PL163920B1 - Sposób hamowania agregacji zwierzecej somatotropiny rekombinowanej PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 Sposób hamowania agregacji zwierzecej somatotropiny rekombinowanej, znamienny tym, ze rozpuszcza sie zwierzeca somatotropine rekombinowana w wodzie lub roztworze wod- nym zawierajacym chlorowodorek guanidyny albo wodoroweglan sodowy, koryguje sie pH tego roztworu do wartosci 8 · 4, dziala sie na ten skorygowany pod wzgledem pH roztwór ditiotreito- lem, a nastepnie dziala sie na tak utworzona mieszanine halogenoacetamidem, kwasem haloge- nooctowym, tetrationianem metylu alkalicznego, metanotiosulfomanem C1-C4-alkilu lub sul- fonem C1-C6-alkilowym, odsala sie powstala mieszanine na drodze ultrafiltracji i poddaje sie powstala odsolona mieszanine ponownemu rozcienczeniu, ponownej filtracji i liofilizacji, w wyniku czego co najmniej jeden, albo oba mostki disulfidowe przy resztach cysteiny zostaja zredukowane i cysternowa reszta aminokwasowa przeprowadzona jest w pochodna. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny kekdmbinouaeej.

Zgodnie z wynalazkiem w zwierzęcych sdmatdtkdpieach ^kombinowanych, co najmniej jedna z czterech cysteieowżch reszt nminokwasdwżch została przeprowadzona w pochodną. Aczkolwiek przystąpiono do produkcji i kontynuuje się wytwarzanie somatotropin na drodze rekombinacji, często występują trudności przy formułowaniu tych somatotropin w celu efektywnego podawania zwierzęciu. W przeciwieństwie do tych somatotropin będących wynikiem ekspresji, stwierdzono, że zmiana tych reszt cysteino^c^ z których cztery znajdują się w somatotropinych przez przeprowadzenie cystein w pochodne, daje w wyniku związki ^logicznie czynne o zwiększonej stabilności do formułowania w dozwolony sposób w celu podawania zwierzętom.

Okazało się, ze możliwe jest zapewnienie nowych somatotropin zwierzęcych, w których co najmniej jedna spośród reszt cysternowych somatotropiny chemicznie przeprowadzona w pochodną, a także przeprowadzanie w pochodną dwu, trzech lub wszystkich czterech spośród tych reszt cżsteieowżch somatotropin zwierzęcych i zapewnienie odpowiadających im nowych związków. Dwie cysteiny znajdują się w małej pętli i dwie w dużej pętli.

Jest możliwe również zapewnienie środków zawierających wspomniane somatotropiny zwierzęce, w których nastąpiło przeprowadzanie w pochodną i które są biologicznie czynne i jeszcze ciągle stabilne pod względem podawania i zapewnienie środków zawierających bilogicznie czynne zwierzęce somatotropiny ^kombinowane, odpowiednie do podawania pozajelitowego, obejmujące zwierzęcą somatotropinę ^kombinowaną, przeprowadzoną w pochodną, lub jej farmaceutycznie i farmakologicznie dozwoloną sól, w ilości sprzyjającej wzrostowi, w farmaceutycznie lub farmakologicznie dozwolonym nośniku stałym lub płynnym, przy czym szybkość wzrostu zwierzęcia zostaje zwiększona w ciągu wydłużonego okresu czasu, pięciu lub więcej dni.

W nowych zwierzęcych somatdtkopieach ^kombinowanych, jedna do czterech cystuiedużce reszt aminokwasowych tych somatotropin mogą być zastąpione jedną do czterech reszt αmindkuαsowych, osobno wybranych spośród aminokwasów takich jak akgieiea, lizyna, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, asparagina. glutamina, histydyna, alanina, glicyna, izoleucyen, leucyna, walina, fenyloalamna, tryptofan, tyrozyna, metionina, seryna, ^eonina lub prolina, albo w których wszystkie cztery cysteiny przeprowadzone zostały w kwas cysternowy, albo w których obie cysteiny w małej pętli lub obie cysteiny w dużej pętli, lub wszystkie cztery cysteiny w obu tych pętlach zostały przeprowadzone z wykorzystaniem podstawników takich jak (CH 2COOH), [CH(C O2 H)(CH 2)xCO2 H], (CH2CONR3 R4), (R_S), [(CH 2)^^(031, (CHCH2 CONR3CO), (CH 2)mNR3R4, (CH2OCOCH2R5) lub (SR6), w których to wzorach R3 i R4 każdy oznacza H, [(CH2KCO2HI, [CH(CO 2H)(CH 2)xCO 2H], C1-C6-alkil ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi, względnie glikolpolietylenowy, R5 oznacza C1-C6-alkil, glikol polietylenowy lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami kwasu karboksylowego lub kwasu sulfonowego, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4, m oznacza liczbę całkowitą od 2 do 4, a x oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, z tym, że gdy cysternowe reszty aminokwasom wspomnianych zwierzęcych somatotropin kekombieowaeych zostają przeprowadzone w pochodną, obie reszty cysternowe w małej pętli, lub obie reszty cysternowe w dużej pętli danej somatotropiny zostają podstawione tą samą grupą, a również z tym, że podstawniki reszt cysternowych w małej pętli (labUnej i najbliższej C-końca) mogą być takie same lub różniące się od podstawników cystein w dużej pętli (stabilnej i bliższej N-końca), oraz dalej z tym, że gdy jedna cysteinom reszta aminokwasom jest utleniona do kwasu cysternowego, wszystkie takie reszty cysternowe wdanej sdmαtotkdpiniu są utleniane do kwasu cysternowego.

163 920

Wynalazek obejmuje swym zakresem sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej polegający na redukcji co najmniej jednego z dwóch mostków disulfidowych między cysteinowymi resztami aminokwasowymi w pozycjach między 55 a 166 oraz 183 a 191 wspomnianych somatotropin i przeprowadzenie dzięki temu w pochodną każdej z cystein zredukowanego mostka lub mostków w pozycjach między 55 a 166 i/lub 183 a 191 z wykorzystaniem tej samej pochodnej, z tym, że pochodne cystein w pozycjach 55 i 166 mogą być utworzone z wykorzystaniem podstawników takich samych lub różniących się od podstawników cystein w pozycjach 183 i 191. Do podstawników stosowanych w otrzymaniu nowych, przeprowadzonych w pochodne zwierzęcych somatotropin rekombinowanych, somatotropin wytwarzanych sposobem według wynalazku należą podstawniki takie, jak (CH₂COOH), (CH/CO₂H)(CH₂/_xCO₂H), (CHaCONRaRA (R_s), ((CH2)nSOa), NR3R4, (SR©), (CHCH2CONR3CO), (CH₂)_m lub (CH2OCOH 2R5), w których to wzorach R 3 i R 4 każdy oznacza H, [(CH 2)xCO2H], [CH(CO2H)(CH₂)x\\ CO 2H], C1-C6-alkil ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi, lub glikol polietylenowy, R₅ oznacza C1-Ce-alkil lub C1-C4-alkoksymetyI, R6 oznacza C1-Ce-alkil, glikol polietylenowy lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami kwasu karboksylowego lub kwasu sulfonowego, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4, a m oznacza liczbę całkowitą od 2 do 4 i x oznacza liccbę całkowitą od 1 do 3.

W sposobie według wynalazku korzystnymi nowymi somatotropinami zwierzęcymi są rekombinowane somatotropiny: świńska, bydlęca, owcza, ludzka 1 ptasia, w których mostek disulfidowy w małej pętli samałotΓopiny został zredukowany i cysteiny w pozycjach 183 i 191 przeprowadzone w pochodne z wykorzystaniem podstawników takich jak (CH2COOH), [CH(CO₂H)(CH2)xCO₂H], (CH₂CONR3R 4), (R 5), (CH2)nSO3 lub (SRe), w których to wzorach R3, R 4, R5, R 6, n i x mają wyżej podane znaczenie.

Korzystne są także takie somatotropiny, w których cysteiny zostały usunięte (od jednej do wszystkich czterech).

Wszystkie z plazmidów, sekwencje DNA i drobnoustroje zdeponowane w związku z niniejszym zgłoszeniem patentowym, z wyjątkiem tych, które w przeciwieństwie do wspomnianych zostały wyszczególnione, są zdeponowane w muzeum szczepów American Cyanamid Company utrzymywanej w Princeton, New Jersey, oraz w American Type Culture Collection (ATCC) w Rockville, Maryland 20952, USA.

Figura 1. Klonowanie świńskiego genu somatotropiny do M13mp11. RF DNA M13mp11 przecina się enzymami restrykcyjnymi ECoRI i Hindlll i poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia. Ekspresyjny plazmid pEFF-902 trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll. Odpowiednie fragmenty oczyszcza się po elektroforezie w 1% żelu agarozowym. Liguje się je i transformuje nimi E. coli JM 101. Przedstawiona jest struktura powstałego RFDNA M13mp11pST.

Figura 4. Jest to schematyczne przedstawienie schematu mutagenezy z użyciem oligonukleotydu AA1 i jednoniciowego DNA M13mp11pST.

Fugura 3. Analiza sekwencji DNA dotycząca jednoniciowego DNA M13mp11ST i jednoniciowego DNA M13mp11pST34 metodą dideoksy-bakońazenia łańcucha Sangera. Porządek ścieżek od lewej do prawej : GATC somatotropiny świńskiej (pST) typu dzikiego, następnie GATC mutanta pSTA34.

Figura 2. Schematyczne przedstawienie schematów mutagenezy z użyciem oligonukleotydów GLU3 i GLU4 oraz jednoniciowego DNA M13mpl IpST.

Figura 5. Schematyczne przedstawienie konstrukcji bakteryjnego wektora ekspresyjnego zawierającego zmutowany gen pST. Plazmidy nadają oporność na antybiotyk ampicylinę (amp^R).

Korzystne zwierzęce somatotropiny rekombinantowe wytwarzane sposobem według wynalazku przedstawione są poniżej, ale według wynalazku wytwarza się też somatotropiny bez dodatkowych Asp-Gln dodatkowych podstawień względnie z innymi podstawieniami, otrzymywane na drodze rekombinacji. Dalsze somatotropiny zwierzęce z usunięciami odbijającymi się na długości łańcucha aminokwasów, uzupełnieniami odbijającymi się na długości łańcucha aminokwasów, zastąpieniami aminokwasów (poza cysternami), fragmenty zawierające część czynną itp. znajdują się w zakresie wynalazku. Numerowanie reszt aminokwasowych w niniejszym opisie odnosi się do analogów Met-Asp-Gln, ale jest zmienione, aby umożliwić fachowcom zidentyfikowanie mostków disulfidowych utworzonych przez cztery reszty cysteinowe.

163 920 świńska somatotropina rekombinantowa H_-Met_-Asp-Gln_-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-l_eu-S_er-Ser Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-Hi_s-LeuHi _s-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Ly_a-Glu-Ih e-GluArg-Ala- Tyr- Ile-Pro- Glu- Gly- Gln-Arg- Tyr-S er- Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-.R2-Phe-Ser-Glu-ThrHe-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Aap-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu- Ile-Gln-Ser- Trp-Leu-Gly-Pro-Val- Gln-Ph e-LeuSer- Arg-VeQ- Ph e- Thr- Asn- S er-L eu-V al-Ph e- Gly- Thr rSer- Asp-Arg-Val- Tyr-Glu-Lys-Leu-Ly s-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-JArg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Aep-Aep166

Ala-Ieu-Leu-Iys-Asn-Tyr-Gly-Ieu-Ieu-Ser-R 2 a“Ph®Ly s-Lys-Asp-Leu-Hi s-Lys-Ala-Glu- Thr- Tyr-Leu- Arg183 191

Val-Met-Lys-Ri-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-Ri_aAla-Phe-OH.

Bydlęca somatotropina rekombinantowa H-Met-Asp-Gln-Phe-PTo-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-GlyL eu-Ph e-Al a-Asn-Al a-Val-L eu-Arg-Ala-Gln-Hi s-L euHis-Gln-Leu- Ala- Ala- Asp- Thr-Pde-Lys-Glu-Phe- GluArg- Thr- Tyr- II e- ir?o- Glu-Gly- Gin- Arg- Tyr- S er-- II e55

Gln-Asn-Thr-Gln^al-Ala-Hae-Rg-Rie-Ser-Glu-ThrIl e-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln- Gln10

163 920

Ly β - S er-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu- Arg- II e- S er—Ieu-leuLeu- Ile- Gin- S er- Tr j>- L eu-Gly- Pro- L eu- Gin- Ph e- L euSer-Arg-VaLL-Rie-Ihr-Asn-Ser-Leu-Vadi-Ehe-Gly-!QirS er-Asp- Arg-VćoL- T^r-Glu-Lys-Leu- Lys-Aap-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly- Thr- Pro-Arg- Ala-Gly- Gin- Ile-Leu-lys- Gin- Trp» Tyj^As^Lyis-Phe—Asp—Tir—Asn—Met—Arg—Ser—Asp—Asp—

166

Ala-Leu-leu-Lys-Asn-Tja^Gly-Leu-Leu-Ser-Rga-IheArg-Lys-Asp-Lei-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-Ri-Arg-Arg-Rie-Glyy-Glu-Ala-Sei^RLj Ala-Phe-OH.

owczą soraatotroplnę rikcombinantową H-Met-Asp-Gln-Phe-Ero-Ala-Met-Ser-leu-Ser-GlyLeu-Rie-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-Hie-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Ihe-GluArg- Thr- ^nr-Il^i^oj-Glu-Gly-Gln-Arg- T^>Ser-Ile55

Gln-A«>-T!hr-Gln-VsLl.-Ala-Ihe--Il2-Ihe-Ser-Glu-TlirIle-Pro-ALa-Pro-lhr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Leu-Glu-L^i-Leu-JA^g-Ile-Ser-leu-LeuLeu- II e- Gin- S er- Trp-Leu- Gly-Pro-Leu-Gln-Ph e-leuS er-Arg-V łL- Hi e- Thr- Asn- S er- Leu-V aLL- Ehe- Gly- Th rS er- Asp-Arg- Val- T^r- Glu-L^s-L eu- Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-IleLleu-Ala-lui-Met-Arg-Glu-Ieu-Glu-AspV al- Tłrr-Pr*n-Arg- Ala- Gly-Gin-II e-l^i-lys-Gln- IhrTyr-Asp-Lys-Ehe-Asp-Thr-Asn-Met-Ai^-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R 2 _a-Phe163 920

Arg-Ly e-A3]p-leu-Hi θ-Ly s-Tłnr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

V<ŁL-Met-Lys-Ri-Arg-Arg-Ihfr-Gliy-Glu-£La-Ser-Ri _aALa-Hie-Oi.

Końska somatotropina r<komblnaitowa i-Mee-J^]p·Gln-Hae-Rro-ALa-Met-Rro-Leι-Seϊr-s erLeu-Hie-ALa-Asn-Ala-VsaL-Leu-A?g-A.a-Glin-His-LeuiLs-^Gln-^Leu-ALa^-Ala-^Asp-Ehr^Tyr-Lye-Glu-Hh^GLuArg-ALa- Ąyr- II e-Pro- Glu- Gly- Gin-Arg- Tyr- Ser- H e55

Gln-Aoa-Aa-Gln- Aa-Aa-Hi e-R2-Ph e-S er-Glu- ThrIle-fto-Aa-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Aa-Gln-GliArg-Ser-Asp-Met-Glu-Leu-Leu-Arg-Htie-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-GL·i-SeΓ-Trp-Leu-Gl3-I^>ro-Val-GL·l-IJeu-LeuSe2r-Arg-Val-^Ph^Ih;r-Asn-S^^Leu-VsaL-Pl&^(^l;y-ThrSer-Asp-Arg-Yć-a-Tyr-Glu-Iiys-Leu-Arg-Asp-Leu-GluGlu-Gly-IleGGl--Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly- S er-Pro-Arg- AL a- Gly-Gln-IIl-Leu-Lye- Gln-ThrT^ιr-Asp-Lys-Hll-Aflp-Thr-Asl--eu- Arg-Ser-Aep-Aep166

Aa-Leu-IlU-LyE-Asn-ϊyr-Gly-Leu-llu-Slr-R2_a-Ehl-yl-Lys-Asp-Leu-ii s-Lys-Ala-Glu-Bii-· Iyr>Leu-Arg183 191

VA-Met- Lys-R .|-Arg-Arg-Phl-Val-Glu-Sθ3^-SωΓ-R.j_aAa-Ph^Oi.

Ludzka eomaac^tn^j^j-ia rekombinaitowa H-Me t-A»p-Gln- Eh e- Pro- Thr- IIe-Ero-Leu- S er-ArgLeu-HlL-As]pAen-Aa-Met--Ll-Arg-Aa-His-Arg--lu12

163 920

Hls-lln-leueALaeph eeAsp-ϊ^^r-TyFelln-Gl1u-Eheellullu-.A.a-¾^^eIl¢e-Pro-Ly8-Glu-lln-LyseTyΓeSeΓ-ehe56

Leu-Gln-As n-Ao- Gln-Thr-Ser- Leu-Rg-Hae-Sear-GluSM—Ile-Pro-Tir-Pro-Ser-Asn-Arg- Glu-Glu- Thjr-GlnGln-ly&-Ser-Asn-Leu-Glu-leuuLeuu.AAg-Ile-Ser-IjeuLeu-Lmi-Il e-Glm-Ser-2rp--Ieu-Glu-Pro-Yal-Gln-Eh eI eu-Arg-S er-V A.-Ph e-Ala-Asn- S er-L eu-Val- Tyr- GlyAla-^Ser-^Asp-Ser-^Aen-Ya^-^Tyii^jLi^Ii^I^^i^I^eu-Lyei^AepLeu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gn--Blr-leu-Mut-Gly-Arg-LeuGlu-Aep-Gly-Sur-Pϊo-Ar--Thr-Gly-Gln- II e-Pb e-LysGln- Bur- Tyr- S er- Ly s- Ph e-Asp Thr-Asn-S eirHi s-AsnAsp-Asp JAa-Leu-Leu-Lys-Asn- iTy-Gly-Leu-Leu- Ty167

B2a-Ehe-Ag-Lye-Aep-MeU-Aseρlyθ-Vaa-Glu-ThJl>EhuI

184

Leu-Ag-Il e-V al-Gln-R -Arg-S er-V AL- Glu-Gly-S er191

R₁aelly-PheeαI.

Ptasia somtotropina rAcombinantowa H-MeU-JAρGln-]EleuIE?o-JA.a-Met-Ero-Luu-SuΓ-AsnLeu-Bh(eIQa-Ase-Ila-Val-Lu^-.A^,g-IAa-Gln-Hiίe-LeuHi s-Leu-Leu-ALa-Ala-Gln- Thr- Tyr-Lys-Glu-Ph e-GluArg- Thr- Tyr-11 e- Pro-Glu- Asp- Gln-Arg- Tyr- Thr-Asn55

Ly8-Asn-SelrGln-Aa-Ala-TyrΊR2-EUe-SuΓ-Glu-ϊhrIl^Pro-ALa-Pro-Thr-Gly-Iys-AspAspALa-Gln-GlnLys-Ser-AsρMet-Gly-Leu-Leu-Arg-Phιu-Se2rLul-VALLeu- Ile- Gin- Ser- Trp-Leu- Thr- Pro-V AL- Gin- Tyi?- LeuS er-Ly s-V AL-Phe-Thr-Asn-Asn-Leu^al-Ph e-Glj-Thr163 920

Ser-Asjp-Arg-y^L-Rn^-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gl^y-Ile-Gln-Ala-Leu-Mee-jAg-Glu-Leu-Glu-AspArg-Ser-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Leu-Leu-Arg-Pro-ThrByr-Asjp-lys-Phie-Asp-Ile-Hie-Leu-Arg-Asn-Glu-Aflp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-^a-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-VO.-Glu-Ih:r-Tyr-Leu-ly8191

VŁL-Met-Lys-R1“Arg-Arg-Ihe-Gly-Glu-Ser-A8n-R.1a“

Bn^-Ile-CH.

po czym symboLe R1, R1a, R 2 i R 2a odnoszące się do tych zwierzęnynh sdmatotrobin rekombinontow-ch każdy, niezaLeżnie, oznacza resztę ami-dkwosową, taką jak reszto orginin-, Lizyn-, kwasu asparaginowego, kwasu gLutaminowego, asbaragi-e, gLutaminy, hist-d-n-, aLonin-, gLic-n-, izoLeęcy-y, Leucyny, waLiny, fenyloaLa-i-y, trebtdfanu, terdzene, metioniny, ser-ny, tredniny, proLinLub nysteine, z tym, że co najmniej jedna z tych reszt ami-dkwasdwenh przedstawionych symboLami R1, R1a, R 2 1 R 2a w powyżej ziLustrowanych somatdtrobinanh oznacza resztę amindkwosdwą inną niż cysteiny.

SpecjaLnie kdrpystnymi zmodyfikowanymi zwierzęcymi sdmatdtrdbinomi rekdmbinontdwymi wytwarzanymi sposobem według wynaLazku są te, w których jeden Lub obo podstawniki o symboLach R1 i R1. w pozycjach somatotrdbi-y 183 i 191, Lub w poz-cjoch 184 i 191 Ludzkiej 2omatotrobine reSombinantowej oznaczają aminokwas inny niż cysteina.

Wytwarzanie wyżej wspomnionych zmodyfikowanych (podstawionych) zwierzęcych somototrobin reSombinantowenh według wynaLazku przebrdwodzo się z zastosowaniem mutogenezy ukierunkowanej. Obecnie używane techniki zmieniania sekwencji DNA kLonowonego segmentu DNA w specyficznie zdefiniowanym miejscu wymagają wytworzenia jednonicidwej postaci tego DNA. Jednoniciowy DNA łączy się z sy-tetenz-em dLigonukLeotedem, który jest kompLementarny z jego częścią, z tym wyjątkiem, że dłigo-ukłeotyd zawiera w sobie region błędnego pordwonio, zazwyczaj umiejscowiony w środkowej części tego dLigdnukłedtydu. Połączoną mieszaninę czyni się następnie dwu-icidwą i kowaLencyjnie zamkniętą w wyniku dodania dużego fragmentu bdłimerazy DNA I E. coLi i trifosforanów ZeoSsenukLeotydów w obecności Ligazy DNA T4 i 5'^fosforanu adenozene. Dwu-iniowem DNA transformuje się następnie odpowiedni szczep E. coLi, w którym region DNA błędnego sbarowa-ia uLega nobrowie i repLikacji. Otrzymuje się dwie popuLacje kLonów. W zaLeżności od tego, która nić zostanie wybrano jako matryco, do setewpe naprawczej, SLon zawiera sekwencję aLbo typu dzikiego, aLbo zmienioną (zmutowaną). KLony, które zawierają sekwencję zmutowaną, to jest taką, któro odpowiada sekwencji dhgdnukłedtedu, seLekcjonuje się na drodze hybrydyzacji z bromlenidtwórnzd znakowanym dhgonukłedtedem.

W zaLeżności od błędnego sbarowa-ia między oLigonukLeot-dem o sekwencją typu dzikiego, promieniotwórczo znokowony oLlgo-ękLeotyd zostOje bardziej stobiLnie związany z kLonomi, które zawierają zmutowaną sekwencję. Tak więc, inkubacja w odpowiedniej temperaturze różnicuje kLony typu dzikiego i zmutowane. Zmiany w pldentyfiSowonenh kLonoch potwierdza się następnie za pomocą sekwencjondwnnιa DNA odpowiednich regionów. W następującym doLej omówieniu wybiera się świńską somototrobmę reSdmbl-antdwą jako rebrezentotywną dLo zmodyfikowanych Lub brzebrowadzdnynh w pochodną 2dmatotrobin zwierzęcych wytwarzanych sposobem według wynaLazku i metod stosowanych w ceh jej otrzemywanio.

163 920

Klonowanie świńskiego genu somatotropiny (rpST) do tworzącego pojedynczą nić wektora, bakteriofaga M13mp 11 (ATCC) osiąga się następującym ogólnym sposobem postępowania przedstawionym na figurze 1.

Fragment DNA zawierający świński gen somatotropiny (rpST) wyodrębnia się z bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pEFF - 902 (ATCC) za pomocą rozszczepienia enzymami restrykcyjnymi EcoRI oraz Hindlll. Fragment zawierający gen rpST oczyszcza się następnie za pomocą elektroforezy w zelu agarozowym. Replikatywną postać (RF) DNA M13mpl 1 trawi się następnie EcoRI i Hindlll, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i oczyszcza duży fragment za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Następnie dwa oczyszczone fragmenty miesza się razem i liguje ligazą DNA T4. Mieszaniną transformuje się E. coli JM 101 (ATCC) i kilka utworzonych łysinek poddaje hodowli. Replikatywną postać (RF) DNA otrzymuje się standardową metodą alkalicznej lizy i ustala strukturę trawieniem odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Wyodrębnia się klon zawierający oczekiwane fragmenty i oznacza go M13mp11pST (ATCC). Do potwierdzenia identyczności klonu stosuje się analizę sekwencji DNA.

Mutagenezę genu rpST w M13mpllpST osiąga się następnie tak, jak to opisano poniżej i przedstawiono w zarysie na figurze 2. Celem programu mutagenezy jest wytworzenie cząsteczki rpST niezdolnej do utworzenia wiązania disulfidowego małej pętli, wiązania disulfidowego dużej pętli lub obydwóch za pomocą podstawienia odpowiednich reszt cysteinowych innymi aminokwasami. Wiązanie disulfidowe dużej pętli jest umiejscowione między cysteinami w pozycjach 55 i 166 w genie rpST. Wiązanie disulfidowe małej pętli znajduje się między cysteinami umiejscowionymi przy 183 i 191. Sposób numerowania jest taki jak opisano. Używa się dwóch zasadniczych protokołów do otrzymywania żądanych mutantów i przykłady każdego z nich są opisane w dalszej części niniejszego opisu.

W pierwszym sposobie, podstawienia cystein w wiązaniu disulfidowym małej pętli dokonuje się przy użyciu długiego syntetycznego oligonukleotydu. W sposobie tym stosuje się oligonukleotyd oznaczany AA1 o następującej sekwencji: 5' gCt ATG AAG GCG CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'. Zmienia to sekwencję genu pST tak, że kodon cysteiny w pozycji 183 przeprowadza się z TGT do GCG kodującego alaninę i kodon cysteiny w pozycji 191 przeprowadza się z TGT do GCT, również kodującego alaninę. Tak więc, cysteiny w małej pętli obie zostają przeprowadzone w alaninę. Jednoniciowy DNA M13mp11pST otrzymuje się z oczyszczonego faga według standardowego protokołu. Ogólny zarys sposobu mutagenezy jest przedstawiony na figurze 4. 1000 ng jednoniciowego DNA M13mp11pST miesza się z 50 ng oligonukleotydu AA1, który uprzednio został 5'-fosforylowany z użyciem 5'-trifosforanu adenozyny i kinazy polinukleotydowej. Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. W ten sposób łączy się oligonukleotyd z jednoniciowym DNA.

Następnie połączony DNA przeprowadza się w postać dwuniciową, kowalencyjnie zamkniętą, dodaniem ATP, dNTP (mieszanina czterech 5'-trifosforanów deoksyrybonukleotydów), ligazy DNA T4 i dużego fragmentu polimerazy DNA I. Mieszaninę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Następnie transformuje się nią E. coli JM101 standardową metodą z chlorkiem wapniowym. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C, na murawie JM101 widoczne są łysinki. Przenosi się je na filtry nitrocelulozowe i poddaje hybrydyzacji zwykłymi metodami. Drugiego oligonukleotydu oznaczonego AA1D używa się do wykrycia mutantów. AA1D ma sekwencję następującą: 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TTT3'. Znakuje się go promieniotwórczo na końcu 5' z użyciem [ y-³²P]-ATP i kinazy polinukleotydowej. Hybrydyzację prowadzi się przez całą noc w temperaturze 37°C w 5XSSC (1XSSC stanowi 0,15 M chlorek sodowy, 0,15 M cytrynian sodowy pH 7,0), 1 X roztworzeDenhardta (0,02% wag/obj. Ficoll, 0,02% wag/obj. bydlęca albumina surowicza, 0,02% poliwinylopirolidon), 150 (ml tRNA po hybrydyzacji. Filtry przemywa się stosując kolejno 5XSSC w temperaturze 4°C, TAC (TAC stanowi 3M chlorek tetrametyloamoniowy), 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometan pH 8,0, 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 0,1% wag/obj. siarczan dodecylo-sodowy w temperaturze 37°C i ostatecznie TAC w pożądanej temperaturze. To ostatnie przemycie określa specyficzność. Dla AA1D temperatura ta wynosi 52,5°C. Po ekspozycji na błonie fotograficznej czułej na promienio163 920 wanie X obseruje się tylko te klony, które są całkowicie komplementarne z AA1D. Kilka takich klonów analizuje się przez sekwencjonowanie DNA. Wszystkie z nich zawierają pierwszą mutację, ale żaden nie zawiera drugiej mutacji (przy cysteinie 191).

W celu zmutowania cysteiny w pozycji 191 używa się drugiego nukleotydu oznaczonego A1 o następującej sekwencji: 5' GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Proces mutagenezy jest identyczny z powyżej opsianym z zastosowaniem AA 1. z tą różnicą, ze matrycą DNA jest M13mp11pSTA3 (jest to klon wyodrębniony podczas mutagenezy AA1, który ma cysteinę w pozycji 183 przeprowadzoną w alaninę) i hybrydyzacji dokonuje się z A1. Temperatura końcowego przemycia wynosi 56°C. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, ze zidentyfikowane klony mają oczekiwaną sekwencję. Zmutowany klon jest oznaczony M13mp11pSTA34 (ATCC). Sekwencja DNA jest przedstawiona na figurze 3.

W drugim sposobie podstawienie w wiązaniu disulfidowym małej pętli otrzymuje się stosując dwa nukleotydy w tej samej reakcji, jak przedstawiono na figurze 2. Te dwa nukleotydy mają następujące sekwencje:

5' GCT ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3' GLU3 GLU

5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 3' GLU4 GLU

Jednoniciowym DNA-matrycą jest M13 mp11pST (ATCC). Te dwa nukleotydy i DNAmatrycę łączy się w tej samej reakcji, wydłuża i ligujejak poprzednio. Mieszaninę transformuje się E. coli J, M101. Odmienność tego sposobu polega na tym, że wykonuje się tu dwa przeniesienia z każdej płytki. Po każdym przeniesieniu następuje oddzielna hybrydyzacja albo ze znakowanym ³²P GLU3, albo ze znakowanym ³²P GLU4. Temperatura końcowego przemycia dla każdego oligonukleotydu wynosi 56°C. Pobiera się tylko te łysinki, które są pozytywne wobec obu nukleotydów. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, ze tak Cys 183 jak i Cys 191 przeprowadzone są w kwas glutaminowy. Klon oznaczony jest M13mp11sSTE34 (ATCC). Sposobu tego używa się do otrzymywania mutacji zapobiegających tworzeniu wiązania disulfidowego dużej pętli w wyniku zastosowania dwóch odpowiednich oligonukleotydów jak opisano powyżej i M13mp11pST. Wyraźnie w wyniku użycia M13mp11pSTA34 jako DNA-matrycy i dwóch oligonukleotydów nadających się do zmiany Cys 55 i Cys 166 na alaninę, otrzymuje się klon, w którym wszystkie reszty cysteinowe przeprowadzone zostały w alaninę.

Zmienione (zmutowane) klony wbudowuje się ponownie do bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pR0211 (ATCC) jak przedstawiono na figurze 5 (opisano w EP 173280). Klony M13 przecina się EcoRI i Hindlll i wyodrębnia fragment genu pST-pR0211 trawi się tymi samymi enzymami, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i wyodrębnia duży fragment. Te dwie części liguje się ze sobą stosując ligazę DNA T4 i używa do transformacji odpowiedniego szczepu bakteryjnego, np. E. coli N99cI (ATCC).

W szczepie tym obecny jest represor k typu dzikiego. Zapobiega on ekspresji z promotora Pl w pR0211. Gdy zostanie wyodrębniona odpowiednia konstrukcja, przenosi się ją do odpowiednich szczepów bakteryjnych, zawierających represor k wrażliwy na temperaturę, np. E. coli 4200 (ATCC). W tych szczepach ekspresja pST jest zależna od temperatury. W temperaturze 42°C represor jest nieaktywny i ekspresja zachodzi. W tym stadium pST otrzymuje się sposobami z EP 173280 (włączonego do niniejszego opisu jak odnośnik), przy czym ekspresja zachodzi. Ekspresja pST nie jest ograniczona do tych szczególnych szczepów E. coli. Zamiast nich stosuje się inne szczepy o odpowiednich właściwościach. Plazmidowe wektory ekspresyjne są zdeponowane w ATCC. Szczepy bakteryjne są zdeponowane oddzielnie.

Podstawienie innymi aminokwasami przeprowadza się powyższymi sposobami przy wykorzystaniu odpowiednich kodonów i oligonukleotydów. Podobnie stosuje się te sposoby do zmodyfikowania somatotropin zwierzęcych (różnych).

Wśród tych zmodyfikowanych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych łatwo otrzymywanych powyższymi sposobami są: (Ala 55, 166)rpST; (Ser 55,166)rpST; (Ala 183,191)rpST; (Glu 183,191)rpST; (Glu 183 — Ala 191)rpST; (Ser 183,191)rpST; oraz (Glu 183-Ser 191)rpST.

163 920

Przeprowadzone w pochodną somatotropiny zwierzęce, korzystnie rekombinantowe, otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia lub zdyspergowania somatotropiny zwierzęcej w wodzie lub wodnym roztworze chlorowodorku guanidyny, wodorowęglanu sodowego itp., którego pH doprowadza się do 8,4 wodnym roztworem zasady, takiej jak wodorotlenek sodowy lub amonowy. Do tego roztworu dodaje się później powoli ditiotreitol, to jest DL-treo-1,4-dimerkapto-2,3-butanodiol. Dodania dokonuje się na ogół w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej. Następnie do powstałego roztworu dodaje się jodoacetamid, kwas jodooctowy, tetrationian sodowy, metanotiosulfonian metylu, sulfon 1,3-propanowy lub jakikolwiek inny związek przeprowadzający w pochodną. Mieszaninę miesza się w ciągu około 1 do 4 godzin, a następnie odsala stosując ultrafiltrację. Roztwór zatęża się, a następnie przeprowadza kilka cykli ponownego rozcieńczenia wodą, wodnym roztworem chlorowodorku guanidyny itp., a potem ultrafiltracji. Następnie liofilizuje się pozostałość z końcowej filtracji w celu uzyskania przeprowadzonej w pochodną rpST.

Korzystnie, nowe somatotropiny zwierzące wytworzone sposobem według wynalazku są użyteczne w zwiększaniu szybkości wzrostu zwierząt, zwłaszcza zwierząt hodowanych na mięso i zwiększeniu efektywności spożytkowania przez nie paszy. Związki te są również skuteczne w polepszaniu tuszy tych zwierząt, to jest zwiększania stosunku chudego mięsa do tłuszczu u tych zwierząt. Oprócz tego, związki wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne w zwiększaniu wytwarzania mleka u zwierząt podczas laktacji i polepszaniu tworzenia wełny przez owce i inne zwierzęta hodowane na futro.

Gdy zmodyfikowane (z podstawieniem) lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne w działaniu na zwierzęta w celu osiągnięcia biologicznych korzyści powyżej opisanych, okazuje się, że polepszona skuteczność i użyteczność zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną somatotropin zwierzęcych wytworzonych sposobem według wynalazku, jest w części przypisywana zahamowaniu agregacji somatotropiny wytworzonej za pomocą zmodyfikowania lub przeprowadzenia w pochodną w przypadku tych somatotropin. Zahamowanie to pozwala na otrzymanie znacznie polepszonych układów zaopatrujących o przedłużonym uwalnianiu, czego nie można łatwo lub skutecznie osiągnąć w przypadku somatotropin natywnych lub rekombinowanych, które nie zostały zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodne, jak to opisano w odniesieniu do niniejszego wynalazku.

Stwierdzono także, że zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny wytwarzane sposobem według wynalazku są w wysokim stopniu stabilne i zasadniczo nie wykazują agregacji zależnej od tworzenia dimerów. Oprócz tego, zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się do otrzymywania znacznie polepszonych środków o przedłużonym uwalnianiu. Podczas gdy stwierdzono, że natywne somatotropiny zwierzęce agregują w jednym dniu, środki pozajelitowe zawierające zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny wytwarzane sposobem według wynalazku kontynuują uwalnianie zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropiny w ciągu 10 lub więcej dni.

W praktyce, środki wytwarzane sposobem według wynalazku podaje się na ogół zwierzętom za pomocą wstrzyknięcia, w postaci biologicznie czynnego środka pozajelitowego. Wśród środków pozajelitowych użytecznych jeśli chodzi o podawanie zwierzęcych somatotropin rekombinowanych wytwarzanych sposobem według wynalazku są takie jak żele, pasty, mikrokuleczki, mikrokapsułki, implanty itp. Co do nich, istnieje zainteresowanie dostarczaniem postaci do dawkowania biologicznie czynnych substancji, które uwalniają substancję w sposób kontrolowany i zmniejszają przez to częstotliwość podawania.

Postęp dotyczący środków o przedłużonym uwalnianiu biologicznie czynnych makrocząsteczek przedstawia specjalne problemy w zależności ód ich skomplikowanego sposobu działania i zawiłej budowy makrocząsteczek. Tak więc, ciągle wymagany jest postęp dotyczący skutecznych środków o przedłużonym uwalnianiu zawierających biologicznie czynną somatotropinę.

Środki użyteczne przy tym typie podawania otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodna somatotropiny zwierzęcej w rozcieńczonym wodorotlenku amonowym, a następnie dodanie do roztworu benzoesanu metalu alkalicznego, laurynianu metalu alkalicznego, węglanu metalu alkalicznego itp. Do roztworu dodaje się domieszkę niejonó163920 ₁₇ wego środka powierzchniowo czynnego i otrzymaną mieszaninę suszy metodą rozpyłową. Tak utworzone ciało stałe miesza się ze stopionym tłuszczem lub woskiem, albo ich mieszaniną i otrzymywaną stopioną mieszaninę rozpyla się przez dyszę rozpylającą powietrze/ciecz wyposażoną w płaszcz grzejny w celu utrzymania dochodzącego powietrza i stopionej fazy w temperaturze powyżej temperatury topnienia. Gdy stopione kropelki ochłodzą się, tworzą się mikrokuleczki. Zbiera się je na zestawie sit o żądanym zakresie wielkości otworów, około 45 do 180 pm i zachowuje do użycia. Mikrokuleczki o wielkości me mieszczącej się w pożądanym zakresie zawraca się do procesu. Alternatywnie, homogeniczną mieszaninę podaje się na wirującą tarczę i tak utworzone mikrokuleczki zbiera jak wyżej, lub tez stopioną mieszaninę chłodzi i miele do cząstek o średniej wielkości w pożądanym zakresie.

Następnie biologicznie czynne mikrokuleczki dysperguje się w nośniku ciekłym, farmaceutycznie i farmakologicznie dozwolonym do wstrzykiwania zwierzęciu. Środek mikrokuleczki-płyn wstrzykuje się na ogół zwierzęciu podskórnie, zazwyczaj w okolicę głowy, karku lub uszu.

Zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny wytwarzane sposobem według wynalazku przygotowuje się także jako biologicznie zgodne implanty, które wstrzykuje się pod skórę zwierzęcia za pomocą zwykłego urządzenia do tabletek wszczepianych podskórnie. Te środki otrzymuje się przez zmieszanie sproszkowanej, zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotkdpiey z woskiem, takim jak wosk rącznikowy, lub z mieszaniną kopolimeru glikolu z laktydem, wodorotlenku magnezowego i kondensatu tlenku etylenu, otrzymanego z zasadą hydrofobową utworzoną na drodze kondensacji tlenku propylenu z glikolem propylenowym. Tak utworzone mieszaniny wprowadza się do tabletkami i formuje cylindryczne tabletki o średnicy około 3,2 mm. Tak utworzone tabletki podaje się za pomocą zwykłego urządzenia do tabletek wszczepianych podskórnie.

Wynalazek objaśniają dalej przykłady zamieszczone w dalszej części niniejszego opisu.

Przykład I. Podstawienia cystein wiązania Wisulfidowegd małej pętli z zastosowaniem długiego oligonukleotydu syntetycznego.

Oligoeukledtyd oznaczony AA1 ma sekwencję następującą: 5' GCT ATG AAG GCG CGC CGC TTG GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'. Zmienia to sekwencje, genu rpST tak, że kodon cysteiny w pozycji 183 zostaje przeprowadzony z TGT do GCG, który koduje alaninę i kodon cysteiny w pozycji 191 zostaje przeprowadzony z TGT do GCT, który także koduje alaninę. Tak więc, obydwie cysteiny w małej pętli zostają przeprowadzone w alaniny. Judndniciowy DNA M13mp 11 pST otryymuje się z oczyszczonego fega na zasadzie standajduwych ρ^^ο!^ . 1000 ng juWedniciowego DNA M13mp11pST miesza się z 50 ng dligonukleotyWu AA1, który został uprzednio 5'-fosforylowany 5'-trifosforanem adenozyny z wykorzystaniem kinazy pdlinukleotydouej, w końcowej objętości 10μ z zawartością 1 X buforu do łączenia (1 X bufor do łączenia stanowi 75 mM KCl, 5 mM Tris pH 8,0). Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Według tego protokołu łączy się oligdeukleotyd z jeWndniciowym DNA. Połączony DNA przeprowadza się następnie w postać Wwueiciową kowalencyjnie zamkniętą przez dodanie 20 pl H 2O, 4 pl 10 X buforu uzupełniającego (10 X bufor uzupełniający stanowi 27 5 m MgCl pH 7,5 2 mM DTT), 1 pl 20 mM ATP, 2pl dNTP (mieszanina czterech 5'-trifdsfdkanóu Weoksyrydoeukluotydóu, każdy w stężeniu 2 mM), 2 jednostek dużego fragmentu polimerazy DNA I, (co do definicji jednostki patrz katalog New England Bio^s, 1986). Mieszaninę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie mieszaniną tą transformuje się E. coli JM 101 z zastosowaniem zwykłego sposobu postępowania przy użyciu chlorku wapniowego. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C na murawie JM 101 widoczne mogą być łysinki. Łysinki przenosi się na filtry nitrocelulozowe i przygotowuje do hybrydyzacji na zasadzie standardowych protokołów. Do wykrycia mutantów używa się drugiego oligonukleotyWa oznaczonego AA1D, o następującej sekwencji: 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Jest on promieniotwórczo znakowany na końcu 5' z użyciem [y-3²P]-ATP i kinazy pdlinukluotyWowej. Hybrydyzacja trwa przez noc w temperaturze 37°C w 5 X SSC, 1 X roztworze Denhardta 150mltRNA. Filtry przemywa się kolejno 5 X SSC w temperaturze 37°C; TAC w temperaturze 37°C 1 w końcu TAC w pożądanej temperaturze. To ostatnie przemycie określa specyficzność. Dla AA 1D temperami ta wynd , 52,5°C , Po ^lc^I^<rz^^Si¹¹³ błome fotogrffi18 163920 cznej czułej na promieniowanie X obserwuje się tylko te klony, które są całkowicie komplementarne z AA1D. Kilka takich klonów analizuje się przez sekwencjonowanie DNA. Wszystkie z nich zawierają pierwszą mutację, ale żaden nie zawiera drugiej mutacji, przy cysteinie 191. W celu zmutowania cysteiny w pozycji 191 używa się drugiego nukleotydu oznaczonego A1, o następującej sekwencji: 5' GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Proces mutagenezy jest identyczny z opisanym w przykładzie I (powyżej), z tą różnicą, że matrycą jest M13mp11pST3 (jest to klon wyodrębniony podczas mutagenezy AA1, który ma cysteinę w pozycji 183 przeprowadzoną w alaninę) i hybrydyzacji dokonuje się z A1. Temperatura końcowego przemycia wynosi 62°C. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, że zidentyfikowane klony mają oczekiwaną sekwencję. Zmutowany klon oznaczony jest M13mp11pSTA34.

Przykład II. Podstawienia cystern w małej pętli świńskiej somatotropiny rekombinantowej.

Podstawienia w wiązaniu disulfidowym małej pętli otrzymuje się stosując dwa oligonukleotydy w tej samej reakcji. Te dwa oligonukleotydy mają następujące sekwencje:

5' GTC ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3' GLU 3 GLU

5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 3' GLU 4 GLU

Jednomciowym DNA-matrycą jest M13mp11psST. Te dwa oligonukleotydy i DNA-matrycę łączy się w tej samej reakcji, wydłuża i ligujejak poprzednio. Mieszaniną transformuje się E. coli JM101. Różnica w tym sposobie polega na tym, że wykonuje się dwa przeniesienia z każdej płytki. Po każdym przeniesieniu przeprowadza się oddzielną hybrydyzację albo ze znakowanym ^MP GLU3 albo GLU4. Temperatura końcowego przemycia dla każdego oligonukleotydu wynosi 56°C. Pobiera się tylko te łysinki, które są pozytywne wobec obu oligonukleotydów. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, że tak Cys 183 jak i Cys 191 są przeprowadzone w kwas glutaminowy. Tego sposobu używa się do otrzymania mutacji zapobiegających tworzeniu wiązania disulfidowego dużej pętli w wyniku zastosowania dwóch odpowiednich oligonukleotydów jak opisano powyżej i M13mp11pST. Wyraźnie przez użycie Ml 3mp11pSTA34 jako DNA-matrycy i dwóch oligonukleotydów odpowiednich do zmiany Cys 55 i Cys 166 na alaninę, otrzymuje się klon, w którym wszystkie reszty cysteinowe zostały przeprowadzone w alaninę.

Przykład III. Ponowne wbudowanie do bakteryjnych plazmidów ekspresyjnych.

Zmienione (mutantowe) klony wbudowuje się ponownie do bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pR0211, opisanego w EP 173280 włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik. Klony M13 przecina się EcoRI i HindIII i wyodrębnia fragment genu pST pR0211 klonuje się z użyciem tych samych enzymów, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i wyodrębnia duży fragment. Te dwie części liguje się ze sobą z wykorzystaniem ligazy DNA T4 i używa do transformacji odpowiedniego szczepu bakteryjnego, np. N99cI+. W szczepie tym obecny jest represor λ typu dzikiego. Zapobiega on ekspresji z promotora P2 w pR0211. Gdy zostanie wyodrębniona odpowiednia konstrukcja, przenosi się ją do odpowiednich szczepów bakteryjnych, które zawierają represor A wrażliwy na temperaturę, np. 4200. W tych szczepach ekspresja pST jest zależna od temperatury. W temperaturze 42°C represor jest nieaktywny i ekspresja zachodzi. W tym stadium, rpST otrzymuje się sposobami z EP 173280 (włączonego do niniejszego opsiu jako odnośnik). Szczepy E. coli, które stosuje się do ekspresji produktu genu pST, nie są ograniczone do E. coli 4200. Można użyć jakiegokolwiek szczepu E. coli.

Powtarzając sposoby postępowania z przykładów I, II i III (powyżej) lecz podstawiając odpowiednie kodony alaniny, seryny, kwasu glutaminowego, argininy, tryptofanu lub asparginy zamiast cysteiny w pozycjach 183 i 191, przeprowadza się TGT odpowiadający cysteinie w TCN, AGC lub AGT odpowiadające serynie, GAG lub GAA odpowiadające kwasowi glutaminowemu, CGN, AGA lub AGG odpowiadające argimnie, AAT lub AAC odpowiadające asparaginie, GCN odpowiadający alaninie, względnie TGG odpowiadający tryptofanowi, we wspomnianej pozycji.

Przykład IV. Otrzymywanie (Cam-Cys 55, 166, 183, 191)rPST.

Otrzymuje się roztwór 100 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) w 33 ml 7M chlorowodorku guanidyny i pH doprowadza do 8,4 za pomocą NaOH. Do tego roztworu dodaje

163920 19 się 1B mg (20 równoważników) ditiotreitolu i miesza mieszaninę reakcyjną w ciągu godziny w temperaturze pokojowej w atmosferze N 2. Do tego roztworu dodaje się B4 mg (100 równoważników)jodoacetamidu i miesza mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 35 ml H2O i chlorowodorku guanidyny 1 usuwa nadmiar odczynników na drodze ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2 (odcięcie przy masie cząsteczkowej około 1000 daltonów) w komorze z mieszaniem Amicon model B400. Po kilku cyklach powtórnego rozcieńczania i powtórnej filtracji, pozostały roztwór wodny liofilizuje się do stałej wagi z uzyskaniem 100 mg puszystego proszku o barwie białej. Ruchliwość elektroforetyczna produktu w żelu SDS-PAGE w warunkach nieredukujących różni się o wykazywanej przez rpST. Produkt jest to przeprowadzona w pochodną świńska somatotropina rekombinantowa wskazana w powyższej części niniejszego opisu.

Przykład V. Otrzymywanie (Cam-Cys 183,191)rpST.

Do 225 ml odgazowanego 0,02 M roztworu NaCl dodaje się 3,375 g świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST), pH doprowadza rozcieńczonym HCl do B,1 i przy utrzymywaniu pH na tym poziomie dodaje się do roztworu rpST 15 mg/ml 0,9463 g ditiotreitolu rozpuszczonego w

31,5 ml wody. Mieszaninę odstawia się na godzinę w temperaturze pokojowej, po czym pH podnosi się do B,41 przy utrzymywaniu na tym poziomie, do roztworu rpST wkrapla się 5,7 gjodpacetamidu rozpuszczonego w 40,5 ml wody. Podczas tego wkraplania następuje tworzenie się drobnego osadu, który usuwa się za pomocą odwirowania. Sklarowany płyn stanowiący supernatant usuwa się i przprowadza przez kolumnę Sephadex G-25 w celu usunięcia nadmiaru materiałów o niskiej masie cząsteczkowej. Zbiera się 342,B g frakcji o wysokiej masie cząsteczkowej (rpST) i liofilizuje, w wyniku czego otrzymuje się 2,2 g (Cam-Cys 183191)rpST.

Przykład VI. Otrzymywanie (Cam-Cys 183191) rpST. Do roztworu 200 mg świńskiej somatotropiny rekombinowanej (rpST) w 100 ml 0,5N NaHCO 3 o pH doprowadzonym do około B,4 wodnym roztworem wodorotlenku amonowego dodaje się 15 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną poddaje się mieszaniu w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Dodaje się 50 mg kwasu jodooctowego i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin, a następnie odsala na drodze ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2 w komorze z mieszaniem Amicon model B400. Po kilku cyklach powtórnego mieszania i powtórnej filtracji pozostały roztwór wodny liofilizuje się do stałej wagi. Otrzymuje się około 200 mg puszystego ciała stałego o barwie białej. Otrzymany produkt jest świńską somatotropiną rekombinantową jak wskazano w niniejszym przykładzie.

Powtarza się powyższy sposób postępowania, z tą różnicą, że zamiast świńskiej somatotropiny rekombinantowej stosuje się bydlęcą somatotropinę rekombinantową, owczą somatotropinę rekombinantową, końską somatotropinę rekombinantową lub ludzką somatotropinę rekombinantową, lub ptasią somatotropinę rekombinantową w wyniku czego otrzymuje się, odpowiednio:

1/ (Cm-Cys 183, 191)rbST; 2/ (Cm-Cys 183, 191)rhST; 3/ (Cm-Cys 1β3, ^UrhoST; 4/ (Cm-Cys 1B4, 191)rhST; 5/ (Cm-Cys 183, 191)raST.

Przykład VII. Otrzymywanie COaS-Cys 55, 166, 1B3, 191)rpST.

Otrzymuje się roztwór 200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) w 50 ml 7 N chlorowodorku guanidyny i pH doprowadza się do około B,4 przy użyciu wodorotlenku sodowego. Do tego roztworu dodaje się 33 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Do tego roztworu dodaje się 200 mg tetrationianu sodowego. pH natychmiast obniża się do około 6 i doprowadza się je z powrotem do B,4 przy użyciu NaOH. Mieszaninę poddaje się następnie mieszaniu w ciągu 2 godzin. Roztwór poddaje się ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2 Mieszaninę reakcyjną zatęża się do około 20 ml, rozcieńcza ponownie około 40 ml 3 N chlorowodorku guanidyny i znów filtruje. Po zatężeniu do około 20 ml roztwór rozcieńcza się wodą 1 ponownie zatęza. Proces ten powtarza się dodatkowo dwa razy i pozostałość liofilizuje do stałej wagi. Otrzymuje się około 20 mg ciała stałego o barwie białej jako produkt. Stanowi on przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropinę rekombinantową opisaną powyżej.

Przykład VIII. Otrzymywanie COsS-Cys 183, 191)rpST.

Do roztworu 250 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) w 100 ml H 2O, której pH doprowadzono do około B,4 za pomocą NaOH, dodaje się 70 mg ditiotreitolu. Roztwór miesza się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Do roztworu zredukowanej rpST dodaje się 400 mg tetratidma-ę sodowego i miesza się go w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną fiLtruje się przez membranę Amicon UM2 i zatężo do około 20 mL. Rozcieńcza się pozostałość do około 200 mL wodą i pdndwnie zatężo. Ten sposób postępowania powtarza się jeszcze dwa razy. Końcowy roztwór LiofiLizuje się do stałej wagi, w wyniku czego otrzymuje się około 240 mg proszku o barwie białej. Jest on brzeprowadzdną w pochodną świńską somototroblną rekombinantową opisaną powyżej.

Przykład IX. Otrzymywanie (MeS-Cys 183, 191)rpST.

200 mg świńskiej somototrobiny rekombinantowej (rpST) rozpuszcza się w 100 mL H 2O. pH tego roztworu doprowadza się do około 8,4 wodnym roztworem NaOH. Do tego roztworu dodaje się 15 mgditiotreitoLu (DTT) i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej wciągu godziny. Po zakończeniu redukcji dodaje się 24μ\ metandtidSuLfdnionu met-Lu i mieszaninę reakcyjną miesza w temperaturze pokojowej wciągu 4 godzin. Podczas prowadzenia reakcji pH jest utrzymywane na poziomie 8,4 przez dodanie 1% NaOH w miarę potrzeby. Roztwór poddaje się uLtrafi Ltracji przez membranę UM21 zatęża do około 20 mL. Pozostałość rozcieńcza się 200 mL H 2O i zatęża bd-ownle. Następnie hofiLizuje się roztwór, w wyniku czego otrzymuje się 210 mg wyżej opisanego produktu, to jest brzebrowadzd-eJ w pochodną świńskiej somatotropiny rekombinontowej opisanej w niniejszym brzekładple powyżej.

Powtarzając powyższy sposób postępowania z tą różnicą, ze zamiast świńskiej sdmototrdbiny rekombinantowej stosuje się bydLęcą sdmatotrdbl-ę rekombinantową, owczą somatotroblnę rekombinantową, końską somatotropinę rekombinantową, Ludzką sdmatotrdpinę rekombinantową Lub ptasią 2omatotrdbi-ę rekombinantową, w wyniku czego otrzymuje się następujące produkty: ^(Mes-Cys 183, 191) bydLęco sdmatotrobina rekombinontowo; 2/(Mes-Cys 183, 191) owcza somatotrobi-a reSombinantowa; 1/ (Mes-Cys 183, 191) końsko somototropina rekombinontowa; 4/ (Mes-Cys 184, 191) Ludzko sdmatotrdpina rekombinontdwo; 1/(Mes-Cys 183, 191) ptasia somatotrdbino rekombinantową.

Przykład X. Otrz-mywanie (HO 3SCH 2CH 2CH 2-Cys 183, ^O-ioST.

Do roztworu 200 mg świńskiej somotdtrdbiny rekombinontowej (rpST) w 100 mL H 2O, której pH doprowadzono do 8,4, dodaje się 15 mg ditiotreitoLu i mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Do tego roztworu dodaje się 50 mg suLfonu 1,3-prdba-dwego i miesza się go w temperaturze pokojowej w ciągu 6 godzin. pH utrzymuje się no poziomie 8,4 dodawaniem 1%> NoOH. Surowy produkt zatężo się no drodze uLtrofiLtrocji przez membranę UM2 do objętości około 20 mL. Dwukrotnie rozcieńcza się go do 200 mL i zatężo bo-dw-le LiofiLizuje się roztwór końcowy, w wyniku czego otrzymuje się 200 mg powyżej opisanego produktu w postaci ciało stałego o barwie białej, to jest przeprowadzonej w pochodną świńskiej 2omatotrobi-e rekombinontowej.

Korzystnie, zastępując w powyższym sposobie postępowonio świńską sdmotdtrdpinę rekombinantową odpowiednią zwierzęcą somatotrobiną rekombinantową, otrzymuje się następujące somatotrobine^:

1/ (HO3SCH2CH2CH2-Cys 183, 191) bydLęco somototropina rekombinontowo,

2/ (HO 3SCH 2CH 2CH 2-Cys 183, 191) owcza somototropina rekombinontowo,

3/ (HO 3SCH 2CH 2CH2-C-s 183, 191) końsko somatotrobi-o rekombinontowo,

4/ (HO3SCH2CH2CH2-Cys 184, 191) Ludzko somatdtrobino rekombinontowa,

5/ (HO3SCH2CH2CH2-Cys 183, 191) ptasio somatotrobino rekombinontowo.

Przykład XI. ProfiLe stabll-ości zmodyfikowanych Lub brzebrowadzonych w pochodną zwierzęcych somatdtrobin rekombl-a-towech.

Otrzymuje się stężony roztwór pochodnej zwierzęcej sdmatdtrdplny rekombinontowej (do 100 mg/mO w roztworze soLi buforowanymi fosforanami o pH 7,4 (3,45 g NaH 2PO 4 Ή 20, 3,55 g Na2HPO4, 9,50 g NaCL, rozpuszczone w wodzie destyLowanej, do łącznej objętości 1000 mL). Roztwór ten poddaje się fiLtracji przez mlllbdrdwą jałową jednostkę filtracyjną MiLLex - 0,22 -um i 0,1 m! próbki umieszcza się w probówkach, które z koLei umieszcza się w piecu o temperaturze 45°C i pobiera w pożądanych odstępach czasu. Następnie zawartość rozcieńcza się buforowanym roztworem soli. Supernatant bada się za pomocą HPLC pod względem zawartości monomeru i dimeru, przeprowadza się zbilansowanie mas i rejestruje każdy wytrącony materiał. Wyniki porównuje się z wyjściowymi stężeniami i udokumentowuje profil stabilności.

Alternatywnie, pochodną somatotropiny wykazującą słabą rozpuszczalność w pH 7,4 rozpuszcza się w mniej korzystnym pH (4-10) lub ocenia się jako zawiesinę.

Próbka	2 dni Roztwór frakcji (Dimer)	5 dni Roztwór frakcji (Dimer)	6 dni Roztwór frakcji (Dimer)	7 dni Roztwór frakcji (Dimer)
1	2	3	4	5
rpST techn	93,1 (17,2)	92,4 (27,6)	92,0 (34,9)	*85,9 (29,4) 89,5 (31,0)
rpST techn	-	79,8 (20,7)	-	-
rpST techn	-	81,5(18,6)	-	-
(Cam-Cys 183, 191)rpST	-	75,2 (2,0)	-	-
(Cam-Cys 183, 191)rpST	-	-	57,8 (2,0)	-
(Cam-Cys 183, 191)rpST	-	-	-	73,0 (3,0)
(Mes-Cys 183, 191)rpST	79.7 (2,2)	-	-	73,4 (3,9)
(Disulfidowa rpST	83.2(1 0)			*73,9 (1,5) 85,0(1,6)

* Wyekstrahowane do buforu PBS Pozostałe w całości ekstrahowane do CBS

Frakcja rozpuszczalna (Dimer)
Opis	2 dni	7 dni
Karboksymetylowa pochodna rpST	92,8 (5,3)	85,6 (5,9)
Pochodna rpST z sulfidem dimetylowym	77,6 (2,4)	63,5 (3,0)
Pochodna rpST z kwasem hydroksybursztynowym	91,5 (7,8)	69,9 (5,6)
Karboksyamidometylowana (CAM) pochodna rpST	78,0(1,0)	57,-4(1,0)
rpST techniczna seria produkcyjna	89,5 (16,6)	75,5 (30,9)

Przykład XII. Otrzymywanie nadających się do wstrzykiwania mikrokuleczek do pozajelitowego podawania pochodnych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych.

Otrzymywanie nowych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych w zakresie wielkości odpowiednim do włączenia w mikrokuleczki drogą suszenia rozpyłowego przeprowadza się za pomocą rozpuszczenia pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej w rozcieńczonym roztworze wodorotlenku amonowego, a nstępnie dodanie roztworów pożądanych soli, takich jak benzoesan sodowy. Dodaje się niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak blokowy kopolimer tlenku etylenu z tlenkiem propylenu i rozpuszcza przy stałym łagodnym mieszaniu.

Następnie roztwór suszy się rozpyłowo. Można do tego celu użyć minisuszarki rozpyłowej Buchi model nr 190. Otrzymuje się homogeniczną mieszaninę przygotowanego tak. składnika czynnego i dodatków w stopionym tłuszczu, wosku lub ich mieszaninie i tak otrzymaną mieszaninę rozpyla się przez dyszę rozpylającą powietrze-ciecz wyposażoną w płaszcz grzejny w celu utrzymania dochodzącego powietrza i stopionej fazy w temperaturze powyżej temperatury topnienia. Gdy stopione kropelki ochłodzą się, tworzą się mikrokuleczki, które się zbiera na zestawie sit o żądanym zakresie wielkości otworów około 45 do 180μτη i zachowuje do użycia. Mikrokuleczki o wielkości nie mieszczącej się w pożądanym zakresie zawraca się do procesu. Alternatywnie, homogeniczną mieszaninę podaje się na wirującą tarczę i tak utworzone mikrokuleczki zbiera jak wyżej, lub też stopioną mieszaninę chłodzi i miele do cząstek o średniej wielkości w pożądanym zakresie.

Woski i tłuszcze, które nadają się do użycia w środkach wytwarzanych sposobem według wynalazku mają na ogół temperaturę topnienia wyższą od 40°C. Woski te zdefiniowane są jako niskotopliwa organiczna mieszanina lub związek o wysokiej masie cząsteczkowej, stały w temperaturze pokojowej i na ogół podobny w składzie do tłuszczów i olejów, z tym wyjątkiem, że nie zawierają one glicerydów. Niektóre są węglowodorami, inne estrami kwasów tłuszczowych z alkoholami. Zaliczone są one do lipidów. Woski są termoplastyczne, ale ponieważ nie są polimerami o dużej masie cząsteczkowej, nie uważa się ich za przynależne do grupy tworzyw sztucznych.

163 920

Wspólnymi właściwościami są: hydrofobowość, wyrównana tekstura, nietoksyczność, brak nieprzyjemnego zapachu i barwy. Są one palne i mają dobre właściwości dielektryczne. Rozpuszczalne są w większości rozpuszczalników organicznych, nierozpuszczalne w wodzie. Główne typy są następujące:

I. Naturalne.

1. Zwierzęce (wosk pszczeli, lanolina, szelak, wosk chiński z owadów).

2. Roślinne (wosk karnauba, wosk kandella, wosk mirtowy, wosk otrzymywany z trzciny cukrowej przy produkcji cukru).

3. Mineralne (a) woski kopalne czyli ziemne (ozokeryt, cerezyna, wosk montana).

(b) woski pochodzące z ropy naftowej (parafina, mikrokrystaliczne) (gacz parafinowy lub parafina w łuskach).

II. Syntetyczne.

1. Polimery etylenowe i etery - estry polioli („Carbowax“, sorbit).

2. Chlorowane naftaleny („Halowax“).

3. Typu węglowodoru via synteza Fischera-Tropscha.

Tłuszcz według wynalazku można zdefiniować jako ester gliceryny i wyższego kwasu tłuszczowego, takiego jak stearynowy lub palmitynowy. Estry te i ich mieszaniny są stałe w temperaturze pokojowej i wykazują strukturę krystaliczną. Przykładowo można wymienić smalec i łój. Nie istnieje chemiczna różnica między tłuszczem a olejem, jednym rozróżnieniem jest to, że tłuszcze są stałe w temperaturze pokojowej, a oleje płynne. Termin „tłuszcz,, odnosi się specyficznie do tnglicerydów, podczas gdy „lipid jest terminem ogólnym, obejmującym je.

Korzystnie, tłuszczem jest długołańcuchowy C10-24-kwas tłuszczowy, alkohol, ester, sól, eter i ich mieszanina z mono-, di- lub triglicerydami złożonymi głównie ze stearynianów, palmitynianów, laurymanów, linolemanów, linoleinianów, oleinianów, ich produktów lub mieszanin, przy czym najkorzystniejsze są spośród nich te, których temperatura topnienia wynosi powyżej 50°C. Tristearynian gliceryny jest najkorzystniejszym tłuszczem. Oprócz tego, nadają się tu lipofilowe sole kwasów tłuszczowych, takie jak stearynian magnezowy itp.

Mikrokuleczki wytwarzane sposobem według wynalazku dysperguje się w farmaceutycznie i farmakologicznie dozwolonym płynie w celu otrzymania środków do podawania pozajelitowego o przedłużonym uwalnianiu. Nośnik jest buforowanym układem wodnym lub olejowym. Olej jest to olej roślinny lub zwierzęcy. Korzystnym olejem jest obojętny triglicerydowy tłuszcz płynny. Olejem obojętnym jest taki olej, który nie zawiera resztkowego kwasu. Do nośników odpowiednich do użycia w środkach według wynalazku należą układy wodne, takie jak buforowane roztwory soli, rozpuszczalniki organiczne, takie jak glikole i alkohole, oraz ciecze niemieszające się z wodą, takie jak oleje, w zależności od rozpuszczalności składnika czynnego, który ma być podawany. Otrzymane dane zamieszczone są w tabeli 1.

Przykład XIII. Mikrokuleczki z kwasem żółciowym.

Buforowany roztwór pochodnej rpST i kwasu żółciowego rozpyla się w suszarce rozpyłowej Buchi Model 190. 10 części tego drobnocząsteczkowego proszku zawiesza się w roztworze 1 części materiałów powłokowych, w chlorku metylenu. Zawiesinę tę suszy się metodą rozpyłową. Powleczone mikrokuleczki zawiesza się przed wstrzyknięciem w odpowiednim nośniku do zawieszania. Te środki opisane są w tabeli 2. Zgodnie z opisem w tabeli 2 otrzymuje się w postaci mikrokuleczek inne przeprowadzone w pochodne lub zmodyfikowane zwierzęce somatotropiny rekombinantowe wytwarzane sposobem według wynalazku, w tym zmodyfikowane świńskie, bydlęce, owcze, końskie, ludzkie i ptasie somatotropiny rekombinantowe, w których cysteiny w małej pętli w pozycjach 183 i 191 (184 i 191 w przypadku ludzkich) zwierzęcych somatotropin rekombinantowych zostały zastąpione alaniną, seryną, kwasem glutaminowym, argininą, lizyną itp.

Przykład XIV. Otrzymywanie implantów zawierających zwierzęcą somatotropinę rekombinantową.

Implanty otrzymuje się za pomocą odważenia wystarczającej ilości rozdrobnionej homogenicznej mieszaniny pożądanej pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej i pożądanych rozcieńczalników. Następnie mieszaninę ściska się w prasie wykrawającej pod ciśnieniem od * The Condensed Chemical Dictionary. wvd 10. str 1094 Van Nostrand Reinhold Publisher.

6,59 · 10³kPa do 34,:5- 10³kPa w cylindrycznej matrycy o średnicy 4,76 lub 3,17 mm, względnie tabletkarce obrotowej stosując wymagany stempel i matrycę. Tak otrzymane implanty powleka się następnie albo ulegającymi metabolizmowi, albo nie ulegającymi metabolizmowi powłokami, z wykorzystaniem sposobów postępowania A i B.

Sposób postępowania A. Nie ulegający metabolizmowi polimer silikonowy.

części elastomeru silikonowego, czystego, miesza się szpatułką z 1 częścią utwardzacza na szkle wodnym i następnie odpowietrza się w eksykatorze w ciągu 30 minut. Implanty chwyta się za końce pincetą, obtacza w polimerze silikonowym, umieszcza końcem na folii aluminiowej i utwardza w temperaturze 40°C w ciągu 5 godzin. Jeden, lub obydwa końce obcina się żyletką pozostawiając „trzonek¹* powleczonego cylindra.

Alternatywnie, implanty powleka się, przez maczanie, 20 do 40% spoiwem medycznym, sprzedawanym pod znakiem towarowym SILASTIC^R przez firmę Dow Corning, które zostało zdyspergowane w heksanie, oraz suszy i utwardza w temperaturze 40 do 50°C przez noc przed usunięciem powłoki z jednego lub obydwu końców stanowiących podstawy.

Sposób postępowania B. Powłoki ulegające metabolizmowi.

część polimeru lub kopolimeru mozu uszcza się: w 3do 8 części zhloroformu. Każdy implam chwyta się za końce pincetą, zanurza w roztworze polimeru, a następnie odparowuje chloroform w temperaturze pokojowej. Każdy implant powleka się dwukrotnie. Po wysuszeniu powłok przez noc w temperaturze pokojowej, końce z polimerem usuwa się przez obcięcie żyletką, pozostawiając długi cylindryczny „trzonek powlekany.

Otrzymywanie implantów

Pochodna świńskiej somatotropiny zokombιnantowoj %	Stearynian magnezowy ' %	Etyloceluloza %	Wosk rącznikowy %
50	—	5,0	45
40	—	5,0	50
20	—	5,0	75
50	0,5	3,5	46
20	0,5	3,5	76
		Środek	Tristeaiynian
Pochodna rpST	Cholesterol	powierzchniowo czynny	gliceryny
%	%	%	%
30	68	2	-
15	41,5	2	41,5

Pochodna rpST	Kwas stearynowy
%	%
50	50
20	80

Alternatywnie, rpST lub inne zwierzęce somatotropiny zekombinwntooe miesza się ze środkami powierzchniowo czynnymi, buforowanymi roztworami soli i/lub środkami konserwującymi w roztworze wodnym. Roztwór ten następnie suszy się metodą rozpyłową w suszarce rozpyłowej Buchi Model 190, w wyniku czego otrzymuje się proszek o małej wielkości porów. Proszek ten miesza się następnie z tłuszczem lub woskiem w stanie stopionym i formuje w cylindryczne implanty. Implanty otrzymane jak wyżej powleka się następnie albo ulegającym metabolizmowi, albo nie ulegającym metabolizmowi polimerem z zastosowaniem sposobu postępowania A lub B.

Preparaty implantów

Środek

Pochodna rpST %	Tzιstoazynιan gliceryny %	Benzoesan sodowy %	powierzchniowo czynny %
28	69,9	2,0	0,15
15	82,9	2,0	0,15
50	48,5	1,5	0

163 920

Tabela 1

Środki w postaci mikkdkaleczuk

Środek nr	Podłoże	Pochodne rpST	Dodatki (%)
Bufor/ikdWuk konserwujący	Środek powierzchniowo czynny
1	2	3	4	5
1	GMS	2,5	_
2		20	—	_
3	CMS/olej sojowy	30	—	—
4	GDS	10	—	_
5		10	Lautyeine Na (1,4)	—
6		25	Benzoesan Na (1,6)	Środek powierzchniowo czynn B (0,12)
7		25	W({gEnn/wdWorourglne Na (1,3)	Środek powierzchniowo czynny A(0,!8)
8	GTS/GDS (19 1)	15	—	—
9		10	Benzoesan Na (0,6)	Środek powierzchniowo czynny B(0,05)
10	GTS/GDS (9.1)	10	—	Środek powierzchniowo czynny B(0,1)
II	GTS /wosk pszczeli (9 1)	7.5	—	—
12	GTS/GMS (19 1)	15	Benzoesan Na (1,4)	—
13	GTS/ olej sojowy (19 1)		7.5	—
14	GMS/ wosk kamauba (1 2)	20	—	—
15		11	Benzoesan Na (0,8)	—
16		10	—	Środek powierzchniowo czynny B(0,05)
17		25	fonzoesan Na (0,75)	Środek powierzchniowo czynny B(0,12)
18		25	Benzoesan Na (3,2)	Środek powierzchniowo czynny B(0,12)
19		25	—	Środek powierzchniowo czynny B(0,12)
20		25	—	Środek pdwlurzcheldud czynny A(0,48)
2i		25	W^glan/uoWokourglne Na (1.2)	—
22	GTL	33	Benzoesan Na (2,1)	Środek pdwukzceJυdwd czynny A(0,! 7)
23	GTS/GDS (12 1)	15	Benzoesan Ca (1,1)	Środek powierzchniowo czynny A(0,17)
24	Wosk pszczeli/olej sojowy (2 1)	30	—	—
25	GTS	7,5	—	—
26	GMS/Olej sojowy (47,25/24)	25	—	Sorbitu
27		15	—	Mooddlelneae (3,75)
28	GMS	10	—	POE(23) (stearynian) (9,0)
29	GMS	20	—	PEG 6000 (9,0)
30	GMS	20	—	PEG 6000 (4,0)
31	GMS	20	—	PEG 6000 (0,8)
32	GMS	20	—	PEG 400 (Wutunkyeznn) (8,0)
33	GMS	20	—	PEG 400 ^£^3^00) (1,57)
34	GMS	20	—	PEG 1540 (Wistenkyniαίe) (16,0)
35	Mondstunrynsne glikolu etylenowego	25	—	—

Tabela 2

Preparaty zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej w postaci mikrokuleczek

Pdhodna zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej %	Kwas cholowy %	RdW Kwas deoksycholowy %	Cholesterol %	Cholesterol %	PowOka Tnstearynan gliceryny %	PVP %	Wosk pszczeli %	FdsfαtyWyldchdllna %
50	50	_	_	42,5	42,5	5		_
20	80	—	—	42,5	42,5	5	—	—
75	25	—	—	42,5	42,5	5	—	—
50	—	50	—	40	—	5	40	5
20	—	80	—	40	—	5	40	5
75	—	25	—	40	—	5	40	5
50	—	—	50	42,5	42.5	5	—	—
20	—	—	20	42,5	42,5	5	—	—
75	—	-	75	42,5	42,5	5	—	—

Przykład XV. Otrzymywanie implantów przy zastosowaniu (Cam-Cys 183, 191)rpST i ocena tych implantów na podstawie rozpuszczalności in vitro.

Do 1,3 ml CH 2CI2 dodaje się 92,4 mg kopolimeru glikolidu z laktydem, 5,3 g nżejdnduegd blokowego kopolimeru tlenku etylenu z tlenkiem propylenu sprzedawanego przez firmę BASF Wyandottee Corp. jako pluronic 127 o średniej masie cząsteczkowej 12500, temperatura topnienia 56°C, lepkość metodą Bkddkfieldα 3100 (cps)³⁵, 5,3 mg / 200 mesh mg (OH )2 i 74,6 mg sproszkowanej (Cam-Cys 183, 191)rpST. Mieszaninę miesza się, wylewa na płytkę Petn^go o dużej powierzchni i dopuszcza do odparowania CH 2Cl2 w temperaturze pokojowej, a następnie suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Zbiera się wysuszoną pozostałość i formuje w implanty o średnicy 3,17 mm stosując prasę wykrawającą przy około 6,9 · 10³ kPa. Tak utworzone implanty o wadze 60 do 70 mg każdy oznacza się I-1.

Drugi zestaw implantów otrzymuje się przez zmieszanie ze sobą w mikserze 12δ g sproszkowanego wosku rącznikowego (-270mesh) i 32 mg sproszkowanej (Cam-Cys 1B3, 191)rpST. Tak otrzymaną mieszaninę formuje się następnie w cylindryczne implanty o średnicy 3,17 mm w sposób powyżej opisany. Tabletki ważą 60 do 70 mg każda i oznacza się je 1-2.

Trzeci zestaw implantów otrzymuje się także powyższymi sposobami postępowania stosując 96 mg (-270 mesh) wosku rącznikowego i 64 mg sproszkowanej (Cam-Cys 183,191)rpST. Cylindryczne implanty o średnicy 3,17 mm otrzymane jak powyżej opisano ważą 60 do 70 mg i oznacza się je 1-3.

Tak otrzymane implanty poddaje się następnie ocenie rozpuszczalności in vitro. Każdy z implantów umieszcza się w oddzielnej próbce z tworzywa sztucznego zawierającej 10 ml buforu fosforanowego o pH 7,4 (z 0,05% azydkiem sodowym) i probówki umieszcza w stojaku wstrząsanym w wodzie, gdzie probówki są wstrząsane, podczas gdy temperaturę wody w urządzeniu utrzymuje się na poziomie 39°C. Probówki wstrząsa się w ciągu jednego dnia, a następnie z każdej pobiera się roztwór i analizuje pod względem rpST za pomocą HPLC, a następnie roztwór odrzuca. Dodaje się nowy bufor fosforanowy do każdej probówki i wstrząsa je po tym w ciągu trzech dodatkowych dni. Roztwór z każdej probówki znowu analizuje się pod względem rpST za pomocą HPLC i znów odrzuca. Nowy bufor fosforanowy znowu dodaje się do każdej probówki i ponownie je wstrząsa w ciągu trzech dni, po czym znowu analizuje pod względem rpST.

Implanty użyte w tych oznaczeniach są opisane poniżej wraz z otrzymanymi wynikami. Bufor fosforanowy stanowi 3,45 g NaH2PO4 · H20, 3,55 g Na2HPO4,9,5 g NaCl, rozpuszczone w wodzie destylowanej do łącznej objętości 1000 ml.

Otrzymywanie i oznaczenia implantów

rpST w implancie	Teoretycznie
Pochodzenie implantu	Waga implantu	mg
I-1	69,6 mg	29,23 mg
I-2	6B,7 mg	2B,B5 mg
I-3	62,B mg	12,56 mg
I-4	63,3 mg	12,66 mg
I-5	66,B mg	26,72 mg
I-6	66,2 mg	26,4B mg

Wyniki rozpuszczania in vitro

Objętość środowiska

do którego następowało uwalnianie (ml)	Dzień	1-1 Dimer %	1-2 Dimer %	1-3 14 Dimer Dimer % %	1-5 Dimer %	1-6 Dimer %
1	2	3	4	5 6	7	B
10	—	Początek	Początek	Początek Początek	Początek	Początek
10	1	1,59 (niski)	1,184(1,3%)	0,4B5 (niski, 0,499 (niski,	1,605 (niski)	1,570 (niski)
				niemierzalny) niemierzalny)
10	4	0,417 (niski)	0,459(1,7%)	0,063 (niski) 0,06B (niski)	0,136 (niski)	0,140 (niski)
10	7	0.044 (niski	0,03β (niski	0,007 (niski 0,007 (niski	0,019 (niski	0,019 (niski
		niemierzalny) niemierzalny) niemierzalny) niemierzalny) niemierzalny) niemierzalny)
		Kumulatywne uwalnianie rpST
		1-1 +1-2
		Kumulatywnie	Kumulatywnie
	Dzień	Uwalnianie (mg) % początkowo uwalnianej
	1	11,72		40,4%
	2	16.10		55,4%
	7	16.51		56,9%
		I-3 +1-4
	1	4,92		39,02%
	4	5,5B		44,25%
	7	5,65		44,B1%
		I-5 +1-6
	1	15,BB		59,7%
	4	17,26		64,B9%
	7	17,45		65,6%

163 920

Przykład XVI. Otrzymywanie zwierzęcej 2dmotdtrdplny rekombinontowej w postaci mlkrokobsułek.

0,85 g kopoLimeru gLikoLidu z Loktydem rozpuszcza się w 29,8 g chLoroformu i zawirowuje w ciągu 2 minut. Następnie, do roztworu poLimeru w chLoroformie dodaje się 0,150 g pochodnej świńskiej sdmototrdplne rekombinontowej (Com-Cys 183, 191)rpST, któro została przesiana no sucho przez 25/um sito ze staLi nierdzewnej i zowlrdwuje w ciągu 3 minut. Powstałą zawiesinę białkową wprowadza się następnie do 50 m) koLby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło mechaniczne. Szybkość mieszania nastawia się no 700 obr/min w temperaturze otoczenia. Dodatkowych 3,2 g chLoroformu używa się do brzemecio wyjściowego naczynia. Całkowita iLość chLoroformu wynosi po tym 32,95 g. Następnie dodaje się 350 g oLeju siLikonowego (13,1 g w okresie 8 minut) w ceLu wytrącenia kopoLimeru gLikoLidu z Loktydem. Następnie zawartość koLby przenosi się do 1720 g hebto-u przy mechanicznym mieszaniu w 4-Litrdwej koLbie. Po upływie 3 godzin utwardzone mikrdkęLeczki sączy się przez zestaw sit ze stoLi nierdzewnej i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem.

Inne poLimery i rozpuszczaLniki, użyteczne przy otrzymywaniu w postaci mikrokapsułek zmodyfikowanych zwierzęcych somototrdpln rekombinantowych, w których cysternowe reszty aminokwasowe w pozycjach 55, 166, 183 Lub 191 zostały zastąpione resztą innego aminokwasu, aLbo sdmatdtrobi- rekombina-towech brzeprdwodzonech w pochodną, w których jeden Lub obydwa mostki disuLfidowe między cysteinomi w pozycjach 55 i 166 Lub w pozycjoch 183 i 191 zostały zredukowane i przebrowodzdne w pochodną, zostały wyliczone poniżej.

Przy wyLiczaniu materiałów zamieszczonych poniżej użyto następujących skrótów: A = jako próbko sbdLlmerezowano; B = próbko bdnownie wytrącono; gLe = gLikoLid; Loct = Loktyd; capro = | kaