DD286613A5 - Verfahren zur herstellung von humangewebetyp-plasminogenaktivator-varianten - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten bereitgestellt, a) bei denen im wesentlichen die vollstaendige biologische Aktivitaet erhalten ist, die eine veraenderte Kohlenhydratstruktur aufweisen und c) die eine veraenderte in vivo-Halbwertszeit besitzen. Bei dem Verfahren wird die Kohlenhydratstruktur von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator modifiziert.{Plasminogenaktivator; Humangewebetyp; Kohlenhydratstruktur; Mannose; Oligosaccharid; Perjodat; * Fibrinolyse; Clearance; in vivo-Halbwertszeit}

Description

Hierzu 7 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der therapeutischen Zusammensetzungen zur Beeinflussung der Fibrinolyse.

-2- 286 613 Charakteristik des bekannten Stander der Technik

Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA) ist eine Serinprotease, die an der Fibrinolyse beteiligt ist. Eine Bindung von t-PA an ein Fibringerinnsel verursacht eine Verstärkung der Plasminogenaktivierung (M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 [1982], S.2912-2919; D. C.Rijken et al., J. Biol.Chem., Bd.25711982), S.292O-2925).Humangewebetyp-Plasminogenaktivator wandelt Plasminogen in Plasmin um. Das auf diese Weise gebildete Protein spaltet proteolytisch Fibrinmatrices, die das Gerüst von Blutgerinnseln darstellen. Humangewebetyp-Plasminogenaktivator übt dadurch eine Mittlerrolle bei der Auflösung von Blutgerinnseln aus und eignet sich daher zur Behandlung von verschiedenen thrombolytischen Störungen. Obgleich t-PA aus vielen Quellen isoliert worden ist, z.B. aus Bowes-Melanom-Zellinien (D. C. Rijken et al., J. Biol.Chem., Bd.256 (1981), S.7053 bis 7041; P. Wallen et al., Eur. J. Biochem., Bd. 132 [1983], S. 681-686), Uterusgewebe (D. C. Rijken et al., Biochem. Biophys. Acia., Bd. 580 [1979], S. 140-153) und Blutgefäßperfusaten (B. R. Binder et al., J. Biol. Chem., Bd. 254 [1979], S. 1998-2003), hat erst das Aufkommen der rekombinanten DNA-Technik die Herstellung von t-PA in ausreichenden Mengen ermöglicht (D. Pennica et al., Nature [London], Bd.301 [1983], S. 214-221), um klinische Untersuchungen an Patienten mit Myokardinfarkt, peripheren Gefäßthromben und pulmonaler Embolle durchzuführen. Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß rekombinanter t-PA (rt-PA) ein äußerst wirksames thrombolytisches Mittel mit minimalen Effekten auf dem Fibrinogenniveau im Blut ist (D.O. Wiliams et al., Circulation, Bd.73 [1986], S.338-346; R.A.Graor et al., Circulation, Bd.74 [Suppl.1] [1986], S. 1-15,1-20); (D.Collen et al.. Circulation, Bd.73 [1986], S.511-517).

Die Elimination von rt-PA aus dem Kreislauf erfolgt relativ rasch. Die biphasische Clearance wird durch eine α-Phase dominiert, die eine Halbwertszeit von etwa 2mln beim Kaninchen (C. Korningsr et &l.,Thromb. Haemos., Bd.46 [1985], S.658-661; S. Nilsson et al., Thromb. Res. Bd.39, S. 511-521; H. Bounameaux et al., ß'ood, Bd.67 [1986], S. 1493-1497) und 4min (R. A. Baughman, Tissue Plasminogen Activator in Thrombolytlc Therapy (Herausg. Sobel et al.], Marcel Dekker, New York, 1987, S.41-53) bis 6min (P.Wallen et al., a.a.O.) beim Menschen aufweist. Die Leber ist die wichtigste Stelle der t-PA-Aufnahme i.nd des t-PA-Stoffwechsels (C.Korninger et al., a.a.O.; S. Nilsson et al., a. a.O.; A. Bournameaux et al., a.a. O.). Eine Anzahl von Rezeptorsystemen in der Leber wurde beschrieben, d\s spezielle terminale Reste an den Oligosaccharidbereichen von Glycoproteinen erkennen. Von diesem Mechanismus befreite Proteine weisen ebenfalls Halbwertszeiten in der Größenordnung von einigen Minuten auf (G.Ashwell et al., Ann. Rev.Biochem., Bd.51 [1982], S.531-554).

Rekombinanter t-PA weist vier potentielle Stellen für N-verknüpfte Glycosylierung auf. Ein Oligosaccharid von hohem Mannosegehalt ist in der Position 117 und ein komplexes Oligosaccharid in der Position 448 vorhanden. In der Position 104 ist ein komplexes Oligosaccharid beim Typ I-rt-PA vorhanden und beim Typ ll-rt-PA abwesend; das Verhältnis von Typ I zu Typ Il beträgt etwa 1:1. Eine vierte potentielle Glycosylierungsstelle am Rest 218Mi nicht glycosyliert. Das Glycosylierungsmuster von rt-PA ist ähnlich dem von aus Melanom abgeleitetem t-PA.

Die Abkürzung t-PA für Humangewebetyp-Plasminogenaktivator wurde aufgrund des Vorschlags beim 28. Meeting of the International Comitee on Thrombosis and Hemostasis, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982 eingeführt. Die hier verwendeten Ausdrücke »Humangewebetyp-Plasminogenaktivator", .t-PA", „human-t-PA" oder „Gewebeplasminogenaktivator" bedeuten humanen, exogenen (Gewebetyp) Plasminogonaktivator, der beispielsweise durch Extraktion und Reinigung aus natürlichen Quellen (vgl. Coden et al., EP-A-41766; und Rijken et al., J. Biol.Chem., Bd. 256 [1901], S.7035) und durch rekombinante Zellkultursy-t.eme, die zusammen mit den Aminosäuresequenzen und physikalischen und biologischen Eigenschaften z. B. in EP-A-93619 beschrieben sind, hergestellt worden ist.

US-PS 4326033 berichtet über die Erhöhung der Halbwertszeit von Urokinase durch chemische Modifikation von dessen Kohlenhydratstruktur. Urokinase unterscheidet sich immunologisch vom Humangewebetyp-Plasminogenaktivator. Es bestand keine Veranlassung, aus der US-PS 4326033 oder anderen Druckschriften den Schluß zu ziehen, daß derartige Kohlenhydratmodifikationen von Urokinase auf andere Glycoproteine anwendbar sind. Tatsächlich verlängert die Entfernung von Sialin°äure aus Ceruloplasmin dessen Halbwertszeit drastisch. Eine identische Behandlung von Transferrin, einem anderen Serumglycoprotein weist keine signifikante Wirkung auf die Halbwertszeit auf (Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley Publ. Co.. [1975], S. 194-196; Ashwell et al.. Adv. Enzymology, Bd. 41 [1974], S.99; und Alexander et al., Science, Bd. 226 [1984], S. 1328).

Es wurde berichtet, daß die tlimination von von Melanom abgeleitetern t-PA bei Mäusen nicht beeinflußt wird durch Titration des aktiven Zentrums mit Phenylmethylsulfonylfluorid oder durch Koinjoktion von Diisopropylfluorophosphat, Thrombin, Asialooromucoid, Macroalbumin oder überschüssigem unmarkiertem t-PA (H.E. Fuchs et al., Blood, Bd.54 [1985], S.539-544). Die mit Asialooromucoid und Macroalbumin erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Kohlenhydratstrukturen die Clearance von t-PA nicht beeinflussen. Es wurde berichtet, daß die Clearance von von Meianom abgeleitetem t-PA durch Monosaccharide bei Ratten nicht beeinflußt wird (C.M.Emeis et al., Thromb. Haemos., Bd. 54 [1985], S.661-664). Andererseits wurde berichtet, daß bei Abtrennung der zellulären Komponenten von der Rattenleber die Endotholzellen Melanom-t-PA über einen Weg aufnehmen, der durch hoch mannosehaltige Glycoproteine nicht gehemmt werden konnte. Dieses Ergebnis wurde so interpretiert, daß t-PA in der Leber zumindest teilweise durch o_,n Mannoserezeptor aufgenommen wird (M.Einarsson et al., Thromb. Haemos., Bd. 5411985), S. 270). Bei anderen In-vitro-Untersuchungen wurde gezeigt, daß rt-PA eine Bindung von hoher Affinität an Ratteniebor-Hepatozyten eingeht. Der Rezeptor erwies sich nicht als kohlenhydratabhängig (C. Bakhit et al., J.Biol.Chem., Bd.262 [1987], S.8716-872C).

In WO-A-84/01786 wird eine wahllose Modifikation eines Gewebetyp-Plasminogenaktivators beschrieben, die zu einem Molekül mit im Vergleich zum unmodifizierten Polypeptid verringerter biologischer Aktivität und verlängerter Halbwortszeit führt. Das einzige Beispiel betrifft die Behandlung eines partiell gereinigten Humangewebetyp-Plasminogenaktivators mit Natriumperjodat unter Bildung eines Produkts, das etwa 70-90% seiner ursprünglichen (unmodifizierten) Aktivität aufweisen soll. Es gibt in WO-A-84/01786 keinen Hinweis auf eine Würdigung der Natur und der Charakteristik der Kohlenhydratstrukturen, die im nativen Material und, was noch wesentlicher ist, in der gebildeten modifizierten Form vorhanden sind. Tatsächlich ist von Perjodat bekannt, daß es sämtliche Kohlenhydratstrukturen durch Oxidation modifziert oder aufbricht, ohne daß gleichzeitig eine wesentliche Entfernung von der Aminosäureverknüpfung erfolgt.

In der WO-A-84/01786 gibt es auch keinen Hinweis darauf, wieviele derartige Strukturen der Humangewebetyp-Plasminogenaktivator aufweist oder wie der tatsächliche Kohlenhydrataufbau - entweder in der modifizierten oder in der unmodifizierten Form- beschaffen ist. Somit ist höchstwahrscheinlich das mit Perjodat behandelte Molekül durch eine wahllose Oxidation von sämtlichen Kohlenhydratstrukturen modifiziert worden, ohne daß eine Ausrichtung auf eine spezielle Stelle stattgefunden hat.

Kürzlich wurde berichtet, daß die in-vivo-Clearancegeschwindigkeiten von glycosyliertem und deglycosyliertem Humangewebetyp-Plasminogenaktivator nicht signifikant unterschiedlich sind, was zu der Annahme zwingt, daß die Clearancegeschwindigkeit von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator durch die Abwesenheit von Kohlenhydraten nicht beeinflußt wird (Larsen et al., Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium, Park City, Utah, 9. bis 14. Februar 1986; Little et al., Biochemistry, Bd. 23 (1984), S. 6191).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten bereitzustellen, die auf dem Gebiet der Fibrinolyse eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von neuen Humangewebetyp-Plasminogenaktivator- Varianten durch Modifikation der Kohlenhydratstruktur von t-PA bereitzustellen. Diese t-PA-Vnrianten sollen im Vergleich zu

unmodifiziertem t-PA mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aus dem Kreislauf entfernt v/erden. Ferner sollenerfindungsgemäß thrombolytisch wirkende Mittel bereitgestellt werden, die sich zur Behandlung von unterschiedlichenklinischen Zuständen eignen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zui Herstellung von neuen Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten, die in ihrer Kohlenhydratstruktur so modifiziert sind, daß sie im wesentlichen ihre vollständige biologische Aktivität behalten und eine

veränderte In-vivo-Halbwertszeit naben, d. h. aus dem Kreislauf mit einer im Vergleich zu natürlich auftretendem t-PAunterschiedlichen Geschwindigkeit ausgeschieden werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daßman die Kohlenhydratstruktur von Humangewebetyp-Plasminogonaktivator modifiziert.

Insbesondere sind die t-PA-Varianten in ihrer Kohlenhydratstruktur in den Positionen 117,184 und/oder 448 modifiziert. Bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung ist es nicht erkannt worden, daß die Veränderung der Kohlenhydratstruktur von

t-PA die Clearance aus dem Kreislauf verändern kann.

Insbesondere wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Entfernung von Kohlenhydraten aus einem oder mehreren der Glycosylierungsstellen von t-PA die Halbwertszeit von t-PA verlängert. Ferner wurde erfindungsgemäß erstmals festgestellt,

daß eine t-PA-Variante, die zusätzlich zur Position 117 auch in den Positionen 184 und 448 stark mannoschaltige Oligosaccharideaufweist, rascher aus dem Kreislauf entfernt wird.

Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Humangewebetyp-Plasminogenaktivators

bereitgestellt, der von der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 befreit ist, dessen funktionell

Kohlenhydratstrukturen an den Aminosäursresten 184 und/oder 448 aber nicht modifiziert sind. Diese neuen t-PA-Wianten

behalten im wesentlichen ihre vollständige biologische Ak*^:> !(St und weisen eine erhöhte In-vivo-Halbwertszeit auf (vorglichenmit „nativem" Humangewebetyp-Plasminogenaktivator η it intakter Kohlenhydraistruktur am Aminosäurerest 117).

Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung neuer Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten

bereitgestellt, die von der funktionellen Kohlenhydratstruktur an den Aminosäureresten 117,184 und 448 befreit sind und die imwesentlichen ihre biologische Aktivität beibehalten und eine erhöhte In-vivo-Halbwertszeit aufweisen (verglichen mit „nativom"

Humangewebetyp-Plasminogenaktivator mit intakter Kohlenhydratstruktur in diesen Positionen). Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung neuer Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten

bereitgestellt, die in den Positionen 184 und 448 stark mannosehaltige Oligosaccharide neben dem entsprechenden in

Position 117 bereits vorhandenen Rest aufweisen. Diese Varianten behalten im wesentlichen ihre biologische Aktivität bei und

weisen eine erhöhte In-vivo-Halbwertszeit auf (verglichen mit .nativem" Humangewebetyp-Plasminogenaktivator mit intakterunmodifizierter Kohlenhydratstruktur in den Positionen 184 und 448).

Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung von Äquivalenten zu biologisch aktivem Humangewebetyp-Plasminogenaktivator,

die in bezug auf eine oder mehrere Aminosäuren in ihrer Gesamtsequenz unterschiedlich sind, aber das gleiche

Kohlenhydratmuster wie die erfindungsgemäßen speziellen neuen Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten

aufweisen. Ferner betrifft die Erfindung assoziierte rekombinante Vektoren und Kulturen.

Eine derartige äquivalente Humangewebetyp-Plasminogonaktivator-Variante ist eine sogenannte einzelkette Mutante, bei der

die Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 275 und 276 durch Beseijigi-ng der von proteolytischen Enzymen erkannten

Aminosäuresequenz zerstört ist. Die Beseitigung der Sequenz wird e. reicht, indem man spezielle Aminosäuren verändert,

beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA-Kodons gemäß den nachstehend beschriebenenVerfahren.

Kurze Erläuterung der Zeichnungen Fig. 1 zeigt ein Comassie-gefärbtes SDS-PAGE von unbehandeltem (Streifen 1) und Endo-H-behandeltem (Streifen 2) Humangewebetyp-Plasminogenaktivator. Bei der Bande von hohem Molekulargewicht handelt es sich um einkettigen t-PA; die

beiden anderen Hauptbanden sind Typ I Kringel (Kl), Typ Il Kringel (KII) und Protease (P).

Fig.2 zeigt Glycosidase-Verdauungen von rsduziertem, carboxymethyliertem t-PA. Streifen 1: -Glycanase; Streifen 2:

+ N-Glycanase; Streifen 3: -Endo H; Streifen 4: +Endo H. Die Bandenbezeichnungen sind die gleichen wie in Fig. 1.

Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte von Ausgangsplasmid pUCPAAHD

Fig.4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Plasmakonzentration von Kontroll-rt-PA (Δ) und rt-PA, das mit Natriumperjodat (o) oder Endo H (O) modifiziert ist. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben. Flg. 5 zeigt den zeitlichen Verlauf der Trichloressijsäure (TCA) fällbaren Radioaktivität für Kontroll-Human-t-PA (o und Glutaminn7-t-PA (D).

Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf der Veränderung der mit Trichloressigsäure (TCA) fällbaren Radioaktivität für Kontroll-Humant-PA (D) und Glutaminii7-Glutaminsäure₂76-t-PA (o).

Fig. 7 zeigt den zeitlichen Verlauf der Plasmakonzentration von ^1wJ-markiertem ( ) und unmarkiertem (o) Kontroll-rt-PA. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

Fig. 8 zeigt den zeitlichen Verlauf der Plasmakonzentration von ¹²⁵J-markiertem, stark mannosohaltigem rt-PA (Δ), Kontrollrt-PA (▲>-, Endo Η-behandeltem rt-PA (o) und perjodatbehandeltem rt-PA (o). Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben

Nachstehend folgt eine allgemeine Beschreibung der Erfindung.

Es wurde festgestellt, daß die Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator folgende Zusammensetzung aufweist:

Man

Man Man^

Man—> 4GIcNAc-> 4GIcNAc-> ASN

.an

Man > 2Mari

während die Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 folgende Zusammensetzungen aufweisen:

Sia2—>3Gal—^GIcNAc->2Man

Fuc

Man—>4GlcNAc -^GIcNAc -—>ASN 3

S Ia2 —>3Gal —^GIcNAc —>2

Man

Abkürzungen: Man = Mannose; GaI ™ Galactos j; Fuc = Fucose; GIcNAc = N-Acetylglucosamin; Sia = Siaünsäure; R = K oder Sia 2 -> 3GaI -»4GIcNAc.

Es ist zu betonen, d*ß die vorstehenden Struktur« η zwar repräsentativ für die Typen von N-verknüpften Oligosacchariden sind, die in Humangewebetyp-Plasminogenaktivator au !treten, die Erfindung jedoch nicht auf die gezeigten Strukturen beschränkt ist. Vermutlich enthält jede Glycosyliorungsstelle mehrere eng verwandte, nichtidentische Strukturen. Dies ist als Mikroheteropenität bekannt und stellt eine übliche Eigenschaft von Glycoprotein-glycanen dar; vgl. J.B.ol.Chom., Bd. 260 11985), S. 4C- j. Beispielsweise können stark mannosehaltigo Oligosaccharide in der Anzahl der Vorhände lenMannoseeinheiten variieren. Bei komplexen Oligosacchariden kann die Mikroheterogenität Unterschiede im Ausmaß der Verzweigung sowie in der Anzahl der Reste an Sialinsäure, Fucose, Galactose und N-Acetylglucosamin mit sich bringen. Eine derartige Mikroheterogenität soll im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen.

Die stark mannosehaltige Strukturen der Aminosäure 117 erweist sich als etwas Besonderes, nicht nur in bezug auf die Struktur im Unterschied zu den komplexeren Strukturen an den Aminosäurereston 184 und 448, sondern auch insofern, als ihre vollständige funktionell Entfernung ohne gleichzeitige funktionell Modifikation der Strukturen an den Positionen 184 und 448 zu einem biologisch vollständig aktiven Humangewebetyp-Plasminogenaktivator mit verlängerter In-vivo-Halbwertszeit führt. Die Entfernung der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 bedeutet eine vollständige Entfernung, z. B. durch Zerstörung des Glycosylierungssignals durch ortsgerichtete Mutagenese gemäß den nachstehenden Ausführungen, oder eine wesentliche Entfernung, z.B. durch Behandlung mit Endoglycosidase, die einen intakten, mit Asni,₇ verknüpften N-Acetylglucosaminrest hinterlassen kann, oder eine wesentliche Entfernung in den Positionen 117,184 und 448, z.B. durch Behandlung mit Natriumperjodat, das vicinale Hydroxylgruppen oxidiert. Eine funktionell nichtmodifizierte Kohlenhydratstruktur an den Aminosäureresten 117,184 und/oder 448 bedeutet entweder eine Beibehaltung der intakten Strukturen oder im wesentlichen sämtlicher intakter Strukturen, so daß ihre Funktionalität äquivalent zu nativem Protein ist. Eine Veränderung der Kohlenhydratstruktur an den Aminosäuren 184 und 448 im rekombinanten t-PA-Typ I bedeutet eine Substitution des komplexen Oligosaccharide durch ein stark mannosehaltiges Oligosaccharid aufgrund der Bildung des rekombinanten Humangewebetyp-Plasminogenaktivators in einer Wirtszelle, der das Enzym N-Acetylglucosamin-transferase,

das ein stark mannosehaltiges Oligosacchar'd in ein Komplexes Oligosaccharid umwandelt, fehlt. Diese stark mannosehaltige t-PA-Variante führt zu einnr im wesentlichen vollständig aktiven Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Variante von verringerter In-vivo-Halbwertszeit.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Entfernung der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 durch ortsspezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA des GlycosylierungssignalsAsn-X-Ser/Thr erreicht, wobei X eine beliebige Aminosäure bedeuten kann. Im fail von Gewebetyp-Plasminogenaktivator handelt es sich bei der dieses Signal darstellenden Sequenz um Asni,7Seri,₈Ser,,₉. Die Entfernung der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 führt somit beispielsweise durch Mutagenese der diesen Aminosäureresten entsprechenden Kortons zur Zerstörung der Signalfunktionalität. Insbesondere kann die Mutagenese an repräsentativen Kodons des Signals so durchgeführt werden, daß beispielsweise ein Humangewebetyp-Plasminogenaktivator gebildet wird, dar in der Position 117 einen von Asparagin (Asn) abweichenden Aminosäurerest und/oder an der Position 119 einen von Serin (Ser) oder Threonin (Thr) abweichenden Aminosäurerest oder in der Position 118 einen von Prolin (Pro¹ jnweichenden Aminosäurerest aufweist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird im Hinblick auf die enge strukturolle Verwandtschaft Asparagin,₁₇ durch Glutamin oder im Hinblick auf die analoge Sequenz im zweiten K' ingel-Bereich Serinng durch Methionin ersetzt. Die Mutagenese wird durch an sich bekannte Techniken erreicht, beispielsweise gemäß den Verfahren von Zoiler et al., Methods in Enzymology, Bd. 100 (1983), S. 468. Zum Beispiel enthält bei Veränderung des für Asparagin kodierenden Kodons AAC in Position 117 zu CAA oder CAG, was zwei Nucloeotidänderungen erfordert, das Expressionsprodukt Glutamin in Stellung 117. Andere Mutationen, die hier in Betracht kommen, ergeben sich aus der Analyse des genetischen Codes. Ein alternatives Verfahren zur Entfernung von funktionellom Kohlenhydrat am Aminosäurerest 117 umfaßt die Verwendung einer Endoglycosidase, z.B. Endoglycosidaso H, die zur Entfernung (oder wesentlichen Entfernung) von stark mannosehaltigen Kohlenhydratstrukturen am Aminosäurerest 117 (Asn) in der Lage ist, ohne daß die Funktionalität der komplexen Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 beeinträchtigt wird. Diese Behandlung wird ebenfalls nach an sich bekannten Techniken erreicht, z. B. gemäß dem Verfahren von Tarentino et al., J. Biol. Chem., Bd.9 (1974), S. 811; und Trimble et al.. Anal. Biochem., Bd.141(1984),S.515.

Ein weiteres Verfahren zur Entfernung von funktionellem Kohlenhydrat an den Aminosäureresten 117,184 und 448 besteht in der Behandlung mit Natriumperjodat, die nach bekannten Techniken durchgeführt wird. Natriump6rjodat oxKjrt Kohlenhydrstroste, die vicinale Hydroxylgruppen ent' "en. Die Oligosaccharide an sämtlichen drei Positionen 117,184 und 448 enthalten Reste, die gegenüber einer Perjodatoxida lpfindlich sind.

Ein weiteres Verfahren zur Veränderung der Kohlen ^struktur unter Änderung des komplexen Oligosaccharide in den Stellungen 184 und 448 von rekombinantem t-PA-Typ I unter Überführuny in ein stark mannosehaltiges Oligosaccharid besteht in der Anwendung von rekombinanten Techniken, z. B. der Transfektion einer Wirtszelle, der das für die Synthese von komplexen, N-verknüpften Oligosacchariden erforderliche Enzym fehlt (C. Gottlieb et al., J. Biol. Chem., Bd. 250 (1975), S. 3303-3309) mit einem für t-PA kodierenden Expressionsvektor.

Ausführungsbeispiele

t-PA-Kohlenhydratvarlante mit einem Mangel an Gin,,, und einem stark mannosehaltigen Oligosaccharid In Position 117 Die folgende ortsspezifische Mutagenese wird angewandt, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der zur Expression einer für Gewebetyp-Plasminogenaktivator mit dem Aminosäurerest Glutamin in Position 117 anstelle von Asparagin kodierenden DNA in der Lage ist.

A. Aufbau des Ollgonucleotlds

Ein 2 '.-mores Oligonucleotid mit der Sequenz 5'-TGC-ACC-AAC-TGG-C¹¹AV^-AGC-AGC-GCg-S' (24-meres Q 117) wird nach dom Phosphotriesterverfahren gemäß Crea et al.. Nucleic Acids Research, Bd.8 (1980), S.2331 synthetisiert. Sterne geben das mutante Kodon (Asn zu GIn) an.

B. Aufbau von rekomblnanterM13-Schablone

Das Plasmid pUCPAAHD (Fig.3) ist ein Derivat des mit pETPFR (sonst als pPADHFR-6 bezeichnet, beschrieben in EP-A-93619) bezeichneten Plasmids mit folgenden Modifikationen: 1) 166bp von 5'-untranslatierter DNA sind vom 5'-Ende des t-PA-Gens unter Verwendung von Exonuclease BaI 31 geschnitten; 2) eine Hind HI-Stelle ist am neuen 5'-Ende des t-PA-Gens hinzugefügt; 3) ein Polylink?r, der die Erkennungsstollen für EcoR I, Sac I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I und Pvu Il enthält, ist am 5'-Ende des SV40-frühon Promotors, der den t-PA-Expressionsvektor steuert, hinzugefügt; 4) die Hind HI-Stelle in Position 3539 von pETPFR ist durch eine Klenow-Auffüllreaktion zerstört.

Das Plasmid pUCPAAHD (Fig.3) wird mit Sma I verdaut. Ein Fragment von etwa 2,0kb mit einem Gehalt an dem t-PA-Gen über Kodon Nr. 507 hinwog wird durch PAGE und Elektroelution des Fragments vom Gel isoliert. Mi3mp10-Vektor (Messing, Methods in Enzymology, Bd. 101 (1983), S. 20) wird ebenfalls mit Sma I verdaut, einmal mit Phenol extrahiert, mit Chloroform, Ethanol gefällt und in 50 millimolarem Trispuffer '">m pH-Wert 8,0,1 millimolar EDIA resuspendiert. Das ca. 2,0 kb-Fragment von pUCPAAHD wird in don Sma I-Schnitt M 3mp10 unter Verwendung von T4-DNA-Ligase eingebunden, und die gebildete DNA wird zur Bildung von E. coli JM101 veiwendet. Die erhaltene Phage wird isoliert. Die Anwesenheit des inserts wird bestätigt und dessen Orientierung durch Restriktionsanalyso von Phagenminipräparstionon bestimmt. Eine rekombinanto Phago M13/t-Pa-SMA wird als Schablone für die anschließende Mutagenese gewählt.

C. Mutagenesereaktion

Der Mutanese-Primer(24-meresQ117) wird an einzelsträngigeM13/t-PA-SMA-DNA angehängt und mit E. coli-DNA-Polymerase-Klenow-Fragment in Gegenwart von dNTPs und T4-DNA-Ligase unter Schaffung von in vitro-Heteroduplex-RF-Molekülen gemäß Adelman et al., DNA, Bd.2 (1989), S. 183 behandelt. Diese Molekülewerdan zur Transformation von E.coli Stamm JM101 (ATCC Nr. 33876) verwendet. Die Phsgeninkorporation der gewünschten Mutation wird durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung des Mutagenese-Primers als Sonde nachgewiesen (Adelmann, a.a.O.). Eine mutante Phage wird isoliert und als M13/t-PA-SMA-GLN117 bezeichnet.

D. Subklonleren der GLN117-Mutante in das Express'.onsplasmld pUCPMHDP

Doppelsträngige DNA der Phage M13/t-PA-SMA-GLN*17 wird mit Sma I, BgI Il und Apa I verdaut. Das 1,4 kb-Fragment wird durch PAGE gereinigt. Dieses Fragment wird sodann als Frsatz für das entsprechende Fragment in pUCPAAHD verwendet. Rekombinante Plasmide mit einem Gehalt an dem t-PA-Genfragment werden identifiziert. Die Plasmide M119 und Q117 werden in DHFR-Mangel-CHO-Zellen auf folgende Weise eingeführt und verstärkt (Urlab et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 77 (1980), S.4216): 1)Plasmid-DNA wird indie Zellen nach dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren gemäß Graham et al., J. Virol., Bd.52 (1973), S.455 eingeführt; 2) im selektiven Medium entstehende Kolonien (Medium ohne Hypoxyathin, Glycin und Thymidin (-HGT) werden auf ihre t-PA-Expression indirekt durch Nachweis der Piasminbildung, bestimmt durch Verdauung von Fibrin auf einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen gemäß Granellia et al., J. Exp. Med., Bd. 148 (1978), S. 223, bestimmt; 3) fünf der am stärksten positiven Klone werden quantitativ auf die Menge an pro Zelle ausgeschiedenen t-PA unter Anwendung eines ELISA-Tests bestimmt; 4) der die höchste t-PA-Menge ausscheidende Klon wird in Methotrexat (MTX) folgendermaßen ausgestrichene 2 χ 10* Zellen werden auf 100-mm-Platten mit einem Gehalt an 50,100 oder 250 nanomolar MV,< ausgestrichen; 5) fünf in MTX entstehende Klone werden extrahiert und quantitativ gemäß vorstehender Stufi 3) (durch ELiSA) bestimmt; 6) der die höchste Menge an t-PA ausscheidende Klon wird in höheren Konzentrationen an MTX g -maß vorstehender Stufe 4) ausgestrichen, wonach sich ein quantitativer Test der fünf entstehenden Klone und die Auswahl des stärksten t-PA-Bildners anschließt.

Das vorstehende Verstärkungs- und Screeningverfshren wird wiederholt, bis sich in der erhaltenen Zellinie kein Anstieg der t-PA-Bildung mehr ergibt. Die entsprechende t-PA-Mutante wird zur Verwendung abgetrennt.

Beispiel 2

t-PA-Kohlenhydratvariante Metm ohne stark manosehaltlges Ollgosaccharid In Position 117 Die N-verknüpfte Glycosylierung in Stellung 117 erfordert für üuen Ablauf eine Asn-X-Ser/Thr-Sequenz. Eine Mutagenose unter Substitution oder Deletion in Position 119 verhindert auch die Glycosylierung in Position 117. Ein ähnliches Verfahren, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wird zur Herstellung der entsprechenden Metng-Mutante unter Verwendung eines 24-meren mit der Sequenz 5'-CC-AAC-TGG-AAC-AGC-A»T^#G^#-GCG-TTG-G-3' (24-meres 119) unter Bildung von puCPAAHD M119 verwendet. Die Bildung der entsprechenden M119-Mutante durch Expression erfolgt gemäß vorstehendem Beispiel 1.

Beispiel 3

Äquivalente t-PA-Kohlenhydratvariente GIn₁₁₁GIu₁₇S

Eine Glutamin_n7-Glutaminsäuro27₅-t-PA-Mutante wird folgendermaßen hergestellt:

Auf die vorstehende Weise hergestelltes Plasmid pUCPAAHD wird mit BgI Il und Sea I verdaut. Das Fragment von etwa 763 bp, entsprechend den Kodons 1-254 der Gawobetyp-Plasminogenaktivator-DNA-Sequenz wird auf an sich bekannte Weise an SDS-PAGE gereinigt.

Human-t-PA-DNA wird aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung diosor beiden t-PA-Plasmide ist in EP-A-093619 beschrieben.

Das Plasmid pA25E10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA-Gens kodieren und 772 Basenpaare des 3-untranslatierten Bereichs. Dieses Plasmid wird mit Sac I und BgI Il unter Bildung eines 747-Basenpaarfragments verdaut, das nach vorstehend beschriebenen Standardverfahren isoliert wird. Dieses Fragment enthält die Kodons für die t-PA-Aminosäuren 411-527 und schließt den Teil des 3'-untranslatierton Bereichs ein.

Das Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Strukturgen für t-PA und einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs. Dieses Plasmid wird mit Sac I und BgI Il unter Bildungeines 1230-Basenpaarfragments, das isoliert wird, verdaut. Dieses Fragment enthält die Kodons für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.

Diese Fragmente werden miteinander unter Anwendung von Standardverfahren verknüpft und mit BgI Il verdaut. Ein 197Ί-Basenpaarfragment, das die Kodons für die gesamte reife t-PA-Sequenz und einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs enthält, wird isoliert. Doppelsträngiges M13mp8 (Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Hcrausg. A.Walter, Elsevier, Amsterdam, 1981, S. 143) wird mit BamH I verdaut und mit dem BgI Il verdauten t-PA unter Bildung von M13mp8PABgl Il verknüpft. E.coli JM 101-Zellen (ATCC Nr.33876) werden mit der doppelsträngigen, replikativen Form von M13mp8PABg! Il transformiert. Din einzelsträngigen und doppelsträngigen (RF) Formen von M13mp8PABgl Il Kissen sich aus E.coli JM 101-Zellen, die mit dieser Phage infiziert sind, isolieren. Die einzelsträngige Form wird für die ortsspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.

Das Human-t-PA-Strukturgen wird durch ortsspezifische Mutagenese modifiziert, um t-PA mit Aminosäuresubstitutionon an verschiedenen Positionen zu exprimieren. Ein sythetisches Oligoniucleotid wird beispielsweise gemäß dem Festphasen-Phosphotriesterverfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (V. St. A.), Bd. 25 (1978>, S. 5765 hergestellt und für die ortsspezifische Mutagenese verwendet:

Primer2C9 GIu

DNA-Sequenz G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G

Das allgemeine Verfahren von Adelman ot al., DNA, Bd. 2 (1963), S. 183, wird zur Erzeugung eines t-PA-Klons, der die mutierte Sequenz des synthetischen Primers enthält, verwendet. Der mutante t-PA-Klon M13RF2C9 wird unter Verwendung des Primers, der die vorstehend gezeigte Mutation für die einzelne Amino: äure aufweist, erzeugt.

Im Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet; vgl. EP-A-93619) erfolgt die Expression des nativen x-PA-Strukturgens unter der Kontrolle des frühen Promotors für SV40-T-Antigen. Dieser Promotor steuert auch die Expression des DHFR-Gons. Ein Vektorfragment 1 wird durch Isolation des großen Fragments, das durch Verdauung von pPADHFR-6 mit BgI Il und BstE Il erzeugt worden ist, erhalten. Ein weiteres Frament 2 wird durch Isolieren des"400-Basenpaar-t-PA-Fragments, das durch Verdauung von pPADHFR-6 mit BgI Il und BstXI erhalten worden ist, gebildet. Ein 1141-Basenpaar-t-PA-Fragnrmnt 3 mit einem Gehalt an der gewünschten Mutation wird durch Verdauen von RF-DNA aus dem mutantent-PA-Klon M13RF2C9 mit BstXI und BstE Il erhalten. Die Fragmente 1 und 2 werden mit dem Fragment 3 verknüpft. Das DNA-Gemisch wird zur Transformation von E.coli unter Bildung des oukariontischcn Expressionsvektors pPADHFR-6 2 C9 verwendet.

Das auf die vorstehende Weise gemäß EP-A-199574 gebildete Plasmid pPADHFR-6 2C9 enthält eine DNA-Sequenz, die für eine Glutaminsäure₂;s-Gewebßtyp-Plasminogenaktivator-Mutante kodiert. Es wird nV See I und Apa I verdaut. Das Fragment von etwa 630bp, entsprechend den Kodons 2G4-466 der Gewebetyp-Plasminogenaktivator-DNA-Sequenz wird auf an sich bekannte Weise an SDS-PAGE gereinigt.

Die beiden Fragmente BgI Il-Sca I (pUCPAAHD) und Sea I-Apa I (pPADHFR-6 2C9) werden in das große Fragment 3gl Il (531 bp)-Apa I (1926bp) aus verdautem pUCPAAHD eingebaut. Das erhaltene Plasmid, das GlutaininM?-Glutaminsäure₂76-t-PA· Mutanten-DNA enthält, wird auf übliche Weise Horn Miniscreening unterworfen. Das erhaltene Plasmid wird auf die vorstehend beschriebene Weise in DHFR-Mangel-CHO-Zellen eingeführt und verstärkt. Die entsprechende t-PA-Mutante wird für die Verwendung abgetrennt.

Beispiel 4 Charakterisierung der t-PA-Kohlonhydratstruktur Die Aminosäuresequenz von t-PA umfaßt vier potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr; Ann. Rev. Biochem., Bd.41 (1972), S.S73). Es handelt sich um die Asparaginreste 117,184,218 und 448 (Nature, Bd.301 (1983), 3.214). Die Position 218 ist jedoch in t-PA nicht glycosyliert. Die Position 184 ist in t-PA Typ I, jedoch nicht in t-PA Typ Il glycosyliert

(Biochemistry, Bd. 23 [1984], S. 3701).

Die Gelfiltrationschromatographie von mit Pronase verdautem rt-PA ergibt eine Auftrennung in zwei Klassen von N-verknüpften Oligosacchariden (vgl. Tabelle I). Die Zusammensetzung des Materials von höherem Molekulargewicht stimmt mit fucosylierton Oligosacchariden vom komplexen Typ überein. Das Material von geringerem Molekulargewicht weist eine Zusammensetzung

auf, die für ein kleines Oligosaccharid von hohem Mannosegehalt erwartet wird (vermutlich Ma^GIcNAc₂).

Die Bir.dungsposition des stark mannosehiltigen Oligosaccharids wird unter Verwendung von glycosidischen Enzymen mit

unterschiedlichen Spezifitäten bestimmt. Folgende Enzyme werden verwendet: Endo-ß-N-acetylglucosaminidase H (Endo H;

Genzyrne, Inc.), die stark mannoschaltige Oligosaccharide entfernt, aber Oligosaccharide vom Komplextyp nicht beeinflußt, und Peptid-N-glycosidase F (N-Glycanaso; Genzyme, Ine), die sowohl stark r.iannosehaltige als auch komplexe Oligosaccharide

entfornt. Das für diese Versuche vorwendete t-PA ist mit Plasmin in die zweikettige Form übergeführt und sodann reduziert undcarboxymethyliert worden.

SDS-PAGE trennt carboxymethyliertes, zweikettiges rt-PA in Kringel-Typ I (Glycosylierung in 117 und 134), Kringel-Typ Il

(Glycosylierung in 117) und Protease (Glycos»''ierung in 448) auf. Die N-Glycanaseverdauung von t-PA bewirkt, daß die beiden

Kringelbanden sich in einer Position vor ' . »ergleich zum Kringel-Typ Il geringfügig höherer Mobilität verschmelzen und daß

sich auch eine erhöhte Mobilität der Protease ergibt (Streifen 2, Fig. 2). Endo Η-Verdauung von t-PA erhöht die elektronhoretische

Mobilität der beiden Kringelbanden, beeinflußt aber nicht die Mobilität der Proteasebande (Streifen 4, Fig. 2). Das Endo Η-Ergebnis zeigt, daß sowohl Kringel-Typ I als auch Kringel-Typ Il jeweils ein stark mannosehaltiges Oligosaccharid

enthalten. Dies muß sich am Rest 117 befinden, da dies die einzige glycosylierto Position in beiden Kringeltypen I und Il ist. Die

Endo Η-Behandlung führt nicht zur Umwandlung von Kringel-Typ I in Kringel-Typ II. Daher enthält der Rest 184, der in Typ I

glycosyliert, jedoch in Typ Il nicht glycosyliert ist, ein komplexes Oligosaccharid. Die Position 448 muß ebenfalls eine komplexe

S'rjktur enthalten, da die N-Giycanasebehandlung die Mobilität dos Proteaseteils von rt-PA erhöht, während Endo H keinen Ei'iilußhat. Tabelle I Kohlenhydratzusammensetzung der Oligosaccharidfraktionen von mit Pronase verdautem t-Pa

Probe	Fuc	Man	GaI	GIcNAc	Sia"
Komplex-Typc stark mannosehahiger Ty pd	1,0 0,6	3,0 6,2	2,8 Spuren	4,2 2,0	2,4 0
Abkürzungen: Fuc = Fucose; Man b Thibarbitursäuretest ' normalisiert auf 3 Mannose ' normalisiert auf 2 GIcNAc	= Mannose; GaI =	Galactose; GIcAc =	N-Acetylglucosamin	; Sia = Sialinsäure

Beispiel 5 Endo Η-Behandlung von t-PA Endo-ß-N-acetylglucosaninidase H (Endo I) wird von der Fa. Genzyme, Ine, bezogen. Endo H entfernt N-verknüpfte Oligosaccharide vom stark mannosehaltigen Typ, beeinflußt aber komplexe Oligosaccharide nicht. SDS-PAGE wird gemäß Laemmli, Nature, Bd.227 (1970) S.680, durchgeführt. 0,8mg Humangewebetyp-Plasmir.ogenaktivator (hergestellt gemäß EP-A-93619) (in 0,2ml Präparationspuffer, der aus 0,2m Argininphosphat, pH-Wert 6, mit einem Gehalt an 0,01 % Tween 80

besteht) werden mit Endo H (0,1 Einheiten in 0,05ml 25 millimolarem Natriumphosphat, pH-Wert 6) und Natriumazid (0.02%) vermischt. Die Probe wird 20h bei 37⁰C inkubiert. Eine Kontrollproba von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator wird hergestellt und auf die gleiche Weise inkubiert, init der Abänderung, daß Natriumphosphatpuffer (60,05ml, 25 millimolar) anstelle der Endo Η-Lösung verwendet wird. Nach der Inkubation worden die Proben mit Präparationspuffer auf ein Gesamtvolumen von 0,075ml verdünnt und im gleichen Präparationspuffer gründlich dialysiert. Sodann werden die Proben filtriert (0,4μηη HV-Filter, Amicon) ur.d bei 4⁰C gelagert.

Die Deglycosylierung wird nach Reduktion und Carboxymethylierung durch SDS-PAGE überwacht. Aliquotanteile des aut diese Weise hergestoilten Humangewebetyp-Plaminogenaktivators (0,05mg in 0,01 ml Präparationspuffer) werden mit 25 millimolarem Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6 (0,015 ml) und 2mal Laemmll-Probenpuffer mit einem Gehalt an 20 millimolar Dithiothreit (0,025ml) vermischt. Die Proben werden 5 Minuten auf95°C erwärmt und sodann abgekühlt. Jodessigsäure (0,015ml einer 0,67m Lösung in 1 η NH₄OH) wird zugesetzt > <nd die Proben werden im Dunkeln 3h bei Raumtemperatur ir.xuhiort. Die reduzierten, carboxymethylierten Proben werden durch SDS-PAGE analysiert. Bei dieser Analyse wird unbehandelter, zweikettiger Kontroll-Humangswebetyp-Plasminogonaktivator in drei Hauptbanden aufgetrennt, die dem Kringel-Typ I (Glycosylierung an den Positionen 117 und 184), Kringel-Typ Il (Glycosylierung an Position 117) und Protease entsprechen (Streifen 1, Fig. 1). Die Endo Η-Verdauung von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator verstärkt die elektrophoretische Beweglichkeit der einzelnen Kringel-Banden, beeinflußt aber die Mobilität der Proteasebande nicht (Streifen '2, Fig. 1). Die Zusammensetzung an Neutral- und Aminozucksrn von Endo H-behandoltem t-PA ist in Tabelle Il angegeber.. Die Endo Η-Behandlung verringert den Mannosegehalt um 5,6 Roote pro Mol und den N-Aretylglucosamingehalt um 0,9 Reste pro Mol. Dieses Ergebnis stimmt mit der stöchiometrischen Entfernung des stark mannosehaltigen Oligosaccharids von Position 117 überein.

Die fibrinolytische Aktivität von Endo Η-behandeltem Humangewebetyp-Plasminogenaktivator wird durch den In-vitro-Gerinnsel-Lysis-Test gemäß Collcn et al., J. din. Path., Bd. 21 (1968) S. 705, bestimmt. Die Aktivität von Endo H-behandeltem Humangewebetyp-Plasminogenaktivator läßt sich bei diesem Test nicht von der Aktivität der unbehandelten Kontrolle unterscheiden.

Die Humangewebe-Plasminogenproben werden gemäß dem Jodobead'-Vorfahren (Markwell, Anal. Biochem., Bd. 125 (1982), S.427) auf eine spezifische Aktivität von etwa 2μθί^ jodiert. Zu sämtlichen Zeitpunkten wird Puffer mit einem Gehalt an 0,2m Arginin und 0,1 m Citrat (pH-Wert 6,0) und 0,01 % Tween 80 verwendet. Sämtliche Proben v/erden vor der Jodierung gegen diosen Puffer dialysiert. Der pH-Wert wird vor der Jodierung mit Tris-Base auf 8,2 eingestellt. Das Jodierungsgomisch wird über eine mit PD-10 (Pharmacia) gepackte Säule, die mit Puffer vom pH-Wert 6,0 äquilibriert ist, gegeben. Die radioaktiven Fraktionen vom Leervolumen ab werden vereinigt, SDS-PAGE wird durchgeführt, und das getrocknete Gel wird der Autoradiographie unterzogen. Die Autoradiographie der markierten Humangewebetyp-Plaminogenaktivatoren ergibt, daß mehr als 95% der Radioaktivität in den Humangewebetyp-Plasminogenaktivatcr eingebaut sind.

Dio einzelnen markieiten Humangewebotyp-Plasminogenaktivatoren werden mit unmarkiertem Material in einem Verhältnis von 1:200 (markiert:unmarkiert, Gew./Gew.) vermischt und intravenös in Form eines Bolus an Kaninchen, die im Ohr einen arteriellen Katheter aufweisen, injiziert. Die Kaninchen erhalten jeweils 1 mg/kg an unmarkiertem rnd 10pCi/kg an markiertem Humangewebetyp-PlasminogenaktivQtor. Der unmarkierte Humangewebetyp-Plasminogenaktivator wird als Träger für die Spurenmenge an markiertom Hurnangewebetyp-Plasminogenaktivator verwendet, um therapeutische Konzentrationen zu erreichen und Veränderungen in der Pharmakokinetik zu vermeiden, die aus einer Konzontrationsabhängigkeit des Clearancewegs entstehen könnten. Serielle arterielle Blutproben werden in einem Zeitraum von 26 Minuten gewonnen und sofort in Röhrchen gegeben die ein lyophilisiertes Gemisch bus D-Phe-pro-arg-chlormethylketen (PPACK) und EDTA in Endkonzentrationen in I mikromolar bzw. 4,8 millimolar enthalten. Die Röhrchen werden auf Eis gegeben, und das Plasma wird abgetrennt. Die mit Trichloressigsäure (TCA) fällbare intakto (Humangewebetyp-Plaminogenaktivator) und die gesamte Radioaktivität werden in den einzelnen Plasmaproben gemessen. Der immunoreaktive Humangewebetyp-Plaminogenaktivator wird ferner gemäß dom Sanchwich-ELISA-Verfahren, das sich polyklonaler Antikörper bedient und eine Empfindlichkeit von mindestens 30ng/ml aufweist, gemessen.

Der zeitliche Verlauf der Plasmakonzentration wird an ein ZweikompartimentmodeH für die Bolusinjoktion unter Anwendung eines interaktiven Kurven-Stripping-Verfahrens^b, das sich bei der Restemothode bedient (Tebaldi et al., Pharmacokinetics, 2. Aufl., New York, Marcel Dekker, Inc., (1982), S.433-444), angepaßt. Folgende exponentiell Gleichung wird angewandt: Cp -- Ae"⁰' + Be"^pi, wobei Cp die Konzentration von rt-PA im Plasma zu einem beliebigen Zeitpunkt t und A und B die y-Abschnitte der raschen und langsamen Clearance-Phasen mit den Steigungsfaktoren α bzw. β bedeuten. Der t|_/2-Wert für die α· und ß-Phase wird als das Verhältnis borechnet. 1 n2/Steigung. Die Ergebnisse aus dem Kurven-Stripping-Verfahren werden als erste Näherungen zur Anpassung der Daten an ein biooxponentielles Modell unter Verwendung von PC NONLIN eingesetzt. Ein Datensatz (Fig. 4) kann nicht unter Verwendung von PC NONLIN angepaßt werden, so daß die Daten aus dem Kurvon-Stripping-Vcrfahren verwendet werden. C₀, d.h. die Plasmakonzentration zum Zeitpunkt 0, ist dio Summe aus A und B. V₀ wird als Dose, dividert durch C₀, berechnet. Die Fläche unter der Kurve AUC wird aus der Formel AUC = Α/α + B/ß bestimmt. In jedem Fall ist die extrapolierte Fläche kleiner als 20% des Gesamt-AUC-Werts. Der AUC-Wert wird sodann verwendet, um die Clearance unter Anwendung der Formel Clearance = Dosis/AUC zu berechnen. Die relativen Anteile der α- und ß-Phasen werden aus folgenden Formeln berechnot:

%AUCa = -^- χ 100 x 100

Die Daten für Tabelle Il wurden an ein Modell unter direkter Elimination des zentralen Kompartiments (K_)o) undÄquilibration mit einem peripheren Kompartiment (K₁₂ und K₂₎) angepaßt.

Zwei Typen von Daten warden aus in vivo-Clearanceuntersuchungen an Kaninchen gewo ->ηβη. Ein Typ mit dem immunoreaktiven Humangewebetyp-Plasminogenaktivator soli ein Maß für d'e Clearance von unmarkiertem Material darstellen. Der zweite Datentyp betrifft die mit TCA fällbare Radioaktivität, die mehr als 95°C des intakten Humangewebetyp-Plaminogenaktivators repräsentiert. Die Kurven der Plasmakonzentration gegen die Zeit aus der Immunoreaktivität und derr> Zählergebnis für die mit TCA fällbare Radioaktivität werden an die geeigneten multiexponentielien Modelle angepaßt, und die abgeleiteten pharmakokinetischen Parameter werden verglichen.

Beispiel β

Mit Per]odat behandelter rt-PA

Rekombinantert-PA (1 mg/m! in 0,2mArgininphosphatpuffer, pH-Wert 6) wird in einem Eisbad gekühlt. Natriumperjodat wird in einer Konzentration von 10 millimolar zugesetzt und das Gemisch wird 1 Stunde bei 4⁰C im Dunkeln gohalten. Glycerin (100 millimolar) und Ethanolamin {50 millimolar) werden zum Stoppen der Reaktion zugesetzt. Die Probe wird sodann gründlich gegen Argininphosphatpuffer vom pH-Wert 6 dialysiert, durch ein 0,22Mm- Filter (Millipore) filtriert und bei 4⁰C gelagert. Natriumperjodat verursacht die Oxidation von Kohlenhydratresten, die vioinale Hydroxylgruppen enthalten. Die N-verknüpften Oligosaccharide en sämtlichen drei Glycosylierungsstellen von rt-PA enthalten Reste, die gegenüber der Perjodatoxidation empfindlich sind. Die Zusammensetzungen der Neutral- und Aminozucker von rt-PA und mit Porjodat behandeltem rt-PA sind in Tabelle Il angegeben. Erwartungsgemäß wird die Fucose durch die Wirkung von Perjodat vollkommen zerstört. Der Abfall im Mannosegehalt stimmt mit der Zerstörung der terminalen Reste des stark mannosehaltigen Oligosaccharide in Position 117 und dor 2-verknüpften Reste der komplexen Oligosaccharide in den Positionen 184 und 448 überein. Ferner wird eine gewisse Abnahme der Galactosekonzentrationen festgestellt, was vermutlich auf die Oxidation von terminalen Galactoseresten (d. h. solchen, die nicht mit Sialinsäure substituiert sind) zurückzuführen ist.

Eine Aminosäureanalyse ohne Reduktion und Carboxymet'iylierung zeigt, daß Cysteinreste durch die Perjodatbehandlung nicht zu Cysteinsäure oxidiert werden. Nach Reduktion und Carboxymethylierung werden 34,2 nMol (die erwartete Anzahl beträgt 35) Carboxymethylcystein pro nMol rt-PA in der mit Perjodat behandelten Probe erhalten. Die Ausbeute an Methionin in mit Perjodat behandeltem rt-PA beträgt nur 0,9nMol von 5,0. Unbehandeltes rt-PA weist einen Wert von 2,5nMol auf. Jedoch steigt durch die R jduktion und Carboxymethylierung die Methioninausbeute auf 3,3 bzw. 2,8nMol für die mit Perjodat behandelten bzw. rnbehandelten Materialien. Diese Ergebnisse lassen auf die Anwesenheit von Methioninsulfoxid in der behandelten Probe schließen. Es gibt keinen signifikanten Unterschied der Ausbeute an anderen Aminosäuren zwischen mit Porjodat behandeltem und unbehandeltem rt-PA (diese Werte werden nicht vorgelegt). Die Behandlung mit Perjodat verändert die Aktivität von rt-PA nicht signifikant. Die spezifische Aktivität von mit Perjodat behandeltem rt-PA beträgt 91 % der Aktivität von Kontroll-rt-PA, gemessen durch einen in vitro-Gerinnsel-Lysis-Test (D.Collen et al,, J. Clin. Path., Bd.21 [1968), S.705-707).

Beispiel 7

t-PA-Varlante mit hohen Mannosegehalt

Klon 15B-Ovarialzellen von Chinesischem Hamster (C. Gottleib et al., J, Biol. Chem., Bd. 250 [1975], S. 3303-3309) werden mit dem Plasmid pETPFR, das für Gewebetyp-Plasminogenaktivator und Dihydrofolat-reduktase kodiert (beschrieben in EPA-A-093619), und pSVENEOBal6 (EP-A-160457), das ein Protein zur Gewährleistung von Neomycin-Resistenz exprimiert, kotransfiziert. Beim Klon 15 B handelt es sich um eine CHO-Zellmutante, dor das Enzym N-Acetylglucosamin-transferase I fehlt (C. Gottloib et al., a. a.O). Die Kotransfcktion in CHO 15B-Zellen wird durch Modifikation dar Calciumphosphatkorpräzipitntionstechnik von Graham und Van der Eb (F. Graham und A. Van Der Eb, Virology, Bd. 52 [1973), s.457-467) durchgeführt. Plasmid-DNA (2,5pg) wird mit Calciumphosphat kopräzipitiert und 3h in 10'Zellen eingeführt. Die Zellen werden anschließend mit ?0% Glycerin 60 Sekunden behandelt und sodann mit nicht-selektiven Medien vorsorgt. Nach zwei Tagen werden dio Zellen passagiert und mit selektiven Medien (Harn F12-DMEM mit einem Gehalt an G418) versorgt. Die Zellen werden drei Wochen gezüchtet und sodann auf vier 60mm-Schalen übertragen. Nach Erreichen von 80% Konfluenz worden die Zellen mit weiteren selektiven Medien (Harn F12-DMEM mit einem Gehalt an 0, 50,100 oder 250 nanomolar Methotrexat) versorgt. Nach weiteren zwei Wochen werden die Zellen durch begrenzende Verdünnung in Schalen mit 96 Vertiefungen geklont. Die einzelnen Vertiefungen werden durch enzymgebur.denen Immunosorbenstest (ELISA) auf rt-PA getestet. Vertiefungen, die rt-PA gebildet haben, werden in Schalen mit 24 Vertiefungen bis zur Konflueriz gezüchtet und weiter mt 500,1000,3000 und 10000 nanomo! r Methotrexat verstärkt. Ein auf 3000 und 100000 nanomolar Methotrexat verstärkter Klon wird ausgewählt und zur Bildung des mutanten rt-PA expandiert. Der rt-PA wird unter Verwendung von Zinkchelat-Sepharose (chelatbildende Sepharose, Pharmacia) goreinigt, und ein immobilisierter, polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Wildtyp-rt-PA wird gebildet. Die spezifische Aktivität, ähnlich der von Wildtyp-rt-PA, wird unter Verwendung des chromogenen Substrats S2251 (Kabi) und eines ELISA-Tests auf polyklonaler Basis bestimmt.

Eine Probe von rt-PA mit stark mannosehaltigen Oligosaccharidon an sämtlichen drei Glycosylierungsstellen wird durch Expression des Gens für t-PA in CHO 15B-Zellinio hergestellt. Der 15B-Zellinie fehlt das Glycoprotein ν jrarbeiter.do Enzym N-Acetylglucosamin-transferase I, so daß sie N-verk- -fte Oligosaccharide vom komplexen Typ nicht synthetisieren kann. Die Zusammensutzungen von Neutral- und Aminozuckern von rt-PA, der Von der 158-Zellinie gebildet wird, stimmt mit der Anwesenheit von stark mannosehaltigen Oligosaccharide!! an sämtlichen drei Glycosylierungsstellen überein (Tabelle II).

Tabelle II

Kohlenhydratzusammensetzung von modifiziertem rt-PA

	Rest* (Mol/Mol rt-PA)	Man	GaI	GIcNAc
	Fuc	9,1	4,5	7,1
EndoHb Kontrolle	2,4	3,5		6,2
behandelt	2,1	9,2	3,6	8,9
Perjodat* Kontrolle	2,2	4,4	1,9	8,9
behandelt	-	16,2	0,9	6,0
stark mannosehaltige Mutante	1,5

a Abkürzungen: Fuc = Fucose; Man = Mannose; GaI = Galactose; GIcNAc = N-Acetylglycossmin b) Normalisiert auf Galactose c Normalisiert auf GIcNAc

Beispiel 8 Pharmakoklnetlk von Gewebetyp-Plat mlnogenaktlvator-Varlanten

Der zeitliche Verlauf der Plasmakonzentrationen der Endo H- und Perjodat-modifizierten Formen von rt-PA ist in Fig.4 gezeigt. Beide Behandlungen verlangsamen offensichtlich die Ausscheidung von rt-PA. Es ergibt sich ein signifikanter Anstieg von v_l;2a nur für den mit Perjodat behandelten rt-PA. Sowohl der mit Endo H ab auch dor mit Perjodat behandelte rt-PA weisen langsamere Clearancegeschwindigkeiten als Kontroll-rt-PA auf, wobei sich ein 1,9- bzw. 2,7facher Unterschied ergibt. Der Unterschied in der Clearancegeschwindigkeit von mit Endo H und mit Perjodat behandeltem rt-PA ist signifikant (p < 0,05). Es gibt keine signifikanten Unterschiede in V₀ oder t_1/:ß (Tabelle III).

Die übrigen modifizierten Formen von rt-Pa stehen nicht in ausreichenden Mengen zur Verfügung, um eine pharmakokinetisdie Charakterisierung unter Anwendung der vorstehenden Techniken zu ermöglichen. Daher werden die pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Materialien nach Jodierung bestimmt. Eine Beschränkung din-Vis Verfahrens besteht darin, daß die Beseitigung von markierten und unmarkierten Formen von rt-PA unterschiedlich ist (Fig.7). Die Immunoreaktivität und das mit TCA fällbare Zählergebnis nehmen identisch bis zu etwa 90% der der Clearance unterworfenen Dosis ab. Anschließend divergieren die Kurven, wobei markierter rt-PA langsamer beseitigt wird. Die pharmakokinetischen Parameter aus diesen beiden Kurven sind in Tabelle IV zusammengestellt. Obgleich die Warte für V₀, t_l/2a und t_1/2ß nicht signifikant unterschiedlich sind, zeigen die reluiven Größen von % AUCa und % AUCß sowie die Clearancegeschwindigkeit signifikante Unterschiede. Um festzustellen, ob die pharmakokinetische Analyse mit radioaktiv markiertem rt-PA eine Vorhersage der vorstehend gezeigten Unterschiede in der Beseitigung gestattet, werden mit Endo H und Perjodat behandelter rt-PA markiert, und ihre pharmakokinetischen Eigenschaften werden bestimmt. Der markierte rt-PA wird immer mit 1 mg/kg nicht-markiertem rt-PA koinjiziert. Die Beseitigungsmuster der mit TCA fällbaren Zählergebnisse dieser modifizierten rt-PAs sind in Fig. 8 gezeigt. Der rt-PA mit stark mannosehaltigen Oligosaccharidstrukturen an sämtlichen Glycosylierungsstellen, der in der Zellinie 15 B gebildet worden ist, ist in diesem Versuch ebenfalls enthalten. Sämtliche vier Formen von rt-PA weisen ähnliche Anfangsvolumina der Verteilung auf. Wie in Fig.4 gezeigt, weisen die mit Endo H und Perjodat behandelten rt-PAs geringere Clearancegeschwindigkeiten als der Kontroll-rt-PA auf. Die dominante Veränderung im Eliminationsmuster von mit Endo Hund Perjodat behandeltem rt-PA liegt offensichtlich in der relativen Größe der α- und ß-Phase. Die Clearancegeschwindigkeit von HM-rt-PA ist nahezu zweifach größer. Die wesentliche Veränderung in der Clearance von HM-t-FA scheint auf eine AbnaSrno in der α-Phase in der Halbwertszeit zurückzuführen zu se<n (Tabelle V).

Die Entfernung des stark mannosehaltigen Oligosaccharids am Aminosäurerest 117 durch Endo und die Oxidation durch Perjodat scheinen ähnliche Veränderungen in der Pharmukokinetik hervorzurufen. Infolgedessen wird die GInI 17-Mutante als weiteres Hilfsmittel zur Bestimmung der Rolle, die die Glycosylierung an der Aminosäure 117 bei de·· Beseitigung von rt-PA spielen kann, verwendet. Fig. 5 zeigt, daß sich diese Mutante ähnlich wie die andere· Formen von rt-^pA mit langsamerer Beseitigung verhält. Die Clearancegeschwindigkeit von GIn117 ist mehr als zweifaci ,edrigor als die der Kontrolle. Es ergibt sich eine Verschiebung zu einer ausgeprägteren ß-Phase. In den Werten von Vo, ti/₂a und t_1/2ß ergeben sich keine signifikanten Veränderungen.

Tabelle III

Pharmakokinetik von unmarkiortenv, modifiziertem und Wildtyp-rt-PA¹

rt-PA" ! V₀ T_1/2a T,_/2ß %AUCa %AUCß Cl K₁₀ ⁰ K₁₂ K₂₁

ml/kg min min ml/min/kg

Kontrolle" 5 43,2 2,61 19,6 82,0 18,0 9,57 227 35 42

13,0 0,29 2,0 18,7 5,2 1,87 30 2,6 4

ENDO 5 53,4 3,52 24,0 37,4" 62,6" 4,98" 95" 80" 65

10,6 1,1 4,1 6,8 9,7 0,53 13 34 15

Poriodat 5 56,4 4,22· 37,b 29,7" 70,3" 3,53" 63" 72" 54

10,4 0,77 10,9 7,7 11,4 0,57 6 22 20

a Sämtliche Werte stellen Mittelwerte der. Darunter finden sich die Standardabweichungen. Sofern ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) zwischen einzelnen Gruppen durch Varianzanalyie festgestellt wird, wird ein Student-t-Test vorgenommen, um den Signifikanzgrad zu bestimmen: (*)p < 0,05; (**)p < 0,01. Die Dosen (mg/kg) für Kontrolle, Endo und Perjodat betragen 1,0,0,83 bzw. 0,95.

b Endo bedeutet mit Endo H behandelten rt-PA. Perjodat bedeutet mit Natriumperjodat behandelten rt-PA.

c Mikrokonstante KifcK_wund Kj₁ (min¹ χ 10¹).

Tabelle iV

Pharmakokinetik von markiertem und unmarkiertem Wildtyp-rt-PA¹

it-PA"	η	V0	Τι«α	T,/2ß	% AlICa	%AUCß	Cl
		ml/kg	min	min			ml/min/kg
IR	4	30,0	21,3	3,05	81,5	18,5	5,51
		3	2,0	0,42 '	14	3,2	0,85
TCA	4	27,7	30,3	3.36	62,1»	37,9*	3,92»
		1.9	9,5	0,28	7,2	5,5	0,40

a Sämtliche Werte stellen Mittelwerte dar. Darur.ter findet ·' :h die Standardabweichungen. (·) ρ < 0,01 beim .two tailed'-Student t-Tect. b Abkürzungen: IR - immunoreaktiver rt-Pa; TCA = mit TriLhloruesigsäure fällbare Radioaktivität. Die Hosen betragen 1 mg/kg und 3,4μΟί/Ι<ο für IRb:w.TCA.

Tabelle V

Pharmakokinetische Parameter von mit Endo H odsr Perjodat behandeltem rt-PA und stark mannosehaltigem rt-PA*

rt-PAbn	η	V0	Ti/jO.	T,/2ß	%AUCa	%AUCß	Cl
		ml/kg	min	min			ml/m'n/kg
Konirolle	5	31,5	2,55	14,9	52	48	5,72
		8,5	0,66	3,8	5	6	0,45
ENDO	4	31,1	3,25··	24,1	33··	67*·	?,84"
		2,35	0,36	1.8	1,1	9	0,24
Pcriodat	4	32,6	3,30"	30,3	32*·	68"	2,74·'
		2,3	0,49	3,7	3.1	7	0,25
HM	4	35,4	1,54"	38,0·	63··	36'·	10,1"
		15,1	0,11	21,2	35	13	4,0

a Sämtliche Werte stallen Mittelwert' dar. Darunter finden sich die Standprdabwaichungen Vgl. Tabelle III bezüglich der Erklärung der

s:atistischen Analyse, b Die Kontrolle ist Wildtyp-rt-PA; Perjodat bedeutet mit Natrlumperjodat behandelten rt-PA; HM bedeutet stark mannosehaltigen rt-PA. der in der

Zellinie CHO 15B gebildet werden ist; Endo bedeutet mit Endo H behandelten rt-PA. Sämtli.ho Dosen betragen lOpCi/kg.

Die Pharmakokinetik von Glutamin₁₁₇-t-PA und Kontroll-Human-t-PA ist in Fig. 5 gezeigt. Die Clearance von Glutamin ₁₇ erfolgt wesentlich langsamer als die der Kontrolle.

Ein ähnliches Profil ergibt sich für Glutamin,u-Glutaminsäu^ys-t-PA, das gemäß Beispiel 3 erhalten worden ist; vgl. Fig. 6.

Fibrinbindungseigenschafton

Die Fibrinbindung ste<!'. ciiion äußerst wichtigen Faktor dar, der vermutlich direkt mit der Fiorinspezifität, die Humang .obctyp-Plasmiiiogenaktivc'or in vivo besitzt, verbunden ist. Die Fibrinbindung von Endo H-Hum?.ngüwebo:yp-Plasminogenaktiva!or wird gemäß zwei Verfahren bewertet. Das erste Verfahren bedient sich der Bindung von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator an einer mit Fibrin beschichteten Verliefung einer Standardmikrotiterplatte; sämtliche Vertiefungen werden anschließend gewaschen und mit einer Lösung von Plasmin und mit einem chromogenen Substrat für Plasminogen (S2251, Kabi) versetzt. Die Färbung ist proportional zur Menge an Humangewebotyp-Plasminogenaktivator, der in der Anfangsstufe gebunden wird (Angles-Cano, Thrombosis and Haemostasis, Bd. 54 (1985), S. 171. Der zweite Testtyp für die Fibrinbildung mißt die Menge an Humangewebetyp-Plasminogenaktivator, die in Lösung verbleibt (durch ELISA), wenn Thrombin zu einer Lösung von plasminogenfreiem Fibrinoge und Humangowebetyp-Plasminogenaktivator gegeben wird (Rijken et al., J. Biol. Chom., Bd. 257 [1982], S\ 2929). Derzeit ist es un'lar, welcher Test adäquat die in vivo-Konsequenzen aor voränderten Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Fibrinbindcrig vorhersagt. Auf der Grundlage der Daten der einzelnen Tests schließen wir, daß mit Endo H behandelter Humangowebetyp-Plasminogenaktivator die Fibrinspezifität zumii dest unverändert läßt, wenn nicht sogar verbessert.

In ähnlicher Weise zeigen die Werte des Fibrinbindungstests von Glutamin,,₇-Glutaminsäure₂7b t-PA von Beispiel 3, daß Glutamin,,7-Glutaminsäure₂76-t-PA sich ähnlich wie Glutaminsäure₂₇₅-t-PA . ''TIt und gegenüber der t-PA-Kontrolla bezüglich der Fibrinstimuliorung und spezifischen Aktivität überlegen ist.

Beispiel 9

Fibrinolytische Aktivität der t-PA-Variante GIn₁₁₁MeI_11n,

GIn₁₁₇, Met_(li und die gemäß den Beispielen 1 und 2 hergestellten Mutanten werden jeweils auf ihre fibrinolytischo Aktivität getestet, wobei ähnliche Ergebnisse wie für das mit tndo H behandelte Material erzielt werden. Die Pharmakokinetik dor einzelnen Tests, verglichen mit Kontroll-Humangewebctyp-Plasminogunaktivatoren, verläuft ähnlich wie bei mit Endo H behandeltem Material.

Beispiel 10

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Verbindungen der Erfindung lassen sich nach bekannten Verfahren zu pharmazeutischen Zusammonsc zung >n verarbeiten, wobei der gebildete Humangewebetyp-Plasminogenaktivator mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff vereinigt wird.

Geeigneto Trägerstoffe und Formulierungsmöglichkeiten, einschließlich mit anderen Humanproteinen, z. B. mi'.

Humanserumalbumin, sind in Remington's Pharmceutical Sciences, E.W. Martin, aufgeführt. Derartige Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge an dem Protein zusammmen mit einer geeigneten Menge an Ti ägerstoff, so daß die Herstellung von pnai mazeutisch vorträglichen Zusammensetzungen, die sich für eine wirksame Behandlung des Wirts eignen, gewährleistet ist.

Beispielsweise kann der erfindungsgemäß hergestellte Hu.nangewebetyp-Plasminogenaktivator parenteral an Personen, die an kardiovaskulären Erkrankungen oder Zuständen leiden, verabreicht werden. Die Dosierung kann sich an den Daten ausrichten, die für die klinische Untersuchung von anderen kardiovaskulären, thrombolytischeri Mitteln gelten, z. B. etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht bei intravenöser oder intraarterieller Verabreichung innerhalb von 1,5 bis 12 Stunden an Patienten, die an Myokardinfarkt, Lungenembolie und dergl., leiden.

Ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform ist eine Ampulle mit einem Gehalt an 50 mg Humangewebetyp-Plasminogenaktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbate 80. Dieses Produkt kann mit 50ml sterilem Wasser für Injektionszwecke rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen an 0,9%iger Natriumchloridlösung für Injektionszwecke vermischt werden.

Die verlängerte oder verminderte Halbwertszeit von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator kann für eine rasche intravenöse Injektio'n geeignet sein. Dies beseitigt die Notwendigkeit komplizierter Verabreichungsverfahren und kann die Möglichkeit der Verwendung von t-PA bei Einrichtungen mit begrenzter medizinischer Ausrüstung verbessern, z. B. in Rettungsfahrzeugen, die von medizinischem Hilfspersonal geführt werden. Eine verlängerte Halbwertszeit von Humangewebetyp-Plasminogonaktivator kann auch geringere, sicherere Anfangsdosen ermöglichen und thrombolytisch wirksame Plasminspiegel bis zu 45 Minuten aufrechterhalten. Ferner kann eine längere Halbwertszeit von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator sich für eine verlängerte Therapie mit niedrigeren Dosen eignen, die erforderlich sein kann, um eine Reokklusion im Anschluß an eino erfolgreiche akute Thrombolyse zu vermeiden. Sie kann sich auch für eino verlängerte Thrombolyse eignen, die in Fällen von Gefäßverschlüssen erforderlich sein kann. Eine verlängerte Halbwertszeit von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator kann bei bestimmten Patienten die gewünschte thrombolytische Therapie ermöglichen, indem wirksame Plasminspiegel über einen verkürzten Zeitraum hinweg bereitgestellt werden.

Claims (22)

1. Verfahren zur HerstrHung von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Varianten, die im wesentlichen ihre ve. ständige biologische Aktivität behalten und eine veränderte In-vivo-Halbwertszeit c ifweisen, gekennzeichnet dadurch, daß man die Kohlenhydratstruktur von Humangewebetyp-Plasminogenaktivator modifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Modifikation die Elimination von einer oder mehreren Kohlenhydratstrukturen beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß die eliminierte funktionell Kohlenhydratstruktur sich am Aminosäurerest 117 befunden hat.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß sich in Position 117 eine andere Aminosäure als Asparagin befindet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß sich in Position 119 eine andere Aminosäure als Serin oder Threonin befindet.

6. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß sich in Position 117 Glutamin befindet.

7. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß sich in Position 119 Methionin befindet.

8. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß sich in Position 118 Prolin befindet.

9. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß ein einkettiger Humangewebetyp-Plasminogenaktivator hergestellt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß sich in Position 117 Glutamin und in Position 275 Glutaminsäure befindet.

11. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß die eliminierte funktioneile Kohlenhydratstruktur sich am Aminoräurerest 117,184 und 443 befunden hat.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Modifikation durch Substitution von stark mannosehaltigen Oligosacchariden an den Aminosäurepositionen 184 und 448 erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Variante hergestellt wird, indem man in rekombinancer DNA-Zellkultur eine für die Humangewebetyp-Plasminogenaktivator-Variante kodierende DNA, die in Position 117 ein Kodon aufweist, das von dem für die Aminosäure Asparagin kodierenden Kodon abweicht, oder in Position 119 ein Kodon aufweist, das von dem für die Aminosäuren Serin und Threonin kodierenden Kodon abweicht, exprimiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß das Kodon in Position 117 für Glutamin kodiert.

15. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß das Kodon in Position 119 für Methionin kodiert.

16. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß das Kodon in Position 117 für Glutamin und in Position 275 für Glutaminsäure kodiert.

17. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß das Kohlenhydrat durch Behandeln des Humangewebetyps-Plasminogenaktivators mit einem Mittel zur Veränderung der Kohlenhydratstruktur modifiziert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Mittel um ein Enzym handelt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß das Eniym endo-H ist.

20. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß das Mittel ein Perjodat ist.

21. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Säugetierwirtszelle, die nicht zur Bildung von Glycoproteinen mit komplexen Kohlenhydratsubstituenten in der Lage ist, mit für den Plasminogenaktivator kodierender DNA transformiert, die transformierten Zellen züchtet und die Variante aus einer Kultur der Zellen gewinnt. ·

22. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet dadurch, daß die Wirtszellen ein Defizit am Enzym N-Acetylglucosaminaminotransferase aufweisen.