CH660743A5

CH660743A5 - Hybride human-leukozyten-interferone und deren mikrobielle herstellung.

Info

Publication number: CH660743A5
Application number: CH7174/81A
Authority: CH
Inventors: Norman Goeddel David Van
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-11-10
Filing date: 1981-11-09
Publication date: 1987-06-15
Also published as: ES506955A0; ES8304200A1; NZ198906A; PL233748A1; JPH07308191A; FR2493867B1; FI813539L; ES8302778A1; NO165201B; IT8124967A0; NO165201C; CH663032A5; ATE46718T1; SE8106641L; CA1277616C; FR2493867A1; JP2642291B2; PH18565A; DE3144469A1; DOP1981004064A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft hybride Human-Leukozyten-Interferone, diese enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von viralen und neoplastischen Erkrankungen, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Das erfindungsge-mässe Verfahren besteht darin, dass man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Expression eines solchen Interferons befähigten replikablen Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und das Interferon isoliert.

Verhältnismässig homogene Leukozyten-Interferone sind aus Leukozyten normaler oder leukämischer Spender gewonnen worden. Diese Interferone sind eine Familie von Proteinen, die sich durch ein starkes Vermögen, in ihren Tar-get-Zellen einen Virus-resistenten Zustand herzustellen, auszeichnen. Ausserdem vermag Interferon auf die Zellvermehrung hemmend und die Immunreaktion modulierend zu wirken. Diese Eigenschaften haben die klinische Verwendung von Interferon als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und bösartiger Erkrankungen veranlasst.

In jüngerer Zeit ist die rekombinante DNA-Technologie dazu herangezogen worden, die mikrobielle Herstellung einer Reihe verschiedener Leukozyten-Interferone zu veranlassen, deren Aminosäure-Sequenzen grössenordnungsmässig 70% Homologie, relativ zueinander, zeigen, wie von David V. Goeddel et al. (Nature 290, 20-26 (1981) ) offenbart. Gene, die Aminosäuresequenzen verschiedener Leukozyten-Interferone verschlüsseln, die u.a. mit LelF A, B, C, D, F, G bzw. H bezeichnet sind, werden aus dem von H.P. Koeffler 10 und D.W. Golde (Science 200, 1153-1154 (1978) ), von David V. Goeddel und Sidney Pestka beschriebenen Zellstamm KG-1 erhalten. Der Zellstamm KG1 ist bei der American Type Culture Collection, ATCC-Zugangsnummer CRL 8031, hinterlegt worden. Solche Gene, in Plasmidträgern für bakterielle Expression geeignet verbreitet, können dazu verwendet werden, Wirtsbakterien, vorzugsweise E. coli K-12, Stamm 294, American type culture collection-Zugangsnum-mer 31446, hinterlegt am 28. Oktober 1978, zu transformieren.

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Das Zugpferd der rekombinanten DNA-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträn-giger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, häufig in Vielfach-Kopien pro Zelle. In der Plasmid-DNA ist die In-25 formation verschlüsselt, die zum Reproduzieren des Plasmids in Tochterzellen erforderlich ist (d.h. ein «Replicon») und gewöhnlich ein oder mehrere Auswahlcharakteristika, wie im Falle von Bakterien, die Resistenz gegenüber Anti-bioticis, die Klone der das Plasmid von Interesse enthalten-30 den Wirtszelle zu erkennen und bevorzugt in selektiven Medien zu züchten erlauben. Die Brauchbarkeit von Plasmiden liegt in der Tatsache, dass sie durch die eine oder die andere Restriktions-Endonuclease oder «Restriktions-Enzym» spezifisch gespalten werden können, die jeweils eine andere Stel-35 le an der Plasmid-DNA erkennen. Danach können heterolo-ge Gene oder Genfragmente in das Plasmid durch das Verbinden der Enden an der Spaltstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der Spaltstelle eingebaut werden. Die DNA-Rekombination erfolgt ausserhalb der Zelle, aber das anfallen-4o de «rekombinante» Plasmid kann nach einem als Transformation bekannten Verfahren in sie eingeführt werden und grosse Mengen des heterologes Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ferner kann, wenn das Gen 45 bezüglich Teilen des Plasmids, die die Transkription und Translation der verschlüsselten DNA-Botschaft steuern, geeignet eingesetzt ist, der sich ergebende Expressionsträger tatsächlich dazu verwendet werden, die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das eingesetzte Gen codiert, ein Verso fahren, das als Expression bezeichnet wird.

Expression beginnt in einem Bereich, der als Promoter bekannt ist, der von RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird. In manchen Fällen, wie beim Tryptophan- oder «trp»-Promoter, der bei der praktischen Durchführung der 55 Erfindung bevorzugt ist, überlappen sich Promoter-Bereiche mit «Operator»-Bereichen unter Bildung eines kombinierten Promoter-Operators. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Frequenz des Beginns einer Transkription 60 an einem besonderen Promoter zu regeln. Die Polymerase geht an der DNA entlang und überträgt die im Codierstrang enthaltene Information vom 5'- zum 3'-Ende auf Messenger-RNA, die wiederum in ein Polypeptid übertragen wird, das die Aminosäuresequenz besitzt, die die DNA codiert. Jede 65 Aminosäure wird durch ein Nucleotid-Triplett oder «Co-don» in etwas verschlüsselt, was für die vorliegenden Zwecke als «Strukturgen» bezeichnet werden kann, d.h. dem Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts ver-

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schlüsselt. Nach der Bindung an den Promoter transkribiert die RNA-Polymerase zuerst Nucleotide, eine Ribosomen-Bindestelle verschlüsselnd, dann eine Translationsinitiation oder «Start»-signal (gewöhnlich ATG, das in der entstehenden Messenger-RNA zu AUG wird), dann die Nucleotid-Codons innerhalb des Strukturgens selbst. Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, worauf die Polymerase eine weitere Sequenz von Messenger-RNA bilden kann, die aufgrund der Anwesenheit des Stopsi-gnals von den Ribosomen unübersetzt bleiben. Ribosomen werden an die auf der messenger-RNA vorgesehene Bindestelle gebunden, in Bakterien gewöhnlich, wenn die mRNA gebildet wird, und erzeugen selbst das verschlüsselte Polypeptid, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem zuvor genannten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird gebildet, wenn die die Ribosomen-Bindesteile verschlüsselnden Sequenzen bezüglich des AUG-Initiatorco-dons geeignet angeordnet sind und wenn alle übrigen Codons dem Initiatorcodon in Phase folgen. Das anfallende Produkt kann durch Lyse der Wirtszelle und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderem Bakterienprotein erhalten werden.

Nucleotid-Sequenzstudien von Genen, die die verschiedenen Leukozyten-Interferone verschlüsseln, lassen ein Mass an Allgemeinheit unter verschiedenen von ihnen im Hinblick auf die Gegenwart und Anordnung von Spaltstellen erkennen, die von bestimmten Restriktions-Endonucleasen erkannt werden. Erfindungsgemäss kann diese Allgemeinheit zur Bildung neuer Hybridgene durch DNA-Rekombination benutzt werden, die bei der mikrobiellen Erzeugung von Hybrid-Leukozyten-Interferonen brauchbar sind, von denen erwartet werden kann, dass sie in mehr oder weniger grossem Ausmass die antiviralen und andere Eigenschaften von Interferonen, durch die elterlichen Gene verschlüsselt, zeigen. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können solche Hybrid-Leukozyten-Interferone verstärkte Aktivität relativ zu den durch die elterlichen Gene verschlüsselten entwickeln.

Die elterlichen Leukozyten-Interferon-Gene, die die Familie der hier betrachteten Leukozyten-Interferon-Proteine codieren, zeigen individuell natürliche allelomorphe Variationen. Diese Variationen.können durch einen oder mehrere Aminosäure-Unterschied(e) in der Gesamtproteinsequenz oder durch Lücken, Substitutionen, Einfügungen, Umkehrungen oder zusätzliche Aminosäure(n) in der Sequenz nachgewiesen werden. Für jedes elterliche Leukozyten-Interferon, mit LeIF A, LeIF B ... LeIF J usw. bezeichnet, fallen solche allelomorphen Variationen unter die Bezeichnung oder Definition und damit unter die Erfindung.

Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden näheren Beschreibung und den Figuren; von diesen zeigt:

Fig. la und lb Nucleotidsequenzen der Codierbereiche von 8 Leukozyten-Interferon («LeIF»)-Komplementär-DNA («cDNA»)-Klonen. Von diesen ist eines, entsprechend mit LeiF E bezeichnet, ein offensichtliches «Pseudogen», das kein aktives Leukozyten-Interferon codiert, während ein weiteres, LeIF G, weniger als die volle Sequenz für die entsprechende Interferon-Art enthält. Das ATG-Translations-Startkodon und das Stop-Triplett für jedes LeIF ist unterstrichen.

Fig. 2 Restriktions-Endonuclease-Karten von acht Arten LeIF geklönter cDNAs (A bis H). Die Klone enthaltende Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailingmethode aufgebaut (D.V. Goeddel et al., Nature 287,411-416 (1980) ). Daher können die cDNA-Inserte mit Pst I herausgeschnitten werden, d.h. jedes Ende eines jeden Inserts ist eine Pst I-

Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle. Die Striche am Ende eines jeden cDNA-Inserts stellen die flankierenden Homopo-lymer-dC:dG-Schwänze dar. Die Positionen von Pvu II-, Eco RI- und Bgl II-Restriktionsstellen sind angegeben. 5 Schattierbereiche in der Figur stellen die Codiersequenzen ausgereifter LelFs dar; die schraffierten Bereiche zeigen Si-gnal-Peptidcodiersequenzen an; und die freien Bereiche zeigen nichtcodierende 3'- und 5'-Sequenzen.

