DD296105A5

DD296105A5 - Stabilisierung von somatotropinen durch modifizierung von cystinresten durch orts-spezifische mutagenese oder chemische derivate

Info

Publication number: DD296105A5
Application number: DD33206389A
Authority: DD
Inventors: Susan M Cady; John S Logan; Brian L Buckwalter; Gerald W Stockton; Deborah T Chaleff
Original assignee: American Cyanamid Company,Us
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-24
Publication date: 1991-11-21
Also published as: PL164207B1; ZA896437B; PL164081B1; PL163920B1

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige modifizierte oder derivatisierte rekombinante Tier-Somatotropine. Die Erfindung betrifft auszerdem Methoden zur Stabilisierung rekombinanter Tier-Somatotropine durch Modifizierung oder Deletierung der Cysteinreste unter Anwendung seitengerichteter Mutagenese, um einen bis vier von den Cysteinaminosaeureresten der Somatotropine durch einen oder mehrere unterschiedliche Aminosaeurereste zu ersetzen, oder durch Derivatisierung von (1) beiden Cysteinaminosaeureresten in der kleinen Schleife des Somatotropins, beiden Cysteinaminosaeureresten in der groszen Schleife oder der vier Cysteinaminosaeurereste in beiden Schleifen des Somatotropins.{Neuartige rekombinante Tier-Somatotropine; Methoden zur Stabilisierung rekombinanter Tier-Somatotropine; Modifizierung von Cysteinresten; Delegierung von Cysteinresten}

Description

Die Erfindung betrifft neuartige modifizierte oder derivatisierterekombinante Tier-Somatotropine, in denen mindestens einer (1) der vier (4) Cysteinaminosäurereste der rekombinanten Tier-Somatotropine ersetzt, modifiziert, deletiert oder derivatisiert ist. Obwohl Somatotropin rekombinant erzeugt wurden und weiterhin erzeugt werden, sind derartige Somatotropine häufig für eine wirksame Anwendung bei einem Tier schwierig zu formulieren. Im Gegensatz zu den auf diese Weise exprimierten Somatotropinen wurde entdeckt, daß die Veränderung oder Eliminierung der Cysteinreste, von denen vier in Somatotropinen vorhanden sind, entweder durch Substitution durch eine andere Aminosäure oder durch Oerivatisierung der Cysteine in biologisch aktiven Verbindungen mit verstärkter Stabilität für die Formulierung zu annehmbaren Formen zur Verabreichung an Tiere resultiert.

Ziel der Erfindung

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neuartige Tier-Somatotropine zur Verfugung zu stellen, worin mindestens einer (1) der Cysteinreste des Somatotropins durch eine andere Aminosäure ersetzt, modifiziert, deletiert oder chemisch derivatisiert wurde. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, zwei (2), drei (3) oder alle vier (4) der Cysteinreste von Tier-Somatotropinen zu substituieren und/oder zu derivatisieren und diese neuartigen Verbindungen zur Verfugung zu stellen. Zwei Cysteine befinden sich in der kleinen Schleife und zwei in der großen Schleife.

Ein weiteres Ziel der Erfindung betrifft die Bereitstellung von Zusammensetzungen der substituierten, ersetzten (modifizierten), eliminierten und/oder derivatisierten Tier-Somatotropine, die biologisch wirksam und für die Verabreichung stabil sind. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Schaffung von Zusammensetzungen biologisch aktiver rekombinanter Tier-Somatotropine, die sich für die parenterale Verabreichung eignen und eine das Wachstum fördernde Menge eines modifizierten oderderivatisierten rekombinanten Tier-Somatotropins, oder eines pharmazeutisch oder pharmakologisch annehmbaren Salzes davon, in einem pharmazeutisch oder pharmakologisch annehmbaren festen oder flüssigen Trägermittel enthalten, wodurch die Wachstumsrate eines Tieres über einen längeren Zeitraum von fünf Tagen oder mehr verstärkt wird. Diese und weitere Ziele der Erfindung werden aus der unten folgenden ausführlicheren Beschreibung der Erfindung deutlich werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung betrifft neuartige modifizierte (substituierte^] oder eliminierte(s) Cystein(e)) oder derivatisierte rekombinante Tier-Somatotropine, worin einer bis vier der Cysteinaminosäurereste der Somatotropine durch einen bis vier Aminosäurereste ersetzt ist (sind), die einzeln ausgewählt sind aus den Aminosäuren Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Histidin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Methionin, Serin, Threonin oder Prolin; oder in denen alle vier Cysteine zu Cysteinsäure umgewandelt sind; oder in denen beide Cysteine in der kleinen Schleife oder beide Cysteine in der großen Schleife oder alle vier Cysteine in den beiden Schleifen mit Substituents derivatisiert sind, ausgewählt unter (CH₂COOH), |CH(CO₂H)(CH₂)_XCO₂H], (CH₂CONR₃R₄), (R₅), |(CH₂)„SO₃J, (CHCH₂CONR₃CO), (CH₂)_mNR₃R₄, (CH₂OCOCH₂R₅) oder (SR₆); worin R₃ und R₄ jeweils sind H, |(CH₂)«CO₂H|, ICH(CO₂H)(CH₂)_XCO₂H1, C,-C_e-Alkyl, wahlweise substituiert mit O bis 2 Hydroxylgruppen, oder Polyethylenglycol; R₅ Ct-Ce-Alkyl oder Ci-C₄-Alkoxymethyl ist und R_s Ct-Ce-Alkyl, Polythylenglycol oder Phenyl ist, wahlweise substituiert durch eine oder zwei Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen; η eine ganze Zahl von O bis 4 ist, m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist; und χ eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; vorausgesetzt, daß, wenn die Cysteinaminosäurereste des rekombinanten Tier-Somatotropins derivatisiert sind, beide Cysteinreste in der kleinen Schleife oder beide Cysteinreste in der großen Schleife des Somatotropins durch die gleiche Gruppe substituiert sind; vorausgesetzt

gleichfalls, daß die Substituenten an den Cysteinresten in der kleinen Schleife (labil und am dichtesten am C-Terminus) die gleichen oder andere Substituenten wie (als) die an den Cysteinen der großen Schleife (stabil und am dichtesten am N-Terminus) sein können; und weiter unter der Voraussetzung, daß, wenn ein Cysteinaminosäurerestzu Cysteinsäure oxydiert ist, alle Cysteinreste in dem Somatotropin zu Cysteinsäure oxydiert sind.

Die Erfindung betrifft auch Methoden für die Inhibierung der Aggregation von rekombinantem Tier-Somatotropin durch die Suöstitution von einem oder mehreren der an den Positionen 55,166,183 oder 191 eines rekombinanten Tier-Somatotropins befindlichen Cysteinaminosäureresten durch Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Histidin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Methionin, Serin, Threonin oder Prolin, oder die Oxydation aller vier Cysteinreste zu Cysteinsäure.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode zur Inhibierung der Aggregation von rekombinantem Tier-Somatotropin durch Reduzierung von mindestens einer der beiden Disulfidbrücken zwischen den Cysteinaminosäureresten an den Positionen 55 und 166 oder an den Positionen 183 und 191 der Somatotropine und anschließende Derivatisierung jedes der Cysteine der reduzierten Brücke oder Brücken an den Positionen 55 und 166 und/oder an den Positionen 183 und 191 mit dem gleichen Derivat, unter der Voraussetzung, daß die Derivate an den Cysteinen an den Positionen 55 und 166 die gleichen oder andere Substituenten sein können wie (als die Substituenten) an den Cysteinen an den Positionen 183 und 191. Die für die Herstellung der neuartigen derivatisierten rekombinanten Tier-Somatotropine der Erfindung verwendeten Substituenten umfassen die folgenden: (CH₂COOH), [CH(CO₂H)(CHj)_xCO₂H], (CH₂CONR₃R₄), (R₅), [(CH₂I_nSO₃], (SR₆), (CHCH₂CONR₃CO), (CH₂)_m, NR₃R₄ oder (CH₂OCOH₂Rs), worin R₃ und R₄ jeweils sind H, [(CH₂J_xCO₂H], [CH(CO₂H)(CH₂H], C,-C₆-Alkyl, wahlweise substituiert durch O bis 2 Hydroxylgruppen, oder Polyethylenglycol; R₅ C,-C₆-Alkyl oder C,-C₄-Alkoxymethyl ist; R₆ C₁-C₆-AIkYl, Polyethylenglycol oder Phenyl ist, wahlweise substituiert durch eine oder zwei Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen; η eine ganze Zahl von O bis 4 ist; und m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist und χ eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den bevorzugten neuartigen Tier-Somatotropinen um rekombinante Schweine-, Rinder-, Schaf-, Human- und Vogelsomatotropine, in denen die Disulfidbrücke in der kleinen Schleife des Somatotropins reduziert ist und die Cysteine an den Positionen 183 und 191 mit einem Substituenten derivatisiert sind, ausgewählt unter (CH₂COOH), [CH [CO₂H)(CH₂)_XCO₂H], (CH₂CONR₃R₄), (R₅), (CH₂J_nSO₃ oder (SR₆), worin R₃, R₄, R₅, R₆, η und χ die erläuterte Bedeutung haben.

Die Cysteine werden gleichfalls von einem Cystein bis zu allen vier eliminiert.

Alle in Verbindung mit der Patentanmeldung hinterlegten Plasmide, DNA-Sequenzen und Mikroorganismen sind, wenn nicht das Gegenteil spezifiziert wird, in der Kultursammlung der American Cyanamid Company in Princetown, New Jersey, hinterlegt und sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockeville, Maryland, 20952, USA, hinterlegt.

Zur weiteren Beschreibung der Erfindung wird auf die Zeichnungen verwiesen. Es zeigen

Fig. 1: Klonierung des Schweine-Somatotropin-Gens in M13mp11. M13mp11 -RF-DNA wird mit den Restriktions-Enzymen ECoRI und Hindlll geschnitten, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt. Das Expressions-Plasmid pEFF-902 wird mit den Restriktionsenzymen ECoRI und Hindlll digeriert. Die entsprechenden Fragmente werden nach der Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel gereinigt. Die gereinigten Fragmente werden ligiert und in E. coli JM101 transformiert. Die Struktur der resultierenden M13mp11 pST-RF-DNA ist abgebildet.

Fig. ?: Die schematische Darstellung des Mutagenese-Schemas unter Verwendung des AA1-Oligonucleotids und einsträngiger M13mp11pST-DNA.

Fig.3: DNA-Sequenz-Analyse von einsträngiger M13mp11 ST-DNA und einsträngiger M13mp11pST34-DNA unter Anwendung der Didesoxy-Ketten-Terminations-Methode von Sanger. Die Reihenfolge der Spuren von links nach rechts ist GATC für Wildtyp-Schweine-Somatotropin (pST) gefolgt von GATC für mutantes pST34.

Fig.4: Schematische Darstellung des Mutagenese-Schemas unter Anwendung der Oligonucleotide GLU3 und GLU 4 und einsträngiger Ml 3mp1 IpST-DNA.

Fig. 5: Schematische Darstellung der Konstruktion des bakteriellen Expressions-Vectors, der das mutierte pST-Gen enthält. Die| Plasmide verleihen Widerstandsfähigkeit gegen das antibiotische Ampicillin (amp®).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Bevorzugte erfindungsgemäße modifizierte rekombinante Tier-Somatotropine werden anschließend dargestellt, jedoch werden rekombinant-abgeleitete Somatotropine ohne die zusätzlichen Asp-Gln-Zusatz-Substitutionen oder mit anderen Substitutionen' gleichfalls in Übereinstimmung mh der Erfindung erzeugt. Weitere Tier-Somatotropine mit Deletionen in der Aminosäure-Kettenlänge, Additionen zur Aminosäure-Kettenlänge, Ersetzen von Aminosäuren (neben Cysteinen), Fragmenten mit den aktiven Anteilen und dergleichen liegen alle innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung. Die hier erfolgte Numerierung der Aminosäurereste bezieht sich von einem Fachmann entsprechend verändert werden, um die von den vier Cysteinresten gebildeten Disulfidbrücken zu identifizieren.

RekombinantesSchweine-Somatotropin

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-Ala-

Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp- \

Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg- j

Tyr-Ser-Ile-

55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ata-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-GIn-I Ie-Le u-Ly s-G In-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Th r-Asn-Leu-Ar g-Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rz.-Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R.-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R^-Ala-Phe-OH. RekombinantesRinder-Somatotropin

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-AIa-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-AIa-As p-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-Thr-lle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-G Iy-IIe-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

AIa-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rj,—Phe-Arg-Lys—Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg

183 191

Val-Met-Lys-R,-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R_l,-Ala-Ph©-OH. Rekombinantes Schaf-Somatotropin

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-

55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-P^e-Rz-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ate-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Il e-Ser-Leu-Le u-Leu-l Ie-G I n-Ser-Trp-Leu-G ly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Val-Thf-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

AIa-Leu-Leu-Lys—Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser—R₂,-Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-Ru-Ala-Phe-OH. Rekombinantes Pferde-Somatotropin

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Ala-Tyr-lle-Pro-Glu-Gly-GliY-Arg-Tyr-Ser-lle-

55

GIn-As n-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rz-Phe-Ser-Glu-Thr-lle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Met-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Raa-Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-Ru-Ala-Phe-OH. Rekombinantes Human-Somatotropin

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-Gln-Glu-Phe-Glu-Glu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe-

56

Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-Rr-Phe-Ser-Glu-Ser-Ile-Pro-

Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-Gln-Gln-Lys-Ser-Asn-Leu-Glu-

Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-

Val-Gln-Phe-Leu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-Gly-

Ala-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu—Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-

Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-

Thr-Gly-Gln-lle-Phe-Lys-Glrv-Thr-Tyr-Ser-^_ys-Phe-Asp-Thr-Asn-

Ser-His-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-Lys—Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr-167

Rja-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe-

184

Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Rj-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-191 Ri.-Gly-Phe-OH.

Rekombinantes Vogel-Somatotropin

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Asn-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Leu-Leu-Ala-Ala-Gln-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-

55

Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Tyr-Rj-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Met-Gly-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Thr-Pro-Val-Gln-Tyr-Leu-Ser-Lys-Val-Phe-Thr-Asn-Asn-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-

Ser-Asp-Arg-Val-Phe-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile- —

Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Arg-Ser-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Leu-Leu-Arg-Pro-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Ile-His-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-SeM^-Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Val-Glu-Thr-Tyr-Leu-Lys-

183 191

Val-Met-Lys-RrArg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ser-Asn-Rn-Thr-lle-OH.

worin R₁, R₁ „ R₂ und R_Ja der rekombinanten Tier-Somatotropine jeweils unabhängig unter Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Histidin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Methionin, Serin, Threonin, Prolin oder Cystein ausgewählte Aminosäurereste darstellen; unter der Voraussetzung, daß mindestens einer der durch R₁, R₁ „ R2 und Rj, in den oben angeführten Somatotropinen dargestellten Aminosäurereste einen anderen Aminosäurerest als Cystein darstellt

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße modifizierte rekombinante Tier-Somatotropine sind diejenigen, in denen einer oder beide der R₁-und R_1a-Substituenten an den Positionen 183 und 191 desSomatotropinsoderan den Positionen 184 und 191 des rekornbinanten Human-Somatotropins andere Aminosäuren als Cystein darstellen.

Seitengerichtete Mutagenese

Die Hersteller der oben erläuterten erfindungsgemäßen modifizierten (substituierten) rekombinanten Tier-Somatotropine wird durch seitengerichtete Mutagenese erzielt. Die zur Zeit üblichen Techniken für die Veränderung der DNA-Sequenz eines klonierten Segments von DNA an einer spezifisch definierten Stelle erfordern die Produktion einer einsträngigen Form dieser DNA. Die einsträngige DNA wird zu einem synthetischen Oligonucleotid hybridisiert, das zu einem Teil davon komplementär ist, nur daßdas Oligonucleotid in sich einen Bereich von Fehlanpassung enthält. Der Bereich der Fehlanpassung befindet sich normalerweise im Mittelabschnitt des Oligonucleotids. Das hybridisierte Gemisch wird dann doppelsträngig gemacht und kovalent durch die Zugabe von E. coli DNA-Polymerase I als großes Fragment und Desoxynucleotid-Triphosphaten in Gegenwart von T4-DNA-Ligase und Adenosin 5'-Triphosphat geschlossen. Die doppelsträngige DNA wird anschließend in einen jj

entsprechenden E. coli Stamm transformiert, wo der Fehlanpassungsbereich der DNA repariert und repliziert wird. Es werden zwei Populationen von Klonen gewonnen. In Abhängigkeit davon, welcher Strang als Matrize für die Reparatursynthese gewählt wird, enthält ein Klon entweder die Wildtyp- oder die veränderte (mutierte) Sequenz. Die Klone, welche die mutierte Sequenz enthalten, d. h. diejenigen, die der Sequenz des Oligonucleotids entsprechen, werden durch Hybridisierung zu dem radioaktivmarkierten Oligonucleotid ausgewählt. Infolge der Fehlanpassung zwischen dem Oligonucleotid und der Wildtyp-Sequenz ist das radioaktiv-markierte Oligonucleotid stabiler an die die mutierte Sequenz enthaltenden Klone gebunden. Durch Inkubation bei einer angemessenen Temperatur wird daher zwischen Wildtyp-und mutierten Klonen unterschieden. Die Veränderungen in den identifizierten Klonen werden dann durch DNA-Sequenzierung der relevanten Bereiche bestätigt. In den folgenden Diskussionen wird rekombinantes Schweine-Somatotropin als repräsentativ für die erfindungsgemäßen modifizierten und derivatisierten rekombinanten Tier-Somatotropine und die für ihre Herstellung angewandten Methoden gewählt. Die Klonierung des Schweine-Somatotropin (rpST)-Gens in die Einzelstrang erzeugende Vector-Bakteriophage M13mp11 (ATCC Zugriffs-Nummer hinterlegt ) wird durch die folgende in Fig. 1 schematisch dargestellte allgemeine]

Verfahrensweise erreicht.

Ein das Schweine-Somatotropin (rpST)-Gen enthaltendes Fragment von DNA wird von dem bakteriellen Expressions-Plasmid, pEFF-902 (ATCC Zugriffs-Nummer hinterlegt ) durch Spaltung mit den Restriktions-Enzymen ECoRI und

Hindlll isoliert. Das das rpST-Gen enthaltende Fragment wird anschließend durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. M 13mp 11-replikative Form (RF)-DNA wird mit ECoRI und Hindlll digeriert, mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt] und das große Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Die beiden gereinigten Fragmente werden danach miteinander vermischt und mit T4 DNA-Ligase ligiert. Die Mischung wird in E. coli JM101 transformiert (ATCC Zugriffs-Numrner hinterlegt ), und verschiedene der resultierenden Plaques werden gezüchtet. Replikative Form

(RF)-DNA wird durch ein alkalisches Standard-Lyseverfahren hergestellt und die Struktur durch Digestion mit passenden Restriktionsenzymen bestimmt. Es wird ein die erwarteten Fragmente enthaltender Klon isoliert und als M13 mp 11 pST (ATCC Zugriffs-Nummer , hinterlegt ) bezeichnet. Die DNA-Sequenzanalyse wird zur Bestätigung der Identität des

Klons angewandt.

Die Mutagenese des rpST-Gens in M13 mp 11 pST wird dann nach der folgenden Beschreibung und der Darstellung in Fig. 2 erzielt. Ziel des Mutagenese-Programms ist die Erzeugung eines rpST-Moleküls, das die Bildung der Disulfidbindung der kleinen Schleife, der Disulfidbindung der großen Schleife oder beider durch Substitution der relevanten Cysteinreste durch andere Aminosäuren nicht bewirken kann. Das Disulfid der großen Schleife befindet sich zwischen Cysteinen an den Positionen 55 und 166 in dem rpST-Gen. Das Disulfid der kleinen Schleife liegt zwischen den bei 183 und 191 befindlichen Cysteinen. Das Numerierungssystem ist wie beschrieben. Es werden zwei grundlegende Protokolle zur Gewinnung der erforderlichen Mutanten verwendet, und Beispiele für jedes werden anschließend beschrieben.

Bei der ersten Methode wird die Substitution der Cysteine in der Disulfidbindung der kleinen Schleife durch Anwendung eines langen synthetischen-OUgonucleotids erreicht.Bei dieser Methode wird das als AAI bezeichnete Oligonucleotid verwendet, das die folgende Sequenz hat:

5'GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Dadurch wird die Sequenz des pST-Gens so verändert, daß das Codon für Cystein in der Position 183 von TGT zu GCG umgewandelt wird, das für Alanin kodiert, und das Cystein in der Position 191 von TGT zu GCT umgewandelt wird, das gleichfalls für Alanin kodiert. Daher werden die Cysteine in der kleinen Schleife beide zu Alanin umgewandelt. Einsträngige M13 mp 11 pST-DNA wird nach Standard-Protokollen aus gereinigter Phage gewonnen. Schematisch sind in Fig. 2 die Grundzüge der Mutagenesemethode dargestellt. 1000 ng einst rängiger M 13mp1 IpST-DNA werden mit 50 ng AA1-Oligonucleotid vermischt, das vorher mit Adenosin 5' Triphosphat und Polynucleotid-Kinase 5'-phosphoryliert worden ist. Die Mischung wird 7 Minuten lang auf 65⁹C erhitzt und anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Durch dieses Protokoll wird das Oligonucleotid zu der einsträngigen DNA hybridisiert. Diese hybridisierte DNA wird anschließend in eine doppelsträngige kovalent geschlossene Form durch die Zugabe von ATP, dNTP's (ein Gemisch der vier Desoxyribonucleotid 5' Triphosphate), 4 DNA-Ligase und DNA-Polymerase I als großes Fragment umgewandelt. Das Gemisch wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wird anschließend in E. coli JM101 durch ein Calciumchlorid-Standardverfahren transformiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C, sind Plaques auf einem Rasen von JM101 zu sehen. Die Plaques werden auf Nitrocellulose-Filter gesetzt und für die Hybridisierung durch Standard-Protokolle behandelt. Ein zweites als AA1D bezeichnetes Oligonucleotid wird für den Nachweis der Mutanten verwendet. AA1D hat die folgende Sequenz 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Es wird an dem 5'-Ende mit c-^MP-ATP und Polynucleotid-Kinase radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 37°C in 5x SSC (1 x SSC ist0/I5M Natriumchlorid,0,015M Natriumeitrat, pH7,0), 1 χ Denhardt's (0,02% (M/VJ Ficoll,0,02% IM/V] Schweineserumalbumin, 0,02% Polyvinylpyrollodon), 15olg/ml tRNA nach Hybridisierung. Die Filter werden nacheinander in 5x SSC bei 4°C, TAC (TAC ist 3M Tetramethylammoniumchlorid, 5OmM (tris)[Hydroxymethyl]aminomethan, pH8,0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure], 0,1 % (M/V] Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und schließlich in TAC bei der verlangten Temperatur gewaschen. Durch diese letzte Wäsche wird die Spezifität bestimmt. Für AA1D beträgt die Temperatur 52,5°C. Nach der Belichtung sind auf Röntgenfilm nur die Klone zu sehen, die zu AA1D vollkommen komplementär sind. Verschiedene dieser Klone werden mit Hilfe von DNA-Sequenzierung analysiert. Von ihnen enthalten alle die erste Mutation, aber keiner von ihnen enthält die zweite (an Cystein 191) Mutation.

Zur Mutation des Cysteins an Position 191 wird ein zweites als A1 bezeichnetes Oligonucleotid verwendet. A1 hat die folgende Sequenz:

5'GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Der Mutageneseprozeß ist dem oben unter Verwendung von AAI beschriebenen identisch, mit dem Unterschied, daß die Matrizen-DNA M13 mp 11 ρ STA 3 ist (es handelt sich um den von der AA1 -Mutagenese isolierten Klon, dessen an Position 183 befindliches Cystein zu Alanin umgewandelt ist), und die Hybridisierung mit A1 erfolgt. Die abschließende Waschtemperatur beträgt 56°C. Die DNA-Sequenzierung zeigt, daß die identifizierten Klone die erwartete Sequenz aufweisen. Der mutierte Klon wird als M13 mp 11 pSTA34 bezeichnet (ATCC Zugriffs-Nummer , hinterlegt ). Die DNA-Sequenz wird in

Fig. 3 gezeigt.

Bei der zweiten Methode wird die Substitution der Disulfidbande der kleinen Schleife durch die Anwendung von zwei Oligonucleotiden in dergleichen Reaktion erreicht, und sie geht aus Fig.4 hervor. Die beiden Oligonucleotide haben die folgende Sequenz:

5'GTC	ATG	AAG	GAA	CGC	CGC	TTC	3'GLU 3
			GLU
5'GAG	AGC	AGC	GAG	GCC	TTC	TAG	3'GLU 4.
			GLU

Die einsträngige Matrizen-DNA ist M13 mp 11 ST (ATCC Zugriffs-Nummer , hinterlegt Y. Die beiden

Oligonucleotide und die Matrizen-DNA werden in der gleichen Reaktion wie zuvor hybridisiert, erweitert und ligiert. Das Gemisch wird in E. coli JM101 transformiert

Der Unterschied bei dieser Methode besteht darin, daß zwei Entnahmen von jeder Platte erfolgen. Jede Entnahme wird getrennt entweder zu ³²P-markierter GLU 3 oder GLU 4 hybridisiert. Die abschließende Waschtemperatur beträgt für jedes Oligonucleotid 56^eC. Nur diejenigen Plaques, die für beide Oligonucleotide positiv sind, werden gesammelt. Die DNA-Sequenzierung ergibt, daß beide Cys 183 und Cys 191 zu Glutaminsäure umgewandelt wurden. Der Klon wird als M13mp11 pSTE34 bezeichnet (ATCC Zugriffs-Nummer hinterlegt ). Diese Methode wird angewandt, um Mutationen zu erzielen, welche die

Bildung von Oisulf id der großen Schleife verhindern, indem zwei geeignete Oligonucleotide nach obiger Beschreibung und M13 mp 11 pST verwendet werden. Selbstverständlich wird bei Verwendung von M 13mp 11 pSTA34 als die Matrizen-DNA und i von zwei für die Umwandlung von Cys 55 und Cys 166 zu Alanin geeigneten Oligonucleotiden ein Klon erhalten, in dem alle Cysteinreste zu Alanin umgewandelt sind.

Die veränderten (Muta nt-) Klone werden anschließend in das Bakterien-Expressions-Plasmid pRO 211 (ATCC Zugriffs-Nummer , hinterlegt ) rekonstruiert, wie in Fig.5 schematisch dargestellt wird (beschrieben in EP 173.280). Die M13- *

Klone werden mit EcoRl und Hindlll geschnitten, und das pST-Genfragment wird isoliert. pRO211 wird mit den gleichen Enzymen digeriert, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt, und das große Fragment wird isoliert. Die beiden Stücke werden mit; T4-DNA-Ligasezusammenligiert und in einer entsprechenden Bakterienstamm, z. B. E. coli N 99cl (ATCC Zugriffs-Nummer , hinterlegt ) transformiert. In diesem Stamm ist ein Wildtyp-k-Repressor vorhanden. Dieser verhindert die

Expression von dem P_L-Promotor in pRO211. Sobald die passende Konstruktion isoliert ist, wird sie anschließend in |

Bakterienstämme transferiert, die einen temperaturempfindlichen k-Repressor, z. B. (ATCC Zugriffs-Nummer hinterlegt ).

E. coli 4200 enthalten. In diesen Stämmen ist die Expression von pST von der Temperatur abhängig. Bei 42°C ist der Repressor inaktiv und es erfolgt Expression. In diesem Stadium wird pST mit Hilfe von in EP 173.280 angeführten Verfahren, worin Expression erfolgt, erzeugt (hier durch Hinweis darauf einbezogen). Die Expression von pST ist nicht auf diese speziellen E. coli-Stämme beschränkt. Andere Stämme mit entsprechenden Eigenschaften werden substituiert. Die Plasmid-Expressions-Vectoren sind bei dem ATCC hinterlegt. Die Bakterienstämme werden gesondert hinterlegt.

Andere Aminosäuresubstitutionen werden mit Hilfe der obigen Verfahrensweisen unter Verwendung der entsprechenden Codons und Oligonucleotide vorgenommen. Diese Verfahrensweisen werden in ähnlicher Weise für die Modifizierung einer Reihe von Tier-Somatotropinen angewandt.

Zu den modifizierten rekombinanten Tier-Somatotropinen, die mit Hilfe der obigen Verfahrensweisen leicht herzustellen sind, zählen (AIa 55,166)rpST; (Ser 55,166)rpST; (AIa 183,191)rpST; (GIu 183,191)rpST; (GIu 183-AIa 191)rpST; (Ser 183,191)rpST; und(Glu 183-Ser 191 )rpST. ~

Derivatisierte Tier-Somatotropine

Derivatisierte Tier-Somatotropine, rekombinante werden bevorzugt, werden durch Auflösung oder Dispersion eines Tier-Somatotropins in Wasser oder einer wäßrigen Lösung von Guanidinhydrochlorid, Natriumhydrogencarbonat oder dergleichen, die mit wäßriger Base wie Natrium-oder Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,4 eingestellt wurde, hergestellt. Zu dieser Lösung wird dann langsam Dithiothreitol, d.h. (DL-threo-1,4-dimercapto-2,3-butandiol) gegeben. Die Zugabe erfolgt im allgemeinen unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur. Zu der resultierenden Lösung werden anschließend Jodacetamid, Jodessigsäure, Natriumtetrathionat, Methylmethanthiosulfonat, 1,3-Propansulfon oder anderes Derivatisierungsmittel gegeben. Die Mischung wird etwa eine bis vier Stunden lang gerührt, danach durch Ultrafiltration entsalzt. Die Lösung wird eingeengt und anschließend verschiedenen Zyklen von erneuter Verdünnung mit Wasser, wäßrigem * Guanidinhydrochlorid oder dergleichen unterzogen, worauf Ultrafiltration folgt Der Rückstand von der letzten Filtration wirdzur j Gewinnung von derivatisiertem rpST lyophilisiert.

Anwendungsmethode

Die erfindungsgemäßen neuartigen Tier-Somatotropine sind vorteilhaft für die Verbesserung der Wachstumsrate von Tieren, vor allem von fleischerzeugenden Tieren, und für die Erhöhung des Wirkungsgrades der Futterausnutzung. Diese Verbindungen' sind auch wirksam für die Verbesserung der Rumpfqualität der Tiere, d. h. für die Steigerung des Verhältnisses von magerem Fleisch zu Fett bei diesen Tieren. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen für die Steigerung der Milcherzeugung von Milchvieh und die Verbesserung der Wollerzeugung bei Schafen und anderen Tieren, die wegen der Haut!

gehalten werden, wirksam.

Während die erfindungsgemäßen modifizierten (substituierten) oder derivatisierten Somatotropine für die Behandlung von Tieren wirksam sind, um die oben beschriebenen biologischen Verbesserungen zu erzielen, hat es den Anschein, als ob die verbesserte Wirksamkeit und Nützlichkeit der erfindungsgemäßen modifizierten oder derivatisierten Tier-Somatotropine teilweise der Inhibition der Aggregation des durch die Modifikation oder Derivatisierung der Somatotropine erzeugten Somatotropins zuzuschreiben sei. Eine derartige Inhibition ermöglicht die Herstellung von wesentlich verbesserten Abgabesystemen mit verzögerter Wirkung, die nicht ohne weiteres oder effektiv mit natürlichen Somatotropinen oder rekombinanten Somatotropinen, die nicht nach der erfindungsgemäßen Beschreibung modifiziert oder derivatisiert wurden, erzielen sind.

Es wurde gleichfalls gefunden, daß die erfindungsgemäßen modifizierten oder derivatisierten Somatotropine überaus stabil sind und im wesentlichen keine Aggregation infolge von Dimerbildung aufweisen. Darüber hinaus eignen sich die erfindungsgemäßen modifizierten oder derivatisierten Somatotropine für die Anwendung bei der Herstellung von erheblich verbesserten Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung.

Von natürlichen Tier-Somatotropinen wurde ermittelt, daß sie schon nach einem Tag Aggregation aufweisen, während bei parenteralen Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen modifizierten oder derivatisierten Somatotropine enthalten, eine Freisetzung über 10 Tage oder langer zu verzeichnen ist.

Zusammensetzungen

In der Praxis werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen den Tieren im aligemeinen durch Injektion in Form von biologisch aktiven parenteralen Zusammensetzungen verabreicht. Zu den für die Verabreichung der erfindungsgemäßen rekombinanten Tier-Somatotropine nützlichen parenteralen Zusammensetzungen gehören Gele, Pasten, Mikrokügelchen, Mikrokapseln, Implantate und dergleichen. Daher besteht ein beträchtliches Interesse an der Bereitstellung von Dosierungsformen biologisch aktiver Substanzen, welche die Substanz in einer kontrollierten Form freisetzen und dadurch ( Häufigkeit der Verabreichung verringern.

Die Entwicklung von Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung von biologisch aktiven Makromolekülen bereitet wegen ihrer komplizierten Wirkungsweise und der schwierigen Strukturen der Makromoleküle spezielle Probleme. Daher ist die Entwicklung von effektiven Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung, die biologisch aktives Somatotropin enthalten, erforderlich.

Die für diese Art der Verabreichung brauchbaren Zusammensetzungen werden dadurch hergestellt, daß das modifizierte oder derivatisierte Tier-Somatotropin in verdünntem Ammoniumhydroxid gelöst und dann eine Lösung von Alkalimetallbenzoat, -laurat, -carbonat oder dergleichen zugegeben wird. Ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel wird anschließend mit der Lösung vermischt, und das resultierende Gemisch wird sprühgetrocknet. Die auf diese Weise gebildeten Feststoffe werden anschließend mit geschmolzenem Fett oder Wachs oder einem Gemisch derselben vermischt, und das resultierende geschmolzene Gemisch wird durch eine Luft/Flüssigkeit-Sprühdüse gespritzt, die mit einem beheizten Mantel ausgestattet ist, um die einströmende Luft und die geschmolzene Phase auf einer über dem Schmelzpunkt liegenden Temperatur zu halten. Die Mikrokügelchen werden beim Abkühlen der geschmolzenen Tröpfchen gebildet. Diese werden auf einer Reihe von Sieben im verlangten Größenbereich von etwa 45 bis 180 Mikrometer gesammelt und für den Gebrauch aufbewahrt. Mikrokügelchen, die nicht dem verlangten Größenbereich entsprechen, werden wieder zurückgeleitet. Alternativ wird das homogene Gemisch auf eine Zentrifugenscheibe geführt, und die auf diese Weise gebildeten Mikrokügelchen werden wie oben gesammelt, oder das geschmolzene Gemisch wird abgekühlt und zu dem verlangten durchschnittlichen Teilchengrößenbereich gemahlen. Die biologisch aktiven Mikrokügelchen werden danach in einem pharmazeutisch und pharmakologisch annehmbaren flüssigen Vehikel für Injektionen bei Tieren dispergiert. Die Mikrokügelchen-Flüssigkeit-Zusammensetzung wird im allgemeinen durch subkutane Injektion unter die Haut des Tieres, gewöhnlich in der Nähe des Kopfes, Halses oder der Ohren, verabreicht. Die erfindungsgemäßen modifizierten oder derivatisierten Tier-Somatotropine werden ebenfalls als bioverträgliche Implantate hergestellt, die unter die Haut des Tieres unter Anwendung einer herkömmlichen Pellet-Implantat-Spritze injiziert werden. Diese Zusammensetzungen werden durch Vermischen eines pulverisierten modifizierten oder derivatisierten Somatotropins mit einem Wachs wie Kastorwachs oder mit einer Mischung von einem Copoly (Glycolid/Lactid), Magnesiumhydroxid und einem Kondensat von Ethylenoxid hergestellt, das mit einer hydrophoben, durch Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol gebildeten Base hergestellt wurde. Die auf diese Weise erzeugten Zusammensetzungen werden anschließend in eine Pelletierpresse geleitet und zu zylindrischen Pellets mit einem Durchmesser von etwa Ve Inch geformt. Die dadurch gebildeten Pellets werden mit einer herkömmlichen Pellet-Implantat-Spritze verabreicht. Die Erfindung wird ausführlich anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Ausführungsbeispiel

Beispiel 1

Substitutionen der Cysteine in der Oisulfidbindung der kleinen Schleife unter Anwendung eines langen synthetischen Oligonucleotids

Ein mit AA1 bezeichnetes Oligonucleotid hat die folgende Sequenz:

5'GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTG GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Dadurch wird die Sequenz des rpST-Gens so verändert, daß das Codon für Cystein an Position 193 von TGT in GCG umgewandelt wird, das für Alanin kodiert, und das Cystein an Position 191 von TGT in GCT umgewandelt wird, das gleichfalls für Alanin kodiert. Daher werden beide Cysteine in der kleinen Schleife zu Alanin umgewandelt. Einsträngige M 13mp 11 pST-DNA wird mit Hilfe von Standardprotokollen von gereinigter Phage hergestellt. 1000 ng einsträngige M 13mp11 pST-DNA werden mit 50 ng AA1 -Oligonucleotid vermischt, das zuvor mit Adenosin 5'-triphosphat und Polynucleotidkinase in einem endgültigen Volumen von 1011, das 1 x Hybridisierungspuffer (1 x Hybridisierungspuffer ist 75 mM KCI5 mM tris-CI, pH 8,0) enthieltji'-phosphoryliert wurde. Die Mischung wird 7 Minuten lang auf 65⁰C erhitzt und anschließend 10 Minuten lang auf Raumtemperatur gehalten. Dieses Protokoll hybridisiert das Oligonucleotid zu der einsträngigen DNA. Die hybridisierte DNA wird danach zu einer doppelsträngigen, kovalent geschlossenen Form umgewandelt, und zwar durch die Zugabe von 2011H₂0,4 Il 10x Filiinpuffer (1 χ Filiinpuffer ist 27,5mM Tris-CI, 15mM MgCI₂, pH7,5,2mM DTT), 11l 2OmM ATP, 2Il dNTP's (ein Gemisch der vier Desoxyribonucleotid 5'triphosphate je mit einer Konzentration von 2mM) 2U T4 DNA-Ligase und 2 U DNA-Polymerase I als großes Fragment (hinsichtlich Einheits-Definition siehe New England Biolabs Katalog, 1986). Das Gemisch wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wird dann mit Hilfe eines Calciumchlorid-Standardaverfahrens in E. coli JM101 transformiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37⁰C sind Plaques auf einem Rasen von JM101 zu sehen. Die Plaques werden auf Nitrocellulosefilter gesetzt und mit Hilfe von Standardprotokollen für die Hybridisierung bearbeitet. Ein zweites als AA1 D bezeichnetes Oligonucleotid wird für den Nachweis der Mutanten verwendet. AA1D hat die folgende Sequenz 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Es wird am 5'-Ende mit d-32P/-ATP und Polynucleotidkinase radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 37°C in 5x SSC, 1 x Denhardt's, 15olg/ml tRNA. Die Filter werden nacheinander in 5x SSC bei 4°C, TAC bei 37 °C u nd schließlich in TAC bei der verlangten Temperatur gewaschen. Durch die letzte Wäsche wird die Spezif ität bestimmt. Für AA1D beträgt die Temperatur 52,2*C. Nach der Belichtung sind auf Röntgenfilm nur diejenigen Klone zu sehen, welche zu AA1D vollständig komplementär sind. Verschiedene dieser Klone werden durch DNA-Sequenzierung analysiert. Alle von ihnen enthalten die erste Mutation, aber keiner von ihnen enthält die zweite (bei Cystein 191) Mutation. Zur Mutation des Cysteins an den Positionen 191 wird ein zweites als A1 bezeichnetes Oligonucleotid verwendet. A1 hat die folgende Sequenz:

5'GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Der M utageneseprozeß ist dem oben in Beispiel 1 unter Verwendung von AA1 beschriebenen identisch, nur daß die Matrize M13 mp 11 pSTA3 ist (es handelt sich um den von der AA1 Mutagenese isolierten Klon, dessen Cystein an Position 183 zu Alanin umgewandelt ist) und die Hybridisierung mit A1 erfolgt. Die abschließende Waschtemperatur beträgt 62"C. Die DNA-Sequenzierung ergibt, daß die identifizierten Klone die erwartete Sequenz aufweisen. Der mutierte Klon wird als M13 mp 11 pSTA34 bezeichnet.

Beispiel 2

Substitution der Cysteine in der kleinen Schleife von rekombinantem Schweine-Somatotropin Die Substitution der Disulfidbande der kleinen Schleife wird durch den Einsatz von zwei Oligonucleotiden in der gleichen Reaktion erreicht. Die beiden Oligonucleotide haben die folgende Sequenz:

5'GTC	ATG	AAG	GAA	CGC	CGC	TTC	3'GLU 3
			GLU
5'GAG	AGC	AGC	GAG	GCC	TTC	TAG	3'GLU 4
			GLU

Die einsträngige Matrizen-DNA ist M 13mp 11 pST. Die beiden Oligonucleotide und die Matrizen-DNA werden wie zuvor in der gleichen Reaktion hybridisiert, erweitert und ligiert. Die Mischung wird in E. coli JM101 transformiert. Der Unterschied bei dieser Methode liegt darin, daß zwei Entnahmen von jeder Platte vorgenommen werden. Jede Entnahme wird einzeln entweder zu ^i!p markiertem GLU 3 oder GLU 4 hybridisiert. Die abschließende Waschtemperatur beträgt für jedes Oligonucleotid 56⁰C. Es werden nur diejenigen Plaques, die für beide Oligonucleotide positiv sind, gesammelt. Die DNA-Sequenzierung ergibt, daß beide Cys 183 und Cys 191 zu Glutaminsäure umgewandelt sind. Diese Methode wird zur Erzielung von Mutationen angewandt, die die Bildung des Disulfide der großen Schleife durch den Einsatz von zwei entsprechenden Oligonucleotiden nach obiger Beschreibung und M13mp11 pST verhindern. Selbstverständlich wird durch die Anwendung von M13mp11 pSTA34alsdie Matrizen-DNA und von zwei für die Umwandlung von Cys 55 und Cys 166zu Alanin geeigneten Oligonucleotiden ein Klon gewonnen, in dem alle Cysteinreste zu Alanin umgewandelt wurden.

Beispiel 3

Rekonstruktion zu bakteriellen Expressionsplasmiden

Die veränderten (Mutant) Klone werden zu dem bakteriellen Expressionsplasmid pRO 211 rekonstruiert (beschrieben in EP 173.280, hier durch Hinweis darauf einbezogen). Die M 13-Klone werden mit ECoRI und Hindlll geschnitten, und das pST-Genfragment wird isoliert. pRO211 wird mit den gleichen Enzymen kloniert, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt, und das große Fragment wird isoliert. Die beiden Stücke werden mit T4 DNA-Ligase zusammenligiert und in einen entsprechenden Bakterienstamm,z.B. N99el* transformiert. In diesem Stamm ist ein Wildtyp-\-Repressor vorhanden. Dadurch wird die Expression von dem Pj-Promotor in pRO 211 verhindert. Sobald die geeignete Konstruktion isoliert worden ist, wird sie anschließend in Bakterienstämme transferiert, die einen temperaturempfindlichen λ-Repressor, z. B. 4200, enthalten. In diesen Stämmen ist die Expression von rpST von der Temperatur abhängig. Bei 42°C ist der Repressor inaktiv und es erfolgt Expression. In diesem Stadium kann rpST mit Hilfe von Verfahrensweisen erzeugt werden, die in EP 173.280 enthalten sind, hier durch Hinweis einbezogen. Die E. coli Stämme, die für die Expression des pST-Genproduktes herangezogen werden, sind nicht auf E. coli 4200 beschränkt. Es kann jeder beliebige E. coli Stamm benutzt werden.

Unter Einhaltung der Verfahrensweise der obigen Beispiele 1,2 und 3, jedoch unter Substitution der entsprechenden Codons für Alanin, Serin, Glutaminsäure, Arginin, Tryptophan oder Asparagin für Cystein an den Positionen 183 und 191, wird TGT für Cystein zu TCN, AGCoderAGTfür Serin, GAG oder GAA für Glutaminsäure, CGN, AGA oder AGG für Arginin, AAT oder AAC für Asparagin, GCN für Alanin oder TGG für Tryptophan an der Position umgewandelt.

Beispiel 4

Herstellung von (Cam-Cys 55,166,183,191)rpST

Es wird eine Lösung von 100 mg rekombinantem Schweine-Somatotropin (rpST)und 33 ml 7 M Guanidin-HCI hergestellt, und der ]| pH-Wert wird mit NaOH auf 8,4 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 18 mg (20 Äquivalente) Dithiothreitol gegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter einer ^-Atmosphäre gerührt. Dieser Lösung werden anschließend 84 mg (100 Äquivalente) Jodacetamid zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur vier Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 35ml H₂O und Guanidin-HCI verdünnt, und überschüssige Reaktionsmittel j werden mit Hilfe der Ultrafiltration durch eine Amicon-Membran UM 2 (Molekülmasseverringerung etwa 1000 Dalton) in einer Amicon-Rührzelle, Modell 8400, entfernt. Nach mehreren Zyklen erneuter Verdünnung und erneuter Filtration wird die zurückbleibende wäßrige Lösung zu konstanter Masse lyophilisiert, um annähernd 100mg eines flaumigen weißen Feststoffes zu gewinnen. Die elektrophoretische Mobilität des Produktes ist auf SDS-PAGE-GeI unter nicht-reduzierenden Bedingungen anders als die von rpST. Bei dem Produkt handelt es sich um das oben angeführte derivatisierte rekombinante Schweine-Somatotropin.

Beispiel 5

Herstellung von (Cam-Cys 183,191)rpST

Zu einer Lösung von entgastem 0,02 M NaCI (225ml) werden 3,375g rekombinantes Schweine-Somatotropin (rpST) gegeben,!

und der pH-Wert wird mit verdünnter HCI auf 9,1 eingestellt; während der pH-Wert dieser Lösung auf 8,1 gehalten wird, werden J 15mg/ml, 0,9463g Dithiothreitol, in 31,5ml Wasser gelöst, zu der rpST-Lösung zugegeben. Die Mischung wird eine Stunde larj bei Raumtemperatur stehen gelassen, danach wird der pH-Wert auf 8,4 erhöht. Anschließend werden 5,7 g in 40,5 ml Wasser gelöstes Jodacetamid tropfenweise zu der rpST-Lösung gegeben, wobei der pH-Wert auf 8,4 gehalten wird. Während dieser _:

Zugabe erfolgt die Bildung eines feinen Präzipitats, das mit Hilfe der Zentrifugation entfernt wird. Die klare überstehende Flüssigkeit wird entfernt und durch eine Säule von Sephadex G-25 geleitet, um überschüssige niedrigmolekulare Stoffe zu entfernen. Die hochmolekulare rpST-Fraktion, 342,8g, wird gesammelt und gefriergetrocknet, so daß 2,2g (Cam-Cys 183, 191 )rpST gewonnen werden.

Beispiel 6

Herstellung von (Cam-Cys 183,191)rpST

Zu einer Lösung von 200 mg rekombinantem Schweine-Somatotropin (rpST) und 100 ml 0,5 N NaHCO₃ (pH mit wäßrigem Ammoniumhydroxid auf annähernd 8,4 eingestellt) werden 15 mg Dithiothreitol gegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Es werden 50mg Jodessigsäure zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend durch Ultrafiltration durch eine Amicon-Membran UM 2 in einer Amicon-Rührzelle, Modell 8400, entsalzt. Nach verschiedenen Zyklen abermaliger Verdünnung und erneuter Filtration wird die zurückbleibende Lösung zu konstanter Masse lyophilisiert. Es werden etwa 200 mg flaumiger weißer Feststoff gewonnen. Das erhaltene Produkt ist das derivatisierte rekombinante Schweine-Somatotropin nach obiger Beschreibung.

Unter Anwendung der obigen Verfahrensweise, jedoch durch Substituierung von rekombinantem Rinder-Somatotropin, rekombinantem Schaf-Somatotropin, rekombinantem Pferde-Somatotropin, rekombinantem Human-Somatotropin oder rekombinantem Vogel-Somatotropin für rekombinantes Schweine-Somatotropin werden jeweils erhalten:

1) (Cm-Cys183,191)rbST

2) (Cm-Cys183,191)roST

3) (Cm-Cys183,191)rhoST

4) (Cm-Cys184,191)rhST

5) (Cm-Cys183,191)raST

Beispiel 7

Herstellung von ("O₃S-CyS 55,166,191)rpST

Es wird eine Lösung von 200 mg rekombinantem Schweine-Somatotropin (rpST) und 50ml 7 N Guanidin-HCI hergestellt, und der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf annähernd 8,4 eingestellt. Dieser Lösung werden 33mg Dithiothreitol zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Dieser Lösung werden 200 mg Natriumtetrathionat zugesetzt. Der pH-Wert fällt sofort auf ca. 6 und er wird mit NaOH wieder auf 8,4 eingestellt. Das Gemisch wird anschließend zwei Stunden lang gerührt. Die Lösung wird durch eine Amicon-Membran UM 2 ultrafiltriert. Das Reaktionsgemisch wird auf annähernd 20ml eingeengt und dann erneut mit etwa 40ml 3N Guanidin-HCI verdünnt und abermals filtriert. Nach der Einengung auf ca. 20ml wird die Lösung mit H2O verdünnt und erneut eingeengt. Dieser Prozeß wird noch zweimal wiederholt, und der Rückstand wird zu konstanter Masse lyophilisiert. Es werden annähernd 200mg weißes festes Produkt gewonnen. Bei dem Produkt handelt es sich um das derivatisierte rekombinante Schweine-Somatotropin nach obiger Beschreibung.

Beispiel 8

Herstellung von ('O₃S-CyS 183,191)rpST

Zu einer Lösung von 250 mg rekombinantem Schweine-Somatotropin (rpST) in 100 ml H₂O (pH-Wert nach NaOH auf annähernd 8,4 eingestellt) werden 70 mg Dithiothreitol gegeben. Die Lösung wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Dieser Lösung von reduziertem rpST werden 400mg Natriumtetrathionat zugesetzt, und die Lösung wird vier Stunden lang bei Raumtemperaturgerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Amicon-UM 2-Membran filtriert und auf etwa 20ml eingeengt.

Es wird mit etwa 200ml H2O verdünnt und abermals eingeengt. Diese Verfahrensweise wird noch zweimal wiederholt. Die fertige, zu konstanter Masse lyophilisierte Lösung ergibt etwa 240 mg weißes Pulver. Es handelt sich um das derivatisierte rekombinante Schweine-Somatotropin nach obiger Beschreibung.

Beispiel 9

Herstellung von (MeS-Cys 183,191)rpST

200mg rekombinantes Schweine-Somatotropin (rpST) werden in 100 ml H₂O gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit wäßriger NaOH auf ca. 8,4 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 15 mg Dithiothreitol (DTT) gegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde tang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reduktion werden 24 μΙ Methylmethanthiosulfonat zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Durch die Zugabe von 1%iger NaOH nach Bedarf wird der pH-Wert während der Reaktion auf 8,4 gehalten. Die Lösung wird durch eine UM 2-Membran ultrafiltriert und auf annähernd 20ml eingeengt. Der Rückstand wird mit 200ml H₂O verdünnt und abermals eingeengt. Die Lösung wird anschließend lyophilisiert, so daß 210mg Produkt nach obiger Beschreibung, d.h. das oben beschriebene derivatisierte rekombinante Schweine-Somatotropin, gewonnen werden.

Unter Einhaltung der obigen Verfahrensweise, allerdings durch Substituierung von rekombinantem Rinder-Somatotropin, rekombinantem Schaf-Somatotropin, rekombinantem Pferde-Somatotropin, rekombinantem Human-Somatotropin oder rekombinantem Vogel-Somatotropin für rekombinantes Schweine-Somatotropin werden die folgenden Produkte erhalten:

1) (MsS-Cys 183,191) rekombinantes Rinder-Somatotropin

2) (MeS-Cys 183,191) rekombinantes Schaf-Somatotropin

3) (MeS-Cys 183,191) rekombinantes Pferde-Somatotropin

4) (MeS-Cys 184,191) rekombinantes Human-Somatotropin

5) (MeS-Cys 183,191) rekombinantes Vogel-Somatotropin

Beispiel 10

Herstellung von (HO₁SCH₂CH₂CH₂-CyS 183,191)-rpST

Zu einer auf einen pH-Wert von 8,4 eingestellten Lösung von 200mg rekombinantem Schweine-Somatotropin (rpST) in 100ml H₂O werden 15 mg Dithiothreitol gegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang unter einer N₂-Atmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Dieser Lösung werden 50mg 1,3-Propansulfon zugesetzt, und die Lösung wird sechs Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert wird durch die Zugabe von 1%iger NaOH auf 8,4 gehalten. Das rohe Produkt wird durch Ultrafiltration durch eine UM 2-Membran auf ca. 20 ml eingeengt. Es wird zweimal auf 200ml verdünnt und erneut eingeengt. Die endgültige Lösung wird lyophilisiert, um 200mg des oben beschriebenen weißen festen Produktes zu gewinnen, d.h. das derivatisierte rekombinante Schweine-Somatotropin.

Durch die Substitution des entsprechenden rekombinanten Tier-Somatotropins für rekombinantes Schweine-Somatotropin in der obigen Verfahrensweise werden die folgenden Somatotropine erzeugt:

1) (HO₃SCH₂CH₂CH₂-CyS 183,191) rekombinantes Rinder-Somatotropin

2) (HO₃SCH₂CH₂CH₂-CyS 183,191) rekombinantes Schaf-Somatotropin

3) (HO₃SCHiCH₂CH₂-CyS 183,191) rekombinantes Pferde-Somatotropin

4) (HO₃SCH₂CH₂CH₂-CyS 184,191) rekombinantes Human-Somatotropin

5) (HO₃SCH₂CH₂CH₂-CyS 183,191) rekombinantes Vogel-Somatotropin

Beispiel 11

Stabilitätsprofile von modifizierten oder derivatisierten rekombinanten Tier-Somatotropinen Es wird eine konzentrierte Lösung des rekombinanten Tier-Somatotropinderivats (bis zu 100mg/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, (NaH₂PO₄ H₂O 3,45g, Na₂HPO₄ 3,55g, NaCI 9,50g, gelöst in destilliertem Wasser bis 1000 ml) hergestellt.

Diese wird durch eine sterile Ultrafiltereinrichtung, Millex-0,22um, filtriert, und 0,1-ml-Aliquoten werden in Röhrchen gegeben.

Diese werden in einen Ofen mit 45°C gestellt und in den erforderlichen Intervallen entnommen. Die Inhalte werden danach mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt. Die überstehende Flüssigkeit wird mit Hilfe der HPLC atrf den Monomer- und Dimergehalt hin analysiert. Es wird eine Massebilanz vorgenommen, alles ausgefällte Material wird notiert. Die Ergebnisse werden mit den anfänglichen Konzentrationen verglichen, und ein Stabilitätsprofil wird festgehalten.

Alternativ wird ein eine schlechte Löslichkeit bei einem pH-Wert von 7,4 aufweisendes Somatotropinderivat bei einem weniger bevorzugten pH-Wert (4 bis 10) gelöst oder als Suspension beurteilt.

Probe	2 Tage	5 Tage	6 Tage	7 Tage	7 Tage
	Fraktion	Fraktion	Fraktion	85,6 (5,9)	Fraktion
	Lös.	Lös.	Lös.	63,5(3,0)	Lös.
	(Dimer)	(Dimer)	(Dimer)	69,9 (5,6)	(Dimer)
rpSTTech.	93,1(17,2)	92,4(27,6)	92,0(34,9)	57,4(1,0)	•85,9(29,4)
				75,5 (30,9)	89,5(31,0)
rpSTTechn.	-	79,8(20,7)	-	-
rpSTTechn.	-	81,5(19,6)	-	-
(Cam-Cys 183,191 )rpST	-	75,2(2,0)
(Cam-Cys183,191)rpST	—	72,8(1,0)	-	—
(Cam-Cys 183,191)rpST	-	-	57,8 (2,0)	-
(Cam-Cys 183,191 )rpST	-	-	-	73,0(3,0)
(Mes-Cys183,191)rpST	79,7(2,2)	-	-	73,4(3,9)
Disulfit	83,2(1,0)	—	-	•73,9(1,5)
rpST				85,0(1,6)
• In PBS-Puffer extrahiert. Übrige alle in CBS extrahiert.
Beschreibung	Lösliche Fraktion (Dimer)
	2 Tage
Carboxymethylderivat von rpST	92,8(5,3)
Methylsulfidderivat von rpST	77,6(2,4)
	91,5(7,8)
	78,0(1,0)
	89,5(16,6)

HydroxybernsteinsäurederivatvonrpST
Carbamidomethyliertes(CAM)-DerivatvonrpST
rpSTTechnische Charge

Beispiel 12

Herstellung von injizierbaren Mikrokügelchen für die parenterale Verabreichung rekombinanter Tier-Somatotropinderivate Die Herstellung der neuartigen rekombinanten Tier-Somatotropine in einem fürdie Aufnahme in Mikrokügelchen durch Sprühtrocknung geeigneten Größenbereich erfolgt durch Auflösung des rekombinanten Tier-Somatotropinderivats in verdünnter Ammoniumhydroxidlösung und die folgende Zugabe erforderlicher Salzlösung wie Natriumbenzoat. Es wird ein nichtionischs oberflächenaktives Mittel wie ein Blockcopolymer von Ethylenoxid und Propylenoxid zugesetzt, das sich unter konstantem sanftem Mischer auflösen kann. Die Lösung wird anschließend sprühgetrocknet. Für diesen Zweck kann ein Minisprühtrockner von Buchi, Modell Nr. 190, angewandt werden.

Ein homogenes Gemisch des auf diese Weise erzeugten aktiven Bestandteils und von Zusatzstoffen in dem geschmolzenen Fett, Wachs oder einem Gemisch derselben, wird hergestellt, und das resultierende Gemisch wird durch eine Luft/Flüssigkeit-Sprühdüse gespritzt, die mit einem beheizten Mantel versehen ist, um die einströmende Luft und die geschmolzene Phase auf einer über dem Schmelzpunkt liegenden Temperatur zu halten. Oie Mikrokügelchen werden beim Abkühlen der geschmolzenen Tröpfchen gebildet und werden auf einer Reihe von Sieben im verlangten Größenbereich von etwa 45 bis 180 Mikrometer gesammelt und für den Gebrauch aufbewahrt. Mikrokügelchen, die nicht dem erforderlichen Größenbereich entsprechen, werden zur Rückführung gesammelt. Alternativ wird das homogene Gemisch auf eine Zentrifugenscheibe geleitet, und die so gebildeten Mikrokügelchen werden wie oben gesammelt, oder die geschmolzenen Gemische werden abgekühlt und zum verlangten durchschnittlichen Teilchengrößenbereich gemahlen.

Für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignete Wachse und Fette haben im allgemeinen über 4OX liegende Schmelzpunkte.* Diese Wachse werden als eine niedrig-schmelzende organische Mischung oder Verbindung von hoher relativer Molekülmasse definiert, die bei Raumtemperatur fest sind und im allgemeinen in den Zusammensetzungen Fetten und Ölen ähnlich sind, nur daß sie keine Glyceride enthalten. Einige sind Kohlenwasserstoffe; andere sind Ester von Fettsäuren und Alkoholen. Sie werden unter die Lipide eingereiht. Wachse sind thermoplastisch, da es sich aber nicht um Hochpolymere handelt, werden sie nicht zur Familie der Plaste gezählt. Gemeinsame Eigenschaften sind Wasserabweisung; glatte Textur; Nichttoxizität; frei von unangenehmem Geruch und unangenehmer Farbe. Sie sind brennbar und haben gute dielektrische Eigenschaften, sind in den meisten organischen Lösungsmitteln lösbar, in Wasser unlöslich. Die Haupttypen sind folgende:

I. Natürliche

1. Tierische (Bienenwachs, Lanolin, Schellackwachs, Chinesisches Insektenwachs)

2. Pflanzliche (Karnaubawachs, Kandelillawachs, Myrtenwachs, Zuckerrohr)

3. Mineralische

a) Mineralische oder Erdwachse (Ozocerit.Zeresin, Montan) ~

b) Erdölwachse (Paraffin, mikrokristalline Art) (Paraffinkuchen oder Schuppenparaffin)

II. Synthetische

1. Ethylenpolymere und Polyoläther-Ester („Carbowax", Sorbit)

2. Chlorierte Naphthalene („Halowax")

3. Kohlenwasserstoffartige über die Fischer-Tropsch-Synthese.

Das erfindungsgemäße Fett kann als Glycerylester höherer Fettsäuren, wie Stearin- oder Palmitinsäure, definiert werden. Derartige Ester und ihre Gemische sind bei Raumtemperatur Feststoffe und zeigen eine kristalline Struktur. Beispiele sind Schweineschmalz und Talg. Zwischen einem Fett und einem Öl gibt es keinen chemischen Unterschied, die einzige Unterscheidung ist dabei, daß Fette bei Raumtemperatur Feststoffe sind und Öle Flüssigkeiten. Die Bezeichnung ,Fett" bezieht sich gewöhnlich speziell auf Triglyceride während „Lipid" alles umfaßt.

Das Fett ist vorzugsweise langkettige C₁₀-C₂4-Fettsäure, Alkohol, Ester, Salz, Ether oder ein Gemisch davon mit Mono-, Di- oder Triglyceriden, vorwiegend zusammengesetzt aus Stearaten, Palmitaten, Lauraten, Linoleaten, Linolenaten, Oleaten und Resten oder Mischungen derselben, wobei über 50^cC liegende Schmelzpunkte am meisten bevorzugt werden. Glyceroltristearat ist eines der am meisten bevorzugten Fette. Außerdem sind lipophile Salze von Fettsäuren wie Magnesiumstearat und dergleichen ebenfalls geeignet.

Die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen werden in einer pharmazeutisch und pharmakologisch annehmbaren Flüssigkeit dispergiert, um eine Zusammensetzung mit langsamer Freisetzung für die parenterale Verabreichung zu gewinnen. Als Vehikel finden wäßrige gepufferte Systeme oder Ölsysteme Anwendung. Als Öl dient ein pflanzliches oder tierisches Öl. Ein bevorzugtes Öl ist ein neutrales Triglycerid-Flüssigfett. Ein neutrales Öl ist eines, da keine Restsäure enthält. Für die Anwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignete Vehikel umfassen wäßrige Systeme wie gepufferte Kochsalzlösungen; organische Lösungsmittel wie Glycole und Alkohole; und mit Wasser unvermischbare Flüssigkeiten wie Öle, in Abhängigkeit von der Löslichkeit des zu verabreichenden Wirkstoffes. Die gewonnenen Daten sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I Mikrokügelchenformulierungen von rekombinantem Tier-Somatotropin

% rekombinantes	%	Kern	%	%	Beschichtung	%	%	%
Tier-Somatotro-	Chol-	%	Chol	Chol	%	PVP	Bie	Phosphat-
pinderivat	säure	Desoxy-	esterin	esterin	Glyceryl-		nenwachs	idylcholin
	cholsäure		tristearat

50 20 75 50 20 75 50 20 75

50	—
60	-
25	_
-	50
-	80
_	25

50 20 75

42,5	42,5
42,5	42,5
42,5	42,5
40	-
40	-
40	-
42,5	42,5
42,5	42,5
42,5	42,5

40 40 40

The Condensed Chemical Dictionary, 10. Ausg., Seite 1094 Van Nostrand Reinhold Publisher.

Tabelle Il Mikrokügelchen-Zusammensetzungen

Zusammensetzung Nr.

Matrix

rpST-Derivate

Zusatzstoffe (%) Puffer/Prä.

Oberflächenaktives Mittel

1	GMS	2,5	—	—
2		20	-	-
3	GMS/Sojaöl	30	-	-
4	GDS	10	-	-
5		10	NaLaurat(1,4)	-
6		25	NaBenzoat(1,6)	ob.-akt. Mittel B (0,12)
7		25	NaCarb/hydrogencarb (1,3)	ob.-akt. Mittel A (0,18)
8	GTS/GDS(19:1)	15	-	-
9		10	NaBenzoat(0,6)	ob.-akt. Mittel B (0,05)
10	GTS/GDS(9:1)	10	-	ob.-akt. Mittel B (0,1)
11	GTS/Bienenwachs (9:1)	7,5	-	-
12	GTS/GMS{19:1)	15	NaBenzoat(1,4)	-
13	GTS/Sojaöl (19:1)		7,5	-
14	GMS/Carnauba(1:2)	20	-	-
15		10	NaBenzoat(0,8)	_
16		10	—	ob.-akt. Mittel B (0,05)
17		25	NaBenzoat(0,75)	ob.-akt. Mittel B (0,12)
18		25	NaBenzoat(3,2)	ob.-akt.MittelB(0,12)
19		25	-	ob.-akt. Mittel B (0,12)
20		25	_	ob.-akt. Mittel A (0,48)
21		25	NaCarb/hydrogencarb (1,2)	-
22	GTL	33	NaBenzoat(2,1)	ob.-akt. Mittel A(0,17)
23	GTS/GDS(12:1)	15	CaBenzoat(1,1)	-
24	Bienenwachs/Sojaöl (2:1)	30	-	-
25	GTS	7,5	-	-
26	GMS/Sojaöl (47,25/24)	25	—	Sorbitan
27		15	-	Monoleat(3,75)
28	GMS	10	—	POE (23)
				Stearat(9,0)
29	GMS	20	—	PEG 6000 (9,0)
30	GMS	20	-	PEG 6000 (4,0)
31	GMS	20	-	PEG 6000 (0,8)
32	GMS	20	_	PEG 400
				Oistearat(8,0)
33	GMS	20	—	PEG 400 Distearat (1,57)
34	GMS	20	-	PEG 1540 Distearat (16,0)
35	Diethylenglycolmonostearat	25	-	-

Beispiel 13 Gallensäure-Mikrokügelchen

Eine gepufferte Lösung von rpST-Derivat und Gallensäure wird in einem Buchi-Sprühtrockner, Modell 190, sprühgetrocknet. Dieses feinkörnige Pulver (10 Teile) wird in einer Methylenchloridlösung von Beschichtungsstoffen (1 Teil) suspendiert. Diese Suspension wird sprühgetrocknet. Die beschichteten Mikrokügelchen werden vor der Injektion in einem geeigneten Suspendiervehikel suspendiert. Diese Zusammensetzungen werden in Tabelle Il beschrieben. Andere erfindungsgemäße derivatisierte oder modifizierte rekombinanteTier-Somatotropine, einschließlich der modifizierten rekombinanten Schweine-, Rinder-, Schaf-, Pferde-, Human- und Vogel-Somatotropine, in denen die Cysteine in der kleinen Schleife an den Positionen 183 und 191 (184 und 191 bei Human) der rekombinanten Tier-Somatotropine durch Alanin, Serin, Glutaminsäure, Arginin, Lysin oder dergleichen ersetzt wurden, werden in Übereinstimmung mit der Beschreibung in Tabelle Il als Mikrokügelchen hergestellt.

Beispiel 14

Herstellung von rekombinanten Tier-Somatotropin-Implantaten

Für die Herstellung von Implantaten wird eine ausreichende Menge des gemahlenen homogenen Gemische des verlangten ; rekombinanten Tier-Somatotropinderivats und der erforderlichen Verdünnungsmittel abgewogen. Dieses Gemisch wird j

anschließend auf einer Carver-Presse mit 1000 bis 5000 psig in einer zylindrischen Preßform mit einem. Durchmesser von Vie" ] oder Ve" oder auf einer drehbaren Tablettenpresse unter Anwendung des erforderlichen Stempels und der erforderlichen Preßform verdichtet. Die auf diese Weise erzeugten Implantate werden danach durch die Verfahrenswelsen A und B entweder mit bioabbaubaren oder nicht-bioabbaubaren Überzügen beschichtet.

Verfahrensweise A Nicht-bioabbaubares Siliconpolymer

Reines Siliconelastomer (10 Teile) wird mit Härtemittel (einem Teil) auf einem Uhrglas mit einem Spatel vermischt. Dieses wird in einem Exsikkator 30 Minuten lang entlüftet. Die Implantate werden an den Enden mit einer Pinzette ergriffen, in dem Siliconpolymer gerollt, mit dem Ende auf Aluminiumfolie gesetzt und fünf Stunden lang bei 40°C ausgehärtet. Ein Ende oder beide Enden werden mit einer Rasierklinge entfernt, so daß der beschichtete „Schaft" des Zylinders übrig bleibt. Alternativ werden Implantate mit 20%igem oder40%igem medizinischem, in Hexan dispergiertem Haftmittel, das unter dem Warenzeichen SILASTIC* von Dow Corning vertrieben wird, tauchbeschichtet und über Nacht bei 40⁰C bis 50⁰C getrocknet, bevor die Beschichtung von einem oder beiden Frontenden entfernt wird.

Verfahrensweise B

ßioabbaubare Beschichtungen

Das Polymer oder Copolymer (ein Teil) wird in Chloroform (drei bis acht Teile) gelöst. Jedes Implantat wird an den Enden mit

einer Pinzette festgehalten, in die Polymerlösung eingetaucht, und danach kann das Chloroform bei Raumtemperaturverdunsten. Jedes Implantat wird zweimal beschichtet. Nachdem die Beschichtung über Nacht bei Raumtemperatur getrocknetist, werden die Polymerenden mit einer Rasierklinge entfernt, so daß der lange beschichtete „Schaft" gewonnen wird.

Implantatformulierung

%rekombinantes % Magnesium Schweine-Somato- stearat tropinderivat	0,5 0,5	% Ethyl- cellulose	%Kastor- wachs	% Glyceryl- tristearat
50 40 20 50 20		5,0 5,0 5,0 3,5 3,5	45 50 75 46 76	41,5
	% Cholesterin
%rpST Derivat	68 41,5	% oberflächenaktives Mittel
30 15		2 2
	% Stearin säure
% rpST- Derivat	in co
50 20

Alternativ werden rpST oder andere rekombinante Tier-Somatotropine mit oberflächenaktiven Mitteln, Puffersalzen und/oder Konservierungsmitteln in einer wäßrigen Lösung vermischt.

Diese Lösung wird anschließend in einem Buchi-Sprühtrockner, Modell 190, sprühgetrocknet und ergibt ein Pulver mit kleiner Teilchengröße. Dieses Pulver wird dann mit einem Fett oder Wachs schmelz-vermischt und zu zylindrischen Implantaten geformt Die oben gewonnenen Implantate werden danach entweder mit einem bioabbaubaren oder einem nichtbioabbaubaren Polymer unter Anwendung von Verfahrensweise A oder B beschichtet.

Implantatformulierungen	%Glyceryl- tristearat	% Natrium benzoat	% oberflächenaktives Mittel
%rpST- Derivat	69,9 82,9 48,5	2,0 2,0 1,5	0,15 0,15 0
28 15 50

Beispiel 15 Herstellung von Implantaten unter Verwendung von (Cam-Cys 183,191)rpST und Beurteilung der Implantate durch Auflösung

in vitro

Zu 1,3ml CH₂CI₂ werden 92,4ms Co-poly (Glycolid/Lactidl-Copolymer, 5,3mg eines nichtionischen Blockcopolymers von Propylenoxid und Ethylenoxid, von der BASF Wyandottee Corp. als Pluronic 127 vertrieben, das eine durchschnittliche relative Molekülmasse von 12 500, einen Schmelzpunkt von 56 und eine Brookfield Viskosität von 3100 (cps)³⁵ hat, 5,3mg (OH₂) mit einer Siebfeinheit von 200 und 74,6mg pulverisiertes (Cam-Cys 183,191 )rpST gegeben. Das Gemisch wird gerührt, auf eine Petrischale

mit großer Oberfläche gegossen, wobei das CH₂CI₂ bei Raumtemperaturverdampfen kann.und danach durch Vakuumtrocknunggetrocknet. Der getrocknete Rückstand wird gesammelt und mit Hilfe einer Carver-Presse bei etwa 10OOpsig zu zylindrischen

Implantaten mit einem Durchmesser von Vs" geformt. Die auf diese Weise erzeugten Implantate wiegen jeweils 60 bis 70 mg und

werden als 1-1 bezeichnet.

Eine zweite Gruppe von Implantaten wird durch Vermischen von 128mg pulverisiertem Kastorwachs (-270 Siebfeinheit) und 32 mg pulverisiertem (Cam-Cys 183,191 )rpST in einem Vortex-Genie-Mischer hergestellt. Die auf diese Weise zubereitete Mischung wird dann in der oben beschriebenen Weise zu zylindrischen Implantaten mit einem Durchmesser von Ve" geformt. Die Pellets wiegen jeweils 60 bis 70 mg und werden als 1-2 bezeichnet.

Eine dritte Gruppe von Implantaten wird ebenfalls nach den oben beschriebenen Verfahrensweisen unter Verwendung von 96 mg Kastorwachs (Siebfeinheit -270) und 64 mg pulverisiertem (Cam-Cys 183,191 )rpST hergestellt. Die nach obiger Beschreibung hergestellten zylindrischen Implantate haben einen Durchmesser von Ve" und wiegen 60 bis 70 mg und werden als I-3 bezeichnet.

Die in dieser Form hergestellten Implantate werden anschließend einer Beurteilung der Auflösung in vitro unterzogen. Jedes der Implantate wird in ein gesondertes Plasteröhrchen gesetzt, das 10ml einer Phosphatpufferlösung (pH 7,4 mit 0,05%igem Na-Azid) enthält, und die Röhrchen werden in ein Rüttelgestell in Wasser gestellt, in dem die Röhrchen gerüttelt werden, wobei die Wassertemperatur in der Anlage auf 39°C gehalten wird. Die Röhrchen werden einen Tag lang gerüttelt, dann werden die Lösungen aus jedem Röhrchen entfernt und durch HPLC auf rpST hin analysiert, und die Lösungen werden verworfen. Es wird neue Phosphatpufferlösung zu jedem Röhrchen gegeben, und die Röhrchen werden anschließend weitere drei Tage lang gerüttelt. Die Lösung jedes Röhrchens wird wieder durch HPLC auf rpST hin analysiert, und die Lösung wird wieder verworfen. Es wird wieder neuer Phosphatpuffer in jedes Röhrchen gegeben und das Röhrchen wieder drei Tage lang gerüttelt und wieder auf rpST hin analysiert.

Die bei diesen Bestimmungen verwendeten Implantate werden anschließend mit den erzielten Ergebnissen beschrieben. Die Phosphatpufferlösung ist (NaH₂PO₄) · H₂0,3,45g, Na₂HPO₄,3,55g, NaCI, 9,5g gelöst in destilliertem Wasser bis 1 000ml.

Implantatherstellung und -bezeichnung rpST im Implantat

Ursprung des Implantats	Masse des Implantats	(Theorie) mg
1-1	69,6 mg	29,23 mg
1-2	68,7 mg	28,85 mg
1-3	62,8 mg	12,56 mg
1-4	63,3 mg	12,66 mg
1-5	66,8 mg	26,72 mg
1-6	66,2 mg	26,48 mg

Ergebnisse der Auflösung in vitro

Vol. von	I-2	1-3	1-4	1-5	1-6
Freisetzung 1-1	%	%	%	%	%
Medium %	Dimer	Dimer	Dimer	Dimer	Dimer
(ml) Tag Dimer

10	-	Beginn	Beginn	Beginn	Beginn	Beginn	Beginn
10	1	1,59	1,184	0,485	0,499	1,605	1,570
		(gering)	(1,3%)	(gering	(gering	(gering)	(gering)
				nicht	nicht
				gemessen)	gemessen)
10	4	0,417	0,459	0,063	0,068	0,136	0,140
		(gering)	(1,7%)	(gering)	(gering)	(gering)	(gering)
10	7	0,044	0,038	0,007	0,007	0,019	0,019
		(gering	(gering	(gering	(gering	(gering	(gering
		nicht	nicht	nicht	nicht	nicht	nicht
		gemes	gemes	gemes	gemes	gemes	gemes
		sen)	sen)	sen)	sen)	sen)	sen)

Kumulative Freisetzung von rpST M plus 1-2

Kumulativ: mg freigesetzt

Kumulativ: % der ursprünglichen Freisetzung

11,72 16,10 16,51

4,92 5,58 5,65

15,88 17,26 17,45

40,4 55,4 56,9

39,02 44,25 44,81

59,7

64,89

65,6

Beispiel 16

Herstellung von mikroeingekapseltem rekombinantem Tier-Somatotropin Poly(lactid-co-glycolid), 0,85g, wird in 29,8g Chloroform gelöst und 2 Minuten lang gewirbelt. Zu der Polymer/Chloroform-Lösung wird dann ein rekombinantes Schweine-Somatotropinderivat (Cam-Cys 183,191 )rpST, 0,150g, das trocken durch ein rostfreies 25-Mikrometer-Stahlsieb gesiebt worden ist, gegeben, und es wird 3 Minuten lang gewirbelt. Die resultierende Suspension des Proteins wird anschließend in einen mit einem mechanischen Rührwerk vorgesehenen 50-ml-Rundkolben gefüllt. Die Rührgeschwindigkeit wird auf 700U/min bei Umgebungstemperatur eingestellt. Weitere 3,2g Chloroform werden zum Spülen des ersten Gefäßes verwendet. Somit beträgt die Gesamtmenge an Chloroform 32,95g. Danach wird Siliconöl (35OcS) zugegeben (13,1 g im Laufe von acht Minuten), um das Polydactid-co-glycolid) auszufällen. Der Inhalt des Kolbens wird unter mechanischem Rühren zu 1720g Heptan in einen 4-Liter-Kolben gegeben. Nach 3 Stunden werden die erhärteten Mikrokügelchen durch eine Reihe von rostfreien Stahlsieben geleitet und unter Vakuum getrocknet. Unten folgt eine Aufstellung anderer Polymere und Lösungsmittel, die sich für die Mikroeinkapselung von modifizierten rekombinanten Tier-Somatotropinen eignen, in denen einer oder mehrere der Cysteinaminosäurereste an den Positionen 55, 166,183 oder 191 des rekombinanten Tier-Somatotropins durch einen anderen Aminosäurerest oder einen derivatisierten rekombinanten, in dem eine oder beide der Sulfidbrücken zwischen den Cysteinen an den Positionen 55 und 166 oder zwischen den Positionen 183 und 191 reduziert und derivatisiert ist (sind), ersetzt ist (sind). In der anschließend angeführten Aufstellung von Stoffen verwendete Abkürzungen sind wie folgt:

A	= als polymerisierte Probe
B	= repräzipitierte Probe
gly	= Glycolid
lact	= Lactid
capro	= Caprolactan
TMC	= Trimethylencarbonat
PHB	= Polyhydroxybutyrat
PHV	= Polyhydroxyvalerat
PEO	= Polyethylenoxid

Für die Mikroeinkapselung von modifiziertem und derivatisiertem rekombinantem Tier-Somatotropin geeignete Polymere

Polymer	Ninh	Zusammensetzungen
	(Lösungsmittel)	(Ma.-%)
Gly/dl-Lactid	0,36^A (HFIP)	43,6/56,4^A
Gly/dl-Lactid	0,52^A (HHP)	42,4/57,4*
Gly/dl-Lactid	0,63^B (HFIP)	43,3/56,7"
Gly/dl-Lactid	0,66" (HFIP)	41,2/58,8"
Gly/dl-Lactid	0,61^A (HFIP)	41,6/58,4^A
Gly/dl-Lactid	0,22" (HFIP)	41,5/58,5"
Gly/dl-Lactid	0,26^B (HFIP)	40,6/59,4"
Gly/dl-Lactid	0,27^B (HFIP)	40,7/59,3"
Gly-L-lact	0,2^B (CHCI₃)	48/52⁸
dl-lact	0,46^B (HFIP)	100^B
dl-lact	0,27^B (HFIP)	100"
PHB	2,92^A (HFAS)	100^A
PHB/HV	3,27^A (HFAS)	70/30^A
Capro/I-Iact	0,45^A (CHCI₃)	84,6/15,4*
Capro/I-Iact	0,46^A (CHCI₃)	84,0/16,0*
Capro/I-Iact	0,51^A (CHCI₃)	85,2/14,8^A
Capro/I-Iact	0,50^A (CHCI₃)	84,4/15,6^A
Capro/I-Iact	0,39^A (CHCI₃)	85,1/14,9*
Capro/I-Iact	0,36* (CHCI₃)	86,1/13,9*
Capro/I-Iact	0,31^β (CHCI₃)	11,4/88,6"
Capro/gly	0,34^A (CHCI₃)	84,0/16,0*
gly/PEO8000/TMC	0,33^B (CHCIj)	50,3/8,4/41,3^B
gly/PEO8000/TMC	0,38^B (CHCI₃)	58,2/4,8/37,0⁸
gly/dl-Lactid/PEO8000	0,35" (CHCI₃)	35,8/54,4/9,8^B
I-Iact/TMC	0,26" (CHCI₃)	85,4/14,6"
	0,23" (CHCI₃)	69/31^β

A) = als polymerisierte Probe

B) = repräzipitierte Probe

Beispiel 17

Hypox-Rattentest zur Bestimmung der Wachstumssteigerung von Tieren, die modifiziertes oder derivatisiertes Tier-Somatotropin erhalten

Der Wirkungsgrad verschiedener modifizierter (substituierter) oder derivatisierter erfindungsgemäßer Tier-Somatotropine bei der Veränderung der Wachstumsrate von Tieren wird unter Anwendung einer hypophysektomierten (Hypox) Rattenanalyse bestimmt. Die hypophysektomierte Ratte erzeugt kein eigenes Wachstumshormon und ist gegen injiziertes Rinderwachstumshormon empfindlich. Als Reaktion wird das Wachstum über einen gewissen Zeitraum wie 10 Tagen gemessen.

Jede der erhaltenen Hypox-Albino-Ratten (Taconic Farms.Sprague Oawley) bekommt eine Injektion von einer ausreichenden Menge der in Beispiel XX hergestellten Zusammensetzungen, um sie mit einer 10-Tage-Dosis von 800 Mikrogramm (80 Mikrogramm/Tag) Schweine-Wachstumshormon in 0,2 ml der angeführten Formulierung zu versehen. Alternativerhält jede der Hypox-Albino-Ratten eine tägliche Injektion von 80 Mikrogramm Schweine-Wachstumshormonderivat.

Testverfahren

Vor dem Test werden die Tiere gewogen, und die für den Test verwendeten Tiere werden auf der Grundlage des Körpergewichts ausgewählt. Es werden nur die Tiere ausgewählt, deren Körpergewicht eine Standardabweichung vom durchschnittlichen Körpergewicht der Gruppe aufweisen. Die resultierende Gruppe wird dann willkürlich mit Hilfe eines von einem Computer aufgestellten Zufallsauswahlprogramms in aus acht Ratten/Gruppe bestehende Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Testtiere werden danach in einen sauberen Käfig gebracht und zu jeweils vier Ratten/Käfig untergebracht. Am ersten Tag der Untersuchung werden die Testtiere gewogen, und alle Tiere mit übermäßiger Gewichtszunahme oder übermäßigem Gewichtsverlust (± 5 Gramm) werden ausgetauscht. Die Tiere werden dann Testgruppen zugeordnet und behandelt. Nach Ablauf der 10-Tage-Testperiode wird die totale Gewichtszunahme jedes Tieres notiert und die durchschnittliche Gewichtszunahme je Ratte für jede Behandlung bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente, die in der folgenden Tabelle XX zusammengefaßt sind, zeigen die Bioaktivität dieser Derivate.

Hypox-Ratten-Daten

Derivat	g Zunahme	2-4 Tage	4-7 Tage	7-10 Tage	gesamt
	0-2 Tage	5,6	6,8	10,1	30
rpST	7,5	5,3	8,4	8Λ	29,7
(Cam-Cys 183,191 )rpST	7,6	4,8	11,1	8,1	32,9
(Sulfit-Cys183,191)rpST	8,9	6,3	9,3	6,5	29,2
(Als 183,191)rpST	7,1	6,4	6,9	9,5	29,8
(SCH₃-CyS 183,191 )rpST	7,0	5,6	9,1	7,9	28,5
(S-CH₂COCT-CyS 183,191) rpST	5,9	5,3	6,8	9,0	28,0
(S-CH₂CH₂CHjSO₃--Cys 183,191) rpST	6,9

Aus den obigen Angaben ist zu sehen, daß jedes der beurteilten modifizierten oder derivatisierten rekombinanten Schweine-Somatotropine biologisch aktiv ist und zu ausgezeichnetem Wachstum der Tiere führte.

Beispiel 18

Rumpfbeurteilungen von Schweinen, die derivatisiertes rekombinantes Schweine-Somatotropin erhalten Schweine werden in einzelnen Koben untergebracht. Das ursprüngliche Gewicht der Schweine beträgt annähernd 60kg. Die Schweine werden bei einem durchschnittlichen Lebendgewicht von 100kg geschlachtet. Mit den Injektionen der Testzusammensetzungen in den Ohransatz wird nach einer Eingewöhnungsperiode von 4 Tagen begonnen. Die Schweine werden mit der Standard „Cy Hog Ration" nach Belieben gefüttert, und Wasser steht nach Belieben zur Verfugung.

Der Wachstumsverlauf wird auf einer wöchentlichen Grundlage ermittelt. Es werden die folgenden Angaben gesammelt:

durchschnittliche tägliche Zunahme, durchschnittliche tägliche Futteraufnahme und Wirkungsgrad des Futters.

Nach einer Zunahme von annähernd 40 kg werden die Schweine geschlachtet und die Rümpfe beurteilt. Im Schlachthaus werden die folgenden Angaben gesammelt: Gewicht des heißen Rumpfes, Semitendinosegewicht, Gewicht von Organen (Leber, Niere, Herz) und Nierenfettgewicht. Nach einer Abkühlung von 24 Stunden werden folgende Messungen notiert: Rumpflänge, Rückenfett-Tiefe (erste Rippe, letzte Rippe, letzter Lendenwirbel, Dreivierteltiefe an der zehnten Rippe, P-2), Bauchdicke, Lendenmittebereich, Farbe, Festigkeit, Marmorierung und Muskelbewertung.

Bei dieser Beurteilung erhält ein negatives Kontrolltier eine tägliche Injektion von Kochsalzlösung, Cam-rpST ist (Cam-Cys 183,

191) rpST nach der Beschreibung im vorstehenden Beispiel 7, und die positive Kontrolle erhält eine tägliche Injektion von

natürlichem PST.

Rumpf-Beurteilung - (Cam-Cys 183,191) rpST

Sechs Schweine je Behandlung werden einzeln untergebracht und bekommen ihre jeweilige Behandlung von 44 bis 94kg Lebendgewicht verabreicht. Das Wachstum und ausgewählte Rumpfdaten sind anschließend zusammen mit Berechnungen des

relativen Wirkungsgrades aufgeführt.

Einflüsse von carbamidomethyliertem rpST (Cam-rpST) auf das Wachstumsverhalten und ausgewählte Rumpfmerkmale von ausgewachsenen Schweinen (Mittel der kleinsten Quadrate)

Kriterium

Durchschn. tägl. Zunahme, kg Durchschn. tägl. Futteraufnahme, kg Zunahme/Futter Leber, g

Nierenfett, g Rückenfett der 10. Rippe, cm P-2 Rückenfett, cm Semitendinose-Gewicht, g Lendenmittebereich, cm²

Negative Kontr.

Cam-rpST

Positive Kontr.

0,99	1,07	1,09
3,11	3,03	2,75
0,32	0,35	0,40
1726,1	1892,8	2085,5
762,4	765,5	563,3
2,22	2,00	1,88
1,80	1,50	1,45
359,5	353,1	387,9
38,6	39,0	39,6

_1

Beispiel 13

Mit (Cam-Cys 183,191) rpST durchgeführte Stickstoffbilanzexperimente

Die Schweine werden in einzelnen rostfreien Verschlagen untergebracht. Mit den Injektionen am Ohransatz wird begonnen, wenn die Schweine in die Verschlage gebracht worden sind. Den Schweinen läßt man 5 Tage Zeit für die Gewöhnung an die neue Umgebung. In diesem Zeitraum wird die Futteraufnahme überwacht und so eingestellt, daß alle Schweine jeden Tag die gleiche Futtermenge verbrauchen (Cy Hog Ration, 18% Rohprotein). Das Sammeln von Kot und Urin beginnt mindestens nach drei Tagen konstanter Aufnahme. Die Schweine werden zweimal täglich mit gleichen Mengen gefüttert, und Wasser steht nach Bedarf zur Verfügung.

Die gesamten Kot- und Urinmengen werden fünf Tage lang gesammelt (das Sammeln erfolgt jeden Morgen). Um den N-Verlust zu reduzieren, werden 35 ml 6 N HCL zu Beginn der Sammlungsphase des Experimentes in die Plastebehälter für die Urinsammlung gegeben sowie nach jeder täglichen Sammlung. Es ist dafür zu sorgen, daß jeder mögliche Urinverlust verhindert wird. Der gesammelte Urin wird zu einem konstanten, notierten Volumen verdünnt und dann zu Proben (50ml) eingeteilt, markiert und bis zur Analyse eingefroren. Der Kot wird täglich gesammelt, in markierte Plastesäcke gefüllt und bis zur Analyse eingefroren. Brocken werden gleichfalls gesammelt, gewogen und eingefroren. Kleine Proben von Futter werden täglich entnommen, eingefroren und vor der Analyse zusammengenommen.

Futter- und Kotproben werden über Nacht bei 100⁰C getrocknet (oder länger bei einer niedrigeren Temperatur). Die getrockneten Futter- und Kotproben werden durch eine Wiley-Mühle gemahlen und 2 Tage zur Äquilibrierung an der Luft gehalten.

Trockensubstanz und N-Gehalt werden von Futter und Kot bestimmt. Alle Proben werden unter Anwendung eines automatisierten Kjeldahl-Verfahrens auf Stickstoff hin analysiert. Urin wird als solcher analysiert, und es wird die tägliche Stickstoffausscheidung im Urin ermittelt. Mit Ausnahme von Urin werden alle N-Werte auf Trockensubstanzbasis ausgedrückt.

Das Gewicht der Schweine wird am ersten Tag der Einstellung, am ersten Sammlungstag und am Schluß der Sammlungsphase aufgezeichnet. Dadurch wird gewährleistet, daß die Schweine eine positive Energiebilanz haben.

Stickstoffbilanz _

Die Ermittlung vom Cam-rpST in einer Stickstoffbilanzstudie umfaßte insgesamt 12 Zuchtschweine bei drei Behandlungen:

1. negative Kontrolle (tägliche Injektion von Kochsalzlösung), 2. Cam-rpST, 3mg/d; und 3. positive Kontrolle, 3mg „natürliches" PST. Kot und Urin wurden nach einer Einstellungsperiode von 2 Wochen sieben Tage lang gesammelt. Die Ergebnisse und die Berechnungen der relativen Aktivität sind wie folgt:

Einfluß von carbamidomethyliertem rpST (Cam-rpST) und „natürlichem" PST auf die Stickstoffbilanz von Zuchtschweinen.

Kriterium	Neg. Kon.	Cam-rpST	Pos. Kon.
Stickstoffaufnahme, g/d	41,86	41,36	41,83
Stickstoffausscheidung, g/d
Kot	5,25	5,21	4,65
Urin	23,06	16,74	15,12
Absorbierter Stickstoff, g/d	36,61	6,15	37,18
Stickstoffverdaulichkeit, %	87,46	87,43	88,88
Stickstoffretention, g/d	13,56	19,41	22,06
Durchschn. tägliche Zunahme, g	328,6	383,9	401,8

*Cam-PST = (Cam-Cys 183,191) rpST

Beispiel 20

Herstellung von Paste unter Verwendung von (Cam-Cys 183,191) rpST

Es wird ein Gemisch aus (Cam-Cys 183,191) rpST, das Natriumbenzoat (7% M/M) und ein Blockcopolymer von Ethylenoxid und Propylenoxid (0,5M/M) enthält, mit Hilfe der in Beispiel 13 beschriebenen Sprühtrocknungsmethode hergestellt. Das dadurch gewonnene Gemisch (7,28g) wird zu einer gerührten Lösung von Glyceryltristearat (19,5g) in einem 4/1 M/M Gemisch von einem Gemisch von Capryl-, Caprin-, Laurin- und n-Capron-triglyceriden (Miglyol®813)³/Sojaöl (71 ml), bei 75°C bis 80⁰C gegeben. Das Gemisch wird bei 75°C bis 80⁰C gerührt, bis es homogen ist und anschließend gekühlt. Die resultierende Zusammensetzung, die auf Massebasis besteht aus: (Cam-Cys 183,191) rpST6,96%, Natriumbenzoat 0,51 % oberflächenaktivem Mittel (Blockcopolymer) 0,03% und Vehikel 73,0%, wird Tieren im allgemeinen durch subkutane Injektion unter die Haut der Tiere im Bereich des Kopfes oder Nackens verabreicht.

Beispiel 21

Herstellung einer viskosen injizierbaren Gelformulierung, die (Ala-Cys 183,191) rpST enthält Zu 140g supergereinigtem Sojabohnenöl in einem Becherglas werden 12g Aluminiummonostearat gegeben. Das Gemisch wird bis zur Gleichförmigkeit gerührt und über 30 Minuten lang auf annähernd 140°C erhitzt, bis die sichtbare Auflösung des Monostearats in dem Sojabohnenöl erfolgt. Das Becherglas wird von der Wärmequelle entfernt und zum Abkühlen auf annähernd 60⁰C stehen gelassen. Anschließend wird unter Rühren sprühgetrocknetes (Ala-Cys 183,191) rpST (2,66g) zugesetzt, um eine homogen verteilte Suspension zu erzeugen. Das viskose Gemisch wird in 30-ml-Einwegspritzen gefüllt. Das in jede Spritze eingefüllte Volumen beträgt 20 ml und enthält 350 mg (Ala-Cys 183,191) rpST. Nach dem Einfüllen des Gelgemischs in die Spritzen wird die Zusammensetzung zu einem kremartigen steifen, jedoch extrudierbaren Gel. Die gefüllten Spritzen werden anschließend bis zum Gebrauch in einem Kühlschrank aufbewahrt

Beispiel 22 Herstellung einer Paste unter Verwendung von Ala-Cys 183,191 rpST

Sesamöl (4,18g) und Getucire 46/07 (Cattlefosse-0,74g) werden unter Anwendung eines Rührstabes in einem Glasbehälter vermischt. Das Gemisch wird anschließend unter Rühren auf 65°C erhitzt, bis es homogen ist. Der Rührstab wird entfernt, und 0,052g Ala-Cys 183,191 rpST werden zur Bildung der Formulierung zugesetzt.

Beispiel 23 Herstellung von zink-assoziiertem Ala-Cys 183,191 rpST und von Paste davon

Ala-Cys 183,191 rpST wird in 0,09 M TRIS-Lösung bei 21,5 mg rpST je ml, 40'C und pH-Wert 9,5 gelöst. Es erfolgt die Umwandlung zu Zinksalz durch die Zugabe von 1 M ZnCb unter Rühren. Das Zinksalz fällt aus. Es wird durch Zentrifugieren mit 10000 χ g über einen Zeitraum von 30 Minuten gewonnen, wobei die Losung auf 40X gehalten wird. Die Lösung wird lyophilisiert, um ein Pulver zu erhalten. Zu 140gSesamöl in einem Becherglas werden 12g Aluminiummonostearai gegeben. Der Inhalt wird unter Rühren auf 155°C erhitzt (bis das Monostearat gelöst ist). Das Becherglas wird von der Wärmequelle entfernt und zum Abkühlen stehen gelassen. Beim Abkühlen wird die Lösung zu einem Gel. Das Gel wird in eine Kugelmühle geleitet (ausgestattet mit Rührwerk mit hoher Scherung und rostfreien Stahlkugeln). An die Mühle wird Vakuum angelegt, und das Zinkpulver wird langsam zugegeben, bis die Zusammensetzung 40% Zinkpulver enthält. Das Rühren wird fortgesetzt, bis der mittlere Durchmesser des Zinkpulvers unter 10 Mikrometer reduziert ist. Die Stahlkugeln werden von dem Gel entfernt, das in Spritzen gefüllt wird.

Die oben beschriebenen DNA-Stämme wurden am 23. August 1988 im ATCC hinterlegt. Es handelt sich um mp 11 pSTE34 (ATCC-Nummer 40482), pRO211 (ATCC-Nummer 40483) und pig24 (ATCC-Nummer 40484). Fachleute dürfen klar sein, daß diese DNAs in jedes beliebige Expressionssystem eingefügt werden können, um erfindungsgemäße Somatotropine oder Mutationen davon zu gewinnen.

Die E.coli K12 Bakterienstämme, die einige der erfindungsgemäßen neuartigen Tier-Somatotropine exprimieren, wurden gleichfalls am 23. August 1988 im ATCC hinterlegt. Die Bakterienstämme umfassen E.coli Stamm 1655 (ATCC-Nummer 67762), 1655/pROpSTA34 (ATCC-Nummer 67763), 1655/pROpSTE34 (ATCC-Nummer 67764), 1655/pROpST (ATCC-Nummer 67765), 4200 (ATCC-Nummer 67766), 4200/pROpSTA34 (ATCC-Nummer 67767), 4200/pROpSTE34 (ATCC-Nummer 67768), 420/ pROpST (ATCC-Nummer 67769), 4255 (ATCC-Nummer 67770), 4255/pROpSTA34 (ATCC-Nummer 67771), 4255/pROpSTE34 (ATCC-Nummer 67772), 4255/pROpST (ATCC-Nummer 67773) und 4300 (ATCC-Nummer 67774).

Beispiel 24

Oeletierung der Cysteine in der Disulfidbindung der kleinen Schleife unter Anwendung von zwei synthetischen Oligonucleotiden

Ein als C183 del bezeichnetes synthetisches Oligonucleotid hat die folgende Sequenz:

5'CGG GTC ATG AAG AGA CGG TTC GTG GAG 3'

Dieses Oligonucleotid unterscheidet sich von der analogen DNA-Sequenz des rpST-Gens in zwei Punkten. Erstens ist die das Cysteincoden an Position 183 kodierende DNA in dem Oligonucleotid deletiert. Zweitens ist die das Arginincoden an Position 184 kodierende DNA in dem Oligonucleotid von CGC in AGA umgewandelt, wobei letztere gleichfalls Arginin kodiert. Daher ist das an Position 183 vorhandene Cystein deletiert.

Einsträngige pGEM-3z (f + )pST-SX DNA bildet das Substrat für die Mutagenese. Diese DNA ist aus einem modifizierten rpST-Gen zusammengesetzt, das in dem im Handel erhältlichen Phagemid pGEM-3z (f+) enthalten ist. Die Modifikation des rpST-Gens resultiert in der Veränderung der DNA-Sequenz, so daß die Einfügung einer Sacl Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstelle an den Positionen 225 bis 230 der Kodierungsregion möglich wird sowie die Einfügung einer Xbal Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstelle an den Positionen 285 bis 290. Durch diese Veränderungen in der DNA-Sequenz erfolgt keine Veränderung der Aminosäuresequenz des rpST-Proteins. Ein mit diesen Restriktions-Endonucleasen unter Anwendung von Standardverfahren gespaltenes ECOR I/Hind Ill-Fragment resultiert in Phagemid pGEM-3z (f+IpST-SX. Die einsträngige pGEM-3z(f+)-DNA wird mit Hilfe von Standardprotokollen aus gereinigter Phage hergestellt. 2 000 ng dieser DNA werden mit 100 ng des Oligonucleotids C183 del vermischt, wobei letzteres vorher mit Adenosin 5'triphosphat und Polynucleotidkinase an seinem 5'-Ende phosphoryliert worden ist. Das Gemisch ist in einem Gesamtvolumen von 10μΙ in 1X Hybridisierungspuffer enthalten (1 X Hybridisierungspuffer ist 75mM KCI und 5mM Tris-Cl, pH-Wert 8,0). Das Gemisch wird 7 Minuten lang auf 65°C erhitzt, worauf eine Inkubationszeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur folgt. Durch diese Verfahrensweise kann das Oligonucleotid zu der einsträngigen Substrat-DNA hybridisieren. Hybridisierte Moleküle werden zu kovalent geschlossener «loppelsträngiger DNA durch die Zugabe von 22 μΙ H₂O, μΙ 2OmM ATP, 2 Einheiten von jeweils T4 DNA-Ligase und großem Fragment von DNA-Polymerase I (hinsichtlich Einheiten-Definitionen siehe New England Biolabs, Katalog, 1986), 2μΙ 20X dNTP's (ein Gemisch von den vier Desoxyribonucleotid 5'-triphosphaten je mit einer Konzentration von 2mM) und 4μΙ 10X Filiinpuffer (1X Filiinpuffer ist 27,5 mM Tris-Cl, pH 7,5,15 mM MgCI₂,2 mM DDT) umgewandelt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur wird die Hälfte der Reaktion in kompetente HB101 Zellen mit Hilfe eines Standardtransformationsprotokolls eingefügt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C werden Kolonien auf Nitrocellulosefilter übertragen und für die Hybridisierung bearbeitet, indem die verlangte Mutation durch Radiomarkierung ihrer 5'-Enden mit Gamma-32 P-ATP und Oligonucleotidkinase nachgewiesen wird. Nach einer Vorhybridisierung von drei Stunden bei 37°C in 5 X SSC, 1 X Denha rdt's und 150μg/ml Hefe tRNA wird das radioaktivmarkierte Oligonucleotid zugegeben, damit es mit der DNA auf den Filtern über Nacht bei 37°C hybridisieren kann. Die Filter werden 30 Minuten lang bei 37°C in 5X SSC und anschließend 30 Minuten lang bei 61,5"C in TAC gewaschen. Während dieser letzten Wäsche werden nur diejenigen Kolonien, deren Plasmid-DN A die verlangte Mutation enthält, weiter mit der radioaktiv markierten Oligonucleotidsonde hybridisieren. Diese Kolonien werden nach der Belichtung der gewaschenen Filter auf Röntgenfilm nachgewiesen. Plasmid-DNAwird aus verschiedenen dieser Kolonien von der ursprünglichen Petrischale zubereitet, in kompetente HB101 Zellen wie oben beschrieben eingefügt und erneut mit der radioaktiv markierten Oligonucleotidsonde wie oben gescreent. Plasmid-DNA wird von Kolonien erzeugt, deren DNA mit der Sonde hybridisiert, und wird auf die verlangte DNA-Sequenz hin analysiert. Alle analysierten Klone enthalten die C183 del Mutation. Plasmid-DNA von einem Klon, als pGEM-3z (fH-)pST-SX 183del bezeichnet, wird durch Transformation in kompetente JM101 Zellen eingefügt, und einsträngige DNA wird aus gereinigter, von einem einzigen Transformanten stammender Phage j erzeugt.

Um die Cystein-kodierende DNA an Position 191 zu deletieren, wird das folgende als c 191 del bezeichnete Oligonucleotid ;

synthetisiert: ί '

5' TTC GTG GAG AGC TCG TTC TAG TTG 3' j i

Dieses Oligonucleotid unterscheidet sich von der analogen DNA in dem rpST-Gen in zwei Punkten. Erstens ist die das Cysteincodon an Position 191 kodierende analoge DNA in dem Oligonucleotid deletiert. Zweitens wurde die serin-kodierende DNA an Position 190 von ABC zu TCG in dem Oligonucleotid verändert, wobei letzteres gleichfalls Serin kodiert. Die einsträngige Matrizen-DNA von pGEM-3z (f+) pST-SXC183del und das Oligonucleotid C191 del werden hybridisiert, erweitert und ligiert wie zuvor. Das Gemisch wird in kompetente HA101 Zellen eingefügt, und Transformanten werden auf das Vorhandensein der Mutation genau nach der für C183 del beschriebenen Methode hin analysiert. Das C191 del-Oligonucleotid wird als die radioaktiv markierte Nachweissonde verwendet. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen entsprechen genau den für C183 del beschriebenen. Verschiedene die C191 del-Mutation enthaltende Klone werden durch die DNA Sequenzanalyse identifiziert. Die C183- und C 191-Deletionen enthaltende Plasmid-DNA wird als pGEM-3z- (f+)-pST-SXC 183,191 del bezeichnet.

Claims

1. Rekombinantes Tier-Somatotropin, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der vier Aminosäurereste in dem rekombinanten Tier-Somatotropin ersetzt, modifiziert, eliminiert oder derivatisiert ist.

2. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den vier (4) Cysteinen, zwei in der kleinen Schleife und zwei in der großen Schleife, mindestens eines (1) durch die Aminosäuren, einzeln unter Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Histidin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Methionin, Serin, Threonin oder Prolin ausgewählt, ersetzt ist.

3. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den vier (4) Cysteinen, zwei in der kleinen Schleife und zwei in der großen Schleife, mindestens eines (Ddeletiertist.

4. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vier Cysteine zu Cysteinsäure modifiziert sind.

5. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei (2) Cysteine in der kleinen Schleife oder die zwei (2) Cysteine in der großen Schleife oder alle vier (4) Cysteine in beiden Schleifen derivatisiert sind mit Substituenten ausgewählt unter (CH₂COOH); [CH(CO₂H)(CH₂)xCO₂H], CH₂CONR₃(R₄), (R₅), [(CH^SO'sl, (CHCH₂CONR₃CO), l(CH₂)_mNR₃R₄J, (CH₂OCOCH₂R₅) oder (SR₆); wobei R₃ und R₄ jeweils sind H, f(CH₂)_xCO₂H], [CHIOOzHMCH^COzH], C₁-C₆-AIkYl, wahlweise substituiert mit 0 bis 2 Hydroxylgruppen oder Polyethylenglycol; R₅ C₁-C₆-AIkYl, C₁-C₄-Alkoxymethyl ist und R₆ C₁-C₆-AIkYl, Polyethylenglycol oder Phenyl, wahlweise mit einer oder zwei Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen substituiert, ist; η eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist; und χ eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; unter der Voraussetzung, daß, wenn die Cysteinaminosäurereste des rekombinanten Tier-Somatotroptns derivatisiert sind, beide Cysteinreste in der kleineren Schleife oder beide Cysteinreste in der großen Schleife des Somatotropins mit der gleichen Gruppe substituiert sind; gleichfalls vorausgesetzt, daß die Substituenten an den Cysteinaminosäureresten in der kleineren Schleife der gleiche Substituent wie oder andere Substituenten als die Substituenten an den Cysteinaminosäureresten in der großen Schleife des Somatotropins sind.

6. Modifiziertes rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier-Somatotropin ist (Ala¹⁸³· ¹⁹VpST; (Ala¹⁸³· ¹⁹VbST; (Ala¹⁸³· ¹⁹VoST; (Ala¹⁸³· ¹⁹VaST; (Ser¹⁸³· ¹⁹VpST; (Ser¹⁸³· ¹⁹VbST; (Ser^l83'¹⁹¹)roST; (Ser¹⁸³· ¹⁹VaST; (Glu¹⁸³· ¹⁹VpST; (Glu^ie3<¹⁹¹)rbST; (Glu¹⁸³· ¹⁹VoST; (GIu¹⁸³'¹⁹VaST; (Glu¹⁸³-Ala¹⁹¹)rpST; (Glu¹⁸³-Ala¹⁹¹)rbST; (Glu¹⁸³-Ala¹⁹¹)roST; (Glu¹⁸³-Ala¹⁹¹)raST; (Glu¹⁸³-Ser¹⁹¹)rpST; (Glu¹⁸³-Ser¹⁹¹)rbST; (Glu¹⁸³-Ser¹⁹¹)roST; (GIu¹⁸³-Ser¹⁹¹)raST; (Arg¹⁸³· ¹⁹VpST; (Trp¹⁸³· ¹⁹VpST; (Asp¹⁸³· ¹⁹VpST und (Asn¹⁸³· ¹⁹VpST.

7. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Tier-Somatotropin ist

Rekombinantes Schweine-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-AIa-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu- His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rr-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-GI u-Gly-l Ie-G In-Ala-Leu-Met-Arg-G I u-Leu-GI u-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp-

166 Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-Phe-

Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R₁-Arg-AΓg-Phe-Val-<3lu-SeΓ-Ser-R_1a-Ala-Phe-OH.

RekombinantesRinder-Somatotropin H-M et-Asp-G I n-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu- His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rr-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-F^a-Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-Val-Met-Lys-Rt-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R^-Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Schaf-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-H i s-G I n-Leu-AI a-Ala-Asp-Th r-Phe-Ly s-G I u-Phe-G I u-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-

55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rr-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Val-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rja-Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-RTa-Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Pferde-Somatotropin H-M et-Asp-G I n-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu- His-Gln-Leu-Ala-Aia-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile

55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rz-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Met-G I u-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-Glu-

GIu-G ly-lle-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu—Arg-Ser—Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rza-Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-Ria-Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Human-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu- His-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-Gln-Glu-Phe-Glu-Glu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe-

56

Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-Rz-Phe-Ser-Glu-Ser-Me-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-Gln-G In-Lys-Ser-Asn-Leu-G I u-Leu-Leu-Arg—Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-Phe-Leu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-Gly-Ala-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-Leu-Glu-Asp-G!y-Ser-Pro~Arg-Thr-Gly-Gln-lle-Phe-Lys-Gln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr-167
Rza-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe-

184

Leu-Arg-lle-Val-Gln-R^Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-191
R_1a_Gly-Phe-OH.

Rekombinantes Vogel-Somatotropin H-M et-Asp-G I n-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Asn-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu- His-Leu-Leu-Ala-Ala-Gln-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-

55

Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Tyr-Rz-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Met-Gly-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Thr-Pro-Val-Gln-Tyr-Leu-Ser-Lys-Val-Phe-Thr-Asn-Asn-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Va I-Phe-G I u-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-G Iu-Glu-Gly-lle-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Arg-Se r-P ro-Arg-G Iy-P ro-G I n-Leu-Leu-Arg-Pro-Th r-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Ile-His-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rza— Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Val-Glu-Thr-Tyr-Leu-Lys-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ser-Asn-R, _a-Thr-Ile-OH.

worin R₁ und R_{1 a} Cys, CyS(CH₂COOH), CyS[CH(CO₂H)(CH₂)XCO₂H], CyS(CH₂CONR₃R₄). Cys(R₅), Cys(CH₂)_nSO-₃, CyS(CHCH₂CONR₃CO), CyS(CH₂UNR₃R₄, CyS(CH₂OCOCH₂R₅) oderCys(SR₆) sind; R₂ und R_2a Cys, CyS(CH₂COOH), CysICH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H], CyS(CH₂CONR₃R₄), CyS(R₅); Cys(CH₂)_nSO-₃, CyS(CHCH₂CONR₃CO), Cys(CH₂)_mNR₃R₄, CyS(CH₂OCOCH₂R₅) oder Cys(SR₆) sind;

R₃ und R₄ jeweils H, l{CH₂)_xCO₂H], (CH(CO₂H)(CH₂)XCO₂H], C₁-C₆-AIkYl, wahlweise substituiert mit bis 2 Hydroxygruppen oder Polyethylenglycol, sind; R₅ C₁-C₆-AIkYl oder Ci-C^AIkoxymethyl ist, und R₆ C₁-C₆-AIkYl, Polyethylenglycol, Phenyl oder Phenyl, wahlweise substituiert mit einer oder zwei Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen, ist; η eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist; und χ eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; unter der Voraussetzung, daß, wenn R₁ und Ri a Cys sind, R₂ und R_2a ein derivatisiertes Cys darstellen müssen; und wenn R₂ und R_2a Cys sind, R₁ und R_{1 a} ein derivatisiertes Cys darstellen müssen; und weiter unter der Voraussetzung, daß, wenn entweder R₁ und R₁₃ oder R₂ und R_2a Cys darstellen, eine Disulfidbrücke zwischen den beiden durch R₁ und R_1a oder R₂ und R_2a dargestellten Funktionen gebildet wird.

8. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Ri und R_1a CyS(CH₂OQH) undR₂.und.R_2a Cys sind.

9. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Ri und R_1a Cys(R₅) sind; R₅ C₁-C₆-AIkYl oder C^GrAlkoxymethyl ist und R₂ und R_2a Cys sind.

10. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R_1a Cys(R₆) sind; R₆ C₁-C₆-AIkYl, wahlweise substituiert mit etwa 0 bis 2 Hydroxylgruppen, PropylenglYCol, Phenyl oder Phenyl, wahlweise substituiert mit einem oder zwei Carbonsäureoder Sulfonsäuresubstituenten ist, und R₂ und R_2a Cys sind.

11. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R_1a Cys(CH₂)_nSO~3 sind; η eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist und R₂ und R_2a Cys sind. _

12. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R_1a CyS(CH₂CONR₃R₄) sind; R₃ und R₄ jeweils H, C₁-C₆-AIkYl, Polyethylenglycol, [(CH₂)_XCO₂H)] oder [CH(CO₂H)(CH₂)_XCO₂H] sind; χ eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und R₂ und R_2a Cys sind.

13. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R_{1 a} Cys [CH(CO₂H)(CH₂)_XCO₂H] sind; χ eins oder zwei ist und R₂ und R_2a Cys sind.

14. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ und R_2a Cys(R₅) sind; R₅ C₁-C₆-AIkYl oder C₁-C₄-AIkOXymethyl ist und R₁ und R_1a Cys sind.

15. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ und R_2a Cys(SR₆) sind; R₆ C₁-C₆-AIkYl, wahlweise substituiert mit 0 bis 2 Hydroxylgruppen, Propylenglycol oder Phenyl, wahlweise mit einer oder zwei Carbonsäure- oder Sulfonsäuresubstituenten substituiert, ist, und R₁ und R_{1 a} Cys sind.

16. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ und R_2a Cys(CH₂)_nSO~3 sind; η eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und R₁ und R_1a Cys sind.

17. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ und R_2a CyS(CH₂CONR₃R₄) sind; R₃ H, C₁-C₆-AIkYl oder Polyethylenglycol ist; R₄ C₁-C₆-AIkYl oder Polyethylenglycol ist und R₁ und R_{1 a} Cys sind.

18. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin (CH₃S-CyS¹⁸³'¹⁹¹) rekombinantes Schweine-Somatotropin ist.

19. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dsrß das Somatotropin (HO₃SCH₂CH₂CH₂-CyS¹⁸³'¹⁹¹) rekombinantes Schweine-Somatotropin ist.

20. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₁und R_1a CyS(CHCH₂CONR₃CO) sind und daß R₃ C₁-C₆-AIkYl ist und R₂ und R_2a Cys sind.

21. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R_1a (CH₂)_mNR₃R₄ sind; m 1 ist; R₃ H ist und R₄C₁-C₆-AIkYl ist und R₂ und R_2a Cys sind.

22. Rekombinantes Tier-Somatotropin nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R_1a (CH₂OCOCH₂R₅) sind; R₅ C₁-C₆-AIkYl ist und R₂ und R_2a Cys sind.

23. Verfahren zur Inhibition der Aggregation eines rekombinanten Tier-Somatotropins, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren umfaßt: Auflösen des rekombinanten Tier-Somatotropins in Wasser oder einer wäßrigen Lösung, die Guanidinhydrochlorid oder Natriumhydrogencarbonat enthält; Einstellung des pH-Wertes dieser Lösung auf einen Wert von 8,4, Behandlung der pH-eingestellten Lösung mit Dithiothreitol; anschließend Behandeln des auf diese Weise gebildeten Gemischs mit einem Halogenacetamid, einer Halogenessigsäure, einem Alkalimetalltetrathionat, Q-C-Alkylmethanthiosulfonat oder C₁-C₆-AIkYlSuIfOn; Entsalzen des resultierenden Gemischs mit Hilfe der Ultrafiltration und Anwendung von erneuter Verdünnung, erneuter Filtration und Lyophilisierung für das resultierende Gemisch, wobei mindestens eine oder beide der Sulfidbrücken am Cysteinrest reduziert wird (werden) und der Cysteinaminosäurerest derivatisiert wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Tier-Somatotropin ist

Rekombinantes Schweine-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Le u-Ph e-AI a-Asn-Ala-Va I-Leu-Arg-Ala-G I n-H is-Leu-H i s-G I n-Le u-AI a-Ala-Asp-Thr-Ty r-Lys-G lu-Phe-G I u-Arg-Ala-Tyr-lle-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-lle-

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-RT-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-lle-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr—Asp—Lys—Phe—Asp-Thr—Asn—Leu—Arg—Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu—Leu—Lys—Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

S S

Val-Met-Lys-Ri-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R^- Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Rinder-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu- His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-

55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rz-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys—Ser-Asp—Leu—GIu-Leu—Leu-Arg-lle-Ser—Leu-Leu-Le u-l I e-G I n-Se r-Trp-Leu-G ly-Pro-Leu-GI n-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp—Lys—Phe—Asp—Thr—Asn—Met-Arg-Ser-Asp-Asp—

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-TyΓ-Gly-Leu-Leu-Ser-R2a-Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-183 191

S S

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R^- Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Schaf-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-G i n-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-G Iu-Arg-Thr-Tyr-lle-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-lle-

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rr-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Le u-lle-G I n-Se r-Trp-Leu-G ly-Pro-Leu-GI n-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-S er-Asp-Arg-Va I-Ty r-G I u-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-G I u-

GI u-G Iy-I le-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-G I u-Leu-Glu-Asp-Val-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-lle-Leu-Lys-Gln-Thr- Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-SeM^a-Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R^- Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Vogel-Somatotropin H-M et-Asp-G I n-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Asn-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu- His-Leu-Leu-Ala-Ala-Gln-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg—Thr—Tyr-lle—Pro—Glu-Asp—Gin—Arg—Tyr-Thr—Asn-

55

Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Tyr-Ry-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Met-Gly-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Thr-Pro-Val-Gln-Tyr-Leu-Se r-Ly s-Va I-Ph e-Th r-Asn-As n-Le u-Va I-Phe-G ly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Phe-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-lle-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Arg-Ser-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Leu-Leu-Arg-Pro-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Ile-His-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rja—Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Val-Glu-Thr-Tyr-Leu-Lys-

183 191

Val-Met-Lys-Ri-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ser-Asn-Ria-Thr-lle-OH.

Rekombinantes Pferde-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-H is-G I n-Leu-Ala-Ala-Asp-Th r-Tyr-Lys-G lu-Phe-Glu-Arg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R^Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Met-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Leu-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-Glu-GIu-GIy-I le-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp-

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R2_a-Phe-Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-

183 191

Val-Met-Lys-R^Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R^- Ala-Phe-OH.

Rekombinantes Human-Somatotropin H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-

His-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-Gln-Glu-Phe-Glu-GI u-AI a-Ty r-l I e-Pro-Lys-GI u-G I n-Lys-Ty r-Ser-Phe-

56

Le u-G I n-Asn-Pro-G I n-Th r-Ser-Leu-Ra-Phe-Ser-G I u-Ser-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-Gln-Gln-Lys-Ser—Asn—Leu-Glu-Leu—Leu-Arg—Ile-Ser—Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-Phe-Leu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-Gly-

Ala-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp- \

Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-Leu-GIu-As p-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-He-Phe-Lys-GI n-Th r—Ty r—Ser-Lys-Phe-Asp-Thr—Asn-Ser—His—Asn—
Asp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr-167
R_2a-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe-

184

Leu-Arg-lle-Val-Gln-R^Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-191

S S

R_1a-Gly-Phe-OH.

worin eine oder zwei der Sulfidbrücken an dem mit R₁ und R_1a oder R₂ und R_2a bezeichneten Cysteinrest reduziert ist (sind) und die Cysteinaminosäurereste unabhängig sind Cys, Cys(CH₂COOH), CyS(CH₂CONR₃R₄), Cys(R₅), Cys(CH₂)_nSO-₃, Cys(CHCH₂CONR₃CO), Cys(CH₂)_mNR₃R₄, Cys(SO"₃), Cys(CH₂OCOCH₂R₅) oder Cys(SR₆); R₃ und R₄ jeweils sind H, [(CH₂J_xCO₂Hl, [CH(CO₂H)(CH₂)_XCO₂H], C₁-C₆-AIlCyI, wahlweise substituiert mit 0 bis 2 Hydroxylgruppen oder Polyethylenglycol; R₅ C₁-C₆-AIkYl oder Ci-Q-Alkoxymethyl ist und R₆ d-Q-Alkyl, Polyethylenglycol, Phenyl, wahlweise substituiert mit einer oder zwei Carbonsäure- | oder Sulfonsäuregruppen, ist; η eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist; und m eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist; unter der Voraussetzung, daß, wenn R₁ und R_{1 a} Cys sind, R₂ und R_2a ein derivatisiertes Cys darstellen müssen; und wennR₂ und R_2a Cys sind, R₁ ein derivatisiertes Cys darstellen muß; sowie unter der Voraussetzung, daß, wenn R₁ und R_{1 a} oder R₂ und R_2a Cys darstellen, zwischen den beiden durch R₁ und R_{1 a} oder R₂ und R_2a dargestellten Cys-Funktionen eine Disulfidbrücke gebildet wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Disulfidbrücke, die sich am dichtesten am C-Terminus des Somatotropins befindet und zwischen den beiden Cysteinaminosäureresten in der labilen kleineren Schleife des rekombinanten Tier-Somatotropins gebildet ist, reduziert und derivatisiert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Disulfidbrücke, die sich am N-Terminus des Somatotropins befindet und zwischen den beiden Cysteinaminosäureresten in der stabilen großen Schleife des obigen rekombinanten Tier-Somatotropins gebildet ist, reduziert] und derivatisiert wird.

27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß beide Disulfidbrücken, die zwischen (1) den beiden Cysteinaminosäureresten in der großen Schleife des Somatotropins und (2) den beiden Cysteinaminosäureresten in der kleinen labilen Schleife des Somatotropins gebildet sind, reduziert und derivatisiert werden.

28. Verfahren zur Inhibierung der Aggregation von rekombinantem Tier-Somatotropin, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren umfaßt: Ersetzen von mindestens einem (1) bis zu allen vier (4)j der Cysteinaminosäurereste des rekombinanten Tier-Somatotropins durch einen (1) bis vier (4) Aminosäurereste, einzeln ausgewählt unter Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Histidin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan,] Tyrosin, Methionin, Serin, Threonin oder Prolin.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß einer (1) oder zwei (2) der Cysteine i der labilen kleineren Schleife des Somatotropins, die sich an den Positionen 183 und 191 an demj C-Terminus des Somatotropins befinden, durch Aminosäuren, ausgewählt unter Alanin, Serin, Glutaminsäure, Arginin, Tryptophan oder Asparagin, ersetzt werden und die Cysteine an den Positionen 55 und 166 in der stabilen großen Schleife nicht ersetzt werden.

30. Verfahren zur Inhibierung der Aggregation eines rekombinanten Tier-Somatotropins, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren umfaßt: Deletierung von mindestens einem (1) bis zu allen vier (4) der Cysteinaminosäurereste des rekombinanten Tier-Somatotropins.

<;iert

31. Verfahren zur Inhibierung der Aggregation von rekombinantem Tier-Somatotropin, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren umfaßt: Oxydieren von vier (4) der Cysteinaminosäurereste des rekombinanten Tier-Somatotropins zu Cysteinaminosäure.

32. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein rekombinantesTier-Somatotropin aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die in den Positionen 183 und 191 befindlichen Cysteinaminosäurereste durch einzeln unter Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Histidin, Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Methionin, Serin, Threonin oder Prolin ausgewählte Aminosäurereste ersetzt sind.

33. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein rekombinantes Tier-Somatotropin aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß der an 183 oder 191 oder an beiden Positionen befindliche Cysteinaminosäurerest deletiert ist.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wachstumsfördernde Menge eines modifizierten oderderivatisierten rekombinanten Tier-Somatotropins oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon; und ein pharmazeutisch annehmbares festes oder flüssiges Trägermittel dafür aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung wirksam für die Steigerung der Wachstumsrate eines Tieres über einen längeren Zeitraum ist.

35. Zusammensetzung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung dem Tier parenteral verabreicht wird.

Hierzu 7 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung