DD293367A5 - Minenjagdgeraet - Google Patents
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Abstract
Herstellung von Protoplastenkulturen aus eukaryotischen Zellen; allgemeine Schrittfolge von Protoplastierungsverfahren; Kultivierung bis zur späten log-Phase; Waschen mit Aqua dest. sowie Tris-Puffer; Oerskovia xanthineolytica GJM-1-Rohlysat; Protoplastierung in flüssiger Phase; Protoplastierung in einer Matrix; erhaltene Protoplasten einsetzbar in Genom-Analyse mittels PFGE
Description
Hierzu2 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Protoplastenkulturen hoher Qualität aus Zellen verschiedenster Orgar.ismengruppen, so aus eukaryotischen Mikroorganismen, d.h. aus Hefe- und aus anderen Pilzzellen, aber auch aus Algen- und aus Pflanzen-Zellen - und zwar von Protoplastenkulturen, die hinsichtlich ihrer Gebrauchswerteigenschaften einen solchen Standard aufweisen, daß sie nicht nur zu den traditionellen zellbiologischen und genetischen Untersuchungen, sondern darüber hinaus auch in den Forschungen zu biochemischen und gentechnologischen Fragestellungen eingesetzt werden können. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der gen- und biotechnologischen Forschung sowie in der mikrobiologischen Industrie. Eine besondere Verwendungsmöglichkeit der vorgeschlagenen Verfahrenslösung ergibt sich in der Genom-Analyse mittels Puls-Feld-Gel-Elektrophorese (PFGE).
Für Mikroorganismen aus den oben charakterisierten Gruppen liegen bislang keine hinreichend guten Verfahron zur Herstellung von Protoplastenkulturen vor. Alle bekannten Verfahrenslösungen sind gemeinsam durch das Merkmal der Verwendung eines ieweils aus Mikroorganismen gewonnenen Enzymkomplexes gekennzeichnet. Für Hefen, die innerhalb dieser Mikroorganismengruppe die bisher am sorgfältigsten untersuchte Teilgruppe der eukaryotischen Mikroorganismen darstellen, sind die vorliegenden Verfahron (I.A.Zakharov et al., Zbornik-Metodik po Genetike droschschejzakharomycetov. Nauka, Leningrad, 1984,141) zum Beispiel mit folgenden allgemeinen Nachteilen behaftet:
- In ihnen werden protoplastierende Enzyme oder Enzymgemische eingesetzt, die nukleolytische Nebenaktivitäten bei
überhaupt nur geringer spezifischer Affinität zum eigentlichen Substrat, der Zellwand, aufweisen; - die mit ihrer Hilfe hergestellten Protoplasten verfügen oft noch über Zel'wandreste und zeichnen sich darüber hinaus auch durch verminderte Überlebensfähigkeit aus;
- als Resultat dergoringen Enzymaktivität befinden sich die mit ihrer Hilfe hergestellten Protoplasten zum großen Teil in einer Protoplasten-Zell-Mischkultur;
- die so hergestellten Protoplasien sind deshalb meistens nur für wenige der oben genannten Verwendungszwecke einsetzbar (z. B. häufig nicht in gontechnologischen Arbeiten sowie in der Genom-Analyse);
- das jeweilige Protoplastierungr.verfahren ist in der Regel nur für einen kleinen Kreis von Spezies anwendbar.
In den bisherigen Verfahren zur Herstellung von Protoplasten bei Hefen bzw. anderen pilzlichen Mikroorganismen wurden als Enzymkomponenten u.a. folgende, zur Zellwandlyse notwendige Enzyme herangezogen: endolytische beta-1,3-Glukanase, endolytische beta-1,6-Glukanase, alpha-Mannase, alkalische Protease und Chitinase (J. R.Villanueva et al., [Eds.], Yeast, Mould and Plant Protopasts, 381,1972). Darüber hinaus erfolgte in einigen Fällen der Einsatz von Amylasen, Xylanasen, Pektinasen und Laminarinasen (Laminaripentaohydrolasen) (K.Kitamura, Agr. Biol. Chem. 46,1982,2093; K.Kitamura, T.Kaneko u. Y.Yamamoto.Arch. Biochem. Biophys. 145,1971,402).
Im Gegensatz zu dieser Soll-vorstellung verwenden die bisher bekannten /erfahren zur Herstellung von zellwandfreien Protoplasten pflanzlicher und mikrobieller Zellen verschiedenster Organismengruppen Enzyme oder Enzymkomplexe, die in ihrer spezifischen Aktivität bisher nur wenig oder gar nicht charakterisiert sind (M. Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 42,1978,1975; D. Knorr, K.J.Sherry u. J.E. Kinsella, Biotech. Bioeng. XXI, 1979,2011; K.Saito et al., Agr. Biol. Chem. 52,1988,1849). Ausgehend von verschiedenen Wirten, aus denen diese Enzyme/Enzymkomplexe isoliert werden, kommen in den bisherigen Protoplastierungsverfahren in Abhängigkeit von den verwendeten Isolations- und Reinigungsverfahren sowie von der Methodik unterschiedlichste Enzyme und Enzymkomplexe zum Einsatz (M. Vrsanka, Z. Kratky u. P. Biely, Z. AIIg. Mikrobiol. 17,1977,391; Patentschriften GB 1281618, DD 145765, DD 145766, WO 84/02001, US 4.473.452). Diese als Glucuronidase/Arylsulfatase, Glusulase, Kitalase, Lyticase, Novozym, Teichozym Y oder Zymolyase bekannten Enzymkomplexe werden hierbei aus folgenden Organismen isoliert: aus dem in der Weinbergschnecke Helix pomatla lebenden Brevlbacterium lytlcum nov. sp„ aus Streptomyces «p., Bacillus circulans bzw. Rarobacter faecltabldut YLM-1, aus verschiedenen Species von Flavobacterlum (S. Nagasaki, H. Mori und S.Yamamoto, Agr. Biol. Chem. 45,1981,2689), aus Cytophaga johnsonil sp. NCIB 9497, aus Basldiomycete aphyllophoroles, und Basldiomycete sp. QM 806 (E.Ryan, O. P. Ward, Proc. Biochem. 2,1988,12), aus dem Oerskovia xanthineolytica Stamm LL-G109 (oft auch als Arthrobocter luteusStamm 73-14 bezeichnet; s.a. J.H.Scott u. R. Schekman, J. Bacteriol. 142,1980,414) und aus den diesem sehr nahestehenden Stämmen Arthrobacter luteus bzw. Oerskovia xanthlneolvtfca GJM-1 (früher als Arthrobacter sp. GJM-1 bezeichnet; s. a. J. Bieber u. R. May, Acta Biotechn. 5,1985,213; O.Hässleretal.,ActaBiotechnol.2,1982,95; M.Vrsanka.P.Biely u.Z. Kratky, Z. AIIg. Mikrot/iol. 17,1977,465). Bedingt durch die Verschiedenartigkeit der Aufarbeitung dieser Enzymkomplexe aus den entsprechenden Wirtsorganismen werden hierbei unterschiedliche Aktivitäten isoliert. Bei der dabei angewandten Einengung oder Konzentrierung mittels Ausfällen durch Ammoniumsulfat (Patentschrift GB 1281618), mittels Vakuumdestillation (M. Vrsanka, Z. Kratky u. P. Biely, Z. AIIg. Mikrobiol. 17,1977,391) bzw. mittels Rotationsverdampfer (Patentschrift DD 145765) erntet man nur wenig bzw. nur
teilweise inaktives Enzym. Diese Enzymlösungen werden, da sie pH- und Temperatur-sensibel sind (was inbesondere für den für die Lyse essentiellen Glukanase-Anteil zutrifft), schon in diesem Teil der Herstellungsprozedur inaktiviert oder nicht mit isoliert. Während der weiteren Aufarbeitung mittels chromatographischer Methoden kommt es zu ähnlichen Ausfallerscheinungen hinsichtlich Enzym-Aktivität und -Menge, und es gelingt oft nicht, nukleolytische Aktivitäten auszuschließen (J. H. Scott u. R.Schekman,J.Bacteriol.142,1980,414).
Zur Protoplastierung von Mikroorganismenzellen aus den eingangs gekennzeichneten Gruppen wurden, wio bereits erwähnt, auch schon aus Oerekovle xanthlneolytlca GJM-1 päparlerte und durchweg sogar aufwendig aufgearbeitete Enzympräparate verwendet (O. Hässler et al., Acta Biotechnol. 2,1982,95; J. Bieber u. R. May, Acta Biotechnol. 5,1985,213). Diese Verfahren weisen den Nachteil auf, daß die in ihnen eingesetzten GJM-1-Enzymaktivitäten zum einen unzureichende Spezifität zum Substrat aufwiesen und zum anderen gleichfalls nur einen kleinen Wirtsbereich an Spezies zu protoplastieren vermochten, wobei die hergestellten Protoplasten nur für traditionell zellbiologische Zwecke einsetzbar waren, da die erwähnten nukleolytischen Nebenaktivitäten auftraten (M. Vrsanka, P. Biely u. Z. Kratky, Z. AIIg. Mikrobiol. 17,1977,465). In allen bisher publizierten Verfahren zur Herstellung von Protoplasten von Hefen und Pilzen werden Zellpopulationen nach Wachstum in einem flüssigen Vollmedium und Abwiec > ι der Feuchtmasae zum Protoplastieren eingesetzt, ohne daß die genaue Wachstumsphase mikroskopisch oder anderweitig bestimmt wird. Bei Verwendung von Minimalmedium (Selektivmedium) ergeben sich daraus Schwierigkeiten bei der Herstellung von Protoplasten. Die Zellen werden dann zumeist schon im osmotischen Stabilisator mehrfach gewaschen und teilweise in diesem mit 2-Mercaptoethanol sensibilisiert, was ein „Mitschleppen" alter Zellen, die bereits im Protoplastierungsmedium lysieren und eigene Nukleasen freisetzen, bedingt. Ein Auswaschen des sensibilisierenden Agens erfolgt nur in einigen Fällen, in anderen wird direkt „weiterprotoplastiert" (damit wird eine teilweise Inaktivierung wichtiger Enzymkomponenten induziert), wobei das Auswaschen wiederum im osmotischen Stabilisator erfolgt.
Das in diesen Verfahren gewählte Protoplastierungsmediu.n, ein Puffer mit dem osmotischen Stabilisator, hat durchweg extreme, d. h. entweder stark basische oder stark saure pH-Werte, so daß zum einen ein Platzen der sensibilisierten Zellen unabdingbar ist sowie zum anderen kein Optimum für den Enzymeinsatz gefunden werden kann und die Zellwand damit nicht vollständig abgebaut wird.
Zum Protoplastieren werden die Zellkulturen in den meisten Fällen stark geschüttelt und großen mechanischen Beanspruchungen ausgesetzt, was gleichfalls ein Platzen der entstehenden Protoplasten bewirkt. Das osmotische Stabilisieren der Protoplasten erfolgt mit mono- oder bivalenten Kationen, die in der Regel nicht „Species-gerecht" eingesetzt sind und weitere molekularbiologische Arbeiten erschweren. Darüber hinaus wird hier ein solches Agens wie Glycerol als Enzymstabilisator eingesetzt, welches ein Verkleben der Zellen und der entstehenden Protoplasten bewirkt. Schließlich wird bei den bisherigen Verfahren die Protoplastierungsrate nach einem Waschschritt (im osmotischen Stabilisator) biologisch oder photospektrometrisch bestimmt und widerspiegelt nicht in jedem Falle den natürlichen Anteil der Protoplasten an der Gesamtpopulation.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, von Zellen verschiedenster eukaryotischer Organismengruppen (Hefe- sowie andere Pilz-, Algen- und auch Pflanzenzellen) solche Protoplastenkulturen herzustellen, die sowohl hinsichtlich ihrer Homogenität un J Stabilität wie auch hinsichtlich der Abwesenheit von Zellwandresten bzw. Zellwandbestandteilen und von Nuklease-Aktivitäten höchsten Ansprüchen genügen.
zur Herstellung von Protoplastenkulturen zu beschreiben, die den voranstehend skizzierten Qualitätsstandard aufweisen.
der eigentlichen Hauptkultur, die jeweils beide in Flüssigphase vorgenommen werden. Hierzu werden Zellkulturen einesgenetisch markierten Ausgangsstammes, entnommen entweder aus der Hefe- oder aus der Pilz-, Algen- sowie Pflanzen-Zellenumfassenden Organismengruppe, angezüchtet, wobei von einer Startkonzentration von mindestens 10s Zellen/Milliliterausgegangen wird. Die Kultivierung jeder ausgewählten Zellkultur erfolgt bis zur späten log-Phase. Anschließend werden die
gewählten Organismus durch Auszählen in einer Zählkammer die erreichte Wachstumsphase bestimmt.
Nachdem Ernten werden die Kulturen mit Aqua dest. und nachfolgend mit Tris-Puffer intensiv gewaschen.
mit dem lytischen Enzympräparat aus dem Stamm Oerskovla xanthlneolytica GJM-1 behandelt, wobei dieses Präparat stets als
der DDR, Beutenbergstraße 11, Jena, DDR - 6900 unter der Registriernummer IMET11437 deponiert worden.
- Protoplastieren in flüssiger Phase (Variante 1)
- Protoplastieren in fester Matrix (Variante 2) ausgearbeitet.
In der Variante 1 werden die gewaschenen Zellen mit 2-Mercaptoethanol sensibilisiert und die sensibilisierten Zellen in sogenanntem Protoplastierungsmedium (siehe Ausführungsbeispiel 1) erneut gewaschen. Die so vorbereiteten Kulturen
werden anschließend in einer Konzentration von 5 χ 107 Zellen/Milliliter bis 1 χ 109 Zellen/Milliliter, vorzugsweise von 2 χ 108 Zellen/Milliliter, in besagtes Protoplastierungsmedium überführt, dem weiterhin 3 Milligramm/Milliliter bis 6 Milligramm/ Milliliter, vorzugsweise β Milligramm/Milliliter, Oerakovla xanthlneolytlca GJM-1 -Rohlysat hinzugefügt werden. Der so bereitete Protopiastlerungsaneatz wird bei 26°C bis 30°C, vorzugsweise bei 300C, für die Dauer von 15 Minuten bis 45 Minuten, vorzugsweise für 30 Minuten, inkubiert, und anschließend wird mittels Zählknmmer der Protoplastierungsgrad ermittelt. Nach Abschluß dieses Schrittes werden die e'raltenen Protoplasten in an sich bekannter Weise in osmotischen Stabilisator, vorzugsweise in Sorbit, aufgenommer,, gewaschen sowie schließlich ihrer endgültigen Verwendung zugeführt. Die bevorzugte Ausführungsform der Variante 1 ist zudem noch dadurch gekennzeichnet, daß die gewaschenen Zellen in Tris-Puffer als Standkultur sensibilisiert werden; gleichfalls wird auch der Protoplastierungsansatz als Standkultur- und zwar bei 28°C für'die Dauer von 30 Minuten - inkubiert.
Die mit dieser Methode unter Verwendung des Oerskovla xanthlneolytica GJM-1-Rohlysates hergestellten Protoplasten sind stabile und zellwandfreie Protoplasten einer homogenen Zellkultur, deren Nukleasefreiheit eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten offenläßt. Dieses Rohlysat, ein nativer Zellwand-degradierender Enzymkomplex, ermöglicht es, auf Grund seiner hohen Affinität zu den Zellwand-Bestandteilen der eukaryotischen Zelle, in sogenannten physiologisch optimierten Zellkulturen mit geringeren Enzymeinsätzen zu arbeiten, als es für singuläre und/oder hochgereinig'e Enzyme zutrifft. Die in der vorliegenden Hauptvariante 1 des Verfahrens gewonnenen Protoplasten sind zudem noch in allen molekularbiologischen Arbeiten verwendbar. Sie liegen in einem nicht-ionischen Stabilisator vor und sind biologisch voll lebensfähig. Das in dieser Variante erläuterte Verfahren zur Herstellung von Protoplasten zu einer flüssigen Phase hat weiterhin den Vorteil, daß es in seiner Ausführung gut reproduzierbar und gleichzeitig einfach realisierbar ist. Es ist für verschiedenste Spezies aus den voranstehend genannten Organismengruppen geeignet und erlaubt den Einsatz der auf diese Weise hergestellten Protoplasten sowohl für biologische Zwecke als auch für den Einsatz in der Genomanalyse mittels PFGE. Die Effizienz dieser Verfahrenvariante ist gegenwärtig insbesondere am Beispiel ausgewählter Hefe-Stämme wie Saccharomyces cerevlsiae 42, Saccharomyces cerevisiae 53 sowie Saccharomyces cerevlsiae 67 belegt worden (siehe auch Ausführungsbeispiel 1). In der Protoplastierung in einer festen Matrix, d.h. in der Hauptvariante 2 der weiteren Verfahrensausgestaltung der Erfindung, werden die geernteten, gezählten und gewaschenen Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/Milliliter bis 1 χ 109 Zellen/Milliliter, vorzugsweise in einer Konzentration von 2 x 108 Zellen/Milliliter, in einem EDTA-Puffer (siehe Ausführungsbeispiel 2) gleichfalls mit 3 Milligramm bis 6 Milligramm, vorzugsweise mit 6 Milligramm, Oerskovia xanthlneolvtica GJM-1-Rohlysat als lytischem Enzymkomplex versetzt und jeweils 1 Milliliter bis 2 Milliliter, vorzugsweise bis 1,5 Milliliter, einer 1%igen Agaroselösung in an sich bekannter Weise beigegeben. Die so erhaltene Agarosematrix (im weiteren als Plugs bezeichnet) wird mitTris-haltigem, hochmolekularem EDTA-Puffer versetzt, dem 2-Mercaptoethanol als Sensibilisator hinzugefügt wird.
Dieser Ansatz wird bei 350C bis 4O0C, vorzugsweise bei 37°C, über eine Zeit von 8 Stunden bis 24 Stunden, vorzugsweise von 16 Stunden bis 24 Stunden, inkubiert, in Tris-Puffer gewaschen und in Tris-haltigem EDTA-Puffer mit N-Lauroylsarcosinat erneut über eine Zeit von 8 Stunden bis 24 Stunden, vorzugsweise bis 16 Stunden, bis 45°C bis 50°C, vorzugsweise bei 50°C, inkubiert. Nach Waschen in hochmolekularem EDTA-Puffer erfolgt vorteilhaft unter Zugabe von O,25Milligramm/Milliliter bis 2,00 Milligramm/Milliliter Proteinase K im Lyse-Puffer eine weitere Inkubation dieser Art. Nach erneutem Waschen in EDTA-Puffer wird unter Zusatz von 500 Einheiten T1-RNAse/Milliliter in diesem zum Zwecke der zusätzlichen Reinigung eine weitere Inkubation bei 370C (Dauer: 24 Stunden) vorgenommen. Im Anschluß an diese Prozedur werden die Plugs mit den so aufbereiteten Protoplasten (und mit der damit bereitgestellten DNS) in hochmolekularem EDTA-Puffer gewaschen und in diesem bei 40C bis zur Verfügung insbesondere in der Genomanalyse mittels PFGE aufbewahrt.
Auch diese Hauptvariante stellt Protoplasten von Zellkulturen aus den eingangs genannten eukaryotischen Organismengruppen her, aus denen unmittelbar intakte chromosomale DNS für alle Belange der modernen Biologie isoliert und universell dargestellt werden kann.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiele werden nachstehend für die Herstellung von Protoplasten in Flüssigphase (Beispiel 1) und in fester Matrix (Beispiel 2) angegeben.
Die Hefe-Ausgangsstämme
S. cerevlsiae 67 (18C-ZJ1005:MATalpha,leu2-3,leu2-112,trpi,thr4,hls3delta,lys2-A12,ura3,ade2-163' und
werden nach Anzucht auf dem YEPD-Agra-Vollmedium (Angaben in g/l: Glukose, 20; Bacto-Pepton, 20; Difco-Hefe-Extrakt, 10; pH 6,6 selbsteinstellend; Zusatz von Agar-Agar, 20; Autoklavieren bei 1200C, 102,3 kPa) über eine Zeit von 1,5 Tagen bis 3 Tagen bei einer Temperatur von 280C bis 32 0C in ein festes Vollmedium umgesetzt. Dabei werden nur gut wachsende, große, runde und mit glatter Kolonieoberfläche ausgestattete Hefekolonien verwendet. Nach einer Inkubationszeit von 10 Stunden bis 16 Stunden (vgl. Abbildung 1) bei der gleichen Temperatur in einer Schüttkultur mit guter Belüftung werden die in einer homogenen, nicht flockuüorenden Suspension aufgewachsenen Zellen in die sog. Hauptkultur, gleichfalls ein Flüssigmedium, mit einer anfänglichen Zellzahl von 105 Zellen/Milliliter bis 10° Zellen/Milliliter umgesetzt.
Diese Kultur wird bis zum Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase bei gleichen Inkubationsbedingungen geschüttelt und anschließend durch Zentrifugation bei 300Orpm 10 Minuten bis 15 Minuten lang geerntet. Nach dem Feststellen der erreichten Zellzahl (Zellkonzentration pro Milliliter) in einer Zählkammer System „THOMA" weroen die Zellen zunächst in Aqua dost, gewaschen, danach wiederum zentrifugiert und in einem Waschpuffer aus Tris-EDTA (0,1 M Tris, 0,1 M EDTA, pH 8,0) gewaschen, womit jegliche nukleolytische Aktivität unterbunden wird.
Nach erneuter Zentrifugation werden die Zellen mit einer Konzentration von 2 χ 108 Zellen/Milliliter mit dem die Zellwand sensibilisierenden 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration von 0,1 M) versetzt. Nach kurzem Aufschütteln werden dann die Zellen bei einer Temperatur von 300C10 Minuten lang inkubiert. Diesem Schritt folgt eineZenirifugation mit anschließendem Waschen der Zellen im Protoplastierungsmedium (0,126M Dinatriumhydrogeiiphosphat, 0,56 M Ammoniumsulfat, 0,062 M Zitronensäure, pH 6,0). Ein nachträgliches weiteres Waschen der Zellsuspension mit diesem Puffer entfernt letzte Reste der sensibilisierenden Substanz, was durch ein Ausbleiben des dafür charakteristischen Schwefelwasserstoffgeruches gekennzeichnet ist. Danach werden die Zellen erneut im Protoplastierungsmedium aufgenommen (Zellkonzentration bei 2 χ 108 Zellen/Milliliter). Unter Zugabe von 6 Milligramm/Milliliter Oerskovia xanthineolytlca GJM-1-Rohlysat (gewonnen aus dem zellfreien Kulturfiltrat durch Ultrafiltration und anschließende Lyophilisation), welches kurz vor der Reaktion in dem Medium au'gelöst wird, wird die aufgeschüttelte und sensibilisierte Zell-Enzym-Suspension bei einer Temperatur von 30"C über eine Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert. Hierbei erfolgt das Ablösen der Zellwand von den Protoplasten durch den lytischen Enzymkomplex aus Oerskovia xanthlneolytica GJM-1.
Die Lysereaktion der Zellwand erfolgt in mehreren Stufen, beginnend mit dem Anhaften des Multi-Enzymkomplexes an die Zellwand und der Lyse dieser durch Eingriff der Protease (welche die Zellwand öffnet, indem sie die äußere Mannoproteinschicht attackiert). Im weiteren Prozeß kommen zunächst die Glukanasen und die Chitinase zur Wirkung, gefolgt von den anderen Aktivitäten (die letztgenannten Enzymgruppen bewirken nach dem Öffnen der Zellwand eine Zersetzung der Zellwandbestandteile in niedermolekularere Bestandteile). Das Monitoring der Protoplastierung erfolgt hier vorteilhaft durch das Anfärben der Protoplasten mit einer Bromphenolblau-Lösung (die Lumen der Protoplasten färben sich an; Zellen dagegen nehmen keinen Farbstoff an), oder durch einen Lysetest in hypertonischer SDS-Lösung (Platzen der Protoplasten, nicht jedoch der nichtprotoplastierten Zellen) und einem Vergleich in einer hypotonischen Stabilisatorlösung, in der Regel in einer wäßrigen 1,0M Sorbit-Lösung (sowohl Protoplasten als auch Zellen bleiben intakt und lebensfähig). Die Protoplasten erscheinen im Lichtmikroskop als sich von den ovalen bis eiförmigen Zellen unterscheidende kleinere runde Gebilde. Geplatzte Protoplasten zeigen sich durch das Auftreten von Zeiltrümmerfraktionen in den Präparationen und führen zu einer Beeinträchtigung aller nachfolgenden Arbeiten oder verhindern diese gar, wie es im Falle der Genomanalyse mittels PFGE der Fall ist. Erst nach erfolgter Kontrolle der Protoplastierung werden die Protoplasten zentrifugiert und im osmotischen Stabilisator gewaschen und für die weitere Verwendung in diesem aufgenommen. Erst danach erfolgt das sorgfältige Abzentrifugieren bei Drehzahlen von 2000 rpm bis 2 500 rpm in einer Zeit von 10 Minuten bis 15 Minuten. Ein sorgfältiges Waschen der Protoplasten mit dem osmotischen Stabilisator Sorbit, 1,OM, bewirkt die Reinigung und zugleich die Stabilisierung der erhaltenen osmotisch labilen Protoplasten. Für Arbeiten mit der PFGE zum Zwecke der Genomanalyse werden die in dieser Weise hergestellten Protoplasten in der neuen wäßrigen Sorbitlösung auf eine Temperatur von 420C gebracht und mit LGT-Agarose, die nach dem Aufschmelzen ebenfalls im selben Temperaturbereich gehalten wird, im Volumenverhältnis 1:1,25 vermischt, in vorbereitete Gießblöcke gegossen und bei Temperaturen von 40C bis 8°C im Verlaufe einer Stunde zum Erstarren gebracht. Diesem Schritt schließen sich die weiteren, an sich bekannten Schritte der PFGE-Methodik an. Für diese Arbeiten beträgt die Konzentration der eingebetteten Protoplasten in der Agarose mindestes 5 χ 108 Protoplasten/Milliliter und darf aus Gründen der besseren Bearbeitung 2 χ 10'° pro ml nicht überschreiten.
verwendet wird, wird das Waschen im Unterschied zur o. a. Methode gloich mit einer die nukleolytischen Aktivitäten hemmenden 5OmM EDTA-Lösung (pH 7,5) vorgenommen. Die auch danach in einer neuen Portion dieses Puffers vorliegenden Zellen werden in der oben angegebenen Konzentration in die Agarose eingebettet. Dazu werden 1,5ml dieser Zellsuspension mit 0,5 Milliliter des lyophilisierten Oerskovia xanthineolytica GJM-1-Rohlysates (bei Einsatz von 6 Milligramm Enzym auf 2 x 108 Zellen) versetzt, und nach dem Temperieren auf eine Temperatur von 42°C bis 450C mit der gleichwarmen LGT-Agarose gut und homogen vermischt und in speziell dafür vorgesehene Gießschablonen bei einer Temperatur von 4°C bis 8°C im Verlaufe einer Stunde zum Erstarren gebracht.
Anschließend erfolgen die für die PFGE weiter notwendigen Schritte der DNS-Isolation. In an sich bekannter Weise werden die Plugs in einen Tris-EDTA-Probenpuffer (0,01 M Tris, 0,5M EDTA, pH 7,5) überführt, in einer Endkonzentration von 2% mit 2-Mercaptoethanol versetzt und nach kurzem Aufschütteln bei einer Temperatur von 370C für eine Zeit von 16 Stunden bis 24 Stunden inkubiert.
Diese Inkubation dient sowohl der Sensibilisierung der Zellen als auch der nachfolgenden Protoplastierung und erfordert deshalb größere Mengen des GJM-1-Enzympräparates.
Eine Kontrolle der sich bis zu diesem Zeitpunkt vollziehenden Reaktionen ist hler nicht möglich; diese erfolgt erst in an sich anschließenden Schritten der DNS-Präparation nach der Lyse der eingebetteten Protoplasten.
Wie Abbildung 2 für die 3 Beispielstämme S. cerevltlae 42, S. cerevislae 67 und S. cerevltiae S3 belegt, werden nach diesem
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Protoplasten aus eukaryotischen Zellen (Hefe-, Pilz-, Algen- und Pflanzenzellen), ablaufend in der allgemeinen Schrittfolge
- Züchten einer Kultur solcher Zellen einschließlich Ernte durch Abzentrifugieren,
- Waschen, Sensibilisieren (mit 2-Mercaptoethanol) dieser und Hinzufügen ionischer Stabilisatoren zur untersuchten Zellkultur sowie
- Behandeln der so vorbereiteten Kultur mit mindestens einem lysierenden Enzympräparat, vorzugsweise mit Präparat von Stamm Oerskovia xanthineolytica GJIVM (Protoplastierungsschritt),
gekennzeichnet dadurch, daß man
- die Zellen des jeweils ausgewählten eukaryotischen Organismus von einer Startkonzentration von mindestens 105 Zellen/Milliliter aus aufwachsen läßt und bis zur späten log-Phase kultiviert,
- die abzentrifugierten Zellen mit Aqua dest. sowie Tris-Puffer wäscht und
- im Protoplastierungsschritt des GJM-1-Enzympräparat als Rohlysat einsetzt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man für die angezogenen Zellen des jeweils gewählten Organismus durch Auszählen in einer Zählkammer exakt die Wachstumsphase bestimmt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man
- die gewaschenen Zellen in Tris-Puffer sensibilisiert,
- die sensibilisierten Zellen zunächst in Protoplastierungsmedium wäscht,
- die so vorbereiteten Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/Milliliter bis 1 x 109 Zellen/ Milliliter erneut in 1 Milliliter Protoplastierungsmedium überführt und 3 Milligramm bis 6 Milligramm Oerskovia xanthineolytica GJM-1-Rohlysat hinzufügt,
- diesen Protoplastierungsansatz bei 260C bis 300C für die Dauer von 15 Minuten bis 45 Minuten inkubiert sowie danach den Protoplastierungsgrad mittels Zählkammer prüft und die so hergestellten Protoplasten in osmotischem Stabilisator wäscht sowie in diesem aufnimmt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man die gewaschenen Zellen in Tris-Puffer als Standkultur sensibilisiert.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß man den Protoplastierungsansatz als Standkultur bei 280C für die Dauer von 3G Mir uten inkubiert.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man
- die in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/Milliliter bis 1 x 109 Zellen/Milliliter in Tris-Puffer gewaschenen Zellen zusammen mit 3 Milligramm bis 6 Milligramm Oerskovia xanthineolytica GJM-1-Rohlysat in 1,0 Milliliter bis 2,0 Milliliter einer 1%igen Agarosematrix (bezeichnet als Plugs) einbettet,
- diese Mixtur in einem Tris-haltigen, hochmolekularen EDTA-Puffer unter Zusatz von 2-
Mercaptoethanol als Sensibilisator bei 350C bis 400C über einen Zeitraum von 8 Stunden bis 24 Stunden inkubiert,
- die so behandelte Agarosematrix (Plugs) anschließend wiederum in Tris-Puffer wäscht sowie
- in Tris-haltigem, hochmolekularem EDTA-Puffer unter Zusatz von N-Lauroylsarcosinate bei 45°C bis 500C über 8 Stunden bis 24 Stunden inkubiert und
- die Plugs nach erneutem Waschen in hochmolekularem EDTA-Puffer in diesem bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man
- die in einer Konzentration von 2 x 108 Zellen/Milliliter in Tris-Puffer gewaschenen Zellen zusammen mit 6 Milligramm Oerskovia xanthineolytica GJM-1-Rohlysat in 1,0 Milliliter bis 1,5 Milliliter einer 1%igen Agarosematrix einbettet,
- diese Mixtur in Tris-haltigem, hochmolekularem EDTA-Puffer unter Zusatz von 2-Mercaptoethanol bei 37°C über einen Zeitraum von 16 Stunden bis 24 Stunden inkubiert und
- die erhaltenen Plugs nach Waschen in Tris-Puffer in EDTA-Puffer obiger Kennzeichnung bei 500C über 8 Stunden bis 16 Stunden nochmals inkubiert.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß man dem EDTA-Puffer obiger Kennzeichnung weiterhin 0,25 Milligramm bis 2,00 Milligramm Proteinase K zusetzt und in diesem Lysepuffer inkubiert.
9. Verfahren gemäß Anspruch 6 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß man
- nach der Inkubation den Lysepuffer obiger Kennzeichnung entfernt,
- die Plugs in T 1-RNAse-EDTA-Puffer aufnimmt, in diesem bei 37°C über 24 Stunden nochmals inkubiert und
- die so behandelten Plugs nach erneutem Waschen in hochmolekularem EDTA-Puffer in diesem bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
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