DD285374A5

DD285374A5 - Verfahren zur herstellung eines prokaryotischen vektorplasmids

Info

Publication number: DD285374A5
Application number: DD33011789A
Authority: DD
Inventors: Helmut Tschaepe; Erhard Tietze; Ulrich Wobus; Ute Heim; Winfriede Weschke
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr; Inst Experimentelle Epidemiolo
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1990-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Vektorplasmids zur UEbertragung von Fremdgenen, deren Expression durch ein antibiotisches Resistenzgen als Marker nachgewiesen werden soll, das ebenfalls Bestandteil des Vektorplasmids ist. Anstelle der bekannten Antibiotikaresistenzen soll ein Marker verwendet werden, der oekologisch und epidemiologisch unbedenklich ist und keine besondere Vorsicht im Gebrauch erfordert. Das erfolgt dadurch, dasz das von dem Resistenzgen kodierte Protein ein wegen seiner Toxizitaet nicht verwendbares Antibiotikum inaktiviert. Es wird ein Gen verwendet, das fuer eine Resistenz gegen Streptothrizine vermittelnde Streptothrizinazetyltransferase kodiert. Fig. 1{Vektorplasmid; antibiotisches Resistenzgen; oekologisch unbedenklich; Streptothrizinresistenz}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Vektorplasmids zur Übertragung von fremden Genen und deren Expression nach Transfer in einem Empfänger-Organismus, wobei der Nachweis der Expression an phänotypisch leicht erkennbaren Merkmalen durch Verwendung eines antibictischen Resistenzgens als Marker geführt wird, mit dem das Vektorplasmid außerdem versehen ist.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Derartige Verfahren sind seit langem bekannt. Die Ausstattung des Vektorplasmids mit einem solchen Marker dient einmal dazu, die Anwesenheit des Veklorplasmids im Empfänger-Organismus zu erkennen, aufrechtzuerhalten ode:-durch Selektion-zu erzwingen, oder zum anderen einen gelungenen Insert bei in vitro durchgeführten Rekombinationen durch Insertionsmutagenese zu erkennen. Besonders verbreitet ist die Anwendung von Antibiotika-Resistenzen, weil dabei diese Aufgabe relativ einfach und sicher gelöst werden können. Allerdings ist der Einsatz derartiger Marker nicht unproblematisch, weil die zur Verfügung stehenden Antibiotika durchweg auch in der Human- und/oder Veterinärmedizin im - therapeutischen Gebrauch sind. Deshalb ist es unter ungünstigen Umständen nicht duszuschließen, daß human- oder veterinärmidizinisch pathogene Bakterienstämme durch Verbreitung über In-vitro-Rekombination der manipulierten Empfänger-Organismen gegen diese Antibiotika resistent werden und klinisch nicht mehr behandelt werden können.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, für den Gentransfer in einen beliebigen Empfänger-Organismus mittels eines prokaryotischen Vektorplasmids einen geeigneten Marker zur Verfügung zu stellen, der einfach isoliert und gehandhabt werden kann.

-2- 285 374 Darlegung des Wesens der Erfindung

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, einen Marker dieser Art anzugeben, dessen Gebrauch in einem beliebigen Empfänger-Organismus die dargelegten ökologischen und epidemiologischen Gefahren nicht heraufbeschwört und bei dessen Einsatz und Nachwels mithin keinerlei besondere Vorsichtsmaßnahmen ergriff in werden müssen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das von dem Resistenzgen kodierte Protein ein wegen seiner Toxizität in der human· und veterinärmedizinischen Therapie nicht verwendbares Antibiotikum inaktiviert. Im einzelnen wird vorteilhaft aus einem Transposon Tn 182S oder einem Transposon Tn 1826 ein DNS-Fragment mit einer DNS-Sequenz entsprechend Anlage 1 oder Anlage 2 isoliert, welches wie bereits bekannt/1 / ein Gen enthält, das für eine Resistenz gegen Streptothrizine vermittelnde Streptothrizinazetyltransferase kodiert. Es ist dabei möglich, daß entweder das DNS-Fragment mit dem eigenei ι Promotor des Resistenzgens in ein prokaryotisches Vektorplasmid oder daß das DNS-Fragment aus dem Transposon Tn 1825 ohne eigenen Promotor des Resistenzgens in ein prokaryotisches Vektorplasmid, exprimiert im Polylinker durch einen Fremd-Promotor, vorzugsweise den lac-Promotor, Moniert wird. Die Verwendung eines bekannten Vektorplasmids pUC 19/2/-DNS-Fragment mit dem - und eines weiteren bekannten Vektorplasmids pUC8/3/ - DNS-Fragment ohne den eigenen Promotor des Resistenzgens- hat sich dabei als besonders günstig herausgestellt. Zusätzlich lsi es vorteilhaft, wenn das entstandene rekombinante Plasmid entweder zur Klonierung bei Insertions-Inaktivierung des DNS-Fragments oder zur Expression von Monierten fremden Genen über den Promotor des DNS-Fragments benutzt wird.

Durch di'j Erfindung werden die beschriebenen Schwierigkeiten in überraschend einfacher Weise beseitigt. Die Beschaffung des Markers bereitet keinerlei experimentelle Schwierigkeiten, seine Gebrauchseigenschaften stehen den bisher verwendeten Antibiotika-Resistenzen nicht nach und der Umgang mit den Empfänger-Organismen gestaltet sich problemlos.

Ausführungsbeispiel

Weitere Vorteile und die näheren Einzelheiten der Erfindung werden nachstehend an Hand der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In der Zeichnung ist die Konstruktion des erfindungsgemäßen Markers dargestellt. Es zeigen

Fig. 1: die Isolierung eines promotorlosen Gens sat-1 in einem DNS-Fragment aus dem Transposon Tn 1825 und dessen

Klonierung in ein Vektorplasmid, Fig. 2: die Konstruktion zweier rekombinanter Plasmide, bei denen das Gen sat-1 einschließlich der Promotorregion in der

jeweils entgegengesetzter! Orientierung eingebaut ist, und Fig. 3: die Isolierung oines kompletten Gens sat-2 in einem DNS-Fragment aus dem Transposen Tn 1826 und dessen Klonierung in einem Vektorplasmid.

Die Zahlen geben die Koordinaten an, bezogen auf das entsprechende Transposon.

Die bereits vorbeschriebenen Plasmide pOIE38 (CoIE 1: :Tn 1825 Delta EcoRI) und pOIE39 (CoIE 1: :Tn 1826 Delta EcoRD/1/ tragen die mit sat-1 und sat-2 bezeichneten Gene, die in erfindungsgemäßer Weise als Marker verwendet werden sollen. Wie in Fig. 1 zu erkennen ist, wird zunächst das Gen sat-1 als BcI I-DNS-Fragment von 1 kb aus dem Plasmid pOIE 38 isoliert und danach in den BamH I-Restriktionsort eines Vektorplasmids pUC8 durch Ligation mit T4-DNS-Ligase und anschließende Transformation eines Bakterienstammes JM83 von Escherichia coli/3/ Moniert. Das dabei entstehende, Resistenz gegen Streptothrizin vermittelnde rekombinante Plasmid pOIE4 enthält das Gen sat-1, flankiert von Restriktionsorten des Polylinkers, und kann so gut als Ausgangspunkt für weitere Manipulationen dienen.

Mittels der Restriktionsendonukleasen EcoR I und Hind III läßt sich das Gen sat-1 in ein vorher mit diesen Restriktionsendonukleason behandelte Plasmid pBR322/4/ Monieren. Das so konstruierte rekombinante Plasmid plE864 ist streptothrizin-sensibel, da sich kein Promotor vor dem Gen sat-1 befindet. Nach Spaltung des geninternen Ava I-Restriktionsortes und des Ava I-Restriktionsortes des Polylinkers wird das Ava I-DNS-Fragment an den Restriktionsenden mit Desoxynukleotiden und Polymerase I (Klenow) aufgefüllt und mit BamHI-Linkern versehen. Nach Klonierung in den BamHI·Restriktionsort eines Suspenzierungsvektors M 13mp 10/5/ kann die DNS-Sequenz mittels Didesoxy-Sequenzanalyse/6/ ermittelt werden. Parallel dazu kann ein EcoRI/Htndlll-DNS-Fragment nach erfolgter Glättung der Enden in den Sma I-Restriktionsort des Sequenzierungsvsktors M 13mp 10 Moniert werden. Die Vielzahl der Restriktionsorte des Polylinkers erlaubt weitere Ansätze. Das Gen sat-1 kann auch entsprechend Fig. 2 durch Verdauung mit der Restriktionsendonuklease BgI I aus dem Plasmid pOIE 38 gewonnen werden. Das BgI I-DNS-Fragment von 2,5kb wird anschließend nach Verkürzung durch limitierte Verdauung mit der Restriktionsendonuklease Bal31 (etwa 200 Basenpaare können auf jeder Seite des DNS-Fragments entfernt werden, ohne daß dadurch die Expression des Gens sat-1 beeinflußt würde) und nach Auffüllung der Enden in einen glatte Enden aufweisenden Restriktionsorteines beliebigen Vektorplasmids, in Fig. 2 in das mit der Restriktionsendonuklease Hindll verdaute Vektorplasmid pUC19, Moniert. Die auf diese Weise konstruierten rekombinanten Plasmide plE942 und plE945 enthalten den erfindungsgemäßen Marker einschließlich seiner Promotorregionen in den entgegengesetzten Orientierungen und sind streptothrizinresistent.

In Fig.3 ist die Isolierung eines Gens sat-2 aus einem Plasmid pOIE39/1/ und die Konstruktion des rekombinanten Plasmids plE 935 zu erkennen. Wie bei der oben beschriebenen Verfahrensweise bei dem Gen sat-1 wird mittels Spaltung mit der Restriktionsendonuklease BgII, daran anschließender Inkubation bei Gegenwart der Restriktionsendonuklease Bal31 und schließlicher Glättung seiner Enden das das Gen sat-2 enthaltende DNS-Fragment in den Hindll-Restriktionsort eines Vektorplasmids pUC19 Moniert.

Über die flankierenden unikalen BamH I-Hind Ill-Restriktionsorte ist eine Subklonierung des Insertes in die speziell für eine Tn9-verrnittelte ln-vivo-Deletionserzeugung/7/ konstruierten Plasmide pAA-PZ718 und pAA-PZ719/8/ möglich. Von den so erzeugten Plasmiden pZ718-935 und pZ719-935/ beziehungsweise deren Deletionsderivaten wird die in Anlage 2 wiedergegebene Nukleotidsequenz mittels Didesoxysequenzierung/6/, ausgehend von einem IS1-Primer/7/, ermittelt.

Besonders einfach können die erfindungsgemäßen Marker selbstverständlich auch aus den rekombinanten Plasmiden plE942, plE 945 oder plE 935, deren Konstruktion oben erläutert worden ist, durch Reaktion mit zwei der flankierenden Restriktionsendonukleaeen (siehe Fig. 1 bis 3, bis auf die Restriktionsendonukleasen BamH I, Sph I und Ava I in den rekombinanten Plasmiden plE942 und plE945 beziehungsweise Sph I in dem rekombinanten Plasmid plE935) isoliert werden. Mit den rekombinanten Plasmiden plE942 und plE945 ist es möglich, eine Ins«, rtions-lnaktivierung einer sat-1-Determinante effektiv zu erzeugen. Die Insertion eines BamHI-DNS-Fragmentes in das rekom! inante Plasmid plE 942 führt zur Inaktivierung der sat-1-Determinante, weil das entsprochende DNS-Fragment anstelle des durch die Spaltung mit der Restriktionsendonuklease BamH I deletierte Promotors sowie 5'-flankierender Bereiche des Gens sat-1 eingebaut wird. Benutzt man stattdessen das rekombinante Plasmid plE945, so wird das Gen sat-1 durch das entsprechende DNS-Fragment ersetzt und dadurch inaktiviert. Ebenso kann man diese Konstruktionen und analog dazu das sat-1 -promotorlose rekombinante Plasmid pOIE4 durch Klonierung eines DNS-Fragmentes in den BamH I-Restriktionsort zum Test geeigneter Promotoren beziehungsweise zur Expression geeigneter Gene über den Promotor des Gens sat-1 benutzen. Verschiedene unikale Restriktionsorte in den rekombinanten Plasmiden plE942, plE945 und pOIE4 vergrößern noch die Möglichkeiten von weiteren Manipulationen (Subklonierungen) durch Insertion in das Gen sat-1.

Die rekombinanten Plasmide plE942, plE945 und plE935 haben darüber hinaus noch einen unikalen NcoI-Restriktionsort in der 5'-flankierenden Region des Gens sat-1 beziehungsweise sat-2 im Insert, der für Klonierungen ohne Insertions-Inaktivierung genutzt werden kann.

Literatur

/1/ TieUe, E. et 81.,J₁BaSIcMlCrObIoI. 28 (1988), Seiten 129-136.

/2/ Vieira. J./Messtng. J., Gene 19 (1982), Seite 269.

/3/ Yanlsch-Peron,C.etal.,Gene33(1985),Se!te 103.

/4/ Bolivar, F. et al., Gene 2 (1977), Selten 95-113.

/6/ Norrander, J. et al., Gene 28 (1983), Seite 101.

/6/ Sanger, F. et al., Proc. Nail. ScI. Acad. USA 74 (1977), Seiten 5463-5487.

/7/ Ahmed, A., Gene 39 (1985), Selten 305-310.

/8/ SequeNest II, Gold BioTechnology, Inc., St. Louis (Mo), USA.

Anlage 1

GGATCATTCA GCACTGAAAG GGGACATGAG AGGGGCAAAC CGTAAAAATT GCGTCATATG ATGCTGAGAA GACCAAGGCT TTACATCTCG TCATCGACCA GATCTAGCCT AGGAGTCGCG GACAGCTCCT TGCAATTTGT CACGTATAAA ACTGGTTCTC ACCGCTTCGC GGTGATCGCC AGCGCCATCT GTGGATGGCG GACCGTAAGG

Anlage 2

GCTACATGTC ACTGCCCATG TAATCCAGTG CGCATATCCG CTCCTTGTCT AAAAAAGTGC TTTAATTTAA TAATGTGCAT AGAGTGTCTT TAATTAACGG AAATGTGAGG AAACATTGGA CACCTATCCG

C^GGAAGGAT

ATGGCGCATT ACATGGAACG CGGCACGGAG AAGCGATTCG TTGCATCATG GTCATATCTA ACTCGCTGCG AAGATTTCGG CCATTTCATT TTGAACTATC GATGATCACT AGAGCTTGTC CTATCGAACA CACAGTCTCA TGGCATACGA ACGCAAAATG ACTAGACCTC GGGAGCACAG GGCGCGGCTT GAAGTATCGA CGAACCGACG GCCTGAAGCC CTTGATGAAA TGCTGTTTGC GTCTGAGGAT CAGGTAAGTT TGCGTATAGA TGCAACTGTC CTGTTTTTTA TGCTAAATAA

CGT6CAAGCA

GTATTTTTAA TAAGCATCAG CGTCATATGA TGCTGAGAAC ACCAAGGCTT TACATCTCGG CATCGACCAA ATCTAGCCTC GATCCTGTAC TGGTTCAAAA AAGACTGGCC TCGGTTGCAC CTCGCAATTT TGATCCCTGA GTTCGTGAAG TACCAGAAGT CTGATGAAGA GGGAAGATTG CATTGTTGTG TCGAATTTGC TTAGAGACAC TGGCTTTACT AAGTCTCGAA GATGACGCCT AATTCAGGAG CTCAACTATC TTGCTGGCCG ACACAGTGAT CAACGCGGCG TAAGCTGGAT GACGTTTTTT TTTTCAGTTT ATTTAAAAAT TGCCTATACA CGCCTAGAGA ATTAAAATGT GGATAGACGG AGAAAGTCTA CGGGTGACAA AGATTTCGGT CATTTCATTG TGAACTATCT ATGATGACTC GAGCTTGTCG TATCGAACAC TTCCTTATGT ATGCTGACAC GAGGATTATC CGTACAACAA TCCGGTGAGC GCAGGTGGCG TGTTCGATGT GTGAGCCCCT CTCTGCTTGC AACTCAACTC TCGCACACGC GAAAAAGTGG AAACGAACAA CTCGGCGGCA CGAAACAGCG AACAATTCAT TTAAACATCA AGAGGTAGTT TACATTTGTA ATTGATTTGC AGCTTTGATC AAAAACAGCC GTGAAACAGA TCAGCGCATA GGACTGTTAG GCCTATTCTA TGCTTGTTTA TATGAGTTCT CATGCACGAT . TTTAATACAA AACGAGCATG GATCCCTGAG TTCGTGAAGT ACCAGAAGTG TGATGAAGAC GGAAGATTGA ATTGTTGTGT GCATGGGTTG TCGAAGGCAC CAGGCGATTA GTTGCTGCAC AAGGCGTTAG GAAACATTGG GCACCTATCC ACCGGAAGGA TATGGCGCAT AACATGGAAC ACCGAGGCAA GCACTAAGCA TGTACCTGCC TTGACCTGTT ATGTACTGGT TCAAGCCGAC TGAGGGAAGC GGCGTCATCG CGGCTCCGCA TGGTTACGGT TGACCTCTTC ATAAAACGCT ACCTTTTTGT ACATAAAACG GCTGGGATTT CCGGTAGAGT TTGGGTGAGA TTGTAATAAC GTGATTATAT CTTACTAATA CAGGTGGCGG GTTCGATGTG TGAGCCCCTA TCTGCTTGCT ACTCAACTCA CGCACACGCA CCGAGGCAAA CACTAAGCAG GTACCTGCCT TGACCTGTTC TGTACTGGTA CAAGCCGACA GAGGGAAGCG GCGTCATCGA GGCTCCGCAG GGTTACGGTG GGAGTCGCGC ACAGCTCCTT GCAATTTGTA ACGTATAAAA CTGGTTCTCG CCGCTTCGCG GTGATCGCCG GCGCCATCTC TGGATGGCGG ACCGTAAGGC ACAGTCTCAT GGCATACGAT CGCAAAATGT CTAGACCTCA GGAGCACAGG GCGCGGCTTA AAGTATCGAC GAACCGACGT CCTGAAGCCA TTGATGAAAC CGAATTTGCG TAGAGACACA GGCTTTACTC AGTCTCGAAC ATGACGCCTA ATTCAGGAGT TCAACTATCA TGCTGGCCGT CACAGTGATA

AACGCGGCG

aaaaagtggg aacgaacaat tcggcggcat gaaacagcga acaattcatt taaacatcat gaggtaghg acatttgtac ttgatttgct

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Vektorplasmids zur Übertragung von fremden Genen uitd deren Expression nach Transfer in einen Empfänger-Organismus, wobei der Nachweis der Expression an phänotypisch leicht erkennbaren Merkmalen durch Verwendung eines antibiotischen Resistenzgens als Marker geführt wird, mit dem das Vektorplasmid außerdem versehen ist und der zur Einführung und Erhaltung von rekombinanten Plasmiden in einen Produktionsstamm eines Mikroorganismus verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß von dem Resistenzgen kodierte Protein ein wegen seiner Toxizität in den human- und veterinärmedizinischen Therapie nicht verwendbaren Antibiotikum inaktiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus einem Transposon Tn 1825 oder Tn 1826 ein DNS-Fragment mit einer DNS-Sequenz entsprechend Anlage 1 oder Anlage 2 isoliertwird, welches wie an sich bekannt ein Gen enthält, das für eine Resistenz gegen Streptothrizine vermittelnde Streptothrizinazetyltransferase kodiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Fragment mit dem eigenen Promotor des Resistenzgens in ein prokaryotisches Vektorplasmid kloniertwird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Fragment aus dem Transposon Tn 1825 ohne eigenen Promotor des Resistenzgens in ein prokaryotischen Vektorplasmid, exprimiert im Polylinker durch einen Fremd-Promotor, vorzugsweise den iac-Promotor, kloniertwird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektorplasmid pUC 19 verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektorplasmid pUC8 verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 und einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das entstandene rekombinante Plasmid

- zur Klonierung bei Insertions-Inaktivierung des DNS-Fragments oder

- zur Expression von klonierten fremden Genen über den Promotor des DNS-Fragments benutzt wird.