Fig. 3a und 3b ist ein Vergleich der acht von den Nucleo-10 tid-Sequenzen vorausgesagten LelF-Proteinsequenzen. Es werden die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemi-cal Nomenclature empfohlenden einbuchstabigen Abkürzungen verwendet: A = Alanin; C = Cystein; D = Aspara-ginsäure, E = Glutaminsäure; F = Phenylalanin; G = Glycin; H = Histidin; I = Isoleucin; K = Lysin; L = Leucin; M = Methionin; N : Asparagin; P = Prolin; Q = Glutamin; R = Arginin, S = Serin; T = Threonin; V = Valin; W = Tryptophan und Y = Tyrosin. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäureposition (S bezieht sich auf Signal-peptid). Der Strich in der 165 Aminosäure-LelF A-Sequenz an Position 44 wurde eingeführt, um diese Sequenz mit den 166 Aminosäuresequenzen der anderen LelFs auszurichten. Die Sequenz von LeIF E wurde durch Ignorieren des Extra-2s Nucleotids (Position 187 der Fig. la) in seinem Codierbereich bestimmt. Die Sternchen bezeichnen In-Phase-Stop-Codons. Allen LelFs (ausgenommen das Pseudogen LeIF E) gemeine Aminosäuren sind auch gezeigt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch in menschlichem Fibro-blasten-Interferon vorhanden sind.

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In Fig. la entsprechen die Nucleotide +1 bis 69 den S1 bis S23-Aminosäuren der Fig. 3a. Das Codon TGT (Nucleotide 70 bis 72) der Fig. la entspricht Cystein (C, Aminosäure 1) der Fig. 3a. In Fig. 3a tritt die Pvu II-Restriktions-Endo-nuclease-Spaltstelle zwischen den Codons für Aminosäuren 92 und 93 in LeIF A, B, D, F und G auf, d.h. zwischen den Nucleotiden 346 und 347 der Fig. la.

Fig. 4a und 4b vergleicht die Aminosäuresequenzen ausgereifter Leukozyten-Interferone A und D, wobei ein Fehlen 40 der Aminosäure 44 in LeIF A durch Striche angezeigt ist.

Nur solche LeIF D-Aminosäuren, die sich von den entsprechenden Aminosäuren von LeIF A unterscheiden, sind dargestellt: Die Aminosäuresequenz von LeIF D ist sonst 45 mit der von LeIF A identisch. Fig. 4b zeigt auch die relative Stellung von Bgl II- und Pvu II-Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen, zur Bildung bevorzugter Hybrid-Leukozyten-Gene nach der Erfindung verwendet, am entsprechenden Gen an.

so Die Fig. 5 und 6 veranschaulichen die Ergebnisse von Vergleichstests eines bevorzugten Hybrid-Leukozyten-Inter-ferons gemäss der Erfindung («LeIF-A/D») auf Aktivität gegenüber Encephalomyocarditis-Virus («EMC») und Vesicu-larstomatitis-Virus («VSV») in Mausezellen.

55 Die Fig. 7 und 8 zeigen die Ergebnisse eines Vergleichstests mit LeIF-A/D und anderen Interferonen gegenüber EMC-Virus-Infektionen in Mäusen bzw. Hamstern. Die Daten in Fig. 7 stammen aus Behandlungen i.p. 3 h vor der Infektion. Die Dosierungen von LeIF-A/D und LeIF-A sind, 6o wie an Wish-Zellen titriert.

Fig. 9a und 9b zeigt die DNA-Sequenzen von fünf LeiF-Proteinen einschliesslich die Typen I und J.

Bei den beschriebenen Arbeiten wurden zwei Mikroorganismen eingesetzt: E. coli xl776, wie in der US-PS 4 190 495 65 beschrieben, und E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi~, hsr-, hsmk+), wie in der GB-PS 2 055 382 A beschrieben. Beide sind bei der American Type Culture Collection, ATCC-Zugangsnummer 31537 und 31446, am 3. Juli 1979

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bzw. 28. Oktober 1978 hinterlegt worden. Alle Arbeiten über rekombinante DNA erfolgten nach anwendbaren Richtlinien der National Institutes of Health.

Die Erfindung wird in ihren am meisten bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf E. coli beschrieben, nicht nur mit den oben beschriebenen Stämmen E. coli xl776 und E. coli K-12, Stamm 294, sondern auch mit anderen bekannten E. coli-Stämmen, wie E. coli B, oder anderen Mikroben-Stämmen, von denen viele hinterlegt und (möglicherweise) von anerkannten Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen, wie der American Type Culture Collection, ATCC, erhältlich sind. (Vgl. die ATCC-Katalogaufstellung und auch die DE-OS 2 644 432). Diese weiteren Mikroorganismen umfassen z.B. Bazillen, wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, unter denen beispielsweise Salmonella typhimurium und Serratia marcescens erwähnt werden können, unter Verwendung von Plasmiden, die reduplizieren und heterologe Gensequenzen exprimieren können. Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, kann auch vorteilhaft als Wirtsorganismus bei der Herstellung der erfindungsgemäs-sen Interferonproteine durch Expression von sie codierenden Genen unter der Kontrolle eines Hefepromoters verwendet werden.

Die LelF-Hybriden werden hergestellt, indem die Re-striktions-Endonuclease-Spaltstellen, die gewöhnlich in den einzelnen elterlichen Genen liegen, und deren jedes Ende in Verbindung mit den gleichen Stellen in Träger-Expressions-Plasmiden (Vektoren) genutzt werden. Beispielsweise kann das grosse (ca. 3900 bp) Fragment eines Xba I-Pst I-Verdau-ungsprodukts des pLelF A trp 25-Expressionsplasmids mit Xba I- Pvu II- und Pvu II-Pst I-Verdauungsfragmenten der verschiedenen LelF-Elterngene zu Expressionsplasmiden verbunden werden, die das entsprechende Hybrid-LelF erhältlich machen.

Jedes LelF-Expressionsplasmid wurde unabhängig mit Verdauungsfragmenten aufgebaut, die aus verschiedenen LelF-Plasmiden isoliert waren, z.B. pLelF A trp 25, pLelF B trp 7, pLelF C trp 35, pLelF D trp 11, pLelF F trp 1, pLelF G, pLelF H und pLeiF I usw., deren Aufbau in Nature 287, 411 (1980) beschrieben ist, oder aus pBR 322, dessen Aufbau in Gene 2, 95 (1977) beschrieben ist. In bestimmten dieser Plasmide bezeichnet «trp» ein Tryptophanpromo-ter-Operator-System, für bakterielle Expression am meisten bevorzugt, wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 36 776 beschrieben.

Direkte Expression eines ersten reifen Leukozyten-Interferons

Die Arbeitsweise, die befolgt wurde, um Lelf A direkt als reifes Interferon-Polypeptid auszudrücken, umfasste die Kombination von synthetischen (N-terminalen) und komplementären DNAs.

Eine Sau 3a-Restriktion-Endonuclease-Stelle wird passenderweise zwischen Codons 1 und 2 von Le-IF A angeordnet. Zwei synthetische Desoxyoligonucleotide wurden geschaffen, die ein ATG-Translations-Startcodon aufweisen, das Codon für Aminosäure 1 (Cystein) wieder herstellen und ein Eco RI-kohaesives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein 34 b.p. Sau 3a-Ava II-Fragment von pL 31 geheftet. Das anfallende 45 b.p.-Produkt wurde an zwei weitere DNA-Fragmente gehängt, um ein 865-Basenpaar-syn-thetisch/natürliches Hybridgen aufzubauen, das Le-IF A codiert und durch Eco RI- und Pst I-Restriktionsstellen gebunden wird. Dieses Gen wurde zwischen Eco RI und Pst I-Stel-len in pBR322 eingefügt, um das Plasmid pLe-IF AI zu ergeben.

Das Plasmid pGMl trägt das E. coli-Tryptophan-Ope-ron mit der Fehlstelle A LE1413 (G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 (1978) ) und führt folglich zur

Expression eines Fusionsproteins mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp-E-Polypeptids (nachfolgend im Zusammenhang als LE' bezeichnet) sowie das trp-D-Polypeptid in seiner Gesamtheit, s alle unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems. 20 (ig des Plasmids wurden mit dem Restriktionsenzym Pvu II verdaut, das das Plasmid an fünf Stellen spaltet. Die Genfragmente wurden sodann mit EcoRI-Verknüpfern (bestehend aus einem selbst-komplementären Oligonucleotid der io Sequenz pCATGAATTCATG) unter Bildung einer EcoRI-Spaltstelle für ein späteres Klonen zu einem Plasmid mit einer EcoRI-Stelle kombiniert. Die 20 jag der aus pGMl erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase in Gegenwart von 200 pico-Mol des 5'-phosphorylier-15 ten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG und in 20 |xl T4-DNA-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl2, 5 mMol Dithiothreitol) bei 4 °C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 min auf 70 °C erwärmt, um das Binden aufzuhalten. Die 20 Bindeglieder wurden durch EcoRI-Abbau gespalten und die Fragmente, nun mit EcoRI-Enden, wurden mittels 5% Poly-acrylamidgel-Elektrophorese (nachfolgend «PAGE») aufgetrennt und die drei grössten Fragmente vom Gel zunächst durch Anfärben mit Ethidiumbromid, Lokalisieren der 25 Fragmente mit UV-Licht und Herausschneiden der interessierenden Teile aus dem Gel isoliert. Jedes Gelfragment wurde mit 300 nl 0,lxTBE in einen Dialysebeutel gebracht und bei 100 V 1 h in 0,lxTBE-Puffer der Elektrophorese unterworfen (TBE-Puffer enthält 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 30 0,09 g Na2EDTA in 11H20). Die wässrige Lösung wurde aus dem Dialysebeutel geholt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2-molar an Natriumchlorid gemacht und die DNA nach Äthanol-Fällung in Wasser gewonnen.. Das trp-Promoter-Operator-haltige Gen mit Eco-35 Rl-kohäsiven Enden wurde in der nachfolgend beschriebenen Arbeitsweise identifiziert, die den Einbau von Fragmenten in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid zur Folge hat, das nach dem Einbau von Promoter-Operator Tetracyclinresistent wird.

