DD290218A5 - Verfahren zur herstellung von prednisolon-17-acetat - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation von * der Pregnanreihe zu Prednisolon-17-acetat mit Hilfe von Pilzen. Es ist dadurch charakterisiert, dasz die 11b-Hydroxylierung unter Induktion mit Hilfe von Verbindungen des Typs der Bisnorcholansaeure und durch p H-Steuerung unter Bedingungen, bei denen ein 17-Acetat nicht enzymatisch verseift wird, durchgefuehrt wird.{11b-Hydroxylierung; mikrobielle Transformation; Cochliobolus lunatus; aerobe Fermentation; p H-Regulierung; Hydroxylierung von acylierten Pregnanderivaten; Substratkonzentration; Induktion mit C22-Steroiden; Induktorkonzentration 1-20%}
Description
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Bekannt ist, daß synthetische Glukokortikoide, wie z. B. 11 ß,17a,21-Trihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (Prednisolon), allgemein durch zwei mikrobielle Stufen, eine 11-Hydroxylierung und anschließend eine 1-Dehydrierung, aus den entsprechenden 4-En-3-oxo-11-desoxysterioden hergestellt werden (vgl. H.J.Rehm, G. Reed; Biotechnology, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, Vol. 6 a, chap. 2 (speziell S.36). Die zwei biologischen Stufen mit der jeweiligen Aufarbeitung der Fermentationsprodukte belasten die Ökonomie des Gesamtverfahrens entscheidend. 11 ß-Hydroxylierungen der entsprechenden 1,4-Dienverbindungen sind im industriellen Maßstab nicht bekannt. Derartige Verfahren besitzen zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur akademisches Interesse. Das aus der DE-OS 2901561 bekannte Verfahren mit dem Pilz Curvularia lunata arbeitet mit dem 17a,21-orthoester eines 1,4-Dien-3-oxo-steroids, läßt aber nur Umsätze von 0,5g Steroid/I Kulturlösung zu. Die zur 11 ß-Hydroxylierung geeigneten Mikroorganismen wie Curvularia, Cunninghamella und Trichothecium besitzen Esterasen, so daß bei Einsatz von 11-Desoxysteroidacetaten ein Gemisch aus Steroidalkoholen und Estern entsteht. Es wurden kürzlich auch mikrobielle Verfahren zur Herstellung der 11 ß,17a,21-Trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-Derivate (Prednisolon) (vgl. WP C12P/281607) sowie Prednisolon-17-acetat (vgl. WP C12P/281608) aus den zugehörigen 11-Desoxy-Verbindungen vorgeschlagen, in denen die 11 ß-Hydroxylierung unter Einsatz von Pilzen der Gattungen Cochliobolus bzw. Absidia realisiert und die Fermentation nach vollendeter Hydroxylierung im Bereich von pH 5 bis pH 7 durchgeführt wird. Diese Verfahren haben jedoch gleichfalls den Nachteil, daß in ihnen höhere Ausbeuten nur bei geringen Substrateinsatzkonzentrationen erreichbar sind.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung verfolgt das Ziel, mit geeigneten Mikroorganismen, bevorzugt Pilzen bzw. deren Enzymsystemen, 17 a-acetylierte 11-Desoxy-1,4-dien-steroide der Pregnanreihe mit Umsätzen von 2g/l bis 10g/l zu Prednisolon-17-acetat zu transformieren. Bei den eingesetzten Mikroorganismen muß gesichert sein, daß die neben den Hydroxylasen enthaltenen Esterasen, die normalerweise ein Gemisch von Prednisolon und Prednisolon-17-acetat liefern, durch die Fermentationsführung inhibiert werden, so daß zum Ende der Fermentation das als einziges Hauptprodukt vorliegende Prednisolon-17-acetat besonders günstig aus der Kulturlösung gewinnbar ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch einfaches fermentatives Verfahren anzugeben, das es gestattet, Prednisolon-17-acetat aus in 17a-Stellung oder in 17a- und 21-Stellung verestertem ^a^i-Dihydroxy-pregna-i^-die dion durch mikrobielle 11 ß-Hydroxylierung in ökonomisch günstiger Weise herzustellen.
Erfindungsgemäß erfolgt das dadurch, daß 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroide der Pregnanreihe, die in 17a-Stellung verestert sind, und die auch in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten können, mit zur 11 ß-Hydroxylierung befähigten Mikroorganismen unter Einsatz eines Induktors und einem die Hydrolyse der Acetatgruppe vermeidenden Fermentationsregime in 11 ß-Stellung hydroxyliert werden.
Es wurde gefunden, daß Steroide vom Typ der ungesättigten 3-Oxo-bisnorcholansäure (I) oder der analogen Alkohole (II), die als Nebenprodukte bei der mikrobiellen Herstellung von Androsta-1,4-dien-3,17-dion anfallen, einen starken induzierenden Effekt auf die 11 ß-Hydroxylierung ausüben, ohne die Acetatabspaltung zu stimulieren.
R = COOH R = CH2OH
Einfach- oder Doppelbindung
Im Ergebnis dieses Befundes wird das Verfahren wie folgt durchgeführt: Einem Fermentationsansatz, wie er für einen 11 ßhydroxylierenden Mikroorganismus in an sich bekannter Weise bereitet wird, wird vor bzw. spätestens mit der Einbringung des Substrates, d.h. der Einbringung eines in 17α-Stellung veresterten 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroids der Pregnanreihe, als Induktor ein C22-Steroid der allgemeinen Formel I oder Il in einer Konzentration, die im Bereich von 1 % bis 20% der Substrat-Konzentration liegt, zugesetzt. Hierbei erfolgt die Induktorzugabe entweder in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Aceton, Methanol bzw. Dimethylformamid oder in einer in der Steroidfermentation gebräuchlichen Suspension
Induktoren des genannten Typs sind:
3-Oxo-bisnorchol-4-en-22-carbonsäure, 3-Oxo-bisnorchola-1,4-dien-22-carbonsäure, 22-Hydroxy-bisnorchol-4-en-3-onund 22-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-on.
Für die verfahrensgemäße mikrobielle Steroidtransformation kann ein beliebiger 11 ß-hydroxylierender Mikroorganismus eingesetzt werden. In erster Linie wird im Verfahren jeweils ein 11 ß-hydroxylierender Stamm aus einer der nachstehenden Mikroorganismengattungen bzw. -arten herangezogen:
Cochliobolus, vorzugsweise C. lunatus
Absidia, vorzugsweise A. orchidis
Curvularia, vorzugsweise Curv. lunata
oder Curv. genticulata
Cunninghamella, vorzugsweise Cunn. blakesleeana
Tieghemella, vorzugsweise T. orchidis.
Einige Stämme aus den oben bevorzugt genannten Arten sind im Zusammenhang mit früheren Patentanmeldungen in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, O - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11 hinterlegt worden, so unter anderem
Stamm C. lunatus m 118 unter Reg.-Nr. ZIMET 43 797 Stamm A. orchidis 409 unter Reg.-Nr. ZIMET43 795
StammA.coerulea468 unter Reg.-Nr. ZIMET43 796;
weiterhin ist der Stamm Curv. lunata NRRL 2380 ein häufig zur 11 ß-Hydroxylierung verwendeter Mikroorganismus. Die Fermentation des jeweils gewählten 11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismus erfolgt unter aeroben Kulturbedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches neben dem Steroid-Substrat und dem Induktor eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle - gegebenenfalls auch in Form einer komplexen Quelle- sowie Mineralsalze enthält. Für diese Fermentation wird der gewählte Mikroorganismus, ausgehend von einer Lyophilkonserve, in einer Vorkultivierung angezogen. Als vorteilhaft hat es sich erw<esen, die Vorkultivierung über eine emerse und zwei submerse Stufen zu erstrecken. 6 Stunden vor oder spätestens mit der Zugabe des Substrates, d.h. eines in 17-Stellung veresterten 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroide der Pregnanreihe wird der Induktor (C22-Steroid der Formel I oder II) zugesetzt und die Hauptkultivierung begonnen, wobei das Substrat in einer Einsatzkonzentration von 0,5g/l bis 5,0g/l und der Induktor in einer Konzentration von einem Zehntel dieser Konzentration dem Fermentationsmedium zugefügt wird. Die Substrat-und Induktoreinbringung erfolgt entweder in Lösung (in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel) oder in Suspension bzw. in feinkristalliner Form. Bei Fermentationen mit Substrat-Einsatzkonzentrationen > 1,0 g/l wird eine gestaffelte Zugabe in der Weise angewandt, daß gleichzeitig mit jeder Substrat-Teilzugabe im oben angegebenen Konzentrationsverhältnis ein weiteres Quantum Induktor zugegeben wird. Als Substrat wird aus der Gesamtheit der in 17-Stellung veresterten 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroide der Pregnanreihe vorzugsweise na-Acetoxy^i-hydroxy-pregna-IAdien-S^O-dion (i-Dehydro-RSS-17-Ac), ^a-^i-Diacetoxy-pregna-i^-dien-3,20-dion (1 -Dehydro-RSS-17,21 -Diac), 17 a-,21 -(1 '-Ethoxy-ethyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion eingesetzt. Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen von 240C bis 33°C; sie wird über eine Dauer von 48 Stunden bis 72 Stunden erstreckt und kann in Rundkolben sowie Steilbrustflaschen, in gerührten Glasfermentem und in V2 A-Stahltanks durchgeführt werden. Die Fermentation wird so gesteuert, daß ein für die Hydroxylierung günstiger pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7 eingehalten wird, was durch die Zugabe von Glucose bzw. Saccharose (0,02-0,04 g/l-Endkonzentration) oder durch den Zusatz einer Mineralsäure erreicht wird. Zur Sauerstoffversorgung wird mittels Belüftung und Rührung ein Sättigungsgrad von 40% bis 50% eingehalten. Diese für die Hydroxylierung günstigen Fermentationsbedingungen hemmen gleichzeitig die Esterasen, deren Wirkungsoptimum bei höheren pH-Werten als pH 7,5 liegt. Die Fermentation wird spätestens dann beendet, wenn der Steroid-Substrat-Gehalt auf einen Restwert = 1 % der Einsatzkonnzentration abgesunken ist.
Zur Isolierung des in der Fermentation entstandenen Prednisolon-17-acetats wird die Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel nebst anschließender Kristallisation aufgearbeitet
Die Vorteile der Erfindung bestehen in
- derFermentierbarkeitvon höheren Substrateinsatzkonzentrationen (>2g/l) mit guten Ausbeuten und
— dem Abbau der verfahrensgemäß eingesetzten Induktoren im Laufe der Fermentation zu Produkten, welche die Aufarbeitung der Zielsubstanz nicht stören.
Die Oberfläche einer versporten Hafermehleprouvette mit Cochliobolus lunatus ZIMET 43797 (Hafermehl 2%, Agar 2%, Aqua dest., pH 7,0, Sterilisation 20min 1200C) wird mit 5ml sterilem Aqua dest. abgeschwemmt. 1,5 ml dieser Sporen-Mycel-Suspension dient zur Beimpfung von 500er Rund-oder Erlenmeyerkolben mit je 100ml Medium 1 (Glucose 3%, Maisquellwasser (fest) 0,5%, NaNO3 0,2%, KH2PO4 0,1 %, K2HPO4 0,2%, MgSO4 · 7H2O 0,05%, FeSO4 0,002%, KCI 0,05%, Aqua dest., pH 6,5-6,7,20'120°C). Die beimpften Kolben werden ca. 68 Stunden bei 26°C ± 10C (220min"1) geschüttelt und je 10ml dieser Vorkultur zum Beimpfen von 2,5-l-Steilbrustflaschen mit Impfstutzen mit je 200 ml Medium 2 (Glucose 1 %, Maisquellwasser (fest) 1 %, Maiskeimöl 0,5%, Aqua dest, pH 6,5-6,7,30' 1200C) benutzt. Diese werden 24 Stunden bei 26°C ± 10C (22OmJn"1) geschüttelt und der Inhalt zur Beimpfung eines Laborfermentors mit 2,91 Medium 3 (Glucose 0,7%, Maisquellwasser (fest)3%, KH2PO40,075%, MgS040,15%, FeSO40,015%, MnCI20,015%,ZnSO40,005%, CaCI20,1%, Aqua dest., pH6,0,30' 120°C) verwendet. Nach der Beimpfung werden 0,25 g 22-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-on gelöst in 10ml Methanol zugegeben. Nach 6 Stunden Anwachszeit (Rührung 400U/min, Belüftung 0,51 Luft/l Kulturlösung/min, Temperatur 25°C ± 0,50C) werden 2,5g 1-Dehydro-RSS-17-acetat gelöst in 15ml Methanol zugegeben. Nach weiteren 6 Stunden erfolgt eine gleichzeitige Zugabe von Induktor (0,25g) und Substrat (2,5g). Der pH-Wert wird durch kontrollierte Zudosierung von 1 η H2SO4 im Bereich von 5,0-5,5 gehalten. Der Verlauf der Fermentation wird dünnschichtchromatographisch kontrolliert.
Ca. 46 Stunden nach der letzten Substratzugabe ist die Fermentation beendet. Das Mycel wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und das mit dem Waschwasser vereinigte Kulturfiltrat mit Chloroform erschöpfend extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt, 20 Stunden bei 4°C aufbewahrt, das Kristallisat abgesaugt und aus der Mutterlauge in gleicherweise ein zweites Kristallisat gewonnen. Insgesamt werden 4,4g Prednisolon-17-acetat (84% d. Th.) erhalten.
Wird wie nach Beispiel 1 verfahren und dabei 17a,21-{1'-Ethoxyethyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion als Substrat verwendet, dabei entstehen bei Einsatz von 3g/l in 72 Stunden Fermentationszeit 60 Gew.-% Prednisolon-17-acetat, das sind 61,9% d. Th.
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung von Prednisolon-17-acetat auf mikrobiologischem Wege gekennzeichnet durch die Fermentation von in 17a-Stellungoder in 17a- und 21-Stellung verestertem 17a,21-Dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion mit Hilfe eines 11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismus unter Zusatz eines C22-Steroids der Formel,
I : R = COOH II : R = CH2OH
eine Einfach- oder Doppelbindung
vor bzw. spätestens mit der Einbringung des Substrats bei Temperaturen von 24°C bis 330C im Zeitraum von 48 Stunden bis 72 Stunden bei pH-Werten von pH 4 bis pH 7 und Isolierung des Prednisolon-17-acetats aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel nebst anschließender Kristallisation.
2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnetdadurch,daß man eine ungesättigte 3-Oxo-bisnorcholan-22-carbonsäure (I) bzw. einen entsprechenden Alkohol (II) als Induktor zusetzt.
3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man S-Oxo-bisnorchol^-en^- carbonsäure als Induktor zusetzt.
4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man 3-Oxo-bisnorchola-1,4-dien-22-carbonsäure als Induktor zusetzt.
5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man 22-Hydroxy-bisnorchol-4-en-3-on als Induktor zusetzt.
6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man 22-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-on als Induktor zusetzt.
7. Verfahren nach Punkt 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß man die Substrat-Einsatzkonzentration im Bereich von 0,5g/l bis 5,0g/l Fermentationsmedium und die Induktor-Einsatzkonzentration im Bereich von 1 % bis 20% der Substrat-Einsatzkonzentration wählt.
8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß man das Substrat in Lösung, in Suspension oder in feinkristalliner Form sowie den Induktor in Lösung oder in Suspension in das Fermentationsmedium einbringt.
9. Verfahren nach Punkt 7 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man bei Substrat-Einsatzkonzentrationen größer 1,0g/l ein über mehrere Portionen gestaffelte Zugabe von Substrat und Induktor vornimmt.
10. Verfahren nach Punkt 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß man im Verfahren einen 11 ßhydroxylierenden Mikroorganismus aus einer der Gattungen Cochliobolus, Curvularia, Absidia, Cunninghamella oderTieghemella einsetzt.
11. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß man im Verfahren einen 11 ßhydroxylierenden Mikroorganismus aus einer der Arten Cochliobolus lunatus, Curvularia lunata oder Curvularia genticulate, Absidia orchidis oder Absidia coerulea, Cunninghamella blakesleeana oderTieghemella orchidis einsetzt.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Transformation von 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroiden, die in 17a- und 21-Stellung oder nur in 17a-Stellung verestert sind, zu Prednisolon-17-acetat, d.h. zu 17a-Acetoxy-11 ß,21-dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion.
Prednisolon und seine Derivate werden als hochwirksame Arzneimittel zur Behandlung der rheumatischen Arthritis, des Asthmas, Allergien, Dermatosen und anderen Krankheiten angewendet. Die mikrobielle Umwandlung von 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroiden der Pregnanreihe,die in 17a-oder 17a- und 21-Stellung verestert sind, zu Prednisolon-17-acetat stellt eine wirtschaftlich und technisch günstige Variante zur Gewinnung dieses Glukokortikoids dar.
Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29742986A DD290218A5 (de) | 1986-12-11 | 1986-12-11 | Verfahren zur herstellung von prednisolon-17-acetat |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29742986A DD290218A5 (de) | 1986-12-11 | 1986-12-11 | Verfahren zur herstellung von prednisolon-17-acetat |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD290218A5 true DD290218A5 (de) | 1991-05-23 |
Family
ID=5584815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD29742986A DD290218A5 (de) | 1986-12-11 | 1986-12-11 | Verfahren zur herstellung von prednisolon-17-acetat |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD290218A5 (de) |
-
1986
- 1986-12-11 DD DD29742986A patent/DD290218A5/de not_active IP Right Cessation
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Legal Events
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