DE3855874T2

DE3855874T2 - Neue variante von menschlichem gewebeplasminogenaktivator

Info

Publication number: DE3855874T2
Application number: DE3855874T
Authority: DE
Inventors: Adair Hotchkiss; John O'connor; Michael Spellman
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1997-09-11
Anticipated expiration: 2008-11-03
Also published as: NO307612B1; EP0387290A1; DE3855874D1; DK112290D0; ZA888250B; HUT54209A; AU2804989A; KR920009521B1; IL88247A0; PT88938B; DK175482B1; DK112290A; PH30064A; HU215230B; DD286613A5; HU890157D0; AU658909B2; EP0387290B1; AU2131792A; FI902239A0

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige menschliche Gewebeplasminogenaktivatorvarianten, die in ihrer Kohlehydratstruktur modifiziert sind, und Zusammensetzungen davon sowie Mittel und Verfahren zur ihrer Herstellung in therapeutisch signifikanten Mengen.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die Ausscheidung von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator auf dem Blutkreislauf durch Änderung der Kohlehydratstruktur des Moleküls manipuliert werden kann.
Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) ist eine Serin-Protease, die an der Fibrinolyse beteiligt ist. Die Bindung von t-PA an ein Fibringerinnsel bewirkt eine Verstärkung der Plasminogenaktivierung (Hoylaerts, M. et al., J. Biol. Chem. 257: 2912-2919 [1982]; Rijken, D.C. et al., J. Biol. Chem. 257: 2920-2925 [1982]). Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator wandelt Plasminogen in Plasmin um. Das so hergestellte Plasmin spaltet proteolytisch Fibrinmatrizen, die das Rückgrat von Blutgerinnseln darstellen. Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator vermittelt dabei die Auflösung von Blutgerinnseln und eignet sich daher bei der Behandlung verschiedener thrombolytischer Störungen. Obwohl t-PA aus vielen Quellen wie z.B. aus der Bowes-Melanomzellinie (Rijken, D.C. et al., J. Biol. Chem. 256: 7035-7041 [1981]; Wallen, P. et al., Eur. J. Biochem. 132: 681-686 [1983)), Uterusgewebe (Rijken, D.C. et al., Biochem. Biophys. Acta 580:140-153 [1979]) und Blutgefäßperfusaten (Binder, B.R. et al., J. Biol. Chem. 254: 1998-2003 [1979]) isoliert wurde, ermöglichte das Aufkommen rekombinanter DNA-Technologie die Herstellung von t-PA (Pennica, D. et al., Nature (London) 301: 214-221 [1983]) in ausreichenden Mengen zur Durchführung klinischer Versuche mit Patienten mit Myokardinfarkt, peripheren Vaskulärthromben und Lungenembolien. Diese Versuche zeigen, daß rekombinanter t-PA (rt-PA) ein äußerst wirksames thrombolytisches Mittel mit minimalen Auswirkungen auf die Fibrinogenwerte im Blut ist (Williams, D.O. et al., Circulation 73: 338-346 [1986]; Graor, R.A. et al., Circulation 74 (suppl.1): 1-15-1-20 [1986); Colien, D. etal., Circulation 73:511-517 [1986]).
Die Ausscheidung von rt-PA aus dem Blutkreislauf geht relativ rasch vor sich. Die zweiphasige Ausscheidung wird durch eine Alphaphase mit einer Halbwertszeit von etwa 2 min in Kaninchen (Korninger, C. et al., Thromb. Haemos. 46: 658-661 [1985); Nusson, 5. et al., Thromb. Res. 39: 511-521; Bounameaux, H. et al., Blood 67:1493- 1497 [1986]) und 4 min (Baughman, R.A., Tissue Plasminogen Activator in Thrombolytic Therapy (Sobel et al., Hg.) S.41-53, Marcel Dekker, NY [1987]) bis 6 min (Wallen, P. et al., s.o.) beim Menschen dominiert. Die Leber ist die wichtigste Stelle der t-PA-Aufnahme und des t-PA-Metabolismus (Korninger, C. et al., s.o.; Nusson, S. et al., s.o.; Bounameaux, H. et al., s.o.). Einige Rezeptorsysteme in der Leber wurden beschrieben, die spezifische terminale Reste auf den Oligosaccharidabschnitten von Glykoproteinen erkennen. Durch diesen Mechanismus ausgeschiedene Proteine weisen ebenfalls Halbwertszeiten in der Größenordnung einiger Minuten auf (Ashwell, G. et al., Ann. Rev. Biochem. 51: 531-554 [1982]).
Rekombinanter t-PA besitzt vier potentielle Stellen für N-gebundene Glykosylierung. Ein mannosereiches Oligosaccharid befindet sich an Position 117 und ein komplexes Oligosaccharid an Position 448. An Position 184 ist in rt-PA vom Typ 1 ein komplexes Oligosaccharid vorhanden und in rt-PA des Typs II nicht; das Verhältnis von Typ I zu Typ II ist etwa 1:1. Eine vierte potentielle Glykosylierungsstelle bei Rest 218 ist nicht glykosyliert. Das Glykosylierungsmuster von rt-PA ähnelt dem aus Melanomen stammendem t-PA.
Die Abkürzung t-PA für menschlichen Gewebeplasminogenaktivator wurde durch einen Vorschlag beim XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostatis, Bergamo, Italien, am 27. Juli 1982 angenommen. Die Ausdrücke "menschlicher Gewebeplasminogenaktivator", "t-PA", "menschlicher t-PA" oder "Gewebeplasminogenaktivator" kennzeichnen hierin menschlichen exogenen (Gewebe)-Plasminogenaktivator, der z.B. durch Extraktion aus natürlichen Quellen und Reinigung [siehe Collen et al., EP-A-41 766 (veröffentlicht am 16. Dezember 1981 auf der Grundlage einer ersten Einreichung am 11. Juni 1980) und Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), hierin durch Verweis aufgenommen] und durch rekombinante Zellkultursysteme, die gemeinsam mit seinen Aminosäureeigenschaifen sowie physikalischen und biologischen Charakteristika z.B. in EP-A-9361 9 (veröffentlicht am 9. November 1983 auf der Grundlage einer ersten Einreichung vom 5. Mai 1982, hierin durch Verweis aufgenommen) beschrieben sind, hergestellt wird.
US-Patent Nr. 4.326.033 berichtet über die Ausdehnung der Halbwertszeit von Urokinase durch chemische Modifikation seiner Kohlehydratstruktur. Urokinase ist von menschlichem Gewebeplasminogenaktivatorimmunologisch zu unterscheiden. Weder US-4.326.033 noch eine andere Veröffentlichung rechtfertigt die Annahme, daß solche Kohlehydratmodifikationen von Urokinase auf andere Glykoproteine anwendbar sind. Beispielsweise verkürzt die Entfernung von Sialinsäure aus Ceruloplasmin seine Halbwertszeit drastisch, doch eine identische Behandlung von Transferrin, einem anderen Serumglykoprotein, übt keine signifikante Wirkung auf die Halbwertszeit aus. (Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley Publ. Co., S. 194-196 (1975); siehe auch Ashwell et al., Adv. Enzymology 41, 99 (1974) und Alexander et al., Science 226, 1328 (1984).
Die Eliminierung von aus Melanomen stammendem t-PA in Mäusen wurde Berichten zufolge durch die Titration der aktiven Stelle mit Phenylmethylsulfonylfluorid oder durch gleichzeitige Injektion von Diisopropylfluorphosphatthrombin, Asialoorosomucoid, Makroalbumin oder überschüssigem unmarkiertem t-PA (Fuchs, H.E. et al., Blood 65: 539-544 [19851) nicht beeinflußt. Die mit Asialoorosomucoid und Makroalbumin erzielten Ergebnisse lassen annehmen, daß Kohlehydratstrukturen die Ausscheidung von t-PA nicht beeinflussen. Die Ausscheidung von aus Melamonen stammendem t-PA in Ratten blieb laut Berichten durch Monosaccharide unberührt (Emeis, CM. et al., Thromb. Haemos. 54: 661-664 [19851). Wenn hingegen die zellulären Komponenten der Rattenleber getrennt wurden, nahmen die Endothelzellen - wie berichtet wurde - Melanom-t-PA durch einen Reaktionsweg auf, der durch mannosereiche Glykoproteine gehemmt werden konnte; dieses Ergebnis wurde so interpretiert, daß t-PA zumindest teilweise durch den Mannose-Rezeptor in die Leber aufgenommen wird (Einarsson, M. et al., Thromb. Haemos. 54: 270 [1985]). In anderen in vitro-Untersuchungen wurde gezeigt, daß sich rt-PA mit hoher Affinität an Leberhepatozyten bindet. Der Rezeptor schien nicht kohlehydratabhängig zu sein (Bakhit, C. et al., J. Biol. Chem. 262: 8716-8720 [1987]).
In der internationalen Patentanmeldung WO84/01786, veröffentlicht am 10. Mai 1984 auf Grundlage einer ersten Einreichung am 28. Oktober 1982, wird eine nicht selektive Modifikation von Gewebeplasminogenaktivator beschrieben, die der Anmeldung zufolge zu einem Molekül mit, im Vergleich zu unmodifiziertem Polypeptid, verringerter biologischer Aktivität und einer verlängerten Halbwertszeit führt. Das einzige Beispiel umfaßt die Behandlung eines teilweise gereinigten menschlichen Cewebeplasminogenaktivators mit Natriumperiodat, wodurch ein Produkt ensteht, das laut obiger Anmeldung etwa 70 bis 90% der ursprünglichen (unmodifizierten) Aktivität aufweist. Es findet sich in WO84/01 786 keine Beschreibung der Beschaffenheit oder Charakterisierung der Kohlehydratstrukturen, die im Nativmaterial und vor allem in der durch sie hergestellten modifizierten Form vorhanden sind. Man weiß, daß Periodat durch Oxidation alle Kohlehydratstrukturen einer Aminosäureverbindung modifiziert oder zerstört, ohne sie gleichzeitig vollständig zu entfernen.
Es gibt in WO84/01 786 auch keinerlei Hinweise darauf, wie viele derartige Strukturen menschlicher Gewebeplasminogenaktivator besitzt oder wie der eigentliche Kohlehydrataufbau aussieht - weder für die unmodifizierte noch für die modifizierte Version. Somit wurde ihr mit Periodat behandeltes Molekül am wahrscheinlichsten nicht selektiv und ohne Fokussierung auf eine spezielle Stelle durch Oxidation aller Kohlehydratstrukturen modifiziert.
In letzter Zeit wurde berichtet, daß sich die in vivo-Ausscheidungsraten von glykosyliertem und deglykosyliertem menschlichem Gewebeplasminogenaktivator nicht wesentlich voneinander unterscheiden, was den Schluß nahelegt, daß die Ausscheidungsrate von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator durch das Fehlen von Kohlehydraten nicht beeinflußt wird (Larsen et al., Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium Park City, Utah, 9-14 Februar 1986. Siehe Little et al., Biochemistry23: 6191(1984).
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neuartige t-PA-Varianten durch Modifikation ihrer Kohlehydratstruktur bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist das Bereitstellen von t-PA-Varianten, die mit unterschiedlichen Raten aus dem Blutkreislauf ausgeschieden werden können. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist das Bereitstellen wirksamer Thrombolysemittel, die sich zur Behandlung verschiedener klinischer Zustände eignen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Ziele der vorliegenden Erfindung werden durch neuartige Gewebeplasminogenaktivatorvarianten erreicht, die in ihrer Kohlehydratstruktur modifiziert sind, im wesentlichen ihre gesamte biologische Aktivität beibehalten und eine geänderte in vivo- Halbwertszeit aufweisen, d.h. bei einer anderen Rate als natürlich vorkommender t-PA aus dem Blutkreislauf ausgeschieden werden. Die Erfindung belegte beispielsweise zum ersten Mal, daß eine t-PA-Variante mit mannosereichen Oligosacchariden an Positionen 185 und 448 zusätzlich zu den an Position 117 vorhandenen rascher aus dem Blutkreislauf ausgeschieden wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit eine neuartige menschliche Gewebeplasminogenaktivatorvariante, die mannosereiche Oligosaccharide an den Positionen 184 und 446 zusätzlich zu dem an Position 117 vorhandenen substituiert hat, welche Variante im wesentlichen ihre gesamte biologische Aktivität beibehält und eine verringerte Halbwertszeit aufweist (im Vergleich zu "nativem" menschlichem Gewebeplasminogenaktivator mit intakter unmodifizierter Kohlehydratstruktur an den Positionen 184 und 448).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiters biologisch aktive menschliche Gewebeplasminogenaktivatoräquivalente, die sich in einer oder mehreren Aminosäure(n) in der Gesamtssequenz unterscheiden, jedoch das gleiche Kohlehydratmuster aufweisen wie die neuartigen menschlichen Gewebeplasminogenaktivatorvarianten der Erfindung. Die Erfindung betrifft weiters damit in Zusammenhang stehende rekombinante Vektoren, Kulturen und Verfahren, die sich zur Herstellung der neuartigen menschlichen Gewebeplasminogenaktivatoren eignen.
Ein derartiges menschliches Gewebeplasminogenaktivatorvarianten-Äquivalent, das im Schutzbereich der Erfindung enthalten ist, ist eine sogenannte Einzelkettenmutante, in der die Spaltungsstelle zwischen den Aminosäuren 275 und 276 durch Eliminieren der durch proteolytische Enzyme erkannten Aminosäuresequenz zerstört ist. Die Eliminierung der Sequenz wird durch das Ändern spezifischer Aminosäuren durchgeführt, z.B. durch stellenspezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA- Codons gemäß den weiter unten beschriebenen Verfahren.

Erklärung der Abbildungen

Fig.1 zeigt eine Comassie-gefärbte SDS-PAGE von unbehandeltem (Spalte 1) und mit Endo H behandeltem (Spalte 2) menschlichem Gewebeplasminogenaktivator. Die hochmolekulare Bande ist Einketten-t-PA; die anderen Hauptbanden sind Typ I-Kringle (KI), Typ II-Kringle (KII) und Protease (P).
Fig.2 zeigt Glycosidase-Spaltungen von reduziertem carboxymethyliertem t-PA. Spalte 1: -N-Glycanase; Spalte 2: +N-Glycanase; Spalte 3: -Endo H; Spalte 4: +Endo H. Bandenidentifizierungen wie in Fig.1.
Fig.3 zeigt eine Restriktionskarte von Ausgangsplasmid pUCPAΔHD.
Fig.4: Zeitverlauf der Plasmakonzentration von Vergleichs-rt-PA (Δ) und rt-PA, der mit Natriumperiodat (0) oder Endo H ( ) modifiziert ist. Die Daten sind als Mittelwerte ±- Standardabweichung dargestellt.
Fig.5 zeigt einen Zeitverlauf der Änderung von mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbarer Radioaktivität für menschlichen Vergleichs-t-PA (0) und Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-t-PA ( ).
Fig.6 zeigt einen Zeitverlauf der Änderung von mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbarer Radioaktivität für menschlichen Vergleichs-t-PA ( ) und Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t- PA (0).
Fig.7: Zeitverlauf der Plasmakonzentration von mit ¹²&sup5;I markiertem ( ) und ummarkiertem (0) Vergleichs-rt-PA. Die Daten sind als Mittelwerte t Standardabweichung dargestellt.
Fig.8: Zeitverlauf der Plasmakonzentration von mit ¹²&sup5;I markiertem mannosereichem rt- PA (Δ), Vergleichs-rt-PA ( ), mit Endo H behandeltem rt-PA (0) und mit Periodat behandeltem rt-PA ( ). Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.

Ausführliche Beschreibung

Allgemeines

Man stellte fest, daß die Kohlehydratstruktur an Aminosäurerest 117 von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator die folgende Zusammensetzung aufweist:
während die Strukturen an Aminosäuren 184 und 448 die folgenden Zusammensetzungen aufweisen:
Abkürzungen: Man - Mannose; Gal - Calactose, Fuc - Fucose; GlcNac - N- Acetylglucosamin; Sia - Sialinsäure; R - H oder Sia2 T 3Gal T 4GlcNac.
Es ist zu beachten, daß die obigen Strukturen zwar repräsentativ für die Arten von N- gebundenen Oligosacchariden sind, die man auf menschlichem Gewebeplasminogenaktivator vorfindet, daß aber die vorliegende Erfindung nicht auf die gezeigten Strukturen beschränkt ist. Jede Glykosylierungsstelle enthält wahrscheinlich mehrere, sehr ähnliche, nicht identische Strukturen. Dies wird als Mikroheterogenität bezeichnet und ist ein allgemeines Merkmal von Glykoproteinglykanen [siehe J. Biol. Chem. 260, 4046 (1985)]. Beispielsweise können mannosereiche Oligosaccharide in der Anzahl der vorhandenen Mannose-Einheiten variieren. In komplexen Oligosacchariden kann die Mikroheterogenität Unterschiede im Ausmaß der Verzweigung sowie in der Anzahl der Reste von Sialinsäure, Fücose, Calactose und N-Acetylglucosamin umfassen. Eine solche Mikroheterogenität ist im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die mannosereiche Struktur an Aminosäure 117 erwies sich nicht nur hinsichtlich der Struktur von den komplexeren Strukturen an Aminosäureresten 184 und 448, sondern auch insofern als einzigartig, als ihre vollständige funktionelle Entfernung ohne gleichzeitige funktionelle Modifikation der Strukturen an 184 und 448 zu einem vollständig biologisch aktiven menschlichen Cewebeplasminogenaktivator mit verlängerter in vivo-Halbwertszeit führte.
Die Entfernung einer funktionellen Kohlehydratstruktur an Aminosäurerest 117 bedeutet eine vollständige Entfernung, d.h. wenn das Glykosylierungssignal durch stellengerichtete Mutagenese zerstört wird (Erklärung weiter unten), oder eine fast vollständige Entfernung, z.B. durch Behandlung mit Endoglycosidase, die möglicherweise einen mit Asn&sub1;&sub1;&sub7; verbundenen intakten N-Acetylglucosaminrest zurückläßt "Funktionell unmodifizierte Kohlehydratstruktur" an Aminosäureresten 117, 184 und/oder 448 bedeutet, daß entweder die intakte(n) Struktur(en) oder im wesentlichen alle derartigen Strukturen beibehalten werden, sodaß sie funktionelle Äquivalente von Nativprotein sind.
Die Änderung der Kohlehydratstruktur der Aminosäure 184 in rekombinantem t-PA vom Typ I und 448 bezieht sich sich auf die Substitution eines komplexen Oligosaccharids durch ein mannosereiches Oligosaccharid durch die Herstellung des rekombinanten Cewebeplasminogenaktivators in einer Wirtszelle, der das Enzym N-Acetylglucosamin- Transferase fehlt, das ein mannosereiches Oligosaccharid in ein komplexes Oligosaccharid umwandelt. Diese mannosereiche t-PA-Variante führte zu einer im wesentlichen vollständig biologisch aktiven menschlichen Gewebeplasminogenaktivatorvariante mit einer verkürzten in vivo-Halbwertszeit.
Auf Wunsch kann die Entfernung der funktionellen Kohlehydratstruktur am Aminosäurerest 117 durch stellengerichtete Mutagenese des Glykosylierungssignals Asn-X-Ser/Thr der zugrundeliegenden DNA erfolgen, worin X jede beliebige Aminosäure sein kann. Im Falle des Gewebeplasminogenaktivators ist die dieses Signal darstellende Sequenz Asn&sub1;&sub1;&sub7; (Ser&sub1;&sub1;&sub8;) Ser&sub1;&sub1;&sub9;. Die Entfernung der funktionellen Kohlehydratstruktur an Aminosäurerest 117 ergibt sich somit z.B. aus dem Mutagenisieren der Codons, die diesen Aminosäureresten entsprechen, wodurch die Signalfunktionalität zerstört wird. Insbesondere kann die Mutagenese auf repräsentativen Codons des Signals durchgeführt werden, sodaß z.B. ein menschlicher Gewebeplasminogenaktivator mit einem anderen Aminosäurerest als Asparagin (Asn) als Position 117 und/oder einem anderen als Serin (Ser) oder Threonin (Thr) an Position 119 oder mit Prolin (Pro) an Position 118 entsteht. In einer am meisten vorzuziehenden Ausführungsform wird Asparagin&sub1;&sub1;&sub7; durch Glutamin ersetzt (aufgrund ihrer engen strukturellen Ähnlichkeit), oder Serin&sub1;&sub1;&sub9; wird angesichts einer analogen Sequenz im zweiten Kringle-Bereich durch Methionin ersetzt.
Die Mutagenese erfolgt durch an sich bekannte Verfahren, z.B. gemäß den durch Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468 (1983) zusammengefaßten Verfahren. Beispielsweise durch Änderung des für Asparagin kodierenden Codons AAC an Position 117 zu CAA oder CAG, wofür zwei Nukleotidänderungen erforderlich sind, enthält das Expressionsprodukt Glutamin an Position 117. Andere hierin vorgesehene Mutationen ergeben sich aus der Analyse des genetischen Codes.
Ein Verfahren zur Änderung der Kohlehydratstruktur umfaßt die Änderung des komplexen Oligosaccharids an Position 184 in rekombinantem t-PA vom Typ I und 448 zu einem mannosereichen Oligosaccharid mittels rekombinanter Techniken, z.B. durch Transfizieren einer Wirtszelle, der das Enzym N-Acetylglucosamin-Transferase fehlt, das für die Synthese komplexer N-gebundener Oligosaccharide erforderlich ist (Gottlieb, C. et al., J. Biol. Chem. 250: 3303-3309 [1975]), mit einem für t-PA kodierenden Expressionsvektor.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich die derzeit beste Durchführungsart der Erfindung veranschaulichen, schränken sie aber keinesfalls ein. Bestimmte Beispiele beschreiben die in den Ansprüchen dargelegte Erfindung, andere bieten Vergleichsdaten über andere Glykosylierungsvarianten von t-PA.

Beispiel 1

t-PA-Kohlehydratvariante Gln&sub1;&sub1;&sub7; ohne mannosereiches Oligosaccharid an Position 117

Die stellenspezifische Mutagenese wurde dazu verwendet, einen Expressionsvektor zu konstruieren, der DNA exprimieren konnte, die für Gewebeplasminogenaktivator, der an Position 117 anstelle von Asparagin den Aminosäurerest Glutamin aufweist, kodiert. Die Vorgangsweise war wie folgt:

A. Oligonukleotidkonstruktion

ACC-CCC-3' (24-mer Q117) wurde durch das Phosphotriesterverfahren nach Crea et al., Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980) synthetisiert. Die Sterne zeigen das Mutantencodon an (asn zu gln).

B. Konstruktion von rekombinantem M13-Templat

Plasmid pUCPAΔHD (Fig.3) ist ein Derivat eines als pETPFR bezeichneten Plasmids (an anderer Stelle als pPADHFR-6 bezeichnet, geoffenbart in EPO-93619, s.o.), das die folgenden Modifikationen aufweist: 1) 166 bp der untranslatierten 5'-DNA wurden unter Verwendung von Exonuklease Bal 31 aus dem 5'-Ende des t-PA-Cens geschnitten; 2) eine Hind III-Stelle wurde zum neuen 5'-Ende des t-PA-Gens hinzugefügt; 3) ein Polylinker, der die Erkennungsstellen für EcoRI, Sac I, Sma I, Bam HI, Xba I, Sal I und Pvu II enthält, wurde zum 5'-Ende des frühen SV40-Promotors hinzugefügt, der die t-PA- Expression steuert; 4) die Hind III-Stelle an Position 3539 von pETPFR wurde durch eine Klenow-Auffüllreaktion zerstört.
Piasmid pUCPAΔHD (Fig.3) wurde mit Smal gespalten und das Fragment mit etwa 2, kb, das das t-PA-Gen bis Codon Nr.507 enthält, durch PAGE und Elektroelution des Fragments aus dem Gel isoliert. Der M13mp10-Vektor (Messing, Methods in Enzymology 101, 20 (1983) wurde auch mit Smal gespalten, einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und erneut in 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) suspendiert. Das Fragment mit etwa 2,0 kb aus pUCPAAHD wurde mittels T4 DNA-Ligase in den mit Smal geschnittenen M13mp10 ligiert und die resultierende DNA dazu verwendet, E.coli JM101 zu transformieren. Der resultierende Phase wurde isoliert und das Vorhandenseins des Inserts verifiziert sowie seine Ausrichtung durch Restriktionsanalyse auf Phagen-Minipreps bestimmt. Ein rekombinanter Phage, M13/t- PA-SMA, wurde als Templat für die nachfolgende Mutagenese ausgewählt.

C. Mutagenesereaktion

Der Mutageneseprimer (24-mer Q117) wurde an einstrangige M131t-PA-SMA-DNA anneliert und mit E.coli-DNA-Polymerase-Klenowfragment in Gegenwart der dNTPs und T4-DNA-Ligase behandelt, um in vitro-Heteroduplex-RF-Moleküle zu erzeugen, wie dies durch Adelman et al., DNA 2, 183 (1983) beschrieben wurde. Diese Moleküle wurden verwendet, um E.coli-Stamm JM101 (ATCC Nr.33876) zu transformieren, und die erwünschte Mutation aufweisende Phagen wurden mittels Plaquehybridisierung mit dem Mutageneseprimer als Sonde nachgewiesen. (Adelman et al., DNA 2, 183 (1983). Ein Mutantenphage wurde isoliert und als M13/t-PA-SMA-GLN 117 bezeichnet.

D. Subklonieren der GLN117-t-PA-Mutante in das Expressionsplasmid pUCPAΔHD

Doppelstrangige DNA des Phagen M13/t-PA-SMA-GLN117 wurde mit SmaI, BgIII und ApaI gespalten und das Fragment mit cirka 1,4 kb durch PAGE gereinigt. Dieses Fragment diente dann dazu, das korrespondierende Fragment in pUCPAΔHD zu ersetzen.
Rekombinante Plasmide, die das t-PA-Genfragment enthielten, wurden identifiziert. Die Plasmide M119 und Q117 werden in DHFR-lose CHO-Zellen [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216 (1980)] wie folgt eingebracht und in diesen amplifiziert: 1) Plasmid- DNA wird durch das Calciumphosphat-Ausfällverfahren nach Graham et al., J. Virol. 52, 455 (1973) eingebracht; 2) Kolonien, die sich in selektivem Medium [Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin (-HGT)] entwickeln, werden hinsichtlich t-PA- Expression indirekt untersucht, indem die Plasminbildung, die durch die Spaltung von Fibrin in einer Agarplatte, die Fibrin und Plasminogen enthält, beurteilt wird, nachgewiesen wird [siehe Granellia et al., J. Exp. Med. 148, 223 (1978)]; 3) fünf der am stärksten positiven Klone werden quantitativ hinsichtlich der Menge an pro Zelle sekretiertem t-PA mittels eines ELISA-Assays untersucht; 4) der die größte Menge an t-PA sekretierende Klon wird wie folgt auf Methotrexat (MTX) ausplattiert: 2 x 10&sup5; Zellen werden auf 100 mm-Platten auspiattiert, die 50, 100 oder 250 nM MTX enthielten; 5) fünf sich in MTX entwickelnde Klone werden extrahiert und quantitativ (durch ELISA) wie in obigem Schritt 3) untersucht; 6) der Klon, der die größte Menge an t-PA sekretiert, wird wie in obigem Schritt 4) auf höheren Konzentrationen von MTX ausplattiert, gefolgt von einem quantitativen Assay von fünf sich entwickelnden Klonen und der Auswahl des besten t-PA-Produzenten.
Das obige Amplifikations- und Screeningverfahren wird wiederholt, bis keine Steigerungen der t-PA-Produktion mehr aus der resultierenden Zellinie erzielt werden, und die korrespondierende t-PA-Mutante wird zur Verwendung abgetrennt.

Beispiel 2

t-PA-Kohlehydratvariante Met&sub1;&sub1;&sub9; ohne mannosereiches Oligosaccharid an Position 117

Die N-gebundene Glykosylierung an Position 117 erfordert für ihre Existenz eine Asn-X- Ser/Ihr-Sequenz. Die Substitutions- oder Deletionsmutagenese an Position 119 verhindert auch die Glykosylierung an Position 117. Ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel 1 wurde verwendet, um die korrespondierende Met&sub1;&sub1;&sub9;-Mutante unter Verwendung eines 24-mer mit der Sequenz 5'-CC-AAC-TGG-AAC-AGC-A*T*G*-GCG- TTG-G-3' (24-mer M119) zu bilden, um pUCPAΔHD M119 zu ergeben. Die Herstellung der korrespondierenden M119-Mutante durch Expression erfolgt wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

t-PA-Kohlehydratvarianten-Gln&sub1;&sub1;&sub7;-Glu&sub2;&sub7;&sub5;-Äquivalent

Eine Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA-Mutante wurde wie folgt hergestellt.
Das wie oben hergestellte Plasmid pUCPAΔHD wurde mit Gal II und Sca I gespalten und das Fragment mit etwa 763 bp, das den Codons 1 bis 254 der Gewebeplasminogenaktivator-DNA-Sequenz entsprach, in an sich bekannter Weise auf SDS-PAGE gereinigt.
Menschliche t-PA-DNA wurde aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung dieser zwei t-PA-Plasmide ist in oben erwähnter und hierin durch Verweis aufgenommener EP-A-093.619 beschrieben.
Plasmid pA2SE10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA- Gens und 772 Basenpaare des untranslatierten 3'-Bereichs kodieren. Dieses Plasmid wurde mit SacI und BgIII gespalten, um ein 744 bp-Fragment zu erzeugen, das durch bereits beschriebene Standardverfahren isoliert wurde. Dieses Fragment enthält die Codons für die t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und umfaßt einen Teil des untransiatierten 3'-Bereichs.
Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Strukturgen für t-PA und einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit SacI und GblII gespalten, um ein 1.230 bp-Fragment zu bilden, das isoliert wurde. Dieses Fragment enthält die Codons für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.
Diese Fragmente wurden durch Standardverfahren miteinander ligiert und mit BglII gespalten. Ein 1.974 bp-Fragment, das die Codons für die gesamte reife t-PA-Sequenz plus einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs enthält, wurde isoliert. Doppelstrangiger M13mp8 [Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Hg. A. Walter, Elsevier, Amsterdam (1981) S.1431 wurde mit BamHI gespalten und an mit BglII gespaltenen t-PA anneliert, um M13mp8PABglII zu bilden. E.coli JM 101-Zellen (ATCC Nr.33876) wurden mit der doppelstrangigen replikativen Form von M13mp8PABglII transformiert. Die ein- und doppelstrangigen (RF) Formen von M13mp8PABglII können aus mit diesem Phageinfizierten E.coli JM 101-Zellen isoliert werden. Die einstrangige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von t-PA verwendet.
Das menschliche t-PA-Strukturgen wurde durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, um t-PA mit Aminosäuresubstitutionen an verschiedenen Positionen zu exprimieren. Ein synthetisches Oligonukleotid wurde z.B. durch das Festphasenphosphotriester-Verfahren nach Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978) gebildet und für eine solche stellenspezifische Mutagenese verwendet:
Primer 2C9 Glu
DNA-Sequenz G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G
Das hierin durch Verweis aufgenommene allgemeine Verfahren von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983) diente dazu, einen t-PA-Kion herzustellen, der die mutierte Sequenz des synthetischen Primers enthielt. Der t-PA-Mutantenklon M13RF2C9 wurde durch Verwendung des Primers, der die Mutation für die obige einzelne Aminosäure umfaßte, erzeugt.
Im Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet - siehe oben angeführte EP-A- 93619) steht die Expression des nativen t-PA-Strukturgens unter der Steuerung des frühen Promotors für das SV40 1-Antigen. Dieser Promotor steuert auch die Expression des DHFR-Gens. Ein Vektorfragment 1 wurde durch Isolieren des großen Fragments, das durch Spaltung von pPADHFR-6 mit BglII und BstEII gebildet wird, erhalten. Ein weiteres Fragment 2 wird durch Isolieren des 400 bp-t-PA-Fragments, das durch die Spaltung von pPADHFR-6 mit Bglll und BstXI entsteht, erhalten. Ein 1.141 bp-t-PA- Fragment 3, das die erwünschte Mutation enthält, wurde durch die Spaltung von RF- DNA aus dem t-PA-Mutantenklon M13RF2C9 mit BstXI und BstEII erhalten. Die Fragmente 1 und 2 wurden mit Fragment 3 ligiert. Das DNA-Gemisch wurde dazu verwendet, E.coli zu transformieren, um den eukaryotischen Expressionsvektor pPADHFR-6 2C9 zu ergeben.
Das wie oben und in EP-A-199.574, veröffentlicht am 29. Oktober 1986, hergestellte Plasmid pPADHFR-6 2C9 enthält eine DNA-Sequenz, die für eine Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;- Gewebeplasminogenaktivatormutante kodiert. Diese wurde mit Sca 1 und Apa 1 gespalten und das Fragment mit cirka 630 bp, das den Codons 254 bis 466 der Gewebeplasminogenaktivator-DNA-Sequenz entsprach, in an sich bekannter Weise durch SDS-PAGE gereinigt.
Die zwei BglII-Scal- (pUCPAAHD) und Scal-ApaI- (pPADHFR-6 2C9) Fragmente wurden in das große Bgl II (bp 531) - Apa 1- (1.926 bp) Fragment aus dem gespaltenen pUCPAAHD ligiert und das resultierende Plasmid, das die Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA-Mutanten-DNA enthielt, in herkömmlicher Weise in kleinem Maßstab gescreent. Das resultierende Plasmid wurde wie oben in DHFR-lose CHO-Zeilen eingebracht und amplifiziert und die entsprechende t-PA-Mutante zur Verwendung abgetrennt.

Beispiel 4

Charakterisierung der t-PA-Kohlenydratstruktur

Die Aminosäuresequenz von t-PA enthält vier potentielle Stellen für N-gebundene Glykosylierung [Asn-X-Ser/Ihr; Ann. Rev. Biochem. 41, 673 (1972)]. Es handelt sich um die Asparaginreste 117, 184, 218 und 448. Es stellte sich allerdings heraus, daß die Position 218 in t-PA nicht glykosyliert ist. Position 184 ist in t- PA vom Typ I glykosyliert, in t-PA vom Typ II jedoch nicht [Biochemistry 23, 3701 (1984)].
Die Gelfiltrationschromatografie von mit Pronase gespaltenem rt-PA zeigte zwei Klassen N-gebundener Oligosaccharide auf (nachstehende Tabelle 1). Die Zusammensetzung des höhermolekularen Materials stimmte mit fucosylierten Oligosacchariden der komplexen Art überein. Das niedermolekulare Material wies die für ein kleines mannosereiches Oligosaccharid erwartete Zusammensetzung auf (wahrscheinlich Man6GlCNAc&sub2;).
Die Befestigungsposition des mannosereichen Oligosaccharids wurde durch Verwendung von glykosidischen Enzymen mit unterschiedlichen Spezifitäten bestimmt.
Die verwendeten Enzyme waren Endo-β-N-Acetylglucosaminidase H (Endo H; Genzyme, Inc.), die mannosereiche Oligosaccharide entfernt, doch keine Wirkung auf Oligosaccharide der komplexen Art ausübt, und Peptid-N-Glycosidase F (N-Glycanase; Genzyme, Inc.), die sowohl mannosereiche als auch Oligosaccharide der komplexen Art entfernt. Der für diese Versuche verwendete t-PA war mit Plasmin in die Zweikettenform umgewandelt und dann reduziert und carboxymethyliert worden.
Die SDS-PAGE löste reduzierten carboxymethylierten Zweiketten-rt-PA in Kringle vom Typ I (Glykosylierung an 117 und 184), Kringle vom Typ II (Glykosylierung bei 117) und Protease (Glykosylierung bei 448) auf. Die N-Glycanase-Spaltung von t-PA bewirkt, daß die Kringle-Banden an einer Position mit etwas größerer Mobilität als Kringle vom Typ II zusammenwachsen, und bewirkt weiters eine verstärkte Mobilität der Protease (Spalte 2, Fig.2). Die Endo H-Spaltung von t-PA verstärkt die elektrophoretische Mobilität jeder Kringle-Bande, übt aber keinen Einfluß auf die Mobilität der Protease- Bande aus (Spalte 4, Fig.2). Das Endo H-Ergebnis zeigt auf, daß die Kringle-Bereiche sowohl vom Typ I als auch II jeweils ein mannosereiches Oligosaccharid enthalten; dieses muß sich an Rest 117 befinden, der einzigen Position, die sowohl im Typ I- als auch in Typ II-Kringle-Bereich glykosyliert ist. Die Endo H-Behandlung wandelt Kringle vom Typ I nicht in Kringle vom Typ II um; daher enthält Rest 184, der in Typ I-, aber nicht in Typ II-Kringle glykosyliert ist, ein komplexes Oligosaccharid. Position 448 muß demnach ebenfalls eine komplexe Struktur enthalten, da die N-Glycanase-Behandlung die Mobilität des Protease-Abschnitts von rt-PA steigert, während Endo H keine Wirkung zeigt. Tabelle I Kohlehydratzusammensetzung von Oligosaccharidfraktionen aus mit Pronase gespaltenem t-PA
Abkürzungen: Fuc Fucose; Man = Mannose; Gal = Galactose; GlcNAc = N-Acetylglucosamin; Sia = Sialinsäure
b Thiobarbitursäureassay
c Normiert auf 3 Mannose
d Normiert auf 2 GlcNAc

Beispiel 5

Endo H-Behandlungs-t-PA

Endo-β-N-Acetylglucosaminidase H (Endo H) stammte von Genzyme, Incorporated. Endo H entfernt N-gebundene Oligosaccharide des mannosereichen Typs, betrifft aber keine Oligosaccharide der komplexen Art. Eine SDS-PAGE wurde nach dem Verfahren von Laemmli, Nature 227, 680 (1970) durchgeführt. 0,8 mg menschlicher Gewebeplasminogenaktivator (hergestellt wie in EP-A-93.619, s.o.) (in 0,2 ml Formulierungspuffer, der aus 0,2 M Argininphosphat, pH 6, mit 0,01% Tween 80 besteht) wurde mit Endo H (0,1 Unit in 0,05 ml 25 mM Natriumphosphat, pH 6) und Natriumazid (0,02%) vermischt. Die Probe wurde 20 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Eine menschliche Gewebeplasminogenaktivator-Vergleichsprobe wurde hergestellt und in gleicher Weise inkubiert, außer daß Natriumphosphatpuffer (0,05 ml 25 mM) statt der Endo H-Lösung verwendet wurde. Nach der inkubation wurden die Proben mit Formulierungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 0,75 ml verdünnt und gegen den gleichen Formulierungspuffer gründlich dialysiert. Die Proben wurden filtriert (0,4 µm HV-Filter, Amicon) und bei 4ºC gelagert.
Die Deglykosylierung wurde durch SDS-PAGE nach Reduktion und Carboxymethylierung überprüft. Aliquote des so hergestellten menschlichen Gewebeplasminogenaktivators (0,05 mg in 0,01 ml Formulierungspuffer) wurden mit 25 mM Natriumphosphat, pH 6, (0,01 5 ml) und 2 x Laemmli-Probenpuffer, der 20 mM Dithiothreitol (0,025 ml) enthält, gemischt. Die Proben wurden 5 Minuten lang auf 95ºC erhitzt und abgekühlen gelassen. Iodessigsäure (0,015 ml einer 0,67 M Lösung in 1 N NH&sub4;OH) wurde zugegeben und die Proben im Dunkeln 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die reduzierten carboxymethylierten Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert.
Bei dieser Analyse wird der Vergleich, unbehandelter menschlicher Zweiketten- Gewebeplasminogenaktivator, in drei Hauptbanden aufgelöst, die Kringle vom Typ I (Glykosylierung an den Positionen 117 und 184), Kringle vom Typ II (Glykosylierung an Position 117) und Protease (Spalte 1, Fig. 1) entsprechen. Die Endo H-Spaltung von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator erhöht die elektrophoretische Mobilität jeder Kringle-Bande, beeinflußt aber nicht die Mobilität der Proteasebande (Spalte 2, Fig.1). Die neutrale und Aminozuckerzusammensetzung von mit Endo H behandeltem t-PA ist in Tabelle 2 veranschaulicht. Die Endo H-Behandlung verringerte den Mannosegehalt um 5,6 Reste pro Mol und den N-Acetylglucosamingehalt um 0,9 Rest pro Mol. Dieses Ergebnis stimmt mit der stöchiometrischen Entfernung des mannosereichen Oligosaccharids von Position 117 überein.
Die fibrinolytische Aktivität von mit Endo H behandeltem menschlichem Gewebeplasminogenaktivator wurde durch den in vitro-Gerinnsellyse-Assay von Collen et al., J. Clin. Path. 21, 705 (1968) untersucht. Die Aktivität von mit Endo H behandeltem menschlichem Gewebeplasminogenaktivator war vom unbehandeltem Vergleich in diesem Assay nicht zu unterscheiden.
Die menschlichen Gewebeplasminogenproben wurden durch das Iodobead-Verfahren [Markwell, Anal. Biochem. 125, 427 (1982)] auf eine spezifische Aktivität von etwa 2 µCi/µg iodiert. Der durchwegs verwendete Puffer bestand aus Arginin, 0,2 M, und Citrat, 0,1 M (pH 6) sowie Tween 80, 0,010/0. Alle Proben wurden vor der lodierung gegen diesen Puffer dialysiert. Der pH-Wert wurde vor der Iodierung mit Tris-Base auf 8,2 eingestellt. Das Iodierungsgemisch wurde über eine mit einem Puffer mit pH 6, äquilibrierte PD-10-Säule (Pharmacia) geschickt, die radioaktiven Fraktionen aus dem Ausschlußvolumen wurden gesammelt, eine SDS-PAGE durchgeführt und das getrocknete Gel autoradiografiert. Die Autoradiografie der markierten menschlichen Gewebeplasminogenaktivatoren zeigte, daß mehr als 95% der Radioaktivität in menschlichen Gewebeplasminogenaktivator eingebaut war.
Jeder markierte menschliche Gewebeplasminogenaktivator wurde mit unmarkiertem Material in einem Verhältnis von 1:200 (markiert:unmarkiert, Gew./Gew.) vermischt und intravenös als Bolus in Kaninchen injiziert, die einen Arterienkatheter im Ohr aufwiesen. Jedes Kaninchen erhielt 1 mg/kg nicht markierten und 10 µCi/kg markierten menschlichen Gewebeplasminogenaktivator. Der nicht markierte menschliche Gewebeplasminogenaktivator wurde als Träger für die Spurenmenge an markiertem menschlichem Gewebeplasminogenaktivator verwendet, um therapeutische Werte zu erzielen und Änderungen der Pharmakokinetik zu verhindern, die sich aus einer Konzentrationsabhängigkeit in den Ausscheidungswegen ergeben würden. Serien proben arteriellen Blutes wurden über eine Zeitspanne von 26 Minuten gesammelt und sofort in Röhrchen gefüllt, die ein lyophilisiertes Gemisch von D-phe-pro-arg-Chlormethylketen (PPACK) und EDTA mit Endkonzentrationen von 1 µM bzw. 4,8 mM enthielten. Die Röhrchen wurden auf Eis gegeben und das Plasma abgetrennt. Die mit Trichloressigsäure (TCA) ausfällbare (intakter menschlicher Gewebeplasminogenaktivator) und die gesamte Radioaktivität wurden in jeder Plasmaprobe gemessen. Der immunreaktive menschliche Gewebeplasminogenaktivator wurde auch durch ein Sandwich-ELISA- Verfahren, das polyklonale Antikörper einsetzte und eine wirksame Empfindlichkeit von zumindest 30 ng/ml aufwies, gemessen.
Die Daten über den Zeitverlauf der Plasmakonzentrationen waren für ein zweiteiliges Modell der Bolusinjektion unter Anwendung eines interaktiven Kurvenausgleichsverfahrens geeignet, die sich des Reste-Verfahrens bedient (Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2. Ausgabe, New York, MArcel Dekker, Inc., S.434-444 [1982]). Die folgende Exponentialgleichung wurde verwendet: Cp = Ae-αt + Be-βt, worin Cp die Konzentration von rt-PA im Plasma zu jedem Zeitpunkt ist, t und A und B die y- Abschnitte der schnellen und langsamen Ausscheidungsphasen sind, die Neigungen von α bzw. β aufweisen. Die t1/2 für die α- und β-Phasen wurden als Verhältnis In2/Neigung errechnet. Die Ergebnisse aus dem Kurvenausgleichsverfahren wurden als erste Näherungen verwendet, um die Daten an ein Biexponentialverfahren unter Verwendung von PC NONLIN anzupassen. Ein Datensatz (Fig.4) konnte nicht mittels PC NONLIN angepaßt werden, weshalb die Daten aus dem Kurvenausgleichsverfahren verwendet wurden. Co, die Plasmakonzentration zum Zeitpunkt null, war die Summe von A und B. V&sub0; wurde als durch C&sub0; dividierte Dosis errechnet. Die Fläche unterhalb der Kurve (AUC) wurde durch die Formel AUC = A/α + B/β bestimmt. In jedem Fall machte die extrapolierte Fläche weniger als 20% der gesamten AUC aus. AUC wurde verwendet, um die Ausscheidung mithilfe der Formel: Ausscheidung = Dosis/AUC zu errechnen. Die relativen Verteilungen der α- und β-Phasen wurden anhand der folgenden Formeln errechnet:
%AUCα = A/α / AUC × 100
%AUCβ = A/β / AUC × 100
Die Daten für Tabelle 2 wurden an ein Modell mit direkter Eliminierung aus dem zentralen Abschnitt (K&sub1;&sub0;) und Äquilibrierung mit einem peripheren Abschnitt (K&sub1;&sub2; und K&sub2;&sub1;) angepaßt.
Zwei Arten von Daten wurden in den in vivo-Ausscheidungsuntersuchungen mit Kaninchen erstellt. Eine Datengruppe stammt aus dem immunreaktiven menschlichen Gewebeplasminogenaktivator, der ein Maß für die Ausscheidung des nicht markierten Materials sein sollte. Die zweite Datenart ist die mit TCA ausfällbare Radioaktivität, die mehr als 95% des intakten menschlichen Plasminogenaktivators darstellt. Die Kurven der Plasmakonzentration gegen die Zeit aus der Immunreaktivität und den mit TCA gefällten Zählungen wurden an die geeigneten Multiexponentialmodelle angepaßt und die abgeleiteten pharmakokinetischen Parameter verglichen.

Beispiel 6

Mit Periodat behandelter rt-PA

Rekombinanter t-PA (1 mg/min 0,2 M Argininphosphatpuffer, pH 6) wurde in einem Eisbad gekühlt. Natriumperiodat wurde auf eine Konzentration von 10 mM zugegeben und das Gemisch 1 Stunde lang bei 4ºC in Dunkeln gehalten. Glyzerin (100 mM) und Ethanolamin (50 mM) wurden zum Abbrechen der Reaktion zugegeben. Die Probe wurde dann ausgiebig gegen Argininphosphatpuffer (pH 6) dialysiert, durch einen 0,22 µm-Filter (Millipore) filtriert und bei 4ºC gelagert. Natriumperiodat bewirkt die Oxidation von Kohlehydratresten, die benachbarte Hydroxylgruppen enthalten. Die N- gebundenen Oligosaccharide an allen drei Glykosylierungsstellen von rt-PA enthalten Reste, die gegenüber Periodatoxidation anfällig sind. Die neutralen und Aminosäurezusammensetzungen von rt-PA und mit Periodat behandeltem rt-PA sind in Tabelle 2 veranschaulicht. Wie erwartet wurde die Fucose durch die Wirkung von Periodat vollkommen zerstört. Der Abfall des Mannosegehalts stimmte mit der Zerstörung der terminalen Reste des mannosereichen Oligosaccharids an Position 117 und der an 2 gebundenen Reste der Oligosaccharide der komplexen Art an den Positionen 184 und 448 überein. Man beobachtete auch einen gewissen Rückgang der Galactose-Werte, vermutlich als Ergebnis der Oxidation terminaler Galactose-Gruppen (d.h. jener, die nicht mit Sialinsäure substituiert sind).
Die Aminosäureanalyse ohne Reduktion und Carboxymethylierung zeigte, daß Cysteinreste durch die Periodatbehandlung nicht zu Cysteinsäure oxidiert wurden. Nach Reduktion und Carboxymethylierung wurden 34,2 nmol (erwartete Anzahl: 35) Carboxymethylcystein pro nMol rt-PA in der mit Periodat behandelten Probe wiedergefunden. Die Wiederfindung von Methionin im mit Periodat behandelten rt-PA betrug nur 0,9 nMol von 5,0; unbehandelter rt-PA wies einen Wert von 2,5 nmol auf. Mit Reduktion und Carboxymethylierung stieg jedoch die Methioninwiederfindung auf 3,3 und 2,8 nMol für die mit Periodat behandelten bzw. unbehandelten Materialien. Diese Ergebnisse lassen auf die Gegenwart von Methioninsulfoxid in der behandelten Probe schließen. Zwischen dem mit Periodat behandelten und unbehandelten rt-PA (Daten nicht dargestellt) bestand kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Wiederfindung. Die Behandlung mit Periodat änderte die Aktivität des rt-PA nicht signifikant. Die spezifische Aktivität des mit Periodat behandelten rt-PA machte 91 % jener des Vergleichs-rt-PA aus, wie dies durch einen in vitro-Gerinnsellyse-Assay gemessen wurde (Collen, D. et al., J. Clin. Path. 21: 705-707 [1968]).

Beispiel 7

Mannosereiche t-PA-Variante

Chinesische Hamstereierstock-Klon 15B-Zellen (Gottleib, C. et al., J. Biol. Chem. 250: 3303-3309 [1975]) werden mit einem Plasmid cotransfiziert, das für Gewebeplasminogenaktivator und Dihydrofolat-Reductase kodiert, pETPFR (siehe EP- 093.619) sowie mit pSVENEOBa16 (EP-160.457), das ein Protein exprimiert, das Neomycinresistenz verleiht. Klon 158 ist eine CHO-Zellmutante, der das Enzym N- Acetylglucosamin-Transferase 1 fehlt (Gottleib, C. et al., s.o.). Die Cotransfektion in CHO 1 SB-Zellen erfolgt durch Modifikation des Calciumphosphat-Coprezipitationsverfahrens von Graham und Van Der Eb (Graham, F. und Van Der Eb, A., Virology 52: 456-467 [1973]). Plasmid-DNA (2,5 µg) wurde mit Calciumphosphat coprezipitiert und über eine Zeitspanne von 3 Stunden in 106 Zellen eingebracht. Die Zellen wurden anschließend 60 Sekunden lang mit 200/o Glyzerin behandelt und dann mit nichtselektiven Medien versorgt. Nach 2 Tagen wurden die Zellen übertragen und mit selektiven Medien versorgt (Ham F12-DMEM mit G418). Die Zellen wurden 3 Wochen lang gezüchtet und dann in vier 60 mm-Platten übertragen. Beim Erreichen einer Konfluenz von 800/o wurden die Zellen mit einem weiteren selektiven Medium versorgt (Ham F-12 DMEM mit 0, 50, 100 oder 250 nM Methotrexat). Nach 2 Wochen wurden die Zellen durch Grenzverdünnung in 96-Napf-Schalen kloniert. Einzelne Näpfe wurden durch enzymgebundene Immunsorptionsassays (ELISA) hinsichtlich rt-PA untersucht.
Die rt-PA produzierenden Näpfe wurden in 24-Napf-Schalen bis zur Konfluenz gezüchtet und weiter mit 500, 1.000, 3.000 und 10.000 nM Methotrexat amplifiziert. Ein auf 3.000 und 10.000 nM Methotrexat amplifizierter Klon wurde ausgewählt und zur Herstellung der rt-PA-Mutante in größerem Maßstab gezüchtet. Der rt-PA wurde mittels Zinkchelat-Sepharose (chelatbildende Sepharose, Pharmacia) und eines immobilisierten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen Wildform-rt-PA gereinigt. Eine spezifische Aktivität, die der des Wildform-rt-PA ähnelte, wurde durch ein chromogenes Substrat S2251 (Kabi) und einen auf polyklonalen Antikörpern basierenden ELISA bestimmt.
Eine Probe von rt-PA mit mannosereichen Oligosacchariden an allen drei Glykosylierungsstellen wurde durch Exprimieren des Gens für t-PA in der CHO 158- Zellinie gebildet. Der 158-Zellinie fehlt das Glykoprotein verarbeitende Enzym N- Acetylglucosamin-Transferase 1, weshalb es N-gebundene Oligosaccharide der komplexen Art nicht synthetisieren kann. Die neutralen und Aminozuckerzusammensetzungen von in der 15B-Zellinie erzeugtem rt-PA stimmten mit dem Vorhandensein mannosereicher Oligosaccharide an allen drei Glykosylierungsstellen überein (Tabelle 2). Tabelle 2: Kohlehydratzusammensetzung von modifiziertem rt-PA
a Abkürzungen: Fuc = Fucose, Man = Mannose, Gal = Galactose, GLcNAc = N- Acetylglucosamin
b Normiert auf Galactose
c Normiert auf GLcNac

Beispiel 8

Pharmakokinetik von Gewebeplasminogenaktivatorvarianten

Die Plasmazeitverläufe der mit Endo H und Periodat modifizierten Formen von rt-PA sind aus Fig.4 ersichtlich. Beide Behandlungen scheinen die Eliminierung von rt-PA zu verlangsamen. Man beobachtete einen signifikanten Anstieg der t1/2-α nur beim mit Periodat behandelten rt-PA. Sowohl mit Endo H als auch mit Periodat behandelter rt-PA wiesen langsamere Ausscheidungsraten als Vergleichs-rt-PA auf, wobei die Unterschiede das 1,9- bzw. 2,7-fache betrugen. Die Differenz zwischen der Ausscheidungsrate von mit Endo H und Periodat behandeltem rt-PA war signifikant (P< 0,005). Es gab keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich V&sub0; oder t1/2-β (Tabelle 3).
Die übrigen modifizierten Formen von rt-PA waren nicht in Mengen erhältlich, mithilfe derer die Pharmakokinetik mittels der obigen Verfahren charakterisiert werden könnte. Daher wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Materialien nach der Iodierung ermittelt. Eine Einschränkung dieses Verfahrens liegt darin, daß die Eliminierung von markierten und unmarkierten Formen von rt-PA unterschiedlich ist (Fig.7). Die Immunreaktivität und die mit TCA fällbaren Zählungen nehmen mit einem identischen Muster ab, bis etwa 90% der unmarkierten Dosis ausgeschieden sind. Die Kurven gehen dann auseinander, wobei markierter rt-PA langsamer ausgeschieden wird. Die pharmakokinetischen Parameter aus diesen zwei Kurven sind in Tabelle 4 veranschaulicht. Obwohl sich die Werte von V&sub0;, t1/2-α und t1/2-β nicht wesentlich voneinander unterscheiden, sind die relativen Größen von %AUCα: und %AUCβ sowie die Ausscheidungsrate signifikant unterschiedlich.
Um zu bestimmen, ob die pharmakokinetische Analyse mit radiomarkiertem rt-PA die Differenz in der Eliminierung, die bereits aufgezeigt worden war, vorhersagen könnte, wurden mit Endo H und Periodat behandelter rt-PA markiert und ihre Pharmakokinetik bestimmt. Der markierte rt-PA wurde immer gemeinsam mit 1 mg/kg unmodifiziertem rt-PA injiziert. Die Eliminierungsmuster der mit TCA fällbaren Zählungen aus diesen modifizierten rt-PAs sind in Fig.8 dargestellt. Der rt-PA mit mannosereichen Oligosaccharidstrukturen an allen Glykosylierungsstellen, der in der CHO 15B-Zellinie hergestellt wurde, war ebenfalls in diesem Versuch enthalten. Alle vier Formen von rt- PA wiesen ähnliche anfängliche Verteilungsvolumina auf. Wie aus Fig.4 ersichtlich, besitzen die mit Endo H und Periodat behandelten rt-PAs niedrigere Ausscheidungsraten als der Vergleichs-rt-PA; die dominierende Änderung im Eliminierungsmuster des mit Endo H und Periodat behandelten rt-Pa scheint in der relativen Größe der α- und β- Phase zu liegen. Die Ausscheidungsrate des HM-rt-PA war fast zweimal höher. Die deutlichste Änderung in der Ausscheidung des HM-rt-PA scheint auf eine Abnahme der α-Phasen-Halbwertszeit zurückzuführen sein (Tabelle 5).
Die Entfernung des mannosereichen Oligosaccharids an Aminosäurerest 117 durch Endo H und die Oxidation durch Periodat scheinen ähnliche Veränderungen in der Pharmakokinetik zu bewirken. Daher wurde die Gln117-Mutante als weiteres Instrument verwendet, um die Rolle zu bestimmen, die die Glykosylierung an Aminosäure 117 bei der Eliminierung von rt-PA spielen könnte. Fig.5 zeigt, daß diese Mutante ein ähnliches Verhalten aufweist wie andere Formen von rt-PA mit langsamerer Eliminierung. Die Ausscheidungsrate von Gln117 ist mehr als zweimal kleiner als der Vergleich, und man kann eine Verschiebung zu einer ausgeprägteren 13-Phase feststellen. Keine signifikanten Änderungen traten in V&sub0;, t1/2-α: und t1/2-β ein. Tabelle 3. Pharmakokinetik von unmerkiertem. modifiziertem und Wildform-rt-PAa
Alle Daten sind mit dem Mittelwert über der Standardabweichung dargestellt. Wenn eine signifikante Differenz (P< 0,05) zwischen Gruppen durch Varianzanalyse festgestellt wurde, erfolgt ein Student-t-Test, um die Signifikanz zu quantifizieren:
(*)P< 0,01. Die Dosen (mg/kg) für den Vergleich, ENDO und Periodat betrugen 1,0, 0,83 bzw. 0,95.
b ENDO ist mit Endo H behandelter rt-PA. Periodat ist mit Natriumperiodat behandelter rt-PA.
c Mikrokonstante K&sub1;&sub0;, K&sub1;&sub2; und K&sub2;&sub1; (min&supmin;¹ x 10³). Tabelle 4: Pharmakokinetik von markiertem und unmarkiertem Wildform-rt-PAa
a Alle Daten sind mit dem Mittelwert über der Standardabweichung dargestellt.
(*) p < 0,01 durch zwei gekürzte Student-t-Tests.
b Abkürzungen sind immunreaktiver rt-PA (IR) und mit Trichloressigsäure ausfällbare Radioaktivität (TCA). Die Dosen betrugen 1 mg/kg und 3,4 µCi/kg für IR bzw. TCA. Tabelle 5: Pharmakokinetische Parameter von mit Endo-H oder Periodat behandeltem markiertem rt-PA und mamosereichem rt-PAa
a Alle Daten sind mit dem Mittelwert über der Standardabweichung dargestellt.
Bezüglich der Erklärung der statistischen Analyse siehe Tabelle 2.
b Der Vergleich ist rt-PA der Wildform; Periodat ist mit Natriumperiodat behandelter rt- PA; HM ist in der CHO 15B-Zellinie gebildeter mannosereicher rt-PA; ENDO ist mit Endo H behandelter rt-PA. Alle Dosen waren 10µCi/kg.
Die Pharmakokinetik von Glutamin117-t-PA und menschlichem Vergleichs-t-PA ist in Fig.5 dargestellt. Der Glutamin117-t-PA wird viel langsamer als der Vergleich ausgeschieden.
Ein ähnliches Profil weist der Glutamin117Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA auf, der wie in Beispiel 3 hergestellt wurde (siehe Fig.6).

Fibrinbindeeigenschaften

Die Fibrinbindung ist ein extrem wichtiger Faktor, der vermutlich direkt mit der Fibrinspezifität, die menschlicher Gewebeplasminogenaktivator in vivo besitzt, zusammenhängt. Die Fibrinbindung des mit Endo H behandelten menschlichen Gewebeplasminogenaktivators wurde durch zwei Verfahren bewertet. Das erste umfaßte das Einfangen von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator durch Fibrin, mit dem ein Napf in einer Standardmikrotiterschale beschichtet ist; jeder Napf wird dann gewaschen und eine Lösung aus Plasminogen und einem chromogenen Substrat für Plasmin (S-2251, Kabi) zugegeben. Die sich bildende Farbe ist proportional zur Menge des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators, der im Anfangssch ritt eingefangen wird (Angles-Cano, Thrombosis and Haemostasis, 54, 171 (1985). Die zweite Art von Assay auf Fibrinbindung mißt die Menge des in Lösung verbleibenden menschlichen Gewebeplasminogenaktivators (durch ELISA), wenn Thrombin einer Lösung von plasminogenfreiem Fibrinogen und menschlichem Gewebeplasminogenaktivator zugegeben wird (Rijken et al., J. Bio. Chem. 257: 2920 (1982). Es ist derzeit unklar, welcher Assay die in vivo-Konsequenzen geänderter menschlicher Gewebeplasminogenaktivator-Fibrinbindung in adäquater Weise vorhersagt. Auf der Grundlage der Daten aus jedem Assay können die Anmelder den Schluß ziehen, daß der mit Endo H behandelte menschliche Gewebeplasminogenaktivator zumindest eine unveränderte, wenn nicht verbesserte Fibrinspezifität aufweist.
In ähnlicher Weise zeigten Fibrinbindungs-Versuchsdaten von Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA (Beispiel 3), daß der Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA Ähnlichkeiten mit Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA aufwies und dem t-PA-Vergleich hinsichtlich Fibrinstimulation und spezifischer Aktivität überlegen war.

Beispiel 9

Fibrinolytische Aktivität der t-PA-Variante Gln&sub1;&sub1;&sub7;Met&sub1;&sub1;&sub9;
Die wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben hergestellten gln&sub1;&sub1;&sub7;- und met&sub1;&sub1;&sub9;-Mutanten werden jeweils hinsichtlich fibrinolytischer Aktivität getestet, wobei ähnliche Ergebnisse wie beim mit Endo H behandelten Material (siehe oben) erzielt werden. Die Pharmakokinetik jeder Mutante ähnelt auch jener des mit Endo H behandelten Materials im Vergleich mit menschlichen Vergleichs-Gewebeplasminogenaktivatoren (siehe oben).

Beispiel 10

Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen zu bilden, wodurch das menschliche Gewebeplasminogenaktivatorprodukt in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung einschließlich anderer menschlicher Proteine, z.B. des menschlichen Serumalbumins, sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben, welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des vorliegenden Proteins gemeinsam mit einer geeigneten Menge eines Vehikels, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen, die für eine wirksame Verabreichung an den Wirten geeignet sind.
Beispielsweise kann der vorliegende menschliche Gewebeplasminogenaktivator parenteral an Patienten verabreicht werden, die an kardiovaskulären Erkankungen oder Zuständen leiden. Die Dosierung und die Dosierungsrate können jenen entsprechen, die derzeit in klinischen Untersuchungen anderer kardiovaskulärer thrombolytischer Mittel angewendet werden, z.B. etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht als intravenöse oder intraarterielle Dosis in einem Zeitraum von 1,5-12 Stunden bei Patienten, die an Myokardinfarkt, Lungenembolie usw. leiden.
Als ein Beispiel einer geeigneten Dosierungsform kann ein Fläschchen mit 50 mg menschlichem Gewebeplasminogenaktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 mit 50 ml sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert und mit einem geeigneten Volumen einer 0,9% Natriumchloridinjektion vermischt werden.
Der menschliche Gewebeplasm i nogenaktivator mit verlängerter oder verkürzter Halbwertszeit kann für rasche intravenöse Injektionen geeignet sein. Dies macht komplexe Verabreichungsverfahren überflüssig und die Anwendungsmöglichkeiten von t-PA in Umgebungen mit beschränkter medizinischer Ausrüstung wie z.B. in Rettungswagen mit Sanitätern erweite. Eine verlängerte Halbwertszeit eines Gewebeplasminogenaktivators kann auch niedrigere, sicherere Anfangsdosen ermöglichen und könnte thrombolytisch wirksame Plasminwerte bis zu 45 Minuten oder länger aufrechterhalten. Eine längere Halbwertszeit des Gewebeplasminogenaktivators könnte sich auch für Langzeittherapien mit niedrigen Dosen, die zur Verhinderung des Wiederverschlusses nach erfolgreicher akuter Thrombolyse notwendig sind, oder für Langzeitthrombolyse, die in Fällen peripheren Gefäßverschlusses erforderlich ist, eignen. Eine verkürzte Halbwertszeit von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator könnte bei einigen Patienten die erwünschte Art von Thrombolysetherapie sein, indem wirksame Plasminwerte über kürzere Zeiträume aufrechterhalten werden.
Obwohl sich die vorliegende Beschreibung auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen bezieht, beachte man, daß die Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß zahlreiche Modifikationen der geoffenbarten Ausführungsformen möglich sind und daß solche Modifikationen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen.

Claims

1. Menschliche t-PA-Variante mit einer Kohlehydratstruktur, die durch die Substitution komplexer Oligosaccharide durch mannosereiche Oligosaccharide modifiziert ist, die im wesentlichen ihre gesamte biologische Aktivität beibehält und die eine verkürzte in vivo-Halbwertszeit aufweist.

2. Menschliche t-PA-Variante nach Anspruch 1, die substituierte, mannosereiche Oligosaccharide an Position 448, und an Position 184 im Fall von t-PA vom Typ 1, sowie die mannosereichen Oligosaccharide an Position 117 aufweist.

3. Menschliche t-PA-Variante nach Anspruch 1 oder 2, die sich zusätzlich in einer oder mehreren Aminosäuren in der Gesamtsequenz unterscheidet.

4. Menschliche t-PA-Variante nach Anspruch 3, die ein einkettiger menschlicher Gewebeplasminogenaktivator ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine menschliche t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 4 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

6. Verfahren zur Herstellung einer menschlichen t-PA-Variante, die im wesentlichen ihre gesamte biologische Aktivität beibehält und eine verkürzte in vivo-Halbwertszeit aufweist, umfassend das Modifizieren der Kohlehydratstruktur eines menschlichen t-PA, um komplexe Oligosaccharide durch mannosereiche Oligosaccharide zu substituieren.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die t-PA-Variante substituierte, mannosereiche Oligosaccharide an Position 448, und an Position 184 im Fall von t-PA vom Typ 1, sowie die mannosereichen Oligosaccharide an Position 117 aufweist.

8. Verfahren zur Herstellung einer menschlichen t-PA-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend das Transformieren einer Säugetierwirtszelle, die keine Glykoproteine mit komplexen Kohlehydratsubstituenten bilden kann, mit für einen t-PA kodierender DNA, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen der Variante aus einer Kultur der Zellen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin den Wirtszellen das Enzym N-Acetylglucosamin- Aminotransferase fehlt.