4o Das Plasmid pBRHl (R.I. Rodriguez et al., Nucleic Acids Research 6 3267-3287 (1979) ) drückt Ampicillin-Re-sistenz aus und enthält das Gen für Tetracyclin-Resistenz, da aber kein zugeordneter Promoter vorliegt, kommt diese Resistenz nicht zum Ausdruck. Das Plasmid ist folglich Tetra-45 cyclin-empfindlich. Durch Einführen eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Stelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.

Ein pBRHl wurde mit EcoRI verdaut und das Enzym durch Phenolextraktion und anschliessende Chloroform-Ex-50 traktion entfernt und nach Äthanolfällung in Wasser gewonnen. Das anfallende DNA-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen jeweils mit den drei oben erhaltenen DNA-Fragmenten kombiniert und mit T4-DNA-Ligase, wie zuvor beschrieben, verknüpft. Die im Reaktionsgemisch vor-55 liegende DNA wurde zum Transformieren eines angemessenen E. coli-K-12-Stammes 294 (K. Backman et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,4174-4198 (1976) ) nach Standard-Techniken (V. Hershfield et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 71, 3455-3459 (1974) ) verwendet und die Bakterien auf LB-60 Platten aufgebracht, die 20 (xg/ml Ampicillin und 5 ng/ml Tetracyclin enthielten. Mehrere Tetracyclin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, Plasmid DNA isoliert und die Anwesenheit des gewünschten Fragments durch Restriktions-Enzymanalyse bestätigt. Das anfallende Plasmid wird mit 65 pBRHtrp bezeichnet.

Ein EcoRI- und BamHI-Abbauprodukt des viralen Genoms oder Chromosomensatzes von Hepatitis B wurde nach herkömmlichen Massnahmen erhalten und zu EcoRI und

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BamHI-Stellen von Plasmid pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) ) zu dem Plasmid pHS32 geklont. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Dann wurde es mit 1 |il E. coli-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer, Mannheim) in 30 ml Polymerase-Puffer (50 mMol Kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mMol MgCl2, 1 mMol ß-Mercaptoäthanol) mit 0,1 mMol dTTP und 0,1 mMol dCTP 30 min bei 0 °C, dann 2 h bei 37 °C behandelt. Diese Behandlung führt dazu, dass zwei der vier Nucleotide komplementär zu dem vorragenden 5'-Ende der Xbal-Spaltstelle aufgefüllt wurden in:

5' CTAGA— 5' CTAGA—

—>

3' T— 3' TCT—

Zwei Nucleotide, dC und dT, wurden eingeführt und bildeten ein Ende mit zwei vorragenden 5'-Nucleotiden. Dieser lineare Rest von Plasmid pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Rückgewinnung in Wasser nach Ätha-nol-Fällung) wurde mit EcoRI gespalten. Das grosse Plas-mid-Fragment wurde vom kleineren EcoRI-Xbal-Fragment durch PAGE getrennt und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNA-Fragment aus pHS32 (0,2 |ig) wurde unter Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen an das EcoRI-Taq I-Fragment des Tryptophan-Operons (ca. 0,01 jxg), aus pBRHtrp stammend, gebunden.

Bei dem Verfahren zum Binden des Fragments von pHS32 an Eco RI-Taq I-Fragment, wie oben beschrieben, wird das vorragende Taq I-Ende an das verbleibende vorragende Ende von Xbal gebunden, obgleich es nicht vollständig nach Watson-Crick Basen-gepaart ist:

—T CTAGA— —TCTAGA—

+ ->

—AGC TCT— —AGCTCT—

Ein Teil dieses Binde-Reaktionsgemischs wurde in E. coli 294-Zellen transformiert, wärmebehandelt und auf Ampicillin enthaltende LB-Platten gebracht. 24 Kolonien wurden ausgewählt, in 3 ml LB-Medium vermehrt und Plasmid isoliert. Bei sechs von ihnen wurde festgestellt, dass die Xbal-Stelle durch E. coli-katalysierte DNA-Reparatur und Repli-kation regeneriert war:

—TCTAGA— —TCTAGA—

—>

—AGCTCT— —AGATCT—

Xbal aufgefüllt —TCTAG

—AGATC

Dieser Aufbau bildet auch wieder das Tetracyclin-resistente Gen zurück. Da das Plasmid pHGH 107 Tetracyclin-Resistenz von einem Promoter vor dem HGH-Gen (dem Lac-Promoter) exprimiert, ermöglicht dieser Aufbau, mit pHGH 207 bezeichnet, die Expression des Gens für Tetra-cyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Pro-moter-Operators. So wurde das Bindegemisch in E. coli 294 transformiert und Kolonien auf LB-Platten, die 5 Hg/ml Tetracyclin enthielten, selektiert.

Auch wurde gefunden, dass diese Plasmide sowohl mit EcoRI als auch mit Hpal spalteten und die erwarteten Restriktionsfragmente ergaben. Ein Plasmid, als pTrp 14 bezeichnet, wurde zur Expression heterologer Polypeptide ver-s wendet, wie nachfolgend erörtert.

Das Plasmid pHGH 107 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) ) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DNA-Fragmenten und 163 Aminosäurecodons, io erhalten aus Komplementär-DNA, hergestellt über reverse Transkription von menschlicher Wachstumshormon-messen-ger-RNA. Dieses Gen enthält, obgleich die Codons der «Vor»-Sequenz von menschlichem Wachstumshormon fehlen, ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 1510 ng pHGH 107 nach Behandlung mit EcORI und dann E. coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment und dTTP und dATP, wie oben beschrieben, isoliert. Nach Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolfällung wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

20 Das Human-Wachstumshormon («HGH»)-Gen-enthal-tende Fragment wurde durch PAGE isoliert, dann folgte Elektroelution. Das anfallende DNA-Fragment enthält auch die ersten 350 Nucleotide des Tetracyclin-resistenten Strukturgens, ihm fehlt aber das Tetracyclin-Promoter-Operator-25 System, so dass beim anschliessenden Klonen zu einem Ex-pressionsplasmid die das Insert enthaltenden Plasmide durch die Wiederherstellung der Tetracyclin-Resistenz lokalisiert werden können. Da das EcoRI-Ende des Fragments durch die Klenow-Polymerase I-Arbeitsweise aufgefüllt worden ist, 30 hat das Fragment ein stumpfes und ein kohäsives Ende, was die richtige Orientierung bei späterem Einschieben in ein Ex-pressionsplasmid gewährleistet.

Sodann wurde das Expressionsplasmid pTrpl4 hergestellt, um das oben hergestellte HGH-Gen-haltige Fragment 35 zu erhalten. So wurde pTrpl4 mit Xbal verdaut und die erhaltenen kohäsiven Enden nach der Klenow-Polymerase I-Arbeitsweise unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP gefüllt. Nach der Phenol- und Chloroformextraktion und der Äthanolfällung wurde die anfallende DNA mit io BamHI behandelt, und das anfallende grosse Plasmid-Frag-ment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das aus pTrpl4 abgeleitete Fragment hatte ein stumpfes und ein kohäsives Ende, was die Rekombination in geeigneter Orientierung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, zu-45 vor beschrieben, erlaubt.

Das HGH-Gen-Fragment, und das pTrpl4 A Xba-Bam-HI-Fragment wurden kombiniert und unter ähnlichen Bedingungen, wie oben beschrieben, aneinander gehängt. Die aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden verbanden sich mitein-50 ander über die Verbindung über die stumpfen Enden unter Rückbildung sowohl der Xbal- als auch der EcoRI-Stelle:

HGH-Gen-Anfang —T CT AG A ATT CT AT G—

—AGATCTT AAGAT AC—

Xbal EcoRI

fio Das Plasmid pHGH207 wurde mit Eco RI verdaut und der trp-Promoter, ein 300 b.p. Eco RI-Fragment enthaltend, durch PAGE und anschliessende Elektroelution gewonnen. Das 300 b.p. Eco RI-Fragment enthält den E. coli-trp-Pro-moter, Operator und trp-Leaderribosomen-Bindestelle, ihm 65 fehlt aber eine ATG-Sequenz für das Einführen der Translation. Dieses DNA-Fragment wurde in die Eco Rl-Stelle von pLe-IF A geklont.

EcoRI aufgefüllt AATTCTATG—

TTAAGATAC—

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Das eben erwähnte trp-Fragment ist ein Analogon des E. coli-Tryptophan-Operons, dessen sogenannter trp-Abschwächer beseitigt worden ist, um Expressionswerte kontrollierbar zu erhöhen. Expressionsplasmide, die das modifizierte trp-Regulon enthalten, können in Nährmedien, die zusätzliches Tryptophan in genügenden Mengen zum Unterdrük-ken des Promoter-Operator-Systems enthalten, bis auf vorbestimmte Werte vermehrt werden, dann von Tryptophan befreit werden, um das System von Repressor zu befreien, und die Expression des gewünschten Produkts veranlassen.

