DD289543A5 - Neue pharmakologisch-aktive cyclopeptide und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

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DD289543A5
DD289543A5 DD32853389A DD32853389A DD289543A5 DD 289543 A5 DD289543 A5 DD 289543A5 DD 32853389 A DD32853389 A DD 32853389A DD 32853389 A DD32853389 A DD 32853389A DD 289543 A5 DD289543 A5 DD 289543A5
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cyclopeptides
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Klaus Neubert
Ralf Schmidt
Alfred Barth
Bianka Hartrodt
Siegfried Hoffmann
Claus Liebmann
Uwe Schrader
Jutta Bergmann
Gisela Grecksch
Heide-Linde Ruethrich
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Univ Halle Wittenberg
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung neuer pharmakologisch-aktiver Cyclopeptide, vorzugsweise vom Casomorphin-Typ, in denen der Ringschlusz bei unveraendertem N-Terminus der Peptidkette ueber die entsprechenden Seitenkettenfunktion der Aminosaeure in Position 2 mit der C-terminalen Aminosaeure ueber eine Peptid- oder Esterbindung erfolgt. Die erfindungsgemaesz erhaltenen Cyclopeptidwirkstoffe zeichnen sich vor allem durch eine hohe analgetische Aktivitaet und Stabilitaet gegenueber enzymatischem Abbau aus und sind fuer die pharmazeutische Industrie, klinische Pharmakologie und Medizin von Bedeutung. Sie eignen sich als neuartige Wirkkomponenten in Human- und Tierarzneimitteln.{Cyclopeptide; Herstellung; Casomorphintyp; Peptidbindung; Esterbindung; Analgesie; Stabilitaet; Pharmakologie; Medizin; Arzneimittel}

Description

X-B-C-D-E-S (II)
X-A-B-C-D-E-S (lll)(
wobei A, B, C, D, E wie oben definiert sind, X eine a-Aminoschutzgruppe, bevorzugt tert.Butyloxycarbonyl und S = OH, aktivierte Ester, vorzugsweise 4-Nitrophenylester, Pentafluorphenylester, oder Hydrazid bedeuten, durch Verknüpfung der w-Amino- bzw. der Hydroxygruppe der Aminosäure B und der a-Carboxylgruppe der Aminosäure E erfolgt, wobei für den Fall B = Lysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure in der L- oder D-Konfiguration die Cyclisierung mit Hilfe von !^,N'-Dicvclohexylcarbodiimid/Additiva (bevorzugt 1-Hydroxybenzotriazol), wasserlöslichen Carbodiimiden/Additive (bevorzugt 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyDcarbodiimid · HCI/1-Hydroxybenzotriazol), Esteraminolyse, dem Azid-Verfahren und vorzugsweise mit2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumsalzen oder Diphenylphosphorylazid als Aktivierungsreagenzien und für den Fall B = Hydroxyprolin, Hydroxypipecolinsäure in der L- oder D-Konfiguration die Cyclisierung zu den entsprechenden Lactonen mit Hilfe von ^N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-Tetramethyluroniumsalzen jeweils in Gegenwart von 4-Dimethylaminopyridin als katalysator oder nach verschiedenen Varianten der Säurechloridmethode durchgeführt wird, die für X eingesetzte a-Aminoschutzgruppe mit den in der Peptidchemie üblichen Deblockierungsverfahren, für die bevorzugte tert.Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe durch Acidolyse, entfernt wird und danach das aus Formel Il resultierende cyclische Tetrapeptid H-cyclo [B-C-D-E-] mit A nach den in der Peptidchemie üblichen Kupplungsmethoden, bevorzugt nach dem Mischanhydrid-Verfahren verlängert wird, wobei A, B, C, D und E wie oben ausgewiesen, definiert sind.
2. Verfahren zur Herstellung neuer pharmakologisch-aktiver Cyclopeptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daßdie Verbindungen derallgemeinen Formel I und/oder deren Derivate und/oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze und/oder deren Metallkomplexe als solche oder wahlweise bzw. zweckgebunden mit bekannten Pharmaka, vorzugsweise Analgetika und/oder Kardiotonika, kombiniert werden und ihr Wirkprofil in Abhängigkeit der Dosierung und durch gezielte Strukturmodifikation moduliert wird.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Entwicklung neuer pharmakologisch-aktiver Cyclopeptide. Die erfindungsgemäß dargestellten Cyclopeptide, vorzugsweise cyclisch-verzweigte Peptide vom Casomorphin-Typ, zeichnen sich im Vergleich zu den entsprechenden linearen Peptiden durch eine signifikante Potenzierung und Prolongierung ihrer Opiataktivität aus und besitzen eine hohe Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau. Darüber hinaus kann das Wirkungsspektrum der erfindungsgemäß dargestellten Cyclopeptidwirkstoffe durch gezielte Strukturmodifikation moduliert werden. Die Erfindung ist zur Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin und klinischen Pharmakologie von Bedeutung.
-2- 289 543 Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Bekannt ist, daß durch Cyclisierung linearer Peptidwirkstoffe bzw. entsprechender Analoga u.a. Bradykinin, Gonadoliberin, Somatostatin Cyclopeptidwirkstoffe mit hoher Stabilität gegenüber enzymatischem Abbau, teilweise mit höherer Wirkung, erhalten werden können (vgl. D. H. Coy et al., Central Nervous System Effect of Hypothalamic Hormones and other Peptides (Eds. R. Colley et al.), Raven Press, New York, 1979,317; D. F. Veber et al., Nature 292 (19811,55; K. Neubert et al., DDR-Patent C07 C103/52 No. 150199,1980; Y. Ovchinnikov et al.. Peptides 1982, Proc. 17th Europ. Peptide Symp. Prag, 1982 (Eds. K. Blaha, P. Malon], Walter de Gruyter & Co, Berlin, 1983,1).
Diese Untersuchungen wurden in den letzten Jahren auch auf Opiatpeptide des Enkephalin-Typs ausgedehnt. Dabei ist man von zwei Strategien ausgegangen. Die erste Gruppe umfaßt Cyciopeptide, boi denen der Ringschluß über die Seitenkette der Aminosäure in Position 2 mit dem C-Terminus des Peptides unter Knüpfung von Peptid- als auch Esterbindungen erfolgt (vgl. J.DiMaio et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA77 [1980], 7162; C.Zechel, K.Kessler und R.Geiger, Peptides: Structure and Function [Eds. CM. Deber, V.J. Hruby, K. D. Kopple], Pierce Chem. Corp., Rockford, III. 1985,507). Dazu gehören auch cyclische Enkephalinanaloga mit modifizierten Peptidbindungen bzw. retro-inverso Peptidbindungen, die sich durch eine Wirkungspotenzierung bei bevorzugter μ-Opiatrezeptorselektivität und erhöhter Stabilität gegenüber enzymatischem Abbau auszeichnen (vgl. J. V. Edwards et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 136 [1986], 730; J. M. Berman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 115 [1983], 864).
Die zweite Gruppe umfaßt Cyciopeptide, bei denen die Ringschlußreaktion über Isopeptidbindungen zwischen w-Amino- und Carboxylgruppen basischer und saurer Aminosäuren in den Positionen 2 und 4 bzw. 5 des Enkephalin-Moleküls erfolgt. Diese cyclischen Enkephalin-Analoga zeichnen sich durch eine hohe μ-Opiatrezeptorselektivität aus (vgl. P.W. Schüler et al., J. Med. Chem. 30 [1987], 2094). Zu dieser Gruppe gehören auch Cyciopeptide mit Cystein bzw. Penicillamin (ß,ß-Dimethylcystein) in Position 2 und 5 des Enkephalin-Moleküls und Ringschluß über eine Disulfidbrücke (vgl. P.W. Schüler et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 101 [1981], 337; H.I.Mosberg et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 [1983], 5871; J.Sarantakis, US-Patent No.4148786,1979). Diese Verbindungen besitzen eine ausgeprägte δ-Opiatrezeptorselektivität.
Die Darstellung der Cyciopeptide erfolgte sowohl durch konventionelle Synthese als auch mittels der Festphasentechnik und anschließender Cyclisierung der linearen Vorstufen mit den dafür in der Peptidchemie bekannten Techniken (vgl. E. Wünsch, Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/11 [Ed. E.Müller], Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart, 1974).
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer, p'<armakologisch wirksamer Cyclopeptidwirkstoffe, vorzugsweise cyclisch-verzweigter Peptide des Casomorphin-Typs, mit im Ve gleich zu den entsprechenden linearen Peptiden signifikant verbesserten Eigenschaften, insbesondere einer bemerkensweiten Potenzierung und Prolongierung ihrer analgetischen Wirkpotenz, einer Erhöhung ihrer Stabilität gegenüber proteoly ischem Abbau, einer Verbesserung ihrer Penetrationsfähigkeit und Bioverfügbarkeit am Wirkort und einer Modulierung ihres Wirkprofils u. a. in Abhängigkeit der Dosierung und durch gezielte Strukturmodifikation zu entwickeln, wobei diese so hergestellten Cyciopeptide als solche oder wahlweise bzw. zweckgebunden mit anderen Pharmaka als Kombinationspräparate in der Medizin von Bedeutung sind.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue pharmakologisch-aktive Cyciopeptide, vorzugsweise cyclisch-verzweigte Peptide der Casomorphin-Reihe, zur Verfügung zu stellen, in denen der Ringschluß bei unverändertem N-Terminus der Peptidkette über die Seitenkettenfunktion der Aminosäure in Position 2 mit der C-terminalen Aminosäure über eine Peptid- oder Esterbindung erfolgt und bei denen zur Erhöhung der Stabilität gegenüber enzymatischem Abbau und zur Verstärkung und Prolongierung ihrer Opiataktivität in einor oder mehreren Positionen der Peptidkette D-Aminosäuren eingebaut werden. Die erfindungsgemäß erhaltenen Cyclopeptidwirkstoffe weisen u.a. folgende Vorteile auf:
1. Einfache Struktur
2. Hohe Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau
3. Wirkungspotenzierung und -Prolongierung u.a. durch gezielte Strukturmodifikation
4. Modulierung der Wirkungsparameter in Abhängigkeit der Dosierung und mittels Strukturmodifikation
5. Günstige physikalisch-chemische Parameter im Sinne einer hohen Penetrierfähigkeit
6. Hohe Bioverfügbarkeit am Wirkort
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß cyclisch-verzweigte Peptide, vorzugsweise vom Casomorphin-Typ der allgemeinen Formel I
A-cyclot-B-C-D-E] (I)
synthetisiert werden, wobei die Ringschlußreaktion über eins Peptid- oder Esterbindung erfolgt und A, B, C, D und E wie folgt definiert sind:
A = Tyrosin, N-Alkyl- (bevorzugt N-Methyl-)Tyrosin, Phenylalanin in der L- Konfiguration, B = Hydroxyprolin, Hydroxypipecolinsäure, Lysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure in der L- oder D-Konfiguration, C = Phenylalanin, N-Alkyl- (bevorzugt N-Methyl-)Phenylalanin, Homophenylalanin, Tyrosin, N-Alkyl- (bevorzugt N-
Methyl-JTyrosin, O-Benzyl-Tyrosin in der L-Konfiguration, D = Prolin, Pipecolinsäure in der L-oder D-Konfiguration E = alle proteinogenen Aminosäure , in der L-Konfiguration, vorzugsweise Glycin.
Einige bevorzugte Verbindungen sind die nachfolgend angeführten cyclisch-verzweigten Peptide der Struktur:
Tyr-cyclot-D-Lys-Phe-P.o-Gly-]
Tyr-cycloi-D-Lys-Phe-D-Pro-Gly-]
Tyr-cycloi-D-Orn-Phe-Pro-Gly-]
Tyr-cycloi-D-Orn-Phe-D-Pro-uly-)
Tyr-cycloi-D-Dab-Phe-Pro-Gly-]
Tyr-cycloi-D-Dab-Phe-D-Pro-Gly-]
Die Darstellung der erfindungsgemäßen Cyclopeptidwirkstoffe erfolgte auf zweierlei Wegen: Die erste strategische Variante zur Herstellung der Cyclopetide der allgemeinen Formel I erfolgt ausgehend von H-E-T durch schrittweise Verlängerung mit X-D-Z, X-C-Z und X-B(Y)-Z, worin B, C, D und E wie zuvor definiert sind und T, X und Y für in der Peptidchemie gebräuchliche Carboxy-, α-Amino-, w-Amino- bzw. Hydroxyschutzgruppen stehen, T bevorzugt für 4-Nitrobenzyl- oder Methylester, X bevorzugt für tert. Butyloxycarbonyl, Y bevorzugt für Benzyloxycarbonyl für den Fall B = Lysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure oder Benzyl für den Fall B = Hydroxyprolin, Hyd.oxypipecolinsäurejeweils in derL- oder D-Konfiguration und Z OH oder Aktivester, bevorzugt Pentafluorphenylester, bedeuten, nach den in der Peptidchemie üblichen Kupplungsmethoden N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid/Additiva (bevorzugt 1-Hydroxybenzotriazole, aktivierte Ester, Mischanhydrid (vgl. E. Wünsch s.o.) oder 2-(1 H-BenzotriazoM-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumsalze (vgl. R.Knorr et al., Abstracts 20th Europ. Peptide Symp., Tübingen, 1988) zu den vollgeschützten Peptiden der allgemeinen Formel Il
X-B(Y)-C-D-E-T (II)
mit B, C, D, E, X, Y, T in der obigen Definition. Vorzugsweise erfolgt der schrittweise Aufbau der Peptide der Formel Il über die Mischanhydridtechnik.
Nach gleichzeitiger oder nacheinander geschalteter Abspaltung der für Y und T eingesetzten Schutzgruppen mit den in der Peptidchemie üblichen Deblockierungsverfahren (vgl. E. Wünsch s. o.), für die oben genannten bevorzugten Schutzgruppenkombinationen P inzyloxycarbonyl/4-Nitrobenzylester, Benzyl/4-Nitrobenzylester durch Hydrogenolvse bzw. Benzyloxycarbonyl/Methylester, Benzyl/Methylester durch Hydrogenolyse und anschließende Verseifung, führt die anschließende Ringschlußreaktion zwischen w-Amino- bzw. der Hydroxygruppe der Aminosäure B und der a-Carboxylgruppe der Aminosäure E zu Cyclopeptiden der allgemeinen Formel III
X-cycloI-B-C-D-E-l (III)
mit B, C, D, E und X in der obigen Definition. Für den Fall B = Lysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure in der L- oder D-Konfiguration kann die Cyclisierung (Amidbindung) mit Hilfe von N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid/Additiva (bevorzugt 1-Hydroxybenzotriazol), wasserlöslichen Carbodiimiden/Additiva (bevorzugt 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid HCI/1-Hydroxybenzotriazol), mit 2-(1 H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumsalzen oder Diphenylphosphorylazid als Aktivierungsreagenzien (vgl. E. Wünsch s. o.; R. Knorr et al. s. o.; S. F. Brady et al., J. Org. Chem. (1979), 3101) bzw. nach Überführung der linearen Vorstufen der allgemeinen Formel X-B(Y)-C-D-E-OH mit B, C, D, E, X und Y in der obigen Definition in die entsprechenden geschützten Tetrapeptidhydrazide bzw. Tetrapeptidaktivester, bevorzugt Nitrophenyl-, Pentafluorphenylester, anschließender Abspaltung der für Y eingesetzten Schutzgruppen mit den in der Peptidchemie üblichen Verfahren, mittels der klassischen Azidmethode bzw. Esteraminolyse erfolgen. Bevorzugte Cyclisierungsvarianten sind die Verfahren mit Diphenylphosphorylazid und 2-(1 H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumsalzen. Für den Fall B = Hydroxyprolin, Hydroxypipecolinsäure in der L- oder D-Konfiguration kann die Cyclisierung zu den entsprechenden Lactonen u.a. mit Hilfe von N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 2-(1 H-Hydroxybenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumsalzen jeweils in Gegenwart von 4-Dimethylaminopyridin als Katalysator oder nach verschiedenen Varianten der Säurechloridmethode (vgl. E.Wünsch s.o.; R.Knorr et al. s.o.) vorgenommen werden. Nach Abspaltung der für X eingesetzten Schutzgruppen mit den in der Peptidchemie üblichen Deblockierungsverfahren (vgl. E. Wünsch s.o.), für die oben bevorzugte Schutzgruppe tert. Butyloxycarbonyl durch Acidolyse (u.a. mittels HCL/Essigsäure; KCL/Essigester; HCL/Dioxan; Trifluoressigsäure), werden die erhaltenen Cyclopeptide der allgemeinen Formel H-cyclo[-B-C-D-E-] mit X-A(W)-Z, worin A, B, C, D, E, X und Z wie oben definiert sind und W für H, Benzyloxycaibonyl, tert. Butyloxycarbonyl, Benzyl oder bevorzugt tert. Butyl steht, nach den in der Peptidchemie oben aufgeführten üblichen Kupplungsmethoden, bevorzugt nach dem Mischanhydrid-Verfahren zu den Cyclopeptiden der allgemeinen Formel IV
X-A(W)-CyCIoI-B-C-D-E-] (IV)
mit A, B, C, D, E, X und W in der genannten Definition verlängert. Die so erhaltenen geschützten cyclisch-verzweigten Peptide der Formel IV werden an einer Kieselgelsäule durch Chloroform/Methanol-Elution bzw. an Sephadex LH-20 (Elutionsmittel Methanol) gereinigt und nach Abspaltung der für X und W eingesetzten Schutzgruppen mit den in der Peptidchemie üblichen Deblockierungsverfahren (vgl. E. Wünsch s.o.), für die oben angeführte bevorzugte Schutzgruppenkombination tert. Butyloxycarbonyl/tert. Butyl durr.h Acidolyse, bevorzugt mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Kationenfängern, anschließender Umkristallisation aus Ethanol/Ether oder Gelfiltration an Sephadex G-10 mit 0,1 M Essigsäure als Elutionsmittel in Cyclopeptide der Formel I überführt.
Die zweite strategische Variante zur Herstellung der Cyclopeptide der allgemeinen Formel I erfolgt ebenfalls ausgehend von H-E-T durch step-by-step-Kondensation mit X-D-Z, X-C-Z, X-B(Y)-Z und X-A(W)-Z, worin A, B, C, D, E, T, W, X, Y, Z auch hinsichtlich bevorzugter Schutzgruppenkombinationon die oben genannte Definition besitzen, nach den in der ersten Synthesevariante aufgeführten Kupplungsmethoden zu den vollgeschützten Peptiden der allgemeinen Formel V
X-A(W)-B(Y)-C-D-E-T iV)
mit A, B, C, D, E, T, W, X, Y in der obigen Definition. Nach Abspaltung der für Y und T eingesetzten Schutzgruppen, wie in der ersten Synthesevariante beschrieben, führt die Cyclisierung nach den oben aufgezeigten Techniken zu geschützten cyclischverzweigten Peptiden gemäß Formel IV, die nach Reinigung uno Abspaltung der für X und W eingesetzten Schutzgruppen unter den in der ersten Synthesevariante beschriebenen Bedingungen in Cyclopeptide der allgemeinen Fo'me11 überführt werden. Die erfindungsgemäß erhaltenen Cyclopeptidwirkstoffe und/oder deren Derivate und/oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze und/oder deren Metallkomplexe können als solche oder wahlweise bzw. zweckgebunden kombiniert mit bekannten Pharmaka in Human- und Tierarzneimitteln enthalten sein. Diese können insbesondere als Analgetika, Kardiotonika, Modulatoren des Immunsystems und zur Förderung der Wundheilung Verwendung finden. Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie einzuschränken.
Ausführungsbelsplele
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Abkürzungen für Aminosäure- und Peptidderivate entsprechend der IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Biochem. J. 219,345(1984)
AcOH Eisessig
Boc tert. Butyloxycarbonyl
BzI Benzyl
CAIBE Chlorameisensäurelsobutylester
DC dünnschichtchromatographisch
DMF N, N'-Dimethy !formamid
DPPA Diphenylphosphorylazid
EE Essigsäureethylester
Fp Schmelzpunkt
h Stunden
i.Vak. im Vakuum
MeOH Methanol
min Minuten
NEM N-Ethylmorpholin
ONb 4-Nitrobenzylester
OPfp Pentafluorphenylester
PE Petrolether
RT Raumtemperatur
tBu tert. Butyl
TEA Triethylamin
TFA Trifluoressigsäure
THf- Tetrahydrofuran
Z Benzyloxycarbonyl
Unttir „üblicher* Aufarbeitung versteht man: Nach beendeter Kupplungsreaktion wird das jeweilige Rohprodukt in EE aufgenommen und die Lösung nacheinander zweimal mit Wasser (NaCI-gesättigt), dreimal mit 5%iger KHSO4-Lösung, einmal mit Wasser und jeweils dreimal mit NaHCOj-Lösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und das Rohprodukt durch Abdampfen des Lösungsmittels i.Vak. isoliert.
Folgende Laufmittelsysteme (in Volumenanteilen) zur Dünnschichtchromatographie auf Silufol-Fertigplatten (Kavalier, £SSR) wurden verwendet:
A Chloroform: Methanol 9:1
B Benzol:Aceton:Eisessig 25:10:0,5
C Essigester:Pyridin:Eisessig:Wasser 90:15:4,5:8,3
D Butan-1-ol:Eisessig:Wasser:Essigester 1:1:1:1
E Butan-2-ol:Ameisensäure:Wasser 75:15:20
F Butan-1-ol:Pyridin:Eisessig:Wasser 30:20:6:24
Die HPLC-Reinheitskontrolle erfolgte an Geräten der Firmen Merck-Hitachi (isokratisch) und Hewlett-Packard (Gradient):
System A-isokratisch:
Säule 250mm χ 4mm, LiChrospher 100RP-8 ΠΟμπι) mobile Phase 0,01 M KH2PO4 pH 3,3/Acetonitril (65:35) System B-Gradient:
Säule 250mm x 4,6mm, LiChrosorb RP-18 (10pm)
mobile Phase A: 0,025M NaH2PO4 pH 3,0 B: Methanol
10% B 0min bis 31 % B in 7,3min
31 % B 7,3min bis 40% B in 4min
Zur Bestimmung der analgetischen Aktivität diente die elektrische Schwanzwurzelreizung an männlichen Wistar-Ratten (vgl. H. Matthies et al., Peptides 5 [1984J, 463). Bestimmt wurde die effektive Dosis für die Verdopplung der Schmerzschwelle ED200 10min nach intracerebroventrikulärer (icv) Applikation der Cyclopeptide. Es ist die relative Aktivität (Morphin = 1) angegeben. Die Ergebnisse sind statistisch abgesichert.
Beispiel I: H-Tyr-cyclof-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly·]
1.1. H.Phe-D-Pro-Gly-ONb · HCI
Der Aufbau des Tripeptids erfolgte ausgehend von 4,93g H-GIy-ONb HCI durch schrittweise Anknüpfung der entsprechenden tert. Butyloxycarbonylaminosäuren nach der Methode der gemischten Anhydride mit Chlorameisensäureisobutylester als Aktivierungsreagenz (vgl. R.A.Boissonnas, HeIv. chim. Acta 3411951], 874). Die Deblockierung der N°-Aminoschutzgruppen erfolgte jeweils mittels 1,1 η HCI/AcOH innerhalb von 30min bei RT.
Ausbeute: 4,92g(5ü%d.Th.bezogenauf H-GIy-ONb- HCI)
Fp: 179-1830C
[a]l°: +115,30Ic = 1,AcOH)
DC: einheitlich in D, E, F
1.2. Bor-D-Orn(Z)-Phe-D-Pro-Gly-ONb
1,1g Boc-D-Orn(Z)-OH, 0,38 ml NEM und 0,39ml CAIBE wurden bei -15°C in 20ml THF gelöst und nach 9min mit 1,47g H-Pha-D-Pro-Gly-ONb · HCI und 0,38ml NEM versetzt. Der Ansatz wurde 1,5h bei -150C und 10h bei RT gerührt und dann wie üblich aufgearbeitet. Das Produkt wurde in EE gelöst und mit PE ausgefällt.
/usbeute: 2,25g (94%d.Th.)
Fp: 64-700C
[a)g°: +62,8° (c- 1,CHCI3)
DC: einheitlich in A, B, C
1.3. Boc-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly-OH
1,5g Boc-D-Orn(Z)-Phe-D-Pro-GIy-ONb wurden in 30ml Me0H/H2O (9:1) gelöst, mit 0,3g Pd/Schwarz versetzt und 6h bei RT hydriert. Anschließend wurde der Katalysator abfiltriert, die Lösung i. Vak. eingeengt und das Produkt mit Ether ausgefällt.
Ausbeute: 0,955g (95%d.Th.)
Fp: 157-1620C
[al§°: +82,0"(C = 0,5,AcOH)
DC: einheitlich in D, E, F
1.4. Boc-cycloI-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly-]
0,53g Boc-D-Om-Phe-D-Pro-Gly-OH, gelöst in 50ml DMF, wurden innerhalb von 8h unter Rühren in eine auf -50C gekühlte Lösung von 0,3ml TEA und 0,55ml DPPA in 450ml DMF gegeben. Der Ansatz wurde 27 h bei -5°C gerührt, anschließend das Lösungsmittel i. Vak. entfernt und das Rohprodukt aus EE/PE umgefällt. Danach wurde das Cyclopeptid durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Merck), Elutionsmittel CHCI3/MeOH (9:1), gereinigt und aus CHCI3/Ether umkristallisiert.
Ausbeute: 0,253g(49%d.Th.)
Fp: 152-1550C
Ia]I0: +50,3°(c = 0,5,AcOH)
DC: einheitlich in A, C, D
1.5. Z-TyriBzO-cyclot-D-Om-Phe-D-Pro-Gly·]
0,19g Z-Tyr(Bzl)-OPfp wurden in 10ml THF/DMF (9:1) gelöst und bei O0C mit 0,15g H-cyclol-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly-) · HCI (erhalten durch Entacylierung von Boc-cyclol-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly-l mittels 1,1 η HCI/AcOH, [a]g° = +69,7° [c = 0,5,AcOH], Fp = 180-1830C) und 50 μΙ TEA versetzt. Der Ansatz wurde * h bei O0C und 12 h bai RT gerührt. Danach wurde die Lösung i. Vak. eingeengt, das Rohprodukt mit EE ausgefällt, auf der Fritte nacheinander mit 5%iger KHSO4-Lösung, Wasser, gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser gewaschen und über P2O6 sorgfältig getrocknet.
Ausbeute: 0,2 g (76% d. Th.)
Fp: 233-2360C
[αΐέ0: +47,3° (c = 0,5, AcOH)
DC: einheitlich in A, C, D
1.6. H-Tyr-cyclot-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly-] · AcOH
0,2g Z-TyrlBzD-cyclol-D-Orn-Phe-D-Pro-Gly-], gelöst in 10ml AcOH/MeOH/H2O (5:5:1), wurden nach Zugabe von 0,1 g Pd/ Schwarz 2,5h bei RT hydriert. Anschließend wurde der Katalysator abfiltriert, die Lösung i. Vak. eingeengt und das Peptid mit Ether ausgefällt.
Ausbeute: 0,14g (89%d.Th.)
Fp: 170-1730C
[a]g°: +50,40C (c = 0,5, MeOH)
DC: einheitlich in D, E, F
Molpeak: berechnet 579 (M+), gefunden 579 (M+)
HPLC-Retentionszeit: System A8,14min System B 7,59min
Relative analgetische Aktivität (Morphin = 1):
Beispiel II: H-Tyi-cyclo[-D-Lys-Phe.Pro-Gly-] · TFA
11.1. H-Phe-Pro-Gly-ONb · HCI
Der Aufbau des Tripeptids erfolgte ausgehend von 4,93g H-GIy-ONb · HCI durch schrittweise Anknüpfung der entsprechenden tert. Butyloxycarbonylaminosäuren nach der Methode der gemischten Anhydride mit Chlorameisensäureisobutylester als Aktivierungsreagenz (vgl. R. A. Boissonnas s. o.J. Die Deblockierung der N°-Aminoschutzgruppen erfolgte jeweils mittels 1,1 η HCI/AcOH innerhalb von 30min bei RT.
Ausbeute: 6,08g (62%d.Th. bezogen auf H-GIy-ONb · HCI)
Fp: 192-1940C
[a)h°: -24,5°(c= 1,AcOH)
.DC: einheitlich in D, E, F
11.2. Boc-D-Lys(Z)-Phe-Pro-Gly-ONb
0,38g Boc-D-Lys(Z)-OH, 127μΙ NEM und 13OpICAIBE wurden bei -150C in 12 ml THFgelöst und nach 10min mit 0,49g H-Phe-Pro-GIy-ONb · HCI und 127μΙ NEM versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei -150C und 3h bei RTgerührt und danach wie üblich aufgearbeitet. Durch Digerieren des Peptids mit η-Hexan wurde ein amorphes Produkt erhalten.
Ausbeute: 0,69g (84 %d. Th.)
Ia)I0: -11,90(c= 1,AcOH)
DC: einheitlich in A, B, C
11.3. Boc-Tyr(tBu)-D-Lys(Z)-Phe-Pro-Gly-ONb
0,26g Boc-Tyr(tBu)-OH, 99μΙ NEM und 108μΙ CAIBE wurden bei -150C in 8ml THF gelöst und nach 10min mit 0,59g H-D-Lys(Z)-Phe-Pro-Gly-ONb · HCI (erhalten durch Entacylierung von Boc-D-Lys(Z)-Phe-Pro-Gly-ONb mittels 1,1 η HCI/AcOH, [a)g° = -28,3° [c = 1, AcOH), Fp = 94-98°C) und 93μΙ NEM versetzt. Der Reaktionsansatz wurde 1,5 h bei -150C und 3 h bei RT gerührt und dann wie üblich aufgearbeitet. Das erhaltene Produkt wurde aus EE/PE umkristallisiert.
Ausbeute: 0,65g (81 %d.Th.)
Fp: 107-1100C
(ojg0: -16,8° (c = 0,5,AcOH)
DC: einheitlich in A, B, C
IU. Boc-Tyr(tBu)-D-Lys-Phe-Pro-Gly-OH
0,64g Boc-TyrltBul-D-LysfZl-Phe-Pro-Gly-ONb, gelöst in 10ml MeOH/H2O (9:1), wurden nach Zugabe von 0,2g Pd/Schwarz 8h hydriert. Anschließend wurde der Katalysator abfiltriert, die Lösung i. Vak. eingeengt und das Produkt mit Ether ausgefällt.
Ausbeute: 0,44g (90%d.Th.)
Fp: 158-162°C
[a)g°: -14,8° (C = 0,5,AcOH)
DC: einheitlich in D, E, F
11.5. Boc-TyrftBuJ-cyclot-D-Lys-Phe-Pro-Gly-J
0,31 g Boc-Tyr(tBu)-D-Lys-Phe-Pro-Gly-OH, gelöst in 50ml DMF, wurden unter Rühren innerhalb von 8h in eine auf -50C gekühlte Lösung von 113 μΙ TEA und 217 μΙ DPPA in 450ml DMF gegeben und 48 h bei -50C gerührt. Danach wurden 50 μΙ TEA sowie 70 μΙ DPPA und nach weiteren 72 h 50μΙ DPPA zugegeben. Der Ansatz wurde noch 48 h bei 40C belassen, danach das Lösungsmittel i. Vak. entfernt und der Rückstand mit Ether ausgefällt. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel 60 (Merck) mit CHCI3/MeOH (9:1) als Elutionsmittel chromatographi6rt. Dann wurde aus EE umkristallisiert.
Ausbeute: 0,173 g (57 %d. Th.)
Fp: 242-244T
[a]g°: +23,0°(c = 0,5,MeOH)
DC: einheitlich in A, C, D
11.6. H-Tyr-cyclof-D-Lys-Phe-Pro-Gly-] · TFA
0,173g Boc-TyrdBuJ-cyclof-D-Lys-Phe-Pro-Gly-] wurden bei 0°C für 1h mit 10ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol versetzt. Das Lösungsmittel wurde dann i. Vak. entfernt und das Produkt mit Ether ausgefällt.
Ausbeute: 0,14g (86%d.Th.)
Fp: 177-181X
Ml0: +21,1°(c = 0,5,MeOH)
DC: einheitlich in D, E, F
Molpeak: berechnet 593 (M+), gefunden 593 (M+)
HPLC-Retentionszeit: System A 8,77 min System B 10,17 min
Relative analgetische Aktivität (Morphin = 1):

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung neuer pharmakologisch-aktiver Cyclopeptide, gekennzeichnet dadurch, daß cyclisch-verzweigte Peptide, vorzugsweise vom Casomorphin-Typ der allgemeinen Formel I
A-cyclo [-B-C-D-E-] (I),
synthetisiert werden, wobei der Ringschluß über eine Peptid- oder Esterbindung erfolgt und A, B, C, D und E wie folgt definiert sind:
A = Tyrosin, N-Alkyl- (bevorzugt N-Methyl-)Tyrosin, Phenylalanin in der L-Konfiguration, B = Hydroxyprolin, Hydroxypipecolinsäure, Lysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure in der
L- oder D-Konfiguration,
C = Phenylalanin, N-Alkyl- (bevorzugt N-Methyl-)Phenylalanin, Homophenylalanin, Tyrosin,
N-Alkyl- (bevorzugt N-Methyl-)Tyrosin, O-Benzyl-Tyrosin in der L-Konfiguration, D = Prolin, Pipecolinsäure in der L-oder D-Konfiguration
E = alle proteinogenen Aminosäuren in der L-Konfiguration, vorzugsweise Glycin und ihre Darstellung aus den durch step-by-step-Kondensation aufgebauten linearen Peptiden der allgemeinen Formeln Il und III
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5817749A (en) * 1993-03-29 1998-10-06 Dupont Pharmaceuticals Company Processes and intermediate compounds for the preparation of platelet glycoprotein IIb/IIIa inhibitors

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