DD295870A5 - Verfahren zur mikrobiellen gewinnung von cyclosporinen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung beschreibt ein technisches Herstellungsverfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Cyclosporinen, welches in effektiver Weise erst durch den Einsatz eines neuen, bisher unbekannten Pilzstammes, der taxonomisch als Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD bestimmt wurde, ermoeglicht wird. Infolge der chemotherapeutischen und pharmakologischen Eigenschaften der Cyclosporine, insbesondere des Cyclosporin A, liegt das Anwendungsgebiet der Erfindung in erster Linie auf dem Sektor der Humanmedizin, wo die Wirkstoffklasse in zunehmendem Masze als Heilmittel von Interesse ist.{Mikrobiologie; Fermentation; Pilzstamm; Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD; zyklisches Peptid; Cyclosporine; Cyclosporin A}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide, wobei eine dieser Verbindungen, das Cyclosporin A, durch seine chemotherapeutischen und pharmakologischen Eigenschaften, insbesondere der ausgeprägten immunmodulatorischen Wirkung in der Allgemeinmedizin bevorzugt aber in der Transplantationsmedizin zunehmend als pharmazeutisch interessante Substanz und als Heilmittel weltweite Bedeutung erlangt hat.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die Cyclosporine gehören zu einer neuartigen Gruppe von Peptiden, die erstmals in den Patentschriften CH-PS 589716 bzw. CH-PS 603790 erwähnt und hinsichtlich ihrer chemischen Struktur und biologischen Wirkung beispielsweise in der Monografie von BOREL (Ciclosporin, Progress in Allergy 38, Karger-Verlag 1986) umfassend beschrieben werden.
Es ist bekannt, daß im technischen Herstellungsverfahren die Fähigkeit von Mikroorganismen zur Synthese der natürlichereweise vorkommenden Cyclosporine ausgenutzt wird, indem man diese Stämme als Produktbildner in einem Fermentationsverfahren bei Einhaltung allgemein bekannter und üblicher Kulturbedingungen verwendet.
Die äußerst geringe Anzahl verfügbarer und bisher technisch nutzbarer Produzentenstämme muß dabei jedoch als Nachteil bewertet werden.
Während der Mikroorganismus Tolypocladium inflatum GAMS, NRRL 8044-der bisher einzig bekannte Produzent, der großtechnische Bedeutung besitzt- und die Stämme Fusarium solani MARTIUS MCI-1549 und MCI-1550 (JP-OS 55-138523,
1980) in submerser Kulturführung zur Produktbildung befähigt sind, erfolgt die Synthese von Cyclosporinen bei Cylindrocarpon lucidum BOOTH, NRRL 5760 nur im Emerskultur. Das ökonomisch günstigste Herstellungsverfahren ist jedoch die submerse Fermentation.
Nach den Angaben von DREYFUSS et al. (Europ. J. Appl. Microbiol. 3,1976,125-133) werden intechn. Fermentoren mit dem Stamm Tolypocladium inflatum GAMS biologische Ausbeuten von 200mg Cyclosporin A pro Liter Kultur am 12. Tag der Fermentation erreicht, während AGATHOS et al. (J. of Industrial Microbiology 1,1986,39—48) mit gleichem Stamm Werte von maximal 180mg CY A/l angibt.
Durch spezielle Untersuchungen konnten KOBEL und TRABER (Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14,1982, 237-240) durch Fütterung spezieller Aminosäuren, deren großtechnischer Einsatz jedoch ausgeschlossen werden muß, eine weitere Erhöhung der Cyclosporin Α-Synthese erreichen. Bei Fütterung von 8g Threonin bzw. 8g Valin wurden an Cyclosporin A 396mg/l bzw.
319mg/l erhalten.
Für den Fall der Immobilisierung der Zellen von Tolypocladium inflatum GAMS erwähnt FOSTER et al. (Biotechnology Letters 5, 10.10,1983, 693-696) max. Ausbeuten von 240mg/l am 18.Kulturtag bzw. 300mg/l für unbehandeltes Ausgangsmaterial.
Mit der Anmeldung DD-285793 wurde ein Verfahren vorgeschlagen, wonach der Emersproduzent Cylindrocarpon lucidum BOOTH, NRRL 5760 in Form seiner Varianten bis zu 260mg/l Cyclosporin A bildet.
Im Sinne einer ökonomischen Nutzung der Produzentenstämme sind diese Raum-Zeit-Ausbeuten für ein technisches Herstellungsverfahren äußerst unbefriedigend, welches sich zudem im Hinblick auf die sich unmittelbar anschließende Isolierung und Reinigung der verschiedenen Cyclosporine, insbesondere des Cyclosporin A, die zwangsweise Wirkstoffverluste einschließt, nachteilig auswirkt.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat zum Ziel, therapeutisch wertvolle zyklische Peptide der Stoffgruppe der Cyclosporine mit einem ökonomisch günstigen Herstellungsverfahren in hoher biologischer Ausbeute bereitzustellen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Zahl verfügbarer und zur Cyclosporinsynthese befähigter Produzentenstamme zu erweitern und diese in technisch relevanter Größenordnung zu einer hohen Produktsynthese zu befähigen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man zur Fermentation einen neuen Stamm der Pilzspezies Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD oder eine aus dieser durch Mutagenese und/oder Selektion erhaltene Stammvariante als Produzentenstamm verwendet. Aus einem natürlichen Habitat der subtropischen Klimazone gelang es überraschenderweise, einen neuen bisher einmaligen Mikroorganismuszu isolieren, der nicht nur die gesuchte Stoffgruppe als Metabolit akkumuliert.
sondern diese und insbesondere das Cyclosporin A nach entsprechender Stammkonditionierung als Folge von Mutagenese- und Selektionsprozessen in submerser Kultur im Rahmen eines mehrstufigen technischen Fermentationsverfahrens in einer völlig unerwartet hohen Größenordnung bildet.
Der neue Mikroorganismus, der in dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung von Cyclosporinen verwendet wird, ist in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDR, unter der Nummer IMET-43888 hinterlegt; ebenso seine hochproduktive Stammlinie F 605, die die Hinterlegungsnummer IMET-43887 erhalten hat.
Dabei umfaßt die Erfindung natürlich auch alle durch Mutation und/oder Selektion des Wildstammes oder der o.g. Mutanten hervorgegangenen Stammvarianten.
Bei dem originellen Mikroorganismus handelt es sich um einen Vertreter der Pilze, der aus einer Bodenprobe Kubas in der Sierra del Rosario isoliert und taxonomisch einer neuen Gattung und Art mit der Bezeichnung Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD zugeordnet wurde.
Der Organismus wächst auf vielartigem Nährboden, die die üblichen Nährstoffe für Pilze enthalten.
Bei Anzucht auf Malz-Agar im natürlichen Tag-Nacht-Rhythmus entstehen innerhalb von 10 Tagen ca. 8cm große Kolonien mit schwach ausgebildeten, leicht flockigen, weißen Luftmyzel, welches sich bis zum Kolonierand erstreckt. Eine Ringbildung ist nur schwach in den Außenpartien der Kolonie zu beobachten. Ein schwacher Duft nach Binowürze ist feststellbar. Das Luftmyzel besteht aus septierten, verzweigten Hyphen, welche in Masse weiß erscheinen. Die aufsteigenden bis aufrechten Konidienträger sind in der Regel stark und mehr oder weniger wirtelig oder unregelmäßig verzweigt, tragen an ihren Zweigenden mehrere, durch Übergipfelung entstehende Phialiden, die farblos, pfriemlich und schlank gestaltet sind.
Die Konidien werden zu mehreren nacheinander an der Spitze der Phialiden gebildet; sie sind länglich, einzellig, hyalin, glatt- und dünnwandig zu einem kleinen Köpfchen verklebt. Chlamydosporen wurden nicht beobachtet.
Von allen ähnlichen Gattungen mit phialidischen, konidiogenen Zellen (z.B. Fusarium mit Mikrokonidien, Gliocladium, Verticillium, Sesquicillium, Sympodiophoya) unterscheidet sich der Stamm Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD infolge genannter Besonderheiten, vor allem aber aufgrund der Art und Weise der Anordnung der konidiogenen Zellen. Eine ausführliche Stammbeschreibung und weitere morphologische Einzelheiten zurtaxonomischen Einordnung des Stammes finden derzeit Eingang in eine laufende Monografie-Reihe für kubanische Pilze.
Die Kultivierung des neuen Stammes Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD und seiner aus ihm isolierten Linien erfolgt unter aeroben Bedingungen.
Nach Anzucht des Stammes auf geeigneten Agarmedien erfolgt die Übertragung von Sporen in ein flüssiges, vorher sterilisiertes OediumL wobei das entstehende Oyzel in an sich bekannter 'eise bei (emperaturen unter CJ°C, vorzugsweise 24°C, über einen Zeitraum von maximal 18 Tagen, vorzugsweise 12-14 Tage, in Glaskolben, Glasfermentoren und/oder in Fermentoren aus hochveredelten Stahllegierungen geschüttelt oder gerührt, in submerser Weise kultiviert wird.
Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie den üblichen Mineralsalzen und Spurenelementen. Als Kohlenstoffquelle können vor allem Maltose, Glukose und Saccharose verwendet werden; als Stickstoffquelle eignen sich insbesondere komplexe, aminosäurereiche Substrate, wie z. B. Peptone, Trockenhefe und Maisquellwasser. Die von dem erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismus gebildeten Cyclosporine werden nach ihrer Synthese nicht in das den Stamm umgebende flüssige, wäßrige Milieu ausgeschieden und müssen daher aus dem Myzel extrahiert werden. Der Nachweis von Cyclosporin A und weiterer Cyclosporine erfolgt in der Weise, daß man die Kultursuspension mit Methanol im Verhältnis 1:5 versetzt, das Myzel mit dem Ultra-Turrax homogenisiert und die zur Trockne eingeengten Methanolextrakte wiederum mehrmals mit Methylenchlorid/Wasser ausschüttelt. Die anschließend vereinigten und ebenfalls zur Trockne eingeengten Extrakte können nun in ein Gemisch von Acetonitril/Wasser aufgenommen und in Anlehnung an die Publikation von KREUTZIG (J. of Chromatography 290,1984,181-186) in an sich bekannter Weise mittels HPLC gegen Standard-Reinsubstanz qualitativ und quantitativ exakt bestimmt werden.
Nach Extraktion größerer Mengen des von der Kulturlösung abgtrennten wirkstoffhaltigen Myzels und mehrfacher säulenchromatografischer Reinigungsschritte des Extraktionsrückstandes können die verschiedenen Cyclosporine und vorzugsweise das Cyclosporin A als hochreine Substanz, die mittels üblicher analytischer Methoden eindeutig identifiziert werden kann, in hoher Ausbeute erhalten werden.
Ausführungsbeispiele
1. 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben enthalten je 100 ml des Nahrmediums folgender Zusammensetzung
75g/l Maltose
25g/l Kaseinpepton
1 g/l KH2PO4
2,5g/l KCI in entionisiertem Wasser, pH5,5.
Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension (1x 107 Sporen/ml) als Inokulum des Stammes Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD IMET Nr.43888 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer 10-14 Tage alten Kultur auf Malz-Agar hergestellt wird.
Nach 3tägiger Bebrütung bei 24"C auf einer Schüttelmaschine mit einer Frequenz von 190U · min"1 wird die Vorkultur in frisches Medium gleicher Qualität im Verhältnis 1:10 überführt und bei Einhaltung gleicher Bedingungen erneut kultiviert. Der am 12. Tag ermittelte Gehalt an Cyclosporin A betrug maximal 213mg/l Kultursuspension.
2. Anzucht und Kultivierung des Produzentenstammes erfolgt ebenso wie im 1 .Ausführungsbeispiel beschrieben, jedoch wird im Gegensatz dazu der aus dem Wildtypstamm IMET 43888 durch Mutagenese und Selektion erhaltene Hochleistungsstamm F 605, IMET 43887 eingesetzt.
Der maximal nachgewiesene Gehalt an Cyclosporin A betrug am 12. Kulturtag 1890mg/l.
3. Anzucht und Kultivierung des Stammes F 605, IMET 43887 erfolgt ebenso wie im 1. Ausführungsbeispiel beschrieben, jedoch wird im Gegensatz dazu der Produzentenstamm nach der Vorkultur in einem 5-I-bzw. 12-l-Laborfermentor überführt und in gleichem Medium oder in einem anderen Medium, welches z. B. statt Maltose Glukose enthalt, aerob kultiviert.
Die bis zu 15 Tagen durchgeführte Fermentation des Stammes ergab Cyclosporin Α-Werte bis maximal 2460mg/l.
4. Nach einer entsprechend Ausführungsbeispiele 1—3 durchgeführten zweistufigen Impfmaterialanzucht im Schüttelkolben bzw. Ruhrfermentor wurde der Stamm F 605, IMET 43887 als Inokulum fur die Produktionsstufe in einem 450-l-Fermentor aus legiertem Stahl eingesetzt und in der Weise überführt, daß sich zu Fermentationsbeginn 0,1 g/l Myzeltrockenmasse in der aus 75g/l Glukose, 25g/l Kaseinpepton, 2,5g/l KCI, 1 g/l KH2PO4 und Leitungswasser bestehenden, zuvor 60' bei 1200C sterilisierten Nährlösung, befanden.
Es wurden bereits nach 12 Kultivierungstagen bei rein diskontinuierlicher Prozeßfuhrung 860 mg Cyclosporin Apro Liter Kultur gemessen. Die gegen Fermentationsende erreichte Produktbildungsgeschwindigkeit betrug 0,006g/l · h für Cyclosporin A.
Die Kultivierung erfolgte bei 24°C. Sauerstofflimitation wurde vermieden. Die konstruktiven und betrieblichen Parameter garantierten Sauerstofftransportkoeffizienten (KLa) von mehr als 40 h"1.
Claims (3)
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Cyclosporinen, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Fermentation einen neuen Stamm der Pilzspezies Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD oder eine aus dieser durch Mutagenese und/oder Selektion erhaltene Stammvariante als Produzentenstamm verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den neuen Stamm der Pilzspezies Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD IMET 43888 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den neuen Stamm der Pilzspezies Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD F 605, IMET 43887 verwendet.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32061088A DD295870A5 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Verfahren zur mikrobiellen gewinnung von cyclosporinen |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32061088A DD295870A5 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Verfahren zur mikrobiellen gewinnung von cyclosporinen |
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| Publication Number | Publication Date |
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| DD295870A5 true DD295870A5 (de) | 1991-11-14 |
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ID=5603057
Family Applications (1)
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| DD32061088A DD295870A5 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Verfahren zur mikrobiellen gewinnung von cyclosporinen |
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|---|---|
| DD (1) | DD295870A5 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994016091A1 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Leiras Oy | A process for producing immunosuppressives and a novel microbial species to be employed therein |
| US7361636B2 (en) | 2004-10-06 | 2008-04-22 | Amr Technology, Inc. | Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents |
-
1988
- 1988-10-11 DD DD32061088A patent/DD295870A5/de unknown
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| US7361636B2 (en) | 2004-10-06 | 2008-04-22 | Amr Technology, Inc. | Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents |
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