Im einzelnen wurden 250 Hg Plasmid pL31 mit Pst I verdaut und das 1000 b.p.-Insert durch Gelelektrophorese an einem 6%-Polyacrylamidgel isoliert. Etwa 40 Hg Insert wurden aus dem Gel elektroeluiert und in drei Teilmengen zu weiterem Aufschluss unterteilt: a) eine 16 ng-Probe dieses Fragments wurde mit 40 Einheiten Bgl II 45' bei 37 °C teilweise verdaut und das Reaktionsgemisch an einem 6%-Poly-acylamidgel gereinigt. Etwa 2 [ig des gewünschten 670 b.p.-Fragments wurden gewonnen, b) Eine weitere Probe (8 jxg) des 1000 b.p.-Pst I-Inserts wurde mit Ava II und Bgl. II behandelt. 1 jag des angegebenen 150 b.p.-Fragments wurde nach Gelelektrophorese gewonnen, c) 16 (ig des 1000 b.p.-Stücks wurden mit Sau 3a und Ava II behandelt. Nach Elektrophorese an einem 10%-Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 (ig (ca. 10 pMol) des 34 b.p.-Fragments gewonnen. Die zwei angegebenen Desoxyoligonucleotide, 5'-dAATT-CATGTGT (Fragment 1) und 5'-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriester-Methode (Maxam und Gilbert, Methods Enzymol. 65, 499-560 1980) ) synthetisiert. Das Fragment 2 wurde wie folgt phosphoryliert.

200 jj.1 (ca. 40 pMol) (y32P) ATP (Amersham, 5000 Ci/ mMol) wurden durchgetrocknet und erneut in 30 (il 60 mmol. Tris-HCl (pH 8), 10 mmol. MgCl2,15 mmol. ß-Mer-captoäthanol, 100 pMol DNA-Fragment und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase enthaltend, suspendiert. Nach 15 min bei 37 °C wurde 1 ja.110 mmol. ATP zugesetzt und die Reaktion weitere 15 min ablaufen gelassen. Das Gemisch wurde dann 15 min "auf 70 °C erwärmt, mit 100 pMol 5'-OH-Fragment 1 und 10 pMol des 34 b.p.-Sau 3a-Ava II-Frag-ments zusammengebracht. Das Binden erfolgte 5 h bei 4 °C in 50 (il 20 mmol. Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol. MgCl2,10 mmol. Dithiothreitol, 0,5 mmol. ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase. Das Gemisch wurde an einem 6-Polyacryl-amidgel elektrophoretisch behandelt, und das 45 b.p.-Pro-dukt durch Elektroelution gewonnen. 860.000 Cerenkov-cpm wurden gewonnen (ca. 30 ng, 1 pMol) kombiniert mit 0,5 ug (5 pMol) des 150 b.p.-Ava II-Bgl II-Fragments und 1 ug (2 pMol) des 670 b.p.-Bgl-II-Pst-I-Fragments. Das Binden erfolgte bei 20 °C 16 h unter Verwendung von 20 Einheiten T4-DNA-Ligase. Die Ligase wurde durch lOminütiges Erwärmen auf 65 °C inaktiviert. Das Gemisch wurde dann mit Eco RI und Pst I zum Beseitigen von Polymeren des Gens verdaut. Das Gemisch wurde durch 6% Polyacryl-amidgel-Elektrophorese gereinigt. 36.000 cpm (ca. 0,04 pMol), 20 ng) 865 b.p.-Produkt wurden isoliert. Die Hälfte hiervon (10 ng) wurde an pBR322 (0,3 ng) zwischen Eco RI und Pst I-Stellen gebunden. Die Transformation von E. coli 294 ergab 70 Tetracyclin-resistente Ampicillin-empfindliche Transformanten. Aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNA wurde mit Eco RI und Pst I verdaut. 16 der 18 Plasmide hatten ein Eco RI-Pst I-Fragment von 865 b.p. Länge. 1 ng von einem von diesen, pLe-IF AI, wurde mit Eco RI verdaut und an ein 300 b.p. Eco RI-Fragment (0,1 jigX das E. coli-trp-Promoter und trp-Leader-Riboso-men-Bindestelle enthielt, hergestellt wie oben beschrieben, gebunden. Den trp-Promoter enthaltende Transformanten wurden mit einer 32P-trp-Sonde nach der Grunstein-Ho-gness-Kolonie-Screening-Methodeidentifiziert - Grunstein et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. (USA) 72, 3961 (1975) ). Eine asymmetrisch angeordnete Xba-I-Stelle im trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinanten, in denen der trp-Promoter in Richtung des Le-IF-A-Gens orientiert war. s Extrakte wurden für den IF-Assay wie folgt hergestellt: 1 ml-Kulturen wurden in L-Brühe mit 5 |xg/ml Tetracyclin zu einem A550 von etwa 1,0 gezüchtet, dann in 25 ml M9-Me-dien mit 5 ng/ml Tetracyclin verdünnt. 10 ml-Proben wurden durch Zentrifugieren gewonnen, wenn A550 1,0 erreichte, io und Zellkuchen wurden in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 mmol. Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol. EDTA suspendiert. 1 mg Lysozym wurde zugesetzt, und nach 5 min bei 0 °C wurden die Zellen durch Beschallung aufgebrochen. Die Proben wurden 10 min bei 15.000 UpM in einem Sorvall-15 SM-24-Rotor zentrifugiert. Die Interferon-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten wurde durch Vergleich mit Le-IF-Standards mit Hilfe des Hemmtests des cytopathischen Effekts (CPE) bestimmt. Zur Bestimmung der Zahl der IF-Moleküle pro Zelle wurde eine Le-IF-spezifische Aktivität 20 von 4 x 108 Einheiten/mg verwendet (Rubinstein et al.,

Proc. Nati. Acad. Sei. (USA) 76, 640 (1979) ).

Der Klon pLe-IF-A-trp 25, in den der trp-Promoter in der gewünschten Orientierung eingesetzt worden war, ergibt hohe Aktivitätswerte (sogar 2,5 x 108 Einheiten/1). Das von 25 E. coli K-12-Stamm 294/pLe-IF A-trp 25 gebildete IF verhält sich wie authentisches Human-Le-IF; es ist gegenüber einer Behandlung bei pH 2 stabil und wird durch Kanin-chen-Antihuman-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein wahrnehmbares Molekulargewicht von et-30 wa 20.000.

Die Isolierung von cDNAs für weitere Leukozyten-Inter-ferone

DNA aus dem vollständig charakterisierten Le-IF a cDNA-haltigen Plasmid wurde mit Pst I herausgeschnitten, 35 elektrophoretisch isoliert und nach einer veröffentlichten Arbeitsweise (Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta. 442, 324 (1976) ) mit 32P markiert. Die radioaktiv markierte DNA wurde als Sonde für das Screening weiterer E. coli 294-Transformanten durch ein in situ-Kolonie-Testverfahren, 4o Grunstein et al., wie oben, verwendet. Kolonien wurden isoliert, die mit der Sonde in unterschiedlichen Mengen hybridisierten. Plasmid-DNA aus diesen Kolonien und die oben erwähnten 10 hybridisierenden Kolonien wurde durch Herausschneiden mit Pst isoliert und nach drei verschiedenen 45 Methoden charakterisiert. Zuerst wurden diese Pst-Frag-mente durch ihre Restriktions-Endonuclease-Abbaumuster mit den Enzymen Bgl II, Pvu II und Eco RI charakterisiert. Diese Analyse erlaubte die Klassifizierung von wenigstens 8 verschiedenen Typen (Le-IF A, Le-IF B, Le-IF C, Le-IF D, so Le-IF E, Le-IF F, Le-IF G und Le-IF H), was der Lokation verschiedener Restriktionsschnitte relativ zu der derzeit bekannten Vorsequenz und Codiersequenz von Le-IF A nahekommt. Einer von diesen, Le-IF D, ist vermutlich identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284 316 (1980) beschrie-55 benen.

Sodann wurden bestimmte der DNAs nach einem veröffentlichten Hybridisierungs-Auswahltest, Cleveland et al., Cell 20, 95 (1980), auf ihr Vermögen zur selektiven Entfernung von Le-IF mRNA aus Poly-A-haltiger KG-l-Zell-60 RNA getestet. Bei diesem Test waren Le-IF A, B, C und F positif. Drittens wurden die letzteren Pst-Fragmente in ein Expressionsplasmid insertiert, E. coli 294 mit dem Plasmid exprimiert und die Fragmente ausgedrückt. Die Expressionsprodukte, vermutlich Vor-Interferone, waren alle positiv 65 beim CPE-Test auf Interferon-Aktivität, wenngleich nur am Rande aktiv im Falle des Le-IF-F-Fragments. Ausserdem wurden alle beschriebenen Le-IF-Typen in Sequenzen aufgeteilt.

7

660 743

Zweites reifes Leukozyten-Interferon

Die Sequenz des isolierten Fragments mit dem Gen für reifes Le-IF-B zeigt, dass die ersten 14 Nucleotide der Typen A und B identisch sind. Wir schlugen daher vor, ein Fragment aus pLe-IF A 25 zu isolieren, das den trp-Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle und den Beginn des Le-IF (A = B)-Gens trägt, und dieses mit dem übrigen Teil der B-Sequenz in einem Expressionsplasmid zu kombinieren.

Um das etwa 950 b.p. Sau 3a - Pst I-Fragment aus der in Fig. 7a dargestellten Sequenz zu erhalten, waren mehrere Schritte nötig aufgrund des Vorliegens einer oder mehrerer störender Sau 3a-Restriktionsstellen, d.h.:

1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert:

a) 110 b.p. aus Sau 3a - Eco RI;

b) 132 b.p. aus Eco RI - Xba;

c) über 700 b.p. aus XBa - Pst.

2. Die Fragmente (la) und (lb) wurden gebunden und mit Xba und Bgl II geschnitten, um Selbstpolymerisation durch Sau 3a und Xba-Endstellen auszuschliessen (die relevante Sau 3a-Stelle war innerhalb einer Bgl Ii-Stelle; Bgl II-Schnitte hinterlassen ein Sau 3a-kohäsives Ende), Ein 242 b.p.-Fragment wurdeisoliert.

3. Die Produkte von (2) und (lc) wurden verbunden und mit Pst I und Bgl II geschnitten, wiederum, um Selbstpolymerisation zu verhindern. Ein Fragment von etwa 950 b.p., Sau 3a - Pst I, wurde isoliert. Dieses Fragment umfasste den Teil des Le-IF-B-Gens, den Le-IF A nicht hatte.

4. Ein etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III - Sau 3a) mit trp-Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle, ATG-Start-signal und Cysteincodon von Le-IF A wurde aus pLe-IF A 25 isoliert.

5. Ein etwa 3600 b.p.-Fragment Pst I - Hind III wurde aus pBr 322 isoliert. Dies umfasste das Replikon und codierte die Tetracyclin-, nicht aber Ampicillin-Resistenz.

6. Die in den Stufen 3,4 und 5 erhaltenen Fragmente wurden dreifach verbunden und mit diesem Plasmid E. coli K-12-Stamm 294 transformiert.

Kleine Mengen Transformanten wurden minigetestet, Birnboim et al., Nucleic Acid Research 7,1513 (1979), und Plasmid-Proben wurden mit Eco RI verdaut. Das verdaute Material lieferte 3 Fragmente, charakteristisch für

1) das Eco-RI-Eco RI-trp-Promoter-Fragment; 2) das innere Eco RI - Eco RI-Fragment von pL4; und 3) das Fragment vom Protein-Translations-Startsignal bis zur Eco RI-Spaltstelle von pL4.

Beim CPE-Test ergeben bakterielle Extrakte von Klonen, hergestellt in der obigen Weise, typischerweise Testwerte von etwa 10 x 106 Einheiten Interferon-Aktivität pro 1 bei A550 = 1. Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist 294/pLIF B trp 7.

Weitere reife Leukozyten-Interferone

Weitere Gen-Fragmente voller Länge, die andere Le-IF-Typen haben, können massgeschneidert und in Expressionsträger zur Expression, wie im Falle von Le-IF A, gebracht werden. Vollständige Sequenzaufklärung nach herkömmlichen Massnahmen wird zeigen, ob eine Restriktionsstelle nahe genug dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interfe-ron-Typs liegt, um eine bequeme Zuflucht zu der Lösung zu ermöglichen, die Beseitigung der Vorsequenz durch Restriktionsschnitt und Ersatz der Codons aminoendständig zusammen mit der Vorsequenz verlorengegangenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNA-Fragments, wie oben beschrieben, anzuwenden. Geht dies nicht, kann die oben beschriebene Arbeitsweise von Kleid et al. angewandt werden. Kurz zusammengefasst gehört hierzu die Spaltung des die Vorsequenz enthaltenden Fragmente genau vor dem Punkt, an dem der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar durch

1. Umwandeln der doppeltsträngigen DNA in Einzel-strang-DNA in einem Bereich um diesen Punkt herum;

2. Hybridisieren des in Stufe 1 gebildeten Einzelstrang-Bereichs mit einer komplementären Starter-Sequenz von

5 Einzelstrang-DNA, wobei das 5'-Ende des Starters dem Nu-cleotid gegenüberliegt, das an die beabsichtigte Spaltungsstelle grenzt;

3. Wiederherstellung des Teils des zweiten Stranges, in Stufe 1 eliminiert, der in 3'-Richtung des Starters liegt, durch io Reaktion mit DNA-Polymerase in Gegenwart von Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin enthaltenden Desoxynucleo-tid-triphosphaten und

4. Abbauen der verbleibenden Einzelstranglänge der DNA, die über den gewünschten Spaltungspunkt hinweg-

i5 reicht.

Ein kurzes Stück synthetischer DNA, das am 3'-Ende des codierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann, z.B. durch Verbinden mit dem stumpfen Ende, an das anfallende massgeschneiderte Gen für die rei-20 fen Interferone gebunden werden, und das Gen in ein Expressionsplasmid eingesetzt und unter die Kontrolle eines Promoters und die zugehörige Ribosomen-Bindestelle gebracht werden.

Ahnlich wie oben wurden Genfragmente mit Codierung 25 für Le-IF-C und Le-IF-D in geeigneter Weise für direkte bakterielle Expression aufgebaut. Die Expressionsstrategie für diese zusätzlichen Leukozyten-Interferone beinhaltete in jedem Falle den Rückgriff auf das etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III - Sau 3a) mit dem trp-Promoter-Operator, Ribo-30 somen-Bindestelle, ATG-Startsignal und Cysteincodon von Le-IF A von pLe-IF A25. Hiermit wurden Genfragmente aus weiteren Interferongenen kombiniert, die ihre jeweiligen Aminosäure-Sequenzen über das allen gemeine anfängliche Cystein hinaus codieren. Jedes anfallende Plasmid wurde zur 35 Transformation von E, coli K-12 Stamm 294 verwendet. Bindungen zur Bildung der jeweiligen Gene waren wie folgt:

LeIF-C

Man isoliert die folgenden Fragmente aus pLe LF-C: 40 (a) 35 b.p. von Sau 3a bis Sau 96

(b) 900 b.p. Sau 96 bis Pst I

(c) Man isoliert ein etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III-

Sau 3a) aus pLe IF A-25 wie in Teil N (4) oben.

(d) Man isoliert das etwa 3600 b.p.-Fragment von Teil N 45 (5) oben.

Konstruktion

1) Man verknüpft (a) und (c). Man spaltet mit Bgl II, Hind III und isoliert das Produkt von etwa 335 b.p. (Basen-

50 paaren).

2) Dreifachverknüpfung von 1) + (b) + (d) und Transformieren von E. coli mit dem erhaltenen Plasmid.

Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLe IF C trp 35.

55

Le-IF D

Man isoliert aus pLe IF-D:

(a) 35 b.p. von Sau 3a bis Ava II

(b) 150 b.p. von Ava II bis Bgl II 60 (c) ca. 700 b.p. von Bgl II bis Pst I

Man isoliert aus pLe IF A25:

(d) 300 b.p. von Hind III bis Sau 3a Man isoliert aus PBr 322:

(e) etwa 3600 b.p. von Hind III bis Pst I

65

Konstruktion

1) Man verknüpft (a) + (b), spaltet mit Bgl II und reinigt: 185 b.p.-Produkt (1).

660 743

8

2) Man verknüpft 1) + (d), spaltet mit Hind III, Bgl II und reinigt das ca. 500 b.p.-Produkt (2).

3) Man verbindet (2) + (c) + (e) und transformiert E. coli mit dem anfallenden Plasmid.

Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.

Le-IF F

Das Le-IF F enthaltende Fragment kann zur direkten Expression durch Wiederzusammensetzen zurechtgeschnitten werden, bequem gemacht durch die vollständige Homologie von Aminosäuren 1-13 von Le-IF B und Le-IF F. Ein trp-Promoter-haltiges Fragment (a) mit geeignet konfigurierten Enden wird aus pHGH 207, oben beschrieben, über Pst I und Xba I-Behandlung mit anschliessender Isolierung des ca. 1050 b.p.-Fragments erhalten. Ein zweites Fragment (b) wird als grösseres der Fragmente aus dem Pst I- und Bgl II-Abbau des Plasmids pHky 10 erhalten, ein Derivat von pBR322, das eine Bgl Ii-Stelle zwischen dem Tetracyclinresistenten Promoter und dem Strukturgen enthält. Fragment

(a) enthält etwa die Hälfte des die Ampicillin-Resistenz codierenden Gens; Fragment (b) enthält den Rest jenes Gens und das gesamte Gen für die Tetracyclin-Resistenz, ausgenommen den zugehörigen Promoter. Die Fragmente (a) und

(b) werden über T4-Ligase kombiniert und das Produkt mit Xba I und Bgl II behandelt, um Dimerisierung zu beseitigen, was zu einem Fragment (c) mit dem trp-Promoter-Operator und Genen für Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz führt.

Ein Fragment (d) von etwa 580 b.p. wird über Ava II und Bgl II-Abbau von pLe IF-F erhalten. Es weist Codons für Aminosäuren 14—166 von Le-IF F auf.

Ein Fragment (e) (49 b.p.) wird durch Xba I und Ava II-Abbau von pLe-IF B erhalten. Fragment (e) codiert die Aminosäuren 1-13 von Le-IF F.

Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4-Ligase dreifach verbunden. Die aneinanderhängenden Enden der jeweiligen Fragmente sind so, dass das zusammengesetzte Plasmid korrekt gebildet wird, wobei das Tetracyclin-Resistenz-Gen unter die Kontrolle des trp-Promoter-Opera-tors zusammen mit dem Gen für reifes Le-IF F gebracht wird, so dass mit dem gewünschten Plasmid transformierte Bakterien auf Tetracyclin-haltigen Platten ausgewählt werden können. Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLelF F trp 1.

Le-IF H

Das vollständige Le-IF H-Gen kann wie folgt zur Expression als ausgereiftes Leukozyten-Interferon konfiguriert werden:

1. Plasmid-pLe-IF-H wird dem Hae II- und Rsa I-Abbau Isolierung des 816-Basenpaar-Fragments, das von der Si-gnalpeptid-Aminosäure 10 bis zum 3'-nichtcodierenden Bereich reicht, unterworfen.

2. Das Fragment wird denaturiert, und der Reparatursynthese mit Klenow-Fragment unterworfen, Klenow et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 65, 168 (1970), wobei das synthetische Desoxyribooligonucleotid-Starter 5'-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird. Diese allgemeine Arbeitsweise wird auch von Goeddel et al., US-SN 190 799 (25.9.1980) beschrieben.

3. Das anfallende Produkt wird mit Sau 3a gespalten und ein 452-Basenpaar («bp»)-Fragment, das die Aminosäuren 1-150 darstellt, wird isoliert.

4. Sau 3a- und Pst I-Abbau von pLelF H und Isolierung des anfallenden 500 b.p.-Fragments liefert ein Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der codierenden Sequenz codiert.

5. Die in den Stufen (3) und (4) isolierten Fragmente werden zum folgenden Fragment miteinander verknüpft:

1 166

met cys asp Stop

ATG TGT GAT TGA Pst

Sau 3a

5

das die 166 Aminosäuren von Le-IF H codiert.

6. pLelF A trp 25 wird mit Xba I aufgeschlossen, mit DNA-Polymerase I mit stumpfem Ende versehen und das Produkt mit Pst I abgebaut. Das grosse anfallende Fragment io kann mit dem Produkt der Stufe (5) zu einem Expressions-Plasmid verknüpft werden, das nach Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 oder anderen Wirtsbakterien reifes LeIF H zu exprimieren vermag.

15 LeIF-I

Die von Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen X Cha-ron 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen durch von Lawn et al., oben, und Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978) 20 beschriebenen Arbeitsweisen durchsucht. Eine radioaktive LelF-Sonde, aus der cDNA, Klon LeIF A, stammend (Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980) ), wurde verwendet, um etwa 500 000 Plaques zu prüfen. Dabei wurden 6 LelF-Genom-Klone erhalten. Nach erneutem Screening und Pla-25 que-Reinigung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, zur weiteren Analyse ausgewählt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren können weitere Sonden vorteilhaft zur Isolierung zusätzlicher LelF-Klone aus dem Human-Genom verwendet werden. Diese wiederum 30 können zur Herstellung weiterer Leukozyten-Interferon-Pro-teine gemäss der Erfindung eingesetzt werden.

1. Das 2000 Basenpaar-Eco RI-Fragment des Genom-Klons (X HLeIF2) wurde an der Eco Rl-Stelle in pBR325 nochmals kloniert. Das anfallende Plasmid LeIF I wurde mit

35 Eco RI gespalten und das 2000 Basenpaar-Fragment isoliert. Das Desoxyoligonucleotid dAATTCTGCAG (ein Eco RI > Pst I-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaar-Exo RI-Fragment geknüpft und das anfallende Produkt mit Pst I zu einem 2000 Basenpaar-Fragment mit Pst I-Enden gespalten. 4o Dies wurde mit Sau 96 gespalten und ein 1100 Basenpaar-Fragment isoliert, das ein Pst I-Ende und ein Sau 96-Ende aufweist.

2. Das Plasmid pLelF C trp 35 wurde mit Pst I und Xba I abgebaut. Das grosse Fragment wurde isoliert.

45 3. Das kleine Xba I-Pst I-Fragment von pLelF C trp 35 wurde mit Xba I und Sau 96 abgebaut. Ein 40 Basenpaar-Xba I- Sau 96-Fragment wurde isoliert.

4. Die in den Stufen 1), 2) und 3) isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLelF I trp 1 verso knüpft.

LeIF-J

1. Das Plasmid pLelF J enthält ein 3800-Basen-Hind III-Fragment von Humangenom-DNA, das die LelF J-Gen-Se-

55 quenz aufweist. Ein 760 Basenpaar-Dde I-Rsa-I-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert.

2. Das Plasmid pLelF B trp 7 wurde mit Hind III und Dde I gespalten und ein 340 bP Hind III-Dde I-Fragment isoliert.

6o 3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pst I gespalten, erhielt durch Inkubation mit DNA Pol I (Klenow-Fragment) ein stumpfes Ende, wurde dann mit Hind III verdaut. Das grosse (ca. 3600 bp) Fragment wurde isoliert.

4. Die in den Stufen 1), 2) und 3) isolierten Fragmente 65 wurden zu dem Expressions-Plasmid pLelF J trp 1 verknüpft.

Die bei den folgenden Aufbauvorgängen eingesetzten Methoden und Materialien waren wie in der obigen Be-

9 660 743

Schreibung. Die folgende Tabelle 1 liefert die Einzelheiten für den speziellen Zusammenbau von Hybrid-LelF-Plasmi-den:

Tabelle 1

LelF

Amino

Expres

Vorderteil

Hinterteil

anfallendes

Hybrid säuren sions-

Fragment

Amino

Fragment

Amino

Expressions-

insgesamt*

Plasmid

säuren

Plasmid

(Vektor)

AD

165

a

Xba I-Pvu II von pLelF A trp 25 (285 bp)

1-91

Pvu Il-Pst I von pLelF D trp 11 (~ 550 bp)

93-166

pLelF AD trp (Pvu II)

DA

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D trp 11 (288 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF A trp 25 (~ 550 bp)

92-165

pLelF DA trp (Pvu II)

AD

165

Bgl Il-Pst I grosses Fragment v.

pLelF A trp 25

1-62

Bgl Il-Pst I von pLelF D trp 11 (~ 600 bp)

64-166

pLelF AD trp (Bgl II)

DA

166

Bgl Il-Pst I grosses Fragment pLelF D trp 11

1-63

Bgl II partial-Pst I v. pLelF A trp 25 (~ 700 bp)

63-165

pLelF DA trp (Bgl II)

AB

165

a

Xba I-Pvu II v. LeIF A trp 25 (285 bp)

1-91

Pvu II partial-Pst I von pLelF B trp 7 (~ 750 bp)

93-166

pLelF AB trp (Pvu II)

AF

165

a

Xba I-Pvu II v. LeIF A trp 25 (285 bp)

1-91

Pvu II Pst I von PLelF F trp I (~ 700 bp)

93-166

pLelF AF trp (Pvu II)

AG

165

a

Xba I-Pvu II v. I pIF A

trp 25 (285 bp)

1-91

Pvu Il-Pst I von pLelF G (~ 750 bp)

93-166

pLelF AG trp (Pvu II)

AI

165

a

Xba I-Bgl II partial von pLelF A trp 25 (~ 455 bp)

1-150

Bgl Il-Pst I von LeIF I trp 1 (~ 650 bp)

151-165

pLelF AI trp (Bgl II)

BA

166

b

Hind III-Pvu II v.

pLelF B

trp 7 (~ 630 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF A trp 25 (~ 550 bp)

92-165

pLelF BA trp (Pvu II)

BD

166

b

Hind III-Pvu II v.

pLelF B

trp 7 (~ 630 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF D trp 11 ~ 550 bp)

93-166

pLelF BD trp 6 Pvu II)

BF

166

b

Hind III-Pvu II v.

pLelF B

trp 7 (~ 630 pb)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF F trp 1 (~ 700 bp)

93-166

pLelF BF trp (Pvu II)

BG

166

b

Hind III-Pvu II v.

pLelF B

trp 7 (~ 630 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF G (~ 750 bp)

93-166

pLelF BG trp (Pvu II)

DB

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D

trp 11 (288 bp)

1-92

Pvu II partial-Pst I von pLelF B trp 7 (~ 750 bp)

93-166

pLelF DB trp (Pvu II)

DF

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D

trp 11 (288 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLEIF F trp 1 (~ 700 bp)

93-166

pLelF DF trp (Pvu II)

DG

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF D

trp 11 (288 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF G (~ 750 bp)

93-166

pLelF DG trp (Pvu II)

FA

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF A trp 25 (~ 550 bp)

92-165

pLelF FA trp (Pvu II)

FB

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 pb)

1-92

Pvu II partial-Pst I von pLelF B trp 7 (~ 750 bp)

93-166

pLelF FB trp (Pvu II)

FD

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF D trp 11 (~ 550 bp)

93-166

pLelF FD trp (Pvu II)

FG

166

a

Xba I-Pvu II von pLelF F trp 1 (288 bp)

1-92

Pvu Il-Pst I von pLelF G (~ 750 bp)

93-166

pLelF FG trp (Pvu II)

IA

166

a

Xba I-Bgl II von pLelF I trp 1 (~ 458 bp)

1-151

Bgl Il-Pst I v. pLelF A

trp 25 (~ 430 bp)

152-166

pLelF IA trp (Bgl II)

660743

10

* ohne N-endständiges Methionin a grosses (ca. 3900 bp) Fragment von Xbal bis Pstl-Verdauung von plelF A trp 25.

b grosses (ca. 3600 bp) Fragment von Hind III bis Pstl-Verdauung von pBR.322.

Unter weiterer Bezugnahme auf Tabelle 1 wurden die er- 5 bei n Aminosäuren einen erheblichen Teil der Aminosäuresesten vier beschriebenen Hybrid-LelFs aus zwei Lelf-Expres- quenz des ersten Interferons bilden. Die Spaltung mit der sions-Plasmiden hergestellt. Eine Bgl Ii-Stelle, wie sie LelF Restriktions-Endonuclease liefert ein Fragment mit dem A und D cDNAs gemein ist, wurde zum Aufbau eines Ex- Aminoende des ersten Interferons und Codons für etwa n pressions-Plasmids pLelF trp AD (Bgl II) verwendet, was Aminosäuren. Ein zweites Fragment mit allen oder einem die 63 in Aminogruppen endenden Aminosäuren von LelF 10 Teil der Codons für die Aminosäure-Sequenz eines zweiten, A und die 102 als Carboxylgruppen endenden Aminosäuren anderen Leukozyten-Interferons wird gewählt, wobei das von LeIF D codiert. Die gleiche Stelle wurde beim Aufbau Fragment eine Spaltstelle für eine identische Restriktions-eines Expressions-Plasmids pLelF trp DA (Bgl II) verwen- Endonuclease nahe Codons für jene Aminosäure des zweiten det, das 64 in Aminogruppen endende Aminosäuren von Interferons aufweist, deren Aminosäurezahl (vom Aminoen-LelF D und 102 in Carboxylgruppen endende Aminosäuren 15 de des zweiten Interferons fortschreitend) etwa 166-n ist. Die von LeIF A codiert. Die Pvu Ii-Stelle ist beim Aufbau der Spaltung des zweiten Fragments mit der Restriktions-Endo-beiden anderen Hybrid-Interferon-Expressions-Plasmide ver- nuclease liefert ein Produkt komplementär zu dem «n»-End-wendet worden: 91 in Aminogruppen endende Aminosäuren teil des Verdauungsprodukts des ersten Fragments, so dass von A mit 74 in Carboxylgruppen endenden Aminosäuren das Verdauungsprodukt des zweiten mit dem des ersten ver-von D (pLelF trp AD (Pvu II) ) und 92 in Aminogruppen 20 knüpft werden kann, unter Rückbildung der Restriktionsendende Aminosäuren von LeIF D mit 74 in Carboxylgrup- Endonuclease-Erkennungsstelle und erneuter Bildung des pen endenden Aminosäuren von LeIF A (pLelF trp DA Codons für die Aminosäure n des ersten Interferons, sofern (Pvu II) ). Zusammengefasst: bei der ersten Verdauung verlorengegangen. Das Produkt pLelF AD trp (Pvu II): der Restriktions-Endonuclease-Verdauung des zweiten Frag-Das grosse (ca. 3900 bp) Fragment eines Xba I- und Pst 25 ments läuft vorzugsweise von dem Ende aus ab, das bei der I-Abbaus von pLelF A trp 25 wurde mit einem 285 bp Xba Spaltung in 3'-Stellung durch Nucleotide anfällt, die das I-Pvu II-Fragment von pLelF a trp 25 und einem ca. 550 bp Carboxylende des zweiten Leukozyten-Interferons codieren. Pvu Il-Pst I-Fragment von pLelF D trp 11 verknüpft; Andererseits können Hybride, die erhebliche Teile der pLelF DA trp (Pvu II): Aminosäure-Sequenzen von mehr als zwei natürlichen vor-Das grosse (ca. 3900 bp) Fragment von einem Xba I- und 30 kommenden Leukozyten-Interferonen enthalten, gebildet Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem 288 bp werden, wobei dann z.B. das oben erwähnte zweite Frag-Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF D trp 11 und einem ca. ment ausserdem dazu ausgewählt wird, eine zweite Restrik-550 bp Pvu Il-Pst I-Fragment von pLelF A trp 25 ver- tions-Endonuclease-Stelle hinter der ersten zu enthalten, wo-knüpft; bei die zweite Stelle identisch einer ähnlich gelagerten Stelle pLelF Ad trp (Bgl II): 35 innerhalb eines Fragments ist, das das Carboxyl-Endteil ei-Das grosse Fragment von einem Bgl II-, Pst I-Abbau von nes dritten Leukozyten-Interferons codiert usw. In dem ge-pLelF A trp 25 wurde mit einem ca. 600 bp Bgl Il-Pst I- nannten Beispiel können die Produkte der aufeinanderfol-Fragment von pLelF D trp 11 verknüpft; und genden Restriktions-Endonuclease-Einsätze dreifach ver-pLelF DA trp (Bgl II): knüpft werden, um ein Hybridgen zu bilden, das den Ami-Das grosse Fragment von einem Bgl II-, und Pst I-Abbau 40 no-Endgruppenteil eines ersten Interferons, den Mittelbe-von pLelF D trp 11 wurde mit einem ca. 700 bp-Fragment, reich der Aminosäuresequenz des zweiten und den Carboxyl-erhalten durch Pst I-Spaltung von pLelF A trp 25 und nach- Endteil des dritten codiert (oder einer weiteren Variante des folgende Bgl Ii-Verdauung, verknüpft. ersten, wobei das erste und das dritte Interferon gleich sind). Beim 5. angegebenen Hybrid:

pLelF AB trp (Pvu II): 45 Vorzugsweise leitet sich das erste oben erwähnte Frag-Das grosse (ca. 3900 bp) Fragment von einem Xba I und ment von einem Expressions-Plasmid ab, d.h. einem solchen, Pst I-Abbau von pLelF A trp 25 wurde mit einem 285 bp bei dem Codons für den Amino-Endteil des ersten Leukozy-Xba I-Pvu II-Fragment von pLelF A trp 25 und einem ca. ten-Interferons als Vorgänger ein ATG- oder anderes Trans-750 bp Pvu II-(partial)-Pst I-Fragment von pLelF B trp 7 lations-Initiations-Codon und einen Promoter oder Promoverknüpft. so ter-Operator-System haben. Im Ergebnis wird das Endpro-

Ähnlich sind die anderen in Tabelle 1 wiedergegebenen dukt der oben beschriebenen Manipulationen ein Plasmid

Zusammensetzungen festgelegt. Als weiteres Beispiel kann sein, das das vom Hybridgen in Bakterien oder anderen mi-

man beim Aufbau eines LeIF C und/oder LelF H-Teil ent- krobiellen, mit den Plasmid transformierten Organismen co-

haltenden Hybrids Vorteil ziehen aus gemeinsamen Bbv I- dierte Polypeptid zu exprimieren vermag. Weitere Massnah-

Steilen, die etwa beim Nucleotid 294 (d.h. GCTGC) der 55 men zur Gestaltung des Hybridgens für mikrobielle Expres-

Gen-Sequenzen auftreten. sion liegen für den Fachmann auf der Hand.

Ähnlich können Plasmide, die sich zur mikrobiellen Ex- Bei bevorzugten Ausführangsformen der Erfindung co-

pression anderer neuer Hybrid-Leukozyten-Interferone eig- dieren die Hybridgene eine neue Leukozyten-Interferon-

nen, durch geeignete Manipulation der alle oder Teile der Aminosäure-Sequenz von etwa 165 bis 166 Aminosäuren,

Aminosäuresequenzen natürlich auftretender Leukozyten- 60 ein Konjugat wesentlicher Aminosäure-Sequenzen von zwei

Interferone codierenden Doppelstrang-DNA gebildet wer- oder mehr verschiedenen Leukozyten-Interferonen darstel-

den. So wird ein erstes Doppelstrang-DNA-Fragment ge- lend, ausgewählt unter LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D,

wählt, das das Aminoende einer ersten, natürlich vorkom- LeIF E, LeIF F, LeIF G und LeIF H, wie in Fig. 3a und 3b menden Leukozyten-Interferon-Aminosäuresequenz und, in dargestellt. Am meisten bevorzugt weisen die neuen, von den

3'-Richtung fortschreitend, einen erheblichen Teil der Ami- es Hybridgenen codierten Leukozyten-Interferone die genann-

nosäuresequenz codiert. Das Fragment weist eine Restrik- ten und wie in der Sequenz «alle» der Fig. 3a und 3b angege-

tions-Endonuclease-Spaltstelle nahe den Codons für die ben angeordneten Aminosäuren auf. Die Expressionspro-

Aminosäure «n» des ersten Leukozyten-Interferons auf, wo- dukte von Plasmiden, erfindungsgemäss hergestellt, können

11

660 743

in herkömmlicher Weise auf antivirale Aktivität getestet werden, wie in den nachfolgend beschriebenen biologischen Aktivitätsbestimmungen.

Nachweis der antiviralen Aktivität

E. coli K-12 Stamm 294 wurden in herkömmlicher Weise unabhängig mit den Plasmiden pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF trp A/D (Bgl II) und pLelF trp D/A (Bgl II) transformiert. Die Transformanten wurden getrennt in 5 ml-Kul-turen in L-Brühe mit 5 mg/ml Tetracyclin zu einem A550-Wert von 1,0 gezüchtet, dann in 11 M9-Medium mit 5 |ig/ml Tetracyclin verdünnt. Die Zellen wurden geerntet, wenn A550 1,0 erreichte, und die Zellen in 10 ml 15%iger Saccharose, 50 mmol. Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol. EDTA suspendiert. 10 mg Lysozym wurden zugesetzt, und nach 5 min bei 0 °C wurden die Zellen durch Schalleinwirkung aufgebrochen. Die Proben wurden 10 min bei 15.000 UpM in einem Sorvall SM-24-Rotor zentrifugiert. Die Interferon-Aktivität der überstehenden Flüssigkeiten wurde auf antivirale Aktivität getestet.

Die Ausbeuten pro 1 Kultur dieser Interferone, an einem menschlichen Zellstamm (Wish) titriert, sind in Tabelle 2 gezeigt, aus der klar wird, dass die LelF-A/D-Aktivität in grösserem Masse hervorgerufen wird als die anderer Interferone. Dieser Unterschied könnte auf der grösseren vorgegebenen Aktivität des LeIF-A/D- oder auf grösserer Ausbeute, ausgedrückt in mg Protein dieses Interferons, beruhen. Da die genetische Verbindung für alle diese Interferone identisch war, erscheint es am wahrscheinlichsten, dass LeIF-A/D praktisch eine grössere Aktivität als die anderen Interferone besitzt.

Tabelle 2

Ausbeute an Leukozyten-Interferonen aus Schüttelkolben-kulturen von E. coli

Art des Interferons Aktivität, Ausbeute/1

(Einheiten an Wish) + ) A 8 x IO7

D 5 x 10A

5 AD (Bgl II) 2 x IO8

DA (Bgl II) 1 x 10"

+ ) getestet durch Hemmung des cytopathischen Effekts io an Wish-Zellen mit VSV als Testsubstanz

Die Wirksamkeit der verschiedenen Interferone in einer Reihe von Säugetier-Zellstämmen wurde bestimmt (vom 15 Menschen Wish; von der afrikanischen grünen Meerkatze Vero; Hamster-Fibroblast BHK; Nierenzellen vom Kaninchen, RK-13; Maus L-929; und Rinderniere, MDBK-Zel-len). Um die relative Aktivität der Interferone zu vergleichen, wurde ihre Aktivität an verschiedenen Zellen, relativ 2o zu ihrer Aktivität an Wish-Zellen als 100 angesetzt, berechnet. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass LelF-A/D eine sehr hohe Aktivität in VERO und L-929-Zellen hat, während LeIF-D/A eine geringe Aktivität in diesen Zellstämmen hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kombination des N-25 Endteils von LeIF-A und des C-Endteils von LeIF-D innerhalb eines Moleküls (LeIF-A/D) zu der besonderen Wirksamkeit des Hybrid-Proteins beiträgt, die in verschiedenen Säugetierarten ihren Ausdruck findet. Weiter sind diese Eigenschaften nicht eine einfache Summierung der Eigenschaf-3o ten der Ausgangs-Interferone. Dies zeigt sich deutlich im Fall der Aktivität an L-929-Zellen (Tabelle 3), in welchem Falle weder ein Gemisch aus LeIF-A und LeIF-D noch das andere Hybrid, LeIF-D/A, eine erhebliche Aktivität aufweist.

Tabelle 3

Titration verschiedener Leukozyten-Interferone in Zellstämmen aus verschiedenen Säugetierarten

Leukozyten-Interferone+1

Zellstamm

A

D

A/D

D/A

A + D

Leukozytenfilm in zentrifugier-tem Blut

WISH

100

VERO

250

75

1.670

20

200

BHK

400

200

833

2.000

400

20

RK-13

12

500

6

N.D.

120

L-292

150

5

3.300

50

2

10

0,1

Anmerkung zu Tabelle 3: tion und LeIF-A auch antivirale Aktivität hat, wie von der

+) Interferone, getestet gegen VSV-Infektion der verschie- Aktivität in Zellstämmen (Tabelle 2) zu erwarten ist. Die denen Zellstämme. Aktivitäten ausgedrückt als Prozentsatz Daten in Fig. 7 stammen aus Behandlungen i.p. 3 h vor der der in WISH-Zellen beobachteten Aktivität. Infektion. Die Dosen an LeIF-A/D und LeIF-A sind wie an

55 WISH titriert.

Die Aktivität von LeIF-A/D gegen andere Viren wurde auch untersucht. Die Daten in Fig. 5 zeigen antivirale Effek- Letale EMC-Virusinfektion von Hamstern wird auch te gegenüber EMC-Virusinfektion von L-Zellen, und die Da- durch LeIF-A/D und LeIF-A (Fig. 8) beeinträchtigt, wobei ten in Fig. 6 zeigen Effekte gegenüber VSV-Infektion von L- ersteres das wirksamste ist, und Leukozytenfilm-Interferon Zellen. Aus diesen Daten wird klar, dass die grössere Aktivi- 6o zeigt nur einen kleinen und statistisch insignifikanten Effekt, tät von LeIF-A/D nicht auf ein Virus (VSV) beschränkt ist Im Falle von Fig. 8 wurden alle Interferone i.p. 3 h vor der und die grössere Aktivität offenbar eine allgemeine Eigen- Infektion in einer Dosis von 5 x 105 ng/kg, titriert an schaft gegenüber vielen Viren ist. Natürliche Human-Leuko- WISH-Zellen, gegeben.

zytenfilm-Interferon-Präparate haben keine Wirkung gegenüber Mauszellen (siehe Tabelle 2). Die Aktivität von LelF- 65 Diese Ergebnisse zeigen an, dass die ausgeprägten antivi-A/D gegen EMC-Virusinfektion von CD-l-Mäusen wurde ralen Effekte von LeIF-A/D bei einer Reihe von Säugetierar-daher untersucht. Die Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, dass LelF- ten nicht auf Zellkulturen beschränkt sind, sondern auch bei A/D extrem wirksam ist gegenüber letaler EMC-Virusinfek- letalen Virusinfektionen beobachtet werden.

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12

EMC-Virus kann als Modellsystem angesehen werden, wobei eine Demonstration der antiviralen Wirkung gegen dieses System eine Voraussage der antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie ermöglichen mag, z.B. die Picornavirus-Familie, für die Maul- und Klauenseuche und Polio Vertreter sind. VSV-Virus kann als Modellsystem betrachtet werden, und eine Demonstration der antiviralen Wirkung gegen dieses mag eine Voraussage zur antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie gestatten, z.B. die Rhabdovirus-Familie, deren wichtiger Vertreter Rabies ist.

Tabelle 4 enthält eine Zusammenstellung der Aktivitäten verschiedener LelF-Hybride an WISH- und MDBK-Zellen und deren Aktivitätsverhältnisse:

Tabelle 4

LelF Einheiten/ Einheiten/ Aktivitäts-

Hybrid 1 Kultur 1 Kultur Verhältnis

(Pvu II) WISH-Zellen MDBK-Zellen WISH/MDB

AB

2.4

X

108

4

X

107

5

AD

1.2

x

108

2

X

107

6

AF

6

x

107

1

X

107

6

AG

4

X

107

1.5

X

107

2.7

AI

3.2

X

107

1.2

X

107

2.7

BA

1.5

X

107

1

X

107

1.5

BD

6

X

107

1.5

X

107

4

BF

1

X

106

3.5

X

105

0.3

BG

2

X

107

6

X

107

0.3

DA

3

X

106

1.2

X

108

0.025

DB

2

X

106

5

X

107

0.04

DF

2

X

105

4

X

106

0.05

DG

2

X

105

1.5

X

107

0.014

FA

2

X

105

6

X

107

0.003

FB

2

X

106

8

X

107

0.025

FD

1

X

107

2

X

107

0.5

FG

1

X

106

4

X

107

0.025

IA

2.4

X

106

6

X

107

0.04

A*

8

X

107

1.2

X

108

0.7

B*

8

X

107

4

X

108

0.2

C*

2

X

107

1.5

X

107

1.3

D*

5

X

106

2.5

X

107

0.2

F*

2

X

107

2

X

108

0.1

I*

1.6

X

107

1.2

X

107

1.3

* Zu Vergleichszwecken

Parenterale Verabreichung

Die Hybrid-Leukozyten-Interferone können Personen, die Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen, und solchen, die immunsuppressive Bedingungen zeigen, paren-5 teral verabreicht werden. Dosierung und Dosisrate können denen gleichen, die derzeit bei klinischen Untersuchungen von aus Menschen stammenden Materialien angewandt werden, z.B. etwa (1 bis 10) x 105 Einheiten täglich, und im Falle von Materialien grösserer Reinheit als 1%, ohne weite-lo res bis zu beispielsweise 5 x 107 Einheiten täglich. Vorläufige Hinweise bei der oben beschriebenen Affenuntersuchung lassen vermuten, dass Dosierungen von bakteriell erhaltenem Le-IF zwecks grösserer Wirkung erheblich erhöht werden könnten, dank dem praktischen Fehlen von anderen 15 menschlichen Proteinen als Le-IF, die in aus Leukozyten stammenden Materialien als Fieber erzeugende Stoffe wirken können und dabei nachteilige Effekte, z.B. Unwohlsein, Temperaturerhöhung, usw. zeigen.

Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform für im wesentlichen homogenes bakterielles Le-IF in parenteraler Form, hier mit den nötigen Änderungen anzuwenden, können 3 mg Le-IF der spezifischen Aktivität von z.B. 2 x 108 25 E/mg in 25 ml 5 n Serumalbumin (human) - USP gelöst werden, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter geführt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen unterteilt werden, von denen diese 6 x 106 Einheiten reines Interferon, für parenterale Verabreichung geeignet, enthält. 30 Die Ampullen werden vor ihrer Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20 °C) gelagert.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können nach be-35 kannten Methoden zur Herstellung pharmazeutisch brauchbarer Mittel zusammengestellt werden, wodurch das Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zusammengemischt wird. Geeignete Träger und deren Zusammenstellung sind in Remington's Pharmaeeutical Sciences 40 von E.W. Martin beschrieben, dessen Offenbarung durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Solche Mittel enthalten eine wirksame Menge des Interferon-Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer 45 Mittel, die sich zur wirksamen Verabreichung eignen.

C

13 Blatt Zeichnungen

Claims

660 743

1. Hybride Human-Leukozyten-Interferone enthaltend 165 bis 166 Aminosäuren, in einer Sequenz die bezüglich Aminosäurenidentität und -zahl aus Untersequenzen verschiedener natürlich vorkommender Human-Leukozyten-Interferone besteht, wobei die Aminosäurensequenz dieser Interferone in der Gesamtzusammensetzung von der Amino-säurensequenz natürlich vorkommender Leukozyten-Interfe-rone verschieden ist.

2. Interferon nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 92 von LeIF-D und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 92 bis 165 von LeIF-A besteht.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Interferon nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-D besteht.

4. Interferon nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 63 von LeIF-D und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 63 bis 165 von LeIF-A besteht.

5. Interferon nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 62 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 64 bis 166 von LeIF-D besteht.

6. Interferon nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-B besteht.

7. Interferon nach Anspruch 1, dessen N-terminaler Teil im wesentlichen aus den Aminosäuren 1 bis 91 von LeIF-A und dessen Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus den Aminosäuren 93 bis 166 von LeIF-F besteht.

8. Verfahren zur Herstellung eines hybriden Human-Leu-kozyten-Interferons gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einemzur Expression eines solchen Interferons befähigten replikablen Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und das Interferon isoliert.

9. Arzneimittel mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-7 und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

10. Arzneimittel gemäss Anspruch 9 in einer parenteral applizierbaren Form.

11. Verwendung eines Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-7 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung viraler oder neoplastischer Erkrankungen.