. ι

8 '

Wenn R eine cyclische Acetalgruppe darstellt, kann sie bei- \ spielsweise 5 bis 7 Ringglieder wie in der Tetrahydropyranyl-

gruppe haben. j

R 1Π

Wenn R eine Silylgruppe darstellt oder R einen Silyloxy- '

substituenten enthält, kann die Silylkomponente drei Gruppen ;

tragen, die gleich oder verschieden sein" können und unter Al- ; kyl-, Alkenyl-, Alkoxy-, Cycloalkyl-, Aralkyl-, Aryl- und Aryl-, oxygruppen ausgewählt werden. Diese Gruppen können die oben

erläuterte Bedeutung haben und insbesondere Methyl-, t-Butyl- ;

und Phenylgruppen einschließen. Besondere Beispiele solcher .

Silylgruppen sind Trimethylsilyl und t-Butyldimethylsilyl. ;

R 13 ^]

Wenn R eine Gruppe -CO(CH₂) CO₂R darstellt, kann sie bei-

spielsweise eine Gruppe -COCO₉R¹³ oder -COCH₉CH₉CO₉R¹³ sein, ;

1 "J Z LLL j

wobei R ein Wasserstoffatom oder eine C, *-Alkylgruppe (z.B. ; Methyl oder Ethyl) darstellt. i

j Wenn R⁸ eine Gruppe R¹⁴R¹⁵NCO- darstellt, dann können R¹⁴ und I R beispielsweise jedes unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Ethylgruppe sein.

9 9a ^ ^!

Wenn R oder R eine C, n^-Alkylgruppe darstellt, kann sie beispielsweise eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butyl-, i-Butyl- oder t-Butylgruppe sein und ist vorzugsweise eine Methylgruppe.

9 9a Wenn R oder R eine C, g-Alkenylgruppe darstellt, kann sie i

beispielsweise eine Allylgruppe sein. ι

Die Gruppe R¹ kann beispielsweise -CH₂OH, -CH₂CH₂OH, -CH(OH)CH₃,, -CH(CH₃)CH₂OH, CK₃C(OH)CH₃, -CO₂H, -CH₂CO₂H oder -CH(CH₃)CO₂H sein.

Verbindungen der Formel (1), die eine saure Gruppe enthalten, können mit geeigneten Basen Salze bilder. Beispiele solcher

j Salze schließen Alkalimetallsalze wie Natrium- und Kaliumsalze ! ein.

ι ι

j In den Verbindungen der Formel (1) stellt R vorzugsweise

I -CH(CH₃)CH₂OH, CH₃C(OH)CH₃ oder -CH(CH₃)CO₂H dar.

j R stellt vorzugsweise eine Acyloxygruppe (z.B. eine Acetyl-

^; oxygruppe) oder eine Methoxygruppe oder noch besser eine Hy-

; droxylgruppe dar.

\ Eine wichtige Gruppe von Verbindungen der Formel (1) ist die- ! "23

! jenige, in der Y¹ -CH₂- ist, Y^z -CH- ist und X -C-

\ darstellt. Besonders wichtige Verbindungen dieses Typs sind

i diejenigen, in denen R^ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxy-,

i "7

¹ Ethoxy- oder Acetyloxygruppe ist und R ein Wasserstoffatom

2 3

ι ist oder R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das

\ sie geknüpft sind, >C = 0, >C = CH₂ oder >C = NOCH-j darstellen.

Wie im vorangegangenen bereits angegeben wurde, besitzen die erfindungsgemäOen Verbindungen antibiotische Wirksamkeit, z.B. , antihelminthische Wirksamkeit, z.B. gegen Nematoden, und insbesondere eine Wirksamkeit gegen Endoparasiten und Ektoparasiten.

Die antibiotische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel (I) kann beispielsweise durch ihre Wirksamkeit gegen parasitische Nematoden wie Caenorhabditis elegans demonstriert werden. |

i Ektoparasiten und Endoparasiten befallen Menschen und viele i

Tiere und kommen besonders bei Tieren in der Landwirtschaft ^;

wie Schweinen, Schafen, Rindern, Zisgen und Geflügel (z.B. Küken und Truthähnen), Pferden, Kaninchen, Jagdvögeln, in Käfigen! gehaltenen Vögeln sowie Haustieren wie Hunden, Katzen, Meer- j schweinchen, Wüstenrennmäusen und Hamstern vor. Parasitische |

Infektionen des Viehbestandes, die zu Anämie, Mangelernährung j und Gewichtsverlust führen, stellen in der ganzen Welt eine Hauptursache für ökonomische Verluste dar.

Beispiele für Gattungen von Endoparasiten, die Tiere und/oder Menschen infizieren sind Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Brugia, Bumestomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia , Dictyocaulus, Oirofilaria, Dracunculus , Enterobius , Haemonchus , Heterakis , Loa , Necator , Nem-atodirus, Nematospiroides,(Heligomoroides), Nippostrongylus , Desophagostomum, Qnchocerca , Ostertacjia , Oxyuris , Parascaris, Strongylus , Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Uncinaria und Wuchereria.

Beispiele von Ektoparasiten, die Tiere und/oder Menschen infizieren, sind Arthropodenektoparasiten wie Beißinsekten, Schmeißfliegen, Flöhe, Läuse, Milben, Sauginsekten, Zecken und andere zweiflüglige Schädlinge.

Beispiele für Gattungen derartiger Ektoparasiten, die Tiere und/oder Menschen infizieren sind Ambylomma, Boophilus, Chorioptes, Culliphore, Demodex, Damalinia, Dermatobia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Lucilia, Melophagus, Oestrus , Otobius, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes, Stomoxys und Tabanus.

Weiterhin sind die Verbindungen der Formel (I) auch bei der \ Bekämpfung von schädlichen Insekten, Akarinen und Mematoden in Landwirtschaft, Gartenbau, Forstwirtschaft, im öffentlichen , j Gesundheitswesen und bei der Lagerwirtschaft nützlich. Schäd- j linge an Boden- und Pflanzenfrüchten, einschließlich Getreide

(z.B. Weizen, Gerste, Mais und Reis), Gemüse (z.B. Soja), Obst j

(z.B. Äpfel, Wein und Zitrusfrüchte) wie auch an Wurzelfrüch- j ten (z.B. Zuckerrüben, Kartoffeln) können wirkungsvoll behan- j delt werden. Besondere Beispiele für derartige Schädlinge sind j Obstmilben und Blattläuse wie Aphis fabae, Aulacorthum circum- : flexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata i lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Pnyllocoptruta olei- _; vora, Tetranychus urticae und Vertreter der Gattungen Trialeu- i roides; Nematoden wie Vertreter der Gattungen Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne und Panagrellus; Lepidopte-

ra wie Heliothis, Plutella und Spodoptera; Kornkäfer wie Antho-i

ί nomus grandis und Sitophilus granarius ; "Sc''warzkäf er wie. Tribo lium castaneum; Fliegen wie Musca domestica; beißende amerikanische Ameisen; Minierfliegen; Pear psylla; Thrips tabaci; Schaben wie Biatella germanica und Periplanata americana und ; Moskitos wie Aedes aegypti.

Erfindungsgemäß werden daher die Verbindungen der Formel (I) mit der oben erläuterten B'.deutung zur Verfügung gestellt, die . als Antibiotika verwendet werden können. Insbesondere können sie bei der Behandlung von Tieren und Menschen mit tndoparasiten-, Ektoparasiten- und/oder Pilzinfektionen und in der Land- ! wirtschaft, im Gartenbau oder in der Forstwirtschaft als Pesti-j zide zur Bekämpfung schädlicher Insekten, Akarinen und Nemato-....'

den eingesetzt werden. Sie können auch allgemein als Pestizide zur Bekämpfung oder Kontrolle von Schädlingen unter anderen Umständen wie z.B. in Lagern, Gebäuden oder anderen öffentlichen Plätzen oder an Schädlingsbefallsstellen eingesetzt werden. Im allgemeinen können die Verbindungen entweder am Wirt (Tier oder Mensch oder Pflanzen oder andere Vegetation) oder an den Schädlingen selbst oder an einer Befallsstelle eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die Verabreichung in jeder für den Einsatz in der Veterinärmedizin oder Humanmedizin günstigen Weise formuliert sein, und die Erfindung umfaßt in ihrem Geltungsbereich daher pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung, die für den Einsatz in der Veterinärmedizin oder Humanmedizin geeignet ist, enthalten. Derartige Zusammensetzungen können für den Einsatz auf herkömmliche Weise mittels eines oder mehrerer geeigneter Trägermittel oder Füllstoffe zur Verfügung gestein werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen schließen diejenigen ein, die in einer Form speziell für die parenterale (einschließlich intramammäre Verabreichung), orale, rektale, topische, ophthalmische, nasale oder urogenitale Verwendung oder als Implantat formuliert sind.

Die Verbindungen der Formel (I) können für die Verwendung in der Veterinär- oder Humanmedizin nach den in GB-PS 2166436 beschriebenen allgemeinen Methoden formuliert werden.

Die tägliche Gesamtdosis der sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin angewandten erfindungsgemäßen Verbindungen liegt geeigneterweise zwischen 1 - 2000 pg/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen 50 - 1000 pg/kg, wobei diese in geteilten Dosen, d.h. 1 bis 4 mal pro Tag gegeben werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in jeder für die Anwendung im Gartenbau oder in der Landwirtschaft günstigen Weise formuliert werden, und die Erfindung schließt daher in ihrem Geltungsbereich Zusammensetzungen ein, die eine für die Anwen-

2 64 04 9

dung im Gartenbau oder in der Landwirtschaft geeignete erfindungsgemäße Verbindung enthalten. Derartige Formu]ierungen sind trocken oder flüssig, z.B. Stäube, einschließlich Staub- ι

grundlagen oder Konzentrate, Pulver, einschließlich lösliche j oder oberflächenaktive Pulver, Granulate, einschließlich Mikro-i granulat und dispergierbares Granulat, Pellets, fließfähige

Stoffe, Emulsionen wie verdünnte Emulsionen oder emulgier'jare ;

Konzentrate, Tauchbäder wie Wurzeltauchbäder und Samentau:h- j

bäder, Saatgutbeizen, Saatgutpellets, Ölkonzentrate, Ollösun- J gen, Injektionen z.B. Stengelinjektionen, Spritzmittel, Räu-

cherm.lttel und Vernebelungsmittel. I

Im allgemeinen enthalten diese Formulierungen die Verbindungen zusammen mit einem geeigneten Träger oder Streckmittel. Derartige Träger und Streckmittel sind in GB-PS 2166436 beschrieben.

In den Formulierungen liegt die Konzentration des wirksamen Materials im allgemeinen zwischen 0,01 und 99 Masse% und noch besser zwischen 0,01 und 40 Masse%.

Handelsübliche Produkte werdpn im allgemeinen als konzentrierte Zusammensetzungen zur Verfugung gestellt, die bei Anwendung bis zur entsprechenden Konzentration verdünnt werden müssen, z.B.

j von 0,001 auf 0,0001 Masse%.

Die Anwendungsmenge einer Verbindung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie dem in Frage kommenden Schädling und dem Grad des Bofalls. Im allgemeinen ist eine Anwendungsmenge von 10 g/ha bis 10 kg/ha geeignet; bei der Bekämpfung von Milben und Insekten vorzugsweise von 10 g/ha bis 1 kg/ha und bei der ; Bekämpfung von Nematoden von 50 g/ha bis 10 kg/ha.

J Für die Verwendung in der Veterinärmedizin oder in der Land-

j wirtschaft und im Gartenbau kann es wünschenswert sein, die

ganze Fermentationsbrühe als Quelle der wirksamen Verbindung

j einzusetzen. Es kann auch angemessen sein, die getrocknete

- (myzelhaltige) Brühe anzuwenden, oder die Myzelia getrennt von_

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der Brühe pasteurisiert oder besser getrocknet, z.B. sprüh-, gefrier- oder walzengetrocknet, anzuwenden. Wenn gewünscht, kann die Brühe oder die Myzelia in Zusammensetzungen formuliert sein, die herkömmliche Trägermittel, Füllstoffe oder Streckmittel wie oben beschrieben enthalten.

Die erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen können zusammen mrt anderen wirksamen Inhaltsstoffen verabreicht oder an- ; gewandt werden. !

Insbesondere die erfindungsgemäße antibiotische Verbindung kann zusammen mit anderen antibiotischen Verbindungen verwendet werden. Dies kann beispielsweise geschehen, wenn die ganze Fermentationsbrühe oder vorherige Trennung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet wird oder wenn die rohen Fermentationsprodukte entsprechend dem erfindungsgemäßen Fermenta'tionsprozeß ohne vorherige oder anschließende Trennung umgesetzt werden; dies kann beispielsweise bei der Verwendung einer Verbindung in der Landwirtschaft vorzuziehen sein, wo die Einhaltung niedriger Produktionskosten eine Rolle spielt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch eine Reihe von im folgenden beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wobei

R , R , R , R , X, Y und Y , falls nichts anderes angegeben, ; die in der allgemeinen Formel (1) erläuterte Bedeutung haben. ; In einigen dieser Verfahren kann es notwendig sein, eine oder ^: mehrere der im Ausgangsmaterial vorhandenen Hydroxylgruppen vor der Durchführung der beschriebenen Reaktion zu schützen. In diesen Fällen kann es erforderlich sein,·den Schutz dieser Hydroxylgruppe(n) wieder zu entfernen, sobald die Reaktion die ; gewünschte erfindungsgemäßj Verbindung erbracht hat. Es können ' herkömmliche Methoden zum Schutz und zur Schutzentfernung an- : gewandt werden, wie beispielsweise die in 'Protective Groups in Organic Synthesis' (Schutzgruppen in der organischen Syn- : these) von Theodora W. Greene (Wiley-Interscience, New York j

1981) und 'Protective Groups in Organic C.emistcy' (Schutzgrup-!

pen in der organischen Chemie) von J.F.W. McOmie (Plenum Press,j

London 1973) beschriebenen Methoden« So kann beispielsweise eine Acylgruppe wie eine Acetylgruppe durch basische Hydrolyse z« B« mittels Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid oder wäßriger Ammoniaklösung wie Methanol entfernt werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1), das die Inkubation einer Verbindung der Formel (2) umfaßt,

(2)

CH₃

(worin X, Y , Y , R und R⁵ die zuvor erläuterte Bedeutung haben und R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe ist) in einem geeigneten Medium in Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines davon abgeleiteten Enzyms oder eines Präparats, das von einem Mikroorganismus stammt, der ein Enzym enthält, das die Umwandlung bewirken kann»

Geeignete Mikroorganismen und deren Extrakte für die Anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren können durch vorherige Tests im kleinen Rahmen, die dazu dienen, die Fähigkeit eines Mikroorganismus oder eines Extraktes daraus zur Umwandlung von Verbindungen der Formel (2) in Verbindungen der Formel (1) zu demonstrieren, herausgefunden werden. Die Bildung der Verbindungen der Formel (1) kann durch geeignete chromatographi-

Analysen (z.B. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) des Reaktionsgemische bestätigt werden.

Es wurden Mikroorganismen der Gattung Streptomyces und Extrakte daraus gefunden, die für die Verwendung in dem erfindungsgemä- ! ßen Prozeß besonders geeignet sind.

Besondere Streptomyces-Mikroorganismen für die Verwendung im : erfindungsgemäßen Verfahren sind die Stämme von Streptomyces avermitilis, Streptomyces cirratus, Streptomyces halstedii, j Streptomyces antibioticus, Streptomyces lavendulae, Strepto- ; myces alboniger , Streptomyces fimbriatus, Streptomyces felleus , j Streptomyces eurythermus, Streptomvces luteogriseus, Streptomyces rimosus, Streptomyces cattley, Streptomyces albus var. j ghye, Streptomyces griseus, Streptomyces plicatus, Strepto-

j

! myces oganonensis, Streptomyces roseochromogenes .und Strepto- j

myces platensis und Mutanten dieser Stämme. j

Insbesondere eignen sich für die Verwendung im erfindungsge- j mäßen Verfahren Streptomyces-Mikroorganismen der Stämme Streptor

Γ myces avermitilis und Streptomyces eurythermus, z.B. Strepto- ;

myces avermitilis ATCC 31272 und Streptomyces eurythermus : ; ISP 5014 sowie deren Mutanten.

Mutanten der oben genannten Stämme können spontan entstellen \ oder können durch mehrere Methoden, einschließlich derjenigen, die in GB-PS 2166436 beschrieben wurden, hergestellt werden. !

Andere verwendbare Bakterien sind Nocardia .orientalis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, I Pseudomonas oleovarans, Mycobacterium rhodochrous, Micrococcus \ flavoroseus , Aerobac t e r aerogenes und Corynebacterium simplex.;

Andere Mikroorganismen, die im erfinüungsgemäßen Verfahren ver^J wendet werden können, sind Pilz- und Pflanzenzellpräparate. i

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2 6 4 049

Beispiele für speziella Pilze, die im erfindungsgemäOen Prozeß verwendet werden können, sind Penicillium oxalicum, Aspergillus clavatus, Rhizopus nigricans, Calonectria decora, Aspergillus ochraceus, Cunninghamella elegans, Gymnoascus reesii, Rhizopus arrhizus , Rhizoctonia muneratii, Calderiella acidophila , Curvularia clavata, Giberella fujikuroi, Absidia orchidis, Absidia cylindrospora, Syncephalastrum racemosum, Cunninghamella·blakesleeana, Cunninghamella echinulata , Mucor hiemlis, Cladosporium herbarum, Helicostylum piriforme, Botryodiploidia theobromae, Curvalaria lunata, Clostridium absonum, Botryodiploidia malorum, Penicillium janthinellum, Pellicularia f ilamentosa, Aspergillus fumigatus, Hyphoderma, roseum Aspergillus phoenicis, Aspergillus niger, Aspergillus giganteus, Glomerulus cingulata, Colletotrichum lini, Cochliobolus lunatus, ghemella orchidis. Cereospora kaki, Fusarium ciliatum, Fusarium lini, Fusarium oxysporum, Colletotrichum phomoides, HeI-minthosporium sativum, Giberella zeae, Leptoporus fissilis, Penicillium lilacinum und Nigrospora sphaerica. Ein besonders geeigneter Pilz für die Verwendung im erfindungsgemäOen Verfahren is Absidia cylindrospora.

Beispiel für Pflanzenzellpräparate für die Verwendung im erfindungsgemäOen Verfahren sind Phaseolus vulgaris L., Citrus paradisi, Nicotiana tabacum L., Coptis jauonica, Digitalis purpurea und Dioscorea tokoro.

Die Biokonversion kann auch mittels eines Organismus, der das genetische Material eines der im vorangegangenen erwähnten Mikroorganismen enthält, und der an der Synthese der Verbindung; der Formel (1) teilnimmt, erfolgen. Derartige Organismen kön- j nen mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden, wie sie ^! von D.A. Hopwood in 'Cloning genes for Antibiotic Biosynthesis i in Streptomyces Spp.: Production of a hybrid antibiotic¹ (Gen- : clonierung für die biosyntheLische Antibiotikumherstellung in : Streptomyces Spp.: Herstellung eines Hybrid-Antibiotikums) j

S. 409-413 in Microbiology 1985, Hrg. L. Lieve, American So- j

ι ciety of Microbiology, Washington D. C. 1985, beschrieben wur- ;

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den. Derartige Verfahren können in ähnlicher Weise angewandt werden, wie sie zuvor zum Cionieren von antibiotischen biosynthetischen Genen, einschließlich der biosynthetischen Gene für Actinorhodin (Malpartida, F. und Hopwood, D.A. 1984, Nature 309, S. 462-464), Erythromycin (Stanzak, R. u.a., 1986, Biotechnology, 4_, S. 229-232) und ein wichtiges Enzym, das an der Produktion von Penicillin und Cephalosporin in Acremonium chrysogenum beteiligt ist (Sansom, S.M. u.a., 1985, Nature 318, S. 191-194) beschrieben wurden.

j Geeignete Enzyme für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich aus einem außerordentlich großen Quellenbereich gewinnen. Die zuvor erwähnten Streptomyces-Mikroorganismen stellen jedoch eine besonders geeignete Quelle für Enzyme dar, die Verbindungen der Formel (2) in Verbindungen der Formel (1) umwandeln können.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann j die Umwandlung einer Verbindung der Formel (2) in eine Verbin- i dung der Formel (1) dadurch erfolgen, das die Verbindung der ! Formel (2) beispielsweise in einem geeigneten Lösungsmittel in i ein Fermentationsmedium gegeben wird, das die. erwähnten Mikroorganismen in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff-, ; Stickstoff- und Mineralsalzquellen enthält. Assimilierbare ' Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralque-llen können entweder '· durch einfache oder komplexe Nährstoffe zur Verfügung gestellt ; werden. Kohlenstoffquellen sind im allgemeinen Glucose, Malto- ^! se, Stärke, Glycerol, Melasse, Dextrin, Lactose, Sucrose, Fruc-i tose, Carbonsäuren, Aminosäuren, Glyceride, Alkohole, Alkane und Pflanzenöle. Die Kohlenstoffquelle umfaßt im allgemeinen 0,5 bis 10 Masse% des Fermentationsmediums.

Stickstoffquellen sind im allgemeinen Sojabohnenmehl, Maisein- ! weichwasser, Brennereiextrakte, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Peptone, Erdnußmehl, Malzextrakt, Melasse, Casein, Aminosäuregemische, Ammoniak (gasförmig-oder in Lösung), Ammoniumsalze oder Nitrate. Harnstoff und andere Amide können ebenfalls

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verwendet werden. Die Stickstoffquellen umfassen im allgemeinen 0,1 bis 10 Masse% des Fermentationsmediums.

Mineralsalze, die in das Kulturmedium gegeben werden können, sind im allgemeinen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, ; Eisen-, Magnesium-, Zink-, Nickel-, Kobalt-, Mangan-, Vanadium-,' Chrom-, Calcium-, Kupfer-, Molybdän-, Bor-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen ergeben können.

Ein Antischaummittel kann zur Bekämpfung übermäßiger Schaumbil- j dung enthalten sein und wird nach Bedarf in Abständen zugegeben.!

Die Verbindung der Formel (2) kann zu Beginn der Kultivierung oder in üblicherer Weise, wenn das Wachstum der Mikroorganismen im Gange ist, z.B. 2 bis 4 Tage nach Beginn der Kultivierung | in einem Lösungsmittel wie einem wassermischbaren·organischen | Lösungsmittel (z.B. einem Alkohol wie Methanol oder Propan-2-olj einem Diol wie Propan-1,2-ol oder Butan-1,3-ol, einem Keton wie Aceton, einem Nitril wie Acetonitril, einem Ether wie Tetra- J hydrofuran oder Dioxan, einem substituierten Amid wie Dimethyl-, formamid oder einem Dialkylsulfoxid wie Dimethylsulfnxid) züge- ; fügt werden.

Die Kultivierung der Organismen erfolgt im allgemeinen bei einerj Temperatur zwischen 20 und 50 ⁰C, vorzugsweise zwischen 25 und 40 ⁰C und findet am besten unter Belüftung und Bewegung, z.B. durch Schütteln oder Ri'hren, statt. Das Kulturmedium kann zu Beginn mit einer kleinen Menge einer Suspension der sporenbildenden Mikroorganismen beimpft werden, um aber eine Wachstumsverzögerung zu vermeiden, kann ein vegetatives Inokulum des Organismus hergestellt werden, indem eine kleine Menge des Kulturmediums mit Sporen des Organismus beimpft wird, und das gewonnene vegetative Inoculum dann in das Fermentationsmedium übertragen wird, oder noch besser in eine oder mehrere Impfferrneritorstuf en, in denen das weitere Wachstum stattfindet, bevor die Übertragung in das Hauptfermentationsmedium erfolgt. Die Fermentation wird im allgemeinen im pH-Bereich von 4,0 bis 9,5,

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vorzugsweise von 5,5 bis 8,5 durchgeführt, wenn Streptomycesi Organismen verwendet werden und vorzugsweise von 4,0 bis 8,5, wenn andere Bakterien oder ein Pilz verwendet werden.

j Nachdem die Verbindung der Formel (2) zum Kulturmedium gegeben ί wurde, in der Regel unter vorsichtigem Mischen, wird die Kultivierung so fortgeführt, daß sich das gewünschte Produkt ansammelt.-Das Vorhandensein des Produktes in der Fermentationsbrühe läßt sich durch überwachung der Extrakte aus der Brühe durch ! Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und UV-Spektroskopie J bei 238 nm bestimmen. i

Das (die) Produkt(e) kann (können) durch herkömmliche Isolations- und Trennverfahren, wie sie in GB-PS 2166436 und 2176182 beschrieben wurden, aus der Fermentationsbrühe isoliert werden.

Wenn Pflanzenzellen als Teil des Fermentationsprozesses verwendet werden, ist es am besten, wenn die Kultivierung mit einem Pflanzenmedium durchgeführt wird, das einen Zellwachstumsreguiator wie Indolessigsäure, Naphthalenessigsäure, Indolbutyrsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Kinetin oder Benzylaminopurin enthält und die Temperatur bei 15 bis 35 ⁰C liegt, wobei der pH-Wert bei 5,0 ^l>is 7,5 gehalten wird. Ammoniumsalze und j Nitrate stellen ebenfalls bevorzugte Stickstoffquellen im Fer-

mentationsmedium dar. Sucross, Fructose und Glucose stellen ebenfalls bevorzugte Kohlenstoffquellen im Fermentationsmedium dar.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Umwandlung einer Verbindung der Formel (2) in eine Verbindung der Formel (1) durch Kombination und Inkubation einer Verbindung der Formel (2) z.B. in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel nach der oben erläuterten Bedeutung) mit einem Enzympräparat, das die Umwandlung bewirken kann, am besten in einer Pufferlösung bei beispielsweise 0° bis 60 ⁰C, vorzugsweise bei 20° bis 40 ⁰C, z.B. bei 28 ⁰C, erfolgen. Die Reaktion erfolgt..

- 17 -

im allgemeinen in einem pH-Bereich von 3,5 bis 8,5, z.B. bei 5,5 bis 7,5. Wenn gewünscht, kann die Reaktion in Gegenwart eines Cofaktors wie NADH oder NADPH durchgyiührt werden. Wenn die Reaktion beendet ist, z.B. wenn die Verbindung der Formel (2) nicht mehr in die erfindungsgernäße Verbindung umgewandelt wird (wie durch die überwachung der Extrakte des Reaktionsgemischs durch Hochleistungschromatographie und UV-Spektroskopie bei 238 nm festgestellt wird), wird das Produkt durch herkömmliche Isolations- und Trennverfahren wie sie in den GB-PS 2166436 und 2176182 beschrieben wurden, gewonnen.

Das für das erfindungsgemäOe Verfahren verwendete Enzym kann \ beispielsweise durch iine Mikroorganismenkultur, die dieses | Enzym in einem Nährmedium herstellt, gewonnen werden. Geeignete j Nährstoffmedien und Fermentationsbedingungen für die Enzymherstellung sind diejenigen, die im vorangegangenen für die Herstellung einer Verbindung der Formel (1) aus einer Verbindung der Formel (2) in Gegenwart eines Mikroorganismus beschrieben wurden.Die Zeit zur Erreichung der maximalen Enzymaktivität hängt natürlich von dem eingesetzten Mikroorganismus ab, und die optimale Kultivierungszeit ist deshalb am besten unabhängig für jeden verwendeten Stamm festzulegen.

Bei Mikroorganismen mit extrazellulärem Enzym kann das flüssige Kulturmedium oder das Filtrat nach der Entfernung der ganzen Zellen als Enzymquelle genutzt werden. Ist das Enzym zellgebunden, kann es durch herkömmliche Methoden für die weitere Verwendung freigesetzt werden, wie beispielsweise durch Beschallung, Mahlen mit Glasperlen, Homogenisierung, Behandlung mit lytischen Enzymen oder mit Detergenzien, nachdem die Zellen in einem geeigneten Puffer suspendiert wurden.

Das entstandene Präparat kann entweder mit oder ohne Entfernung der Zelltrümmer als Enzymquelle genutzt werden. Die weitere Reinigung durch herkömmliche Mittel ist jedoch vorzuziehen. Chargen- oder Säulenchromatographie mit Ionenaustauschercellulose oder Affinitätsabsorptionsmittel oder anderen Absorp_-j

- 18 -

tionsmitteln wie z.B. Hydroxylapatit können günstigerweise an-

j gewandt werden. Außerdem kann das Enzym durch Molekularsiebverfahren, z.B. durch Ultrafiltration oder Aussalzen konzentriert oder weiter gereinigt werden. Im allgemeinen ist es wünschens-

j wert, den pH-Wert während der Reinigungsverfahren im Bereich !

j von 3 bis 11 zu halten.

Gas Enzym kdnn in immobilisiert ir Form, beispielsweise durch Insolubilisierung oder Einschluß in eine geeignete Matrix ver- j

ι wendet werden. Has Enzymextrakt kann dann an ein ansonsten ! ^:

j inertes anorganisches oder organisches Polymer gebunden oder

geknüpft sein, an eine Faser oder an eine Membran oder ein Po- i

lymer wie ein Polyacrylamidgel gebunden oder in diesen einge- i schlossen sein, von einem Ionenaustauscherharz absorbiert sein, j ! mit einem Reagens wie Glutaraldehyd verknüpft sein oder in j : einer Hülle wie eine Perle eingeschlossen sein. Immobilisierte j ! Enzyme lassen sich vorteilhaft sowohl in Chargenprozessen, \ ! nach denen das Enzym wiederverwendet werden kann, und in konti-i nuierlichen Fließprozessen, bei denen die Substrate eine das | j immobilisierte Enzym enthaltende Säule passieren, einsetzen.

;

ι '

In einem weiteren Verfahren können die Verbindungen der Formel

j O

(1), in denen OR eine substituierte Hydroxylgruppe ist, im _: allgemeinen durch Umsetzung der entsprechenden 5- und/oder ; 23-Hydroxyverbindung mit einem Reagens, -das zur Bildung einer substituierten Hydroxylgruppe dient, und falls erforderlich, ; der anschließenden Entfernung von etwa vorhandenen Schutzgruppen, hergestellt werden.

Die Reaktion ist im allgemeinen eine Acylierungs-, Sulfonylie- ^: rungs-, Veretherungs-, Silylierungs- oder Acetylierungsreaktion, und sie kann entsprechend den allgemeinen, in GB-PS 2176182 beschriebenen Methoden durchgeführt werden. :

In einem weiteren Verfahren können die /erbindungen der Formel (1), in denen R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie geknüpft sind, >C=0 darstellen, durch Oxydation der

entsprechenden 5-Hydroxyverbinoungen, in denen R eine Hydroxylgruppe ist, hergestellt werden.

Die Reaktion kann mit einem Oxydationsmittel erfolgen, das zur , J Umwandlung einer sekundären Allyl-Hydroxylgruppe in eine Oxo- | gruppe dient, wobei eine Verbindung der Formel (1) entsteht.

Geeignete Oxydationsmittel sind beispielsweise Oxide von Ubergangsmetallen, wie Mangandioxid, und atmosphärischer Sauerstoff! in Gegenwart eines geeigneten Katalysators wie einem fein ver- '

teilten Metall z.B. Platinum. i

Das Oxydationsmittel wird im allgemeinen im Vergleich zur stöchiometrischen Menge im Überschuß verwendet.

Die Reaktion kann günstigerweise in einem geeigneten Lösungs- j mittel erfolgen, das unter einem Keton, z.B. Aceton; einem \ Ether, z.B. Diethylether, Dioxar; oder Tetrahydrofuran; einem |

Kohlenwasserstoff, z.B. Hexan; einem halogenieren Kohlenwas- serstoff, z.B. Chloroform oder Methylenchlorid; oder einem Ester, z.B. Ethylacetat ausgewählt wird. Kombinationen dieser Lösungsmittel entweder allein oder mit Wasser können ebenfalls ^: verwendet werden.

Die Reaktion kann bei einer Temperatur von -50 ⁰C bis +50 ⁰C, vorzugsweise bei 0° bis 30 ⁰C erfolgen. :

In einem weiteren erfindungsgemäOen Verfahren kann eine Verbindung der Formel (1), in der X die Gruppe >C.= N0R darstellt und : R eine Gruppe OR ist, oder R und R zusammen mit dem Kohlen-; stoffatom, an das sie geknüpft sind, >C=0 darstellen, oder X

-C- darstellt (wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe OR⁸ ist und R ein Wasserstoffatom ist, oder R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie geknüpft sind, _; >C = N0R⁹ darstellen) oder -Y^X-Y² -CH = CH-CH- oder -CH₂-CH = C j darstellt, und R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an:

- 20 -

das sie geknüpft sind, >C=NOR darstellen (wobei Verbindungen ausgeschlossen sind, in denen R eine Gruppe CHO ist), durch

Q Q

Umsetzung mit einem Reagens H₂NOR (wobei R die zuvor erläuterte Bedeutung hat) aus den entsprechenden 5- und/oder 23-Ketoverbindungen hergsstellt werden.

ι Die Oximationsreaktion kann günstigerweise bei einer zwischen

-20 und +100 ⁰C liegenden Temperatur, z.B. bei -10 bis +50 °o,

9

! durchgeführt werden. Es ist günstig, das Reagens H₉NOR in Form eines Salzes, z.B. eines Säureadditionssalzes wie Hydrochlorid, ; zu verwenden. Wenn ein solches Salz verwendet wird, kann die

Reaktion in Gegenwart eines säurebindenden Mittels durchgeführt werden.

Es können Lösungsmittel angewandt werden, die folgende umfassen: Alkohole (z.B. Methanol oder Ethanol), Amide (z.B. N,N-

i Dimethylformamid, Ν,Ν-Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphor-j

amid), Ether (z.B. cyclische Ether wie Tetrahydrofuran oder !

Dioxan, und acyclische Ether wie Dimethoxyethan oder Diethyl- ;

ether), Nitrile (z.B. Acetonitril), Sulfone (z.B. Sulfolan) \

und Kohlenwasserstoffe wie halogenierte Kohlenwasserstoffe j

(z.B. Methylenchlorid), sowie auch Gemische aus zwei oder drei :

dieser Lösungsmittel. Wasser kann ebenfalls als Co-Lösungsmit- ι tel verwendet werden.

Wenn wäßrige Bedingungen angewandt werden, kann die Reaktion i günstigerweise mit einer entsprechenden Säure, Base oder Puffer

gepuffert werden.

Geeignete Säuren sind Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, und Carbonsäure wie Essigsäure. Geeignete Basen sind Alkalimetallcarbonate, und Hydrogencarbonate, wie ' Natriumhydrogencarbonat, Hydroxide wis Natriumhydroxid und Al-. kalimetallcarboxylate wie Natriumacetat. Ein geeigneter Puffer ist Natriumacetat/Essigsäure.

Es sei darauf hingewiesen, daß, wenn die Verbindungen der For-

amm ,9a

9 4 5

mel (1), in denen X >C=N0R darstellt, und R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie geknüpft sind, >C=NOR' darstellen, aus den entsprechenden 5,23-Diketonen (d.h. Verbindungen der Formel (1), in denen X >C = 0 darstellt und R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie geknüpft sind,

>C = 0 darstellen) hergestellt werden, die G uppen >C=N0R und >C=NQR^9a gleich sind.

In einem weiteren ürfindungsgemäßen Verfahren kann eine Verbindung der Formel (1) in der X die Gruppe >C=0 darstellt (wobei Verbindungen ausgeschlossen sind, in denen R eine Gruppe CHO ist) durch Oxydation einer Verbindung der Formel (1), in der X

i ο 3

-C- darstellt (wobei R eine Hydroxylgruppe ist und R

ein Wasserstoff atom ist), und, wenn erforderlich, .durch anschließende Entfernung aller vorhandenen Schutzgruppen hergestellt

werden. Die Reaktion kann mit einem Oxydationsmittel erfolgen, |

das der Umwandlung einer Sekundärhydroxylgruppe in eine Oxo- i

gruppe dient, wobei eine Verbindung der Formel (1) erzeugt j

wird. :

Geeignete Oxydationsmittel sind Chinone bei Anwesenheit von ,

Wasser, z.B. 2 , 3-Dichloro-5,6-dicyano-l,4-benzochinon oder ;

2 ,3,5, 6-Tetrachloro-l,4-benzochinon; ein Chrom(VI)-Oxydations-

mittel, z.B. Pyridiniumdichromat oder Chromiumtrioxid in Pyri- i

din; ein Mangan(IV)-Oxydationsmittel, z.B. Mangandioxid in i

Dichlormethan; ein N-Halogensuccinimid, z.B. N-Chlorsuccinimid '

oder N-Bromsuccinimid; ein Dialkylsulf oxid,, z.B. Dimethylsulf- i

oxid in Gegenwart eines Aktivierungsmittel wi'¹ N,N' -Dicyclo- ;

hexylcarbodiimid oder eines Acylhalids, z.B. Oxalylchlorid; i

oder ein Pyridin-Schwefel-Trioxid-Komplex. ;

Die Reaktion kann günstigerweise in einem geeigneten Lösungs- _:

mittel durchgeführt werden, das ausgewählt werden kann unter: j

einem Keton z.B. Aceton; einem Ether z.B. Diethylether, Dioxan \

oder Tetrahydrofuran; ainem Kohltr;wasserstof f, z.B. Hexan; !

- 22 -

einem haloyenierten Kohlenwasserstoff z.B. Chloroform oder Methylenchlorid; oder einem Ester z.B. Ethylacetat oder einein substituierten Amid z.B. Dimethylformamid. Kombinationen dieser Lösungsmittel entweder allein oder mit Wasser können eben- i falls verwendet werden.

Die Reaktion kann bei einer Temperatur von -80 ⁰C und +50 ⁰C erfolgen.

ι j In einem weiteren erfindungsgemäOen Verfahren kann eine Verbin-;

dung der Formel (1), in der X >C = CH₀ darstellt (wobei Verbin- ;

7 '

düngen, in denen R eine Gruppe CHO oder COOH ist, ausgeschlos-j sen sind) durch Umsetzung der entsprechenden 23-Ketoverbindungen (d.h. Verbindungen der Formel (1), in denen X >C=0 ist) mit einem geeigneten Wittig-Reagens, z.B. einem Phosphoran der | Formel (R^a),P=CH₀ (wobei R^a C₁ ,-Alkyl oder Aryl z.B. mono- '

JL J. — O ' ;

cyclisches Aryl wie Phenyl ist), und, wenn erforderlich, durch j

anschließende Entfernung aller vorhandenen Schutzgruppen her- i

gestellt werden. Die geeigneten Reaktionslösungsmittel sind ;

Ether wie Tetrahydrofuran oder Diethylether oder ein dipolares ;

aprotisches Lösungsmittel wie Dimcthylsulfoxid. Die Reaktion j kann bei jeder beliebigen Temperatur z.B. bei 0 ⁰C durchgeführt;

werden. !

In einem weiteren erfindungsgemäOen Verfahren kann eine Verbin-i dung der Formel (1), in der X -CH₂- darstellt, aus den entspre-i

chenden 23-OH-Verbindungen [d.h. Verbindungen der Formel (1), ι r2 r3 !

^R^>*^R 2 i

in der X -C- darstellt (wobei R eine Hydroxylgruppe j ist und R ein Wasserstoffatom ist)] nach den allgemeinen in GB-PS 2¹76182 beschriebenen Methoden hergestellt werden. _;

In einem noch weiteren erfindungsgemäOen Verfahren kann eine Verbindung der Formel (1), in der -Y^X-X-Y² -CH=CH-CH- oder -CH₀-CH=C- darstellt, aus einer entsprechenden 23-OH-Verbindung der Formel (1) mittels herkömmlicher Verfahren, z.B. der in EP-PS 215654 beschriebenen hergestellt werden.

23 -

Salze von Säuren der Formel (1) können durch herkömmliche Methoden, z. B. durch Behandlung der Säure mit einer Base oder durch Umwandlung eines Salzes in ein anderes durch Austausch eines Ions, hergestellt werden*

Zwischenverbindungen der Formel (2), in der Y -CH₉- ist,

Rf R³

9 λ r 2

Y -CH- ist und X -C- darstellt (wobei R ein Wasserstoff-

atom oder eine Gruppe OR darstellt und R° ein Wasserstoffatom darstellt oder R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie geknüpft sind, >C«O darstellen) oder -Y-X-Y- -CHaCH-CH- oder -CH₂-CHaC- darstellt, sind entweder in GB-PS 2166436 und 2176182 und EP-PS 215654 beschriebene bekannte Verbindungen oder können aus diesen bekannten Verbindungen mittels der oben beschriebenen Verfahrensweisen hergestellt werden.

Zwischenverbindungen der Formel (2), worin Y -CH₂- ist,, Y² -CH- ist und X >C=CH₂ oder >CeNOR⁹ darstellt, können aus bekannten Verbindungen der Formel (2), die in GB-PS 2166436 und 2176182 beschrieben wurden, mittels der oben für die Herstellung der entsprechenden Verbindungen der Formel (1) beschriebenen Verfahren hergestellt werden'.

Ausführungsbelspiele '

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, wobei die Verbindung der obigen Formel (2), in der R¹ Isopropyl ist, Y¹ -CH₉- ist, Y² -CH- ist, R² R³

\ A 2

X -C- darstellt (wobei R eine Hydroxylgruppe ist und R ein Wasserstoffatom ist), R eine Hydroxylgruppe ist und

- 23a -

R ein Waoserstoffa*om ist, als 'Faktor A' bezeichnet wird. Erfindungsgemäße Verbindungen werden in Bezug auf Faktor A bezeichnet. Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben.

Beispiel 1

Steriles Wasser (5 ml) wurde zu einer Schrägkultur Streptomyces eurythermus la: 5014 gegeben, und 1-ml-Portionen wurden zur Beimpfung von 250-ml-Schüttelkolben, die das Me-

dium A (25 ml) enthielten, verwendet:

gTi i

D-Glucose 2,5

Malzdextrose MD30E 25,0 ;

Arkasoy 50 12,5 i Melasse 1,5 KH₂PO₄ 0,125

Calciiimcarbonat 1,25 \

[3-(N-Morpholino)propansulfonsäure] 21,0 j

Destilliertes Wasser nach Bedarf j

Der pH-Wert wurde vor der Behandlung im Autoklaven mit H₂SO. | auf 6,5 eingestellt.

Die Kolben wurden 2 Tage lang bei 28 ⁰C auf einer Drehschüttelj apparatur (250 L) min ) inkubiert, und diese 2 Tage alte Kultur j (100 ml) wurde zur Beimpfung eines das Medium A (5 1) enthalj tenden 7-1-Fermentors verwendet. Die Inkubation wurde unter Be-; j lüftung (2 l/min) und Rühren (250 U min"¹) bei 28 ⁰C fortgesetzt, und nach 2 Tagen wurde eine Lösung aus Faktor A (2,5 g) in Methanol (50 ml) zugesetzt. Die Fermentation wurde weitere 7 Tage fortgesetzt, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und mit Methanol extrahiert. Der wäßrige Überstand wurde nach der Entfernung der Zellen mit konzentrierter Chlorwasserstoff säure auf pH 2,0 eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wurde zu einem Öl eingedampft, zum Methanolextrakt aus den Zellen gegeben und eingedampft .

Der Rückstand wurde mit Methanol (50 ml) extrahiert, und die entstandene Lösung wurde nach einem Vordurchlauf von 800 ml über eine Sephadex-LH20-Säule (130 cm χ 5 cm) in Methanol fraktioniert, (45 ml). Die Fraktionen 18 bis 26 wurden zusammengenommen und eingedampft, und der Rückstand wurde mit Methanol/ Acetonitril/0,1 M Ammoniumdihydrogenphosphat (10:2:2, 12 ml) extrahiert und filtriert. Die Lösung wurde dann in Portionen von 1,9 ml auf eine Säule Spherisorb SS ODS 2 (250 mm χ 20 mm)--

- 25 -

aufgetragen und bei 255 nm nachgewiesen. Acetonitril/0,1 M Ammoniumdihydrogenphosphat (1:1) wurde als Elutionsmittel verwendet, die konstante DurchfluQgeschwindigkeit betrug 25 ml/min, die aus jeder Injektion zwischen 12,2 und 12,8 min und zwis^hnn 14,6-15,6 min eluierten Peaks wurden aufgefangen, und die Frak-j tionen mit den gleichen Elutionszeiten wurden zusammengenommen. ;

Dieses vereinigte Material mit einer Elutionszeit von 12,2 12,8 min wurde mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und j wieder über die Säule gepumpt, mit Acetonitril eluiert, eingedampft, und der Rückstand wurde aus Aceton/Cyclohexan lyophili-i siert und ergab eine Verbindung der Formel (1), in der R j

-CH(CH,)CH₉0H ist, Y¹ -CH₉- ist, X -C- ist, Y-CH- ist,

4 5 6

R öine Hydroxylgruppe ist, R ein Wasserstoffatom ist und R

ein Wasserstoffatom ist, als einen farblossn Feststoff (19 mg)

Ein E.I. Massespektrum mit geringem Auflösungsvermögen hat ein ί Molekülion bei m/z 628 und Fragmentionen bei 610, 592, 500, 482, 464, 425, 354, 314, 313, 28.1, 263, 151 und 95 Masseeinheiten.

Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃) umfaßt Signale bei etwa ί 60,82 (d7; 3H), 1,01 (d7; 3H), 1,09 (d7; 3H), 1,53 (s; 3H), 1,68; (s; 3H), l,88(s; 3H), 2,71(m; IH), 3,27 (m; IH), 3,3-3,6 (m; \

2H), 3,96 (d6; IH). 4,29 (t6; IH), 5,16 (d9; IH). !

25,05 MHz ¹³ NMR (CDCl₃) hat Signale bei etwa: ' '

δ 173,2 (s) 76,4 (d) \

142,6 (d) 68,9 (d) !

139.2 (s) 68,4 (?) ^! 137,6 (s) 68,2 (?) " '

137.3 (s) 67,4 (?) I

134.8 (s) 48,2 (t) \ 131,6 (d) 45,5 (d) : 123,2 (d) 40,8 (t) ; 120,1 (d) 40,5 (t) :

119.9 (d) 35,7 (?) i 117,8 (d) 35,0 (d)

99,6 (a) 34,5 (t)

- 26 -

80.0 (s)

79.1 (d)

22	,1	(q)
19	,7	(q)
16	,6	(q)
15	,3	(q)
13	,9	(q)

11,6 (q)

Mit der gleichen Methode ergab das vereinigte Material mit einer Elutionszeit von 14,6-15,6 min eine Verbindung der For-

OH,^ ^H

mel (1), in der R¹ CH₃C(OH)CH₃ ist, Y¹ -CH₂- ist, X -*C-

2 λ I 5

ist, Y -CH- ist, R eine Hydroxylgruppe ist, R ein Wasserstoffatom ist und R ein sen Feststoff (23,5 mg).

stoffatom ist und R ein Wasserstoffatom ist, als einen farblo-

Ein E.I. Massespektrum mit geringem Auflösungsvermögen hat ein Molekülion bei m/z 628 und Fragmentionen bei 610, 592, 574, 482, 464, 446, 425, 381, 354, 314, 151 und 95 Masseeinheiten.

Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃) umfaßt Signale bei etwa S 0,82 (d7; 3H), 1,00 (d7; 3H), 1,52 (s; 3H), 1,59 (s; 6H), 1,84 (s; 3H), 1,88 Cs; 3H), 3,28 (m; IH), 3,73 (dll; IH), 3,96 (d6; IH), 4,29 (t6; IH), 5,56 (s; IH).

25,05 MHz ^1JC NMR (CDCl₃) hat Signale btfi etwa δ 173,0 (s), 142,5 (d), 139,1 (s), 137,4 (s), 137,2 (s), 136,0 (d), 134,4 (s), 123,1 (d), 119,9 (d), 117,8 (d), 99,5 (s), 79,9 (s), 79,1 (d), 77,0 (d), 70,6 (s), 68,9 (d), 68,3 (?), 68,1 (?),

67.4 (d), 48,1 (t), 45,4 (d), 40,7 (t), 40,4 (t), 35,7 (?),

34.5 (t), 31,3 (q), 30,1 (q), 22,0 (q), 19,6 (q), 15,3 (q), 13,7 (q), 11,5 (q).

Beispiel 2

Faktor A (2,5 g) in Dimethylsulfoxid (50 ml) wurde zu einer Kultur Streptomyces avermitilis ATCC 31272 gegeben, die entsprechend der in Beispiel 1 oben beschriebenen Methode ent-

-27-

wickelt wurde. Die Fermentation wurde weitere 5 Tage fortgesetzt, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt.

(i) Die Zellen wurden in Methanol 16 h aufbewahrt und anschlie- ; Oend filtriert, um 800 ml Filtrat zu ergeben. Wasser wurde zu , dem Filtrat gegeben (bis zu einer relativen Dichte von 0,90), und das Gemisch wurde mit Hexan gewaschen und zur Entfernung des Methanols eingedampft. Der wäßrige Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, und die zusammengenommenen Ethylacetat-j extrakte wurden mit Wasser gewaschen, eingedampft und ergaben I ein Öl. Das Öl wurde in Methanol/Acetonitril/Wasser (2:1:1, j 7,5 ml) gelöst, filtriert, und das Filtrat wurde als 2,5-ml-Portionen auf eine Säule Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm χ 20 mm) '> aufgetragen mit Nachweis bei 238 nm. Acetonitril/Wasser (1:1)

ι wurde als Elutionsmittel verwendet, die konstante DurchfluOge- j schwindigkeit betrug 30 ml/min, die aus jeder Injektion zwischen 10,5-12,5 min und zwischen 25,8-26,7 min eluierten Peaks wurden aufgefangen, und die Fraktionen mit den gleichen Elutionszeiten wurden zusammengenommen.

Die zusammengenommenen Fraktionen mit einer Elutionszeit von 10,5-12,5 min wurden zur Entfernung des Acetonitrils eingedampft, der wäßrige Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, und das Ethylacetatextrakt wurde bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Aceton/Cyclohexan lyophilisiert und ergab eine Verbindung der Formel (1), in der R¹ -CH(CH₃)CH₂OH :

OH^ ^H j

ist, Y¹ -CH₉- ist, X -t- ist, Y² -CH- ist, R⁴ eine :

5 6

Hydroxylgruppe ist, R ein Wasserstoffatom ist und R ein Wasserstoffatom ist, als einen farblosen Feststoff (29,6 mg), der i sich bei HPLC-Analyse als die gleiche Verbindung erwies, die im nachfolgenden Beispiel 2 (ii) gewonnen wurde und die zwischen 15,6 und 17 min eluierte.

Die zusammengenommenen Fraktionen mit einer Elutionszeit zwi- j sehen 25,8-26,7 min wurden mit einem gleichen Volumen Wasser i

verdünnt und zurück über eine Säule Spherisorb S5 ODS-2 (100 mm|

-28 -

2 64 04

χ 4,6 mm) gepumpt, Elutionsmittel war Acetonitril. Das Eluat wurde eingedampft, der Rückstand wurde aus Aceton/Cyclohexan lyophilisiert und ergab eine Verbindung der Formel (1), in der

R¹ -CH(CH,)CH₉OH ist, Y¹ -CH,,- ist, X -C- ist, Y² -CH-

4 5

ist, R eine Methoxygruppe ist, R ein Wasserstoffatom ist, und R ein Wasserstoffatom ist, als einen weißen Feststoff (4,4 mg).

Ein E. I. Massespektrum mit geringem Auflösungsvermögen hat ein ! Molekülion bei m/z 642 und Fragmentionen bei 624, 606, 482, 464, 439, 354, 314, 281, 313, 263, 151 und 95 Masseeinheiten.

j Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃) ergab Signale bei etwa 60,81 (d7; 3H), 1,01 (d7; 3H), 1,07 (d7; 3H), 1,52 (s; 3H), 1,66 (s; 3H), 1,80 (s; 3H), 2,71 (m_; IH), 3,31 (m;lH), 3,50 (s; 3H), 3,96 (d6; IH), 4,02 (d6; IH), 4,95 (m; IH), 5,39 (rh; IH)J

(ii) Der wäßrige Überstand wurde nach Entfernung der Zellen mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde eingedampft, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde in Ac etonitril/0,1 M Ammoniumdihydrogenphosphat (2:1, 15 ml) gelöst, filtriert, und das Filtrat wurde als 4,5-ml-Portionen auf eine Säule Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm χ 20 mm) aufgetragen mit Nachweis bei 238 nm. Acetonitril/0,1 M Ammoniumdihydrogenphosphat/Wasser (5:5:1) wurde als Elutionsmittel verwendet, die konstante Durchflußgeschwindigkeit betrug 30 ml/min und die aus jeder Injektion zwischen 11,2-12,6 min und zwischen 15,6-17 min eluierten Peaks wurden aufgefangen, und die Fraktionen mit gleichen EIutionszeiten wurden vereinigt.

Das vereinigte Material mit einer Elutionszeit von 11,2-12,6 min wurde eingedampft, um das Acetonitril zu entfernen, und der wäßrige Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die zusammengenommenen Ethylacetatextrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet, eingedampft, und der Rückstand wurde lyophilisiert, um eine Verbindung der Formel (1), in der R

HUH ^i]

-CH(CH-JCO₉H ist, Y¹ -CH₉- ist, X ^C- ist, Y² -CH- ist,

4 5 6

R eine Hydroxylgruppe ist, R ein Wasserstoffatom ist und R ein Wasserstoffatom ist, als einen farblosen Feststoff (13 mg) \ zu ergeben. ·

Ein E.I. Massespektrum mit geringem Auflösungsvermögen hat ein j Molekülion bei m/z 642 und Fragmentionen bei 624, 606, 514, 496, 478, 442, 425, 354, 327, 314, 295, 277, 15i und 95 Masseeinheiten. ;

IR (CHBr-j-Lösung) zeigte Banden bei etwa 3500 (OH), 1720 (C0,.h; un d 1696 (CO₂R) cm"¹.

Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃) umfaßt Signale bei etwa 60,79 (d7; 3H), 1,00 (d7; 3H), 1,36 (d7; 3H), 1,53 (s; 3H), 1,68 (s; 3H), 1,86 (s; 3H), 3,27 (m; IH), 3,46 (m; IH), 3,94 (d.6; IH), 4,29 (d.6; IH), 4,96 (m; IM).

ι In ähnlicher Weise ergab das zusammengenommene Material mit einer Elutionszeit von 15,6-17 min eine Verbindung der Formel j OH^ .H

ί (1), in der R¹ -CH(CH^)CH₉OH ist, Y¹ -CH₉- ist, X -C-

2 4 5

• ist, Y -CH- ist, R eine Hydroxylgruppe ist, R ein Wasser-

; stoffatom ist und R ein Wasserstoffatom ist, als einen farblosen Feststoff (23 mg).

Ein E.I. Massespektrum mit geringem Auflösungsvermögen hat ein Molekülion bei m/z 628 und Fragmer.tionen bei 610, 592, 500, 482, 464, 425, 354, 314, 313, 281, 263, 151 und 95 Masseeinheiten .

Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum umfaßt Signale bei etwa 6 0,81 (d7; 3H), 1,00 (d7; 3H), 1,08 (d7; 3H), 1,53 (s; 3H), 1,69 (s; 3H), 1,88 (s: 3H), 271 (m; IH), 3,27 (m; IH), 3,3-6,6 (m; 2H), 3,96 (d6; IH), 4,29 (d6; IH), 5,16 (d9; IH).

- 30 -

20	,0	Bedarf
10	,0
1	,0
nach

Beispiel 3

ί I ktor A (2,5 g) in Methanol (50 ml) wurde zu einer Kultur

j Absidia cylindrospora NNRL 2796 gegeben, die nach der Methode

von Beispiel 1 entwickelt wurde, mit der Ausnahme, daß das

folgende Medium verwendet wurde:

j gl"¹

Ma i se i.nwe ich wasser j Meritose i Sojaöl j Destilliertes Wasser

Der pH-Wert wurde vor der Behandlung im Autoklaven mit Kaliumhydroxid auf 4,8 - 5,0 eingestellt.

Die Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen 5 Tage \

fortgesetzt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation ent- I

fernt. Die Zellen wurden anschließend mit Methanol (400 ml) j

extrahiert. !

Der Überstand der Kulturflüssigkeit wurde bis auf etwa 900 ml ^! eingedampft und mit Ethylacetat extrahiert. Die zusammengenommersn Ethylacetatextrakte wurden eingedampft, und der Rückstand wurde in Methanol (ca. 100 ml) gelöst. Die entstandene Suspension wurde filtriert, und das Filtrat wurde bis zur < Trockne eingedampft.

Der methanolische Zellextrakt wurde zu einem Öl eingedampft, das in Wasser gelöst und mit Ethylacetat extrahiert wurde. Der zusammengenommene Ethylacetatextrakt wurde anschließend zu dem : überstehenden Rückstand gegeben, und das Gemisch wurde getrocknet . ;

Der Rückstand wurde in Chloroform/Ethylacetat (3:1, ca. 30 ml) gelöst und auf eine Säule mit Kieselgel 60 (Merck 5734, 100 ml)i aufgetragen und im gleicher. Lösungsmittel fraktioniert (20 ml).! Die Fraktionen 11 - 32 wurden zusammengenommen und bis zur ;

- 31 -

Trockne eingedampft. Die Säule wurde anschließend mit Ethylacetat eluiert, diese Lösung wurde eingedampft und Lieferte einen Feststoff. Der Rückstand aus den Fraktionen 11 - 32 wurde in 4 Portionen durch präparative Hochleistungsf liissigkeitschroma- ; tographie auf einer Säule mit Spherisorb S5 ODS-2 gereinigt, wobei Acetonitril/Wasser (1:1) als Elutionsmittel verwendet ! wurde, die Durchflußgeschwindigkeit 30 ml/min betrug und der Nachweis bei 238 nm erfolgte. Die aus jeder Injektion zwischen 19,8 und 21,3 min eluierten Peaks wurden aufgefangen und zusammengenommen. Das zusammengenommene Material mit einer Elutions-i zeit von 19,8 - 21,3 min wurde mit einem gleichen Volumen Was- i

I ser verdünnt, über die Säule zurückgepumpt und mit Acetonitril j eluiert. Das Eluat wurde eingedampft und ergab einen Feststoff,; der aus Aceton/Cyclohexan lyophilisiert wurde. Es wurde eine l Verbindung der Formel (1) gewonnen, in der R -CH(CH₃)CH₂ OH j

OH^ _>H . !

ist, Y¹ -CH₉- ist, X -'c- ist, Y² -CH- ist, R⁴ eine Hydro- |

5 6 '

xylgruppe ist, R ein Wasserstoffatom ist und R ein Waaser-

stoffatom ist (96,8 mg). !

Ein E.I. Massespektrum mit niedrigem Auflösungsvermögen hatte ; ein Mclekülion bei m/z 628 und Fragmentionen bei 610, 592, 500, 482, 464, 425, 354, 314, 313, 291, 263, 151 und 95 Masseeinheiten. .

Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃) umfaßt Signale bei etwa 60,82 (d7; 3H), 0,98 (d7; 3H), 1,01 (d7; 3H), 1,54 .'s; 3H), 1,58 (s; 3H), 1,68 (s; 3H), 1,88 (s; 3H), 2,71 (rn; IH), 3,26 (m; IH), 3,96 (d6; IH), 4,29 (t6, IH), 4,97 (m; IH), 5,20 , (d9; IH). 1

Eine ähnliche Behandlung des Ethylacetateluats aus Kieselgej., jedoch mit Acetonitril:Wasser (4:6) als Entwicklungslösungsmittel liefer'e e:.n Peak, der zwischen 20,0 - 22,6 min eluierte, der nach der Rückgewinnung eine Verbindung der Formel (1) ergab, in der R¹ -CH(CH₃)CH₂OH ist, Y¹ -CH₂- ist, X

^0H<v ^

"1 4

-C- ist, Y -CH- ist, R eine Hydroxylgruppe ist, W ein _:

Wasserstoffatom ist und R eine Hydroxylgruppe ist (33,6 mg). ^; Ein E.I. Massespektrum mit geringem Auflösungsvermögen hatte j

ein Molekülion bei m/z 644 und Fragmentionen bei 626, 608, 590, 516, 498, 480, 462, /'25, 354, 314, 151 und 95 Masseeinheiten.

Das 250 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃) umfaOt Signale bei etwa j 00,84 (d7; 3H), 1,01 (d6; 6H), 1,53 (s; 3H), 1,87 (s; 3H), j 3,24 (m; IH), 3,94 (d6; IH), 4,03 (dlO; IH), 4,14 (dll; IH), j 4,24 (dll; IH), 5,01 (m; IH), 5,18 (m; IH). '

62,5 MHz ¹³C NMR (CDCl₃) ergab Signale bei etwa

δ 172,8 (s) 68,1 (?)

142,6 (d) 67,5 (?)

139.2 (s) 67,0 (?) 137,6 (s) 66,7 (t) 137,4 (d) 57,2 (t) 137,1 (s) 48,3 (t) 12·;, 3 (d) 45,6 (d)

120.3 (d) 40,8 (t) 119.9 (d) 40,7 (t) 117,9 (d) 36,5 (.d)

99,8 (s) 35,8 (?)

80.1 (s) 35,7 (?) 79,3 (d) 35,2 (d)

76.5 (d) 34,5 (t)

73.2 (t) 22,1 (q) " 72,8 (t) 19,6 (q) 69,0 (d) 17,2 (q)

68.6 (d) 15,3 (q)

14,0 (q)

Im folgenden sind Beispiele von erfindungsgemäOen Formulierungen aufgeführt. Der Begriff 'Wirkstoff bedeutet in der hier gebrauchten Bedeutung eine erfindungsgemäOe Verbindung.

- 33 -

^parenterale Mehrfachdoseninjektion

Beispiel 1

Wirkstoff Benzylalkohol Polysorbat 80 Glycefolformal Wasser zur Injektion

h M/V

2,0

1,0

10,0

50,0

zu 100,0

Bereich

0,1 - 6.0 h M/V

Den Wirkstoff in Polysorbat 80 und Glycerolformal lösen. Benzylalkohol zufügen und mit Wasser zur Injektion bis zum Volumen auffüllen. Das Produkt mit herkömmlichen Methoden, z.B. sterile Filtration oder durch Erhitzen in einem Autoklaven, sterilisieren und aseptisch verpacken.

Beispiel 2

Wirkstoff Benzylalkohol Glyceryltriacetat Propylenglycol

% M/V

4,0

2,0

30,0

100,0

Bereich

0,1 - 7,5 h M/V

Den Wirkstoff in Benzylalkohol und Glyceryltriacetat lösen

Propylenglycol zugeben und bis zum Volumen auffüllen. Das Produkt durch herkömmliche Methoden, z.B. sterile Filtration, sterilisieren und aseptisch verpacken.

Beispiel 3

Wirkstoff 2,0 M/V

Ethanol 36,0 V/V

Nichtionogenes Netzmittel

(z.B. Synperonic PE L44*) 10,0 M/V Propylenglycol zu 100,0

Bf i.-eich

0,1 - 7,5 H M/V

- 34 -

Den Wirkstoff in Ethanol und im Netzmittel lösen und bis zum Volumen auffüllen. Das Produkt durch herkömmliche pharmazeutische Methoden, z.B. durch sterile Filtration, sterilisieren und aseptisch verpacken.

* Handelsname von ICI

Beispiel 4

•	h	,0	M/V	Bereich
Wirkstoff	2			0,1 - 3
Nichtionogenes Netzmittel		,0	M/V
(z.B. Synperonic PE F68*)	2	,0	M/V
Benzylalkohol	1	,0	V/V
Miglyol 840**	16	,0
Wasser zur Injektion zu	100

Den Wirkstoff im Miglyol 840 lösen. Das nichtionogene Netzmittel und Benzylalkohol im größten Teil des Wassers lösen. Die Emulsion herstellen, indem die ölige Lösung in die wäßrigj Lösung gegeben wird, wobei init herkömmlichen Mitteln homogenisiert wird. Bis zum Volumen auffüllen. Aseptisch herstellen und aseptisch verpacken.

* Handelsname von ICI ** Handelsname von Dynamit Nobel

Aerosolspray

Wirkstoff Trichlorethan Trichlorfluormethan üichlordifluormethan

Μ/Μ

O	,1
29	,9
35	,0
35	,0

Bereich

0,01 - 2,0'/iM/M

Den Wirkstoff mit Trichlorethan mischen und in den Aerosolbehälter füllen. Den Kopfraum mit dem Treibmittel spülen und das ' Ventil in seine Lage drücken. Die erforderliche Masse an flüs- , sigem Treibmittel unter Druck durch das Ventil einfüllen. Zer-_.j stäuberteil und Schutzkappe aufsetzen. I

- 35 -

Tabletten

Herstellungsmethode - Naßnranulierung

mg

Wirkstoff 250,0

Magnesiumstearat 4,5 ^]

Maisstärke 22,5

Natrium-Stärke-Glycolat 9,0

Natriumlaurylsulfat 4,5 j

Mikrokristalline Cellulose bis Tablettenkernmasse von 450 mg

Eine ausreichende Menge eines 10 %igen Stärkekleisters zum j Wirkstoff geben und eine geeignete feuchte Masse zur Granulie- ; rung herstellen. Das Granulat herstellen und mittels Platten- j oder Fließbetttrockner trocknen. Durch ein Sieb geben, die restlichen Inhaltsstoffe zugeben und zu Tabletten pressen.

Wenn erforderlich, die Tablettenkerne mit einem Film aus Hy- i droxypropylmethylcellulose oder einem ähnlichen filmbildenden . Material entweder mittels eines wäßrigen oder eines nichtwäßri-, gen Lösungsmittelsystems umgeben. In die filmbildende Lösung | können Piastiziermittel und geeignete Farbstoffe eingearbeitet

werden. ;

Tierärztliche Tabletten für Klein-/Haustiere I

Herstellungsmethode - Trockengranulierung \

Wirkstoff 50,0 i

Magnesiumstearat , 7,5 j

Mikrokristalline Cellulose bis Tabletten- ;

kernmasse von 75,0 ;

Den Wirkstoff mit dem Magnesiumstearat und der mikrokristallinen Cellulose vermischen. Die Mischung zu Perlen pressen. Die Perlen durch einen Rotationsgranulator leiten, um freifließen- .

de Granalien herzustellen. Diese zu Tabletten pressen. Die j

Tablettenkerne können anschließend, wenn gewünscht, wie oben I

- -j beschrieben filmbeschichtet werden.

I i

- 36 -

Tierärztliche intramammäre

mg/Oosis \ Bereich

Wirkstoff 150 mg /' 0,05 - 1,0 g

Polysorbat 60 3,0 % M/M ) ) '

Weißes Bienenwachs 6,0 % Μ/Μ ) bis 3 g ) bis 3 oder 15 g

Erdnußöl 91,0 % M/M ) )

Erdnußöl, weißes Bienenwachs und Polysorbat 60 unter Rühren auf 160 ⁰C erhitzen. Diese Temperatur 2 Stunden lang halten und dann unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Den Wirkstoff unter aseptischen Bedingungen zu diesem Trägermittel geben und mit einem Hochleistungsmischer dispergieren. Klären durch Passieren einer Kolloidmühle. Das Produkt unter aseptischen Bedingungen in sterile Plastspritzen füllen.

j Tierärztlicher Bolus zur langsamen Freisetzung

; h M/M Bereich

1 Wirkstoff 0,25 -2g

j Kolloidsiliciumdioxid 2,0 erforderliche Men-

j Mikrokristalline Cellulose zu 100,0 ge zur Erreichung : der Masse

! I

i Den Wirkstoff mit dem Kolloidsiliciumdioxid und der mikrokri-

! stallinen Cellulose mittels eines geeigneten Verfahrens zur

, aliquoten Mischung vermischen, um eine zufriedenstellende Ver-

I teilung des Wirkstoffs im Trägermittel zu erreichen. In das

i Mittel zur langsamen Freisetzung einarbeiten, um (1) eine

'; konstante Freisetzung des Wirkstoffs oder (2) eine stoßweise

¹ Freisetzung des Wirkstoffs zu erreichen.

ι Tierärztlicher oraler Arzneitrunk

; h M/V Bereich

I Wirkstoff 0,35 · 0,01 - 2 % M/V

j Polysorbat 85 5,0

¹ Benzylalkohol 3,0

\ Propylenglycol 30,0

h M/V Bereich

Phosphatpuffer als pH 6,0 - 6,5

Wasser zu 100,0

Den Wirkstoff in Polysorbat 85, Benzylalkohol und Propylengly- ' col lösen. Einen Anteil Wasser zugeben und den pH-Wert, wenn erforderlich, mit Phosphatpuffer auf 6,0 bis 6,5 einstellen. Bis zum Endvolumen mit Wasser auffüllen. Das Produkt in den Arzneitrankbehälter einfüllen. ;

Tierärztliche Paste zur oralen Verabreichung i

M/M Bereich

Wirkstoff 4,0 1 - 20 % M/M

Saccharinnatrium Polysorbat 85 Aluminiumdistearat Fraktioniertes Kokosnußöl

Das Aluminiumsteerat im fraktionierten Kokosnußöl und Polysor- ! bat 85 durch Erhitzen dispergieren. Auf Raumtemperatur abküh-

len und das Saccharinnatrium in dem Trägeröl dispergieren. In diesem Grundstoff den Wirkstoff dispergieren. In Plastspritzen füllen.

Tierärztliches Granulat zur Verabreichung im Futter

Bereich

4,	0	100,0
2,	5
3,	0
5,	0
zu

Wirkstoff 2,5 0,05 - 5 % M/M

Calciumsulfathalbhydrat

Den Wirkstoff mit dem Calciumsulfat vermischen. In einem Naßgranulierverfahren Granalien herstellen. Mit einem Plattenoder Fließbetttrockner trocknen. In geeigneten Behälter füllen

- 38 -

Tierärztliches Mittel zur RückenbegieQung

% M/V Bereich

Wirkstoff 2,0 0,1 bis 30 %

Dimethylsulfoxid 10,0

Methylisobutylketon 30,0 ! Propylenglycol (und Pigment) zu 100,0

Den Wirkstoff in Dimethylsulfoxid und Methylisobutylketon lösen,

Pigment zugeben und mit Propylenglycol bis zum Volumen auffül- ι ι j

I len. In den Behälter zur RückenbegieOung füllen.

! I

' ι

Emulgierbares Konzentrat ;

Wirkstoff 50 g

j Anionisches Emulgiermittel 40 g

(z.B. Phenylsulfonat CALX) Nichtionoges Emulgiermittel 60 g

(z.B. Synperonic NP13)*

Aromatisches Lösungsmittel (z.B. Solvesso 100) zu 1 Liter.

I Alle Bestandteile mischen und bis zur Auflösung rühren.

! * Handelsname von ICI

i Granulat

j

; (a) Wirkstoff 50 g

; Naturharz 40 g

! Gipsgranulat (Siebgröße 20 - 60) zu 1 kg j (z.B. Agsorb lOOA)

j (b) Wirkstoff 50 g

! Synperonic NP13* 40 g

' Gipsgranulat (Siebgröße 20 - 60) zu 1 kg

- i ' Die Bestandteile in einem flüchtigen Lösungsmittel, z.B. Mei thylenchlorid, lösen und zu Granulat im Trommelmischer geben. i Zur Entfernung des Lösungsmittels trocknen.

! * Handelsname von ICI

Claims (2)

Patentansprüche

1.. Verfahren zur Herstellung von Makrolidverbindungon der Formel 1

und deren Salze, worin

R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe ist, die jeweils durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, oder R ist eine Gruppe -(CH₂)nR oder eine Gruppe -CH(CH₃)R (wobei η Mull oder 1 ist und R⁷ CHO und CO₉H ist);

2 1

Y -CH₀- ist, Ί -CH- ist und X -CH- darstellt (wobei

2 -8

R ein Wasserstoffatom ist, oder eine Gruppe OR ist eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte Hydroxylgruppe mit bis zu 25 Kohlenstoffatomen) und R ist ein Wasserstoffatom, oder R und R stellen zusammen mit dem Kohlenstoffatom,

an das sie geknüpft sind, >C=0, >C=CH_O .oder >C=NOR dar

9
(wobei R ein Wasserstoffatom oder eine C^g-Alkylgruppeoder eine C₃_g-Alkenylgruppe ist) und die Gruppe >C=NOR* befindet sich in der Ε-Konfiguration) oder -Y^X-Y²- stellt -CH=CH-CH- oder -CH₂-CH=C- dar;

- Ho

bt eine Gruppe OR mit der oben erläuterten Bedeutung darstellt und R" ist eine Wasserstoffatom, oder R⁴ und R stellen zusammen mit dem Kohlenstoffatom« an das sie geknüpft sind, >C»O oder >C»NOR dar (wobei R"^a die oben für R brläuterte Bedeutung hat); und R ist ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe« gekennzeichnet durch die Inkubation einer Verbindung der Formel (2)

(2)

(worin X, Y¹, Y², R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 erläuterte Bedeutung haben und R eine Methyl-« Ethyl- oder Isopropylgruppe ist) in einem geeigneten Medium, in Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines davon abgeleiteten Enzyms oder eines Präparats« das von einem Mikroorganismus stammt« der ein Enzym enthält« das die Umwandlung bewirken kann; und anschließend wahlweise« wenn R und/oder R im Produkt -OH ist (sind)« die Hydroxylgruppe modifiziert wird« um eine substituierte Hydroxylgruppe oder eine Verbindung zu bilden, in der X -CHg- ist oder -Y^3--X-Y²- -CHaCH-CH- oder -CH₂-CH=C ist; oder die Hydroxylgruppe oxidiert wird, um eine Ketogruppe zu bilden und die Ketoverbindung anschlies· send wahlweise mit HpNOR umgesetzt wird.

Pestizide Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet ι daß sie eine wirksame pestizide Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und ein pestizidvorträgliches Trägermittel enthält.

Verfahren zur Bekämpfung von schädlichen Insekten, Akarinen und hlematoden, dadurch gekennzeichnet, daß eine Menge einer Verbindung nach Anspruch 1, die bei der Schädlingsbekämpfung wirksam ist, auf die Schädlinge oder eine von Schädlingen befallene Stelle aufgebracht wird.