DD285614B5 - Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums - Google Patents

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamen Substanz, die bei der Chemotherapie von durch Bakterien bei Menschen und Nutztieren hervorgerufenen Erkrankungen von potentiellem Nutzen ist.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie oder der Veterinärmedizin.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Vom Typ der Maduramycin-Antibiotika sind bisher das Maduramycin, das Butylmaduramycin und das Methylmaduramycin bekannt. Herstellung und Eigenschaften dieser Wirkstoffe sind beschrieben in den Patentschriften DD 118299 und DD 241 270. Zur Gewinnung der voranstehend genannten Wirksubstanzen sind jeweils ausgewählte Mikroorganismen-Stämme aus der Gattung Actinomadura eingesetzt worden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein neues Antibiotikum, einschließlich seiner Derivate und Salze, aus der Strukturklasse der Benz(a)anthrachinone bereitzustellen, um damit die Palette der potentiell antibakteriell wirksamen Verbindungen zu erweitern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches biotechnologisches Verfahren anzugeben, welches gestattet, ein neues Antibiotikum mit Hilfe eines neuen Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guter Ausbeute herzustellen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß auf fermentativem Wege unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die Kohlenstoff-und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, bei einerTemperaturzwischen 25⁰C und 38°C, ein Mikroorganismus der Gattung Actinomadura während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 10 Tagen zunächst bei einer Temperatur nahe 37°C sowie gegen Fermentationsende bei einer Temperatur nahe 25°C und bei pH-Werten zwischen pH 6,2 bis pH 8,5 kultiviert wird. Das gebildete neue Antibiotikum Maduransäure wird auf extraktivem Wege aus dem durch Filtration abgetrennten Myzel der zuvor angesäuerten Kulturlösung gewonnen und durch Alkalibehandlung in der Wärme sowie durch kieselgelchromatographische Trennverfahren von seinen biologisch inaktiven Begleitstoffen befreit. Es wird nach erfolgter Reinigung aus den Eluatkonzentraten durch Hinzufügen von Verdrängungsmitteln gefällt sowie anschließend getrocknet. In der weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird ein Mikroorganismus der Art Actinomadura rubra, vorzugsweise der Stamm Actinomadura rubra S9-24 eingesetzt. Der Mikroorganismus, der in dem Verfahren bevorzugt zur Anwendung kommt, ist mit Hilfe an sich bekannter Methoden der Mutagenese und Selektion aus Populationen des Maduranmycinbildners Actinomadura rubra 13001, ausgewählt worden. In der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstraße 11 wurde der Stamm Actinomadura rubra S9-24 unter der Nummer IMET43863 hinterlegt.

Die Herstellung des neuen Antibiotikums Maduransäure wird nach Methoden der Submersfermentation durchgeführt und besteht in der bevorzugten Variation darin, daß der Stamm Actinomadura rubra S9-24 in einem flüssigen, vorher sterilisierten Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von vorzugsweise 26°C bis 28°C über einen Zeitraum von vorzugsweise 4 Tagen bei einem pH-Wert, der zu Beginn der Fermentation zwischen pH 6,2 und pH 6,9 und an ihrem Ende zwischen pH 7,8 und pH 8,5 liegt, gezüchtet wird. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Dextrin, Glukose, Sojamehl, Fischmehl, Sojaöl, Glyzerin, Maltose und andere verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen außer einigen der oben angeführten stickstoffhaltigen Substrate auch Trockenhefe, Hefeextrakte, Fleischpepton, Casein u.a. in Frage. Gute Fermentationsergebnisse bezüglich der Ausbeute an Maduransäure können bei Zusatz von Mineralsalzen zu den Nährmedien erzielt werden. Je nach verwendetem Nährmedium begünstigen sieden Verlauf der Fermentation. Die Fermentation des Stammes Actinomadura rubra S9-24kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben aus Glas, darüber hinaus in Glasfermentoren mit einem Fassungsvermögen von 10I bis 301 sowie in Fermentoren aus nichtrostendem Stahl (V2A-Stahl) unterschiedlicher Größe durchgeführt werden. Das gebildete Antibiotikum Maduransäure wird auf extraktivem Wege gewonnen und durch Alkalibehandlung in der Wärme und durch kieselgelchromatographische Trennverfahren von seinen biologisch inaktiven Begleitstoffen befreit. Nach erfolgter Reinigung wird aus den Eluatkonzentraten durch Hinzufügen von Verdrängungsmitteln das Antibiotikum gefällt sowie anschließend bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Dazu wird das Antibiotikum zusammen mit seinen biologisch aktiven Nebenkomponenten durch Erhitzen des Extraktionskonzentrates in die Laktonform überführt und in dieser Form an Kieselgel chromatografisch gereinigt. Die vereinigten und gereinigten Laktone aus den Eluatkonzentraten werden durch Ausfällen gemeinsam gewonnen und anschließend hydrolytisch komplett in die Maduransäure überführt. Das neue Antibiotikum Maduransäure wird nach der hydrolytischen Spaltung des Laktons aus der Hydrolyselösung durch Erniedrigen des pH- Wertes auf unter pH 7, vorzugsweise auf pH 6,3 ± 0,2, ausgefällt, abfiltriert und getrocknet.

Die Isolierung der Maduransäure wird in der Weise durchgeführt, daß die geerntete Kulturlösung angesäuert, in Kulturfiltrat und Mycel getrennt und anschließend der Wirkstoff aus dem Mycel durch Extraktion mit organischen, polaren Lösungsmitteln ausgezogen und durch Konzentration der Extrakte bis zur wäßrigen Endphase in dieser angereichert, mit apolaren organischen Lösungsmitteln in die organische Phase überführt und aus dieser nach erneuter Konzentration mit einem niedrigsiedenden Kohlenwasserstoff präzipitiert wird. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert, anschließend in Alkalilauge gelöst und zur Vorreinigung von Fremd- und Nebenkomponenten erhitzt. Die nach dem Erkalten filtrierte Lösung wird bis zum Umschlagspunkt der Wirkstoffeigenfarbe mit verdünnter Mineralsäure versetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das auf diese Weise erzeugte und vorgereinigte Antibiotikum wird zur Feinreinigung von restlichen Begleitstoffen an Kieselgel chromatographiert und die biologisch aktive Fraktion gesammelt, konzentriert, danach wird die Maduransäure aus dem Konzentrat mit niedrigsiedenden Kohlenwasserstoffen verdrängt, abfiltriert und getrocknet.

Maduransäure stellt den Grundkörper aller bisher bekannter Maduramycine dar und ist ein amorphes, farbiges Antibiotikum mit Indikatoreigenschaften, in organischer Phase gelbrot und in natronalkalischer wäßriger Phase braunviolett. Das Antibiotikum löst sich gut in allen polaren organischen Lösungsmitteln und in Alkalien. Maduransäure besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff. Aus den Signalen des ¹³C-n.m.r-Spektrums, des ¹H-n.m.r.-Spektrums und mit Hilfe des Massenspektrums wurde seine Summenformel zu СгеНівО,о bestimmt (Abb.1 ¹³C-Kernresonanzspektrum der Maduransäure; Abb.2 Protonenresonanzspektrum der Maduransäure; Anlage ¹³C- und 'H-Kernresonanzdaten der Maduransäure). Der neue Wirkstoff bindet intramolekular 1 Mol Wasser, woraus die Formel C₂₆H₁₈Oi₀ H₂O resultiert. Die quantitative Zusammensetzung wurde bestimmt zu:

% C % H % O

61,57 3,88 34,55 und für die о. а. Formel

berechnet zu: 61,42 3,96 34,62

Der intramolekulare Wasseranteil ließ sich nicht entfernen, ohne daß eine Relaktonisierung einsetzte.

Maduransäure absorbiert im ultravioletten und sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums und zeigt die gleichen Absorptionsmaxima wie Maduramycin, Butyl- und Methylmaduramycin. Maduransäure unterscheidet sich von allen bisher bekannten Benz(a)anthrachinon-Antibiotika in der gleichen Weise wie die Maduramycine und unterscheidet sich von den Maduramycinen durch das Fehlen der Alkoxy-Funktion.

Das Protonenresonanzspektrum enthält folgende Signale:

14,25/13,57/11,20/9,67/8,05 ppm für 5mal OH; 7,27/7,13 und 6,56 für je 1 H; 3,80 für - OCH₃M, 3,39 für H₂O; 2,80 für -CH₂-CH₂-Im) und 2,06 für -CH₃(t).

Die aus dem Stamm Actinomadura rubra S 9-24 isolierte Maduransäure hemmt die Entwicklung von bakteriellen Infektionserregern, insbesondere auch dann, wenn in diesen Bakterien Plasmide mit verschiedenen Resistenzdeterminanten für klinisch eingesetzte Antiinfektiva vorliegen, die Ursache für die Arzneimittel-Mehrfachresistenz sind. Maduransäure unterdrückt bevorzugt das Wachstum grampositiver Bakterien. Gramnegative Bakterien zeigen nur als Sphäroplasten oder stabile L-Formen Empfindlichkeit gegen Maduransäure. Hefen und fadenförmig wachsende Pilze werden dagegen in ihrem Wachstum nicht unterdrückt. Maduransäure hemmt neben den als „Problemkeime" bekannten Α-Streptokokken auch jene Staphylokokken, die Resistenzplasmide tragen, die zur Resistenz von Infektionserregern gegen Wirkstoffe wie Penicillin, Ampicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Erythromycin, Neomycin, Kanamycin, Chloramphenicol und Sulfonamide führen.

Ausführungsbeispiele

1. Zwei 500-ml-Rundkolben aus Glas enthalten je 80ml des folgenden Vorzucht-Mediums: BactoTrypton 0,5% Dextrose 0,1% Bacto-Beef-Extrakt 0,3% Stärke 2,4% Hefe-Extrakt 0,5% Aqadest.

Sterilisation: 20 Minuten bei 115°C

Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert zwischen pH 6,9 und pH 7,0. Jeder Rundkolben wird mit einer Sporen- und/oder Myzelsuspension beimpft. Letztere werden hergestellt durch Abschwemmen des Sporen- bzw. Myzelrasens mit Hilfe von steriler isotonischer NaCI-Lösung von einer im Reagenzröhrchen auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten, 20 bis 30 Tage alten Kultur des Stammes Actinomadura rubra S9-24.

Der Anzucht-Nährboden hat folgende Zusammensetzung:

Saccharose 0,3% Dextrin 1,5%

Harnstoff 0,01% Hefe-Extrakt 0,1%

Pepton,bakt. 0,5% NaCI 0,05%

FeSO₄ 0,001% KH₂PO₄ 0,05%

in Leitungswasser. Die Sterilisation erfolgt bei 120⁰C, einem pH-Wert von pH 7 und einer Dauer von 35 Minuten. Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 3 bis 5 Tage bei 37⁰C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 240 rpm bebrütet.

5 ml bis 10ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen als Impfmaterial für die Beimpfung von 500-ml-Steilbrustflaschen aus Glas, die je 80ml des folgenden Produktionsmediums enthalten:

Sojamehl 2,0% Dextrose 2,0%

CaCO₃ 0,3% NaCI 0,5%

in Wasser.

Die Kulturlösung des Stammes Actinomadura rubra S9-24 wird mit verdünnten Mineralsäuren auf einen pH-Wert von pH 2 bis pH 4, vorzugsweise pH 4, eingestellt und anschließend in Myzel und Kulturfiltrat getrennt. Das Myzel wird mehrfach mit einem niedrigstehenden aliphatischen Alkohol oder Keton, vorzugsweise mit Azeton, ausgezogen und die auf diese Weise gewonnenen Extrakte werden vereinigt und bis zur wäßrigen Endphase aufkonzentriert. Daran anschließend wird die Maduransäure mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Chloroform, extrahiert und die vereinigten Chloroformextrakte werden getrocknet und auf ein Minimalvolumen eingeengt. Aus dem Reextraktkonzentrat wird der Wirkstoff durch Zufügen von niedrigsiedenden Kohlenwasserstoffen wie Petrolether oder Leichtbenzin ausgefällt, abfiltriert und getrocknet.

2. Die gemäß Beispiel 1 gewonnene rohe Maduransäure wird in Alkali-, vorzugsweise in 1 η Natronlauge, unter Erhitzen vollständig gelöst und zur Vervollständigung der Zersetzung von Begleitstoffen mindestens eine Stunde bei 100⁰C gehalten. Nach dem Erkalten der so vorbehandelten Lösung wird diese mit Mineralsäure neutralisiert und auf einen pH-Wert von pH 5 bis pH 7, vorzugsweise auf einen pH-Wert von pH 6,2 bis pH 6,4, eingestellt und der ausgefallenen Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet.

Anschließend wird die Maduransäure in einem Lösungsmittel, vorzugsweise in einem Lösungsmittelgemisch, bestehend aus neun Vol.-Teilen Chloroform und einem Vol.-Teil Methanol, gelöst und an einer Kieselgelsäure mit einem Lösungsmittel als mobiler Phase chromatographiert, die Hauptzone getrennt aufgefangen und bis auf ein Minimalvolumen konzentriert und aus diesem die reine Maduransäure mit Petrolether verdrängt, abfiltriert und getrocknet.

Die Ausbeute an reiner Maduransäure in der Form mit einem Mol Wasser/Mol Maduransäure beträgt 7,35g/1001 Kulturlösung und entspricht gemäß photometrischer Bestimmung einer Ausbeute von 42,3% d.Th.

3. Die gemäß Beispiel 1 vereinigten und konzentrierten Chloroformextrakte werden mit dem gleichen Volumen n-Butanol vermischt und einige Stunden zum Sieden erhitzt, um die Laktonisierung zu beschleunigen und zu vervollständigen. Daran anschließend wird die Reaktionslösung konzentriert und der Wirkstoff wird aus dem Minimalvolumen mit neidrigsiedenden aliphatischen Kohlenwasserstoffen verdrängt und gemäß Beispiel 2 weiterverarbeitet, wobei eine aus den Nebenkomponenten resultierende Ausbeuteverbesserung um etwa 20% erreicht wird.

Anlage

¹³C- und ¹H-Kernresonanzspektrum von Maduransäure

Kohlenstoff	Resonanzsignal	Multiplizität	Funktionalität
1	187,9675	S	Chinoncarbonyl
2	185,8056	S	Chinoncarbonyl
3	186,0394	S	Carboxyl
4	162,9338	S
5	162,5136	S
6	156,7517	S
7	154,2938	S
8	154,1861	S
9	151,0711	S
10	150,2718	S
11	149,5279	S
12	147,2876	S
13	130,8732	S
14	129,5055	S
15	122,7390	S
16	120,7242	S
17	119,2333	S
18	114,2394	S
19	113,2485	d	^C-H
20	110,0066	S
21	106,9565	d	=C-H
22	101	d	^C-H
23	61,57	q	-OCH3
24	30,1059	t	-CH2-
25	22,8949	t	-CH2-
26	8,6283	q	-CH3

Aufnahme in DMSO-d₆, 50MHz, Signalwerte in ppm.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums auf fermentativem Wege unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25⁰C und 38^CC, gekennzeichnet dadurch, daß ein Mikroorganismus der Art Actinomadura rubra während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 10 Tagen zunächst bei einer Temperatur nahe 37⁰C sowie gegen Fermentationsende bei einer Temperatur nahe 25°C und bei pH-Werten zwischen pH 6,2 bis pH 8,5 kultiviert und das gebildete Antibiotikum Maduransäure auf extraktivem Wege aus dem durch Filtration abgetrennten Mycel der zuvor angesäuerten Kulturlösung gewonnen, durch Alkalibehandlung in der Wärme sowie durch kieselgelchromatographische Trennverfahren von seinen biologisch inaktiven Begleitstoffen befreit und nach erfolgter Reinigung aus den Eluatkonzentraten durch Hinzufügen von Verdrängungsmitteln gefällt sowie anschließend getrocknet wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Mikroorganismus der Stamm Actinomadura rubra S9-24 eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung des Stammes Actinomadura rubra S 9-24 über eine Zeitraum von 3 Tagen bei 37⁰C sowie nachfolgend über 4Tage bei 26°C bis 28°C vorgenommen, der pH-Wert zu Beginn der Fermentation zwischen pH 6,2 und pH 6,9 und an ihrem Ende zwischen pH 7,8 und pH 8,5 eingestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Antibiotikum Maduransäure zusammen mit seinen biologisch aktiven Nebenkomponenten durch Erhitzen des Extraktkonzentrates in die Laktonform überführt und in dieser Form an Kieselgel chromatographisch gereinigt wird und die vereinigten sowie gereinigten Laktone aus den Eluatkonzentraten durch Ausfällen gemeinsam gewonnen und daran anschließend hydrolytisch komplett in die Maduransäure überführt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß das Antibiotikum Maduransäure nach der hydrolytischen Spaltung des Laktons aus der Hydrolyselösung durch Erniedrigen des pH-Wertes auf unter pH 7, vorzugsweise pH 6,3 ± 0,2, ausgefällt und abgefiltert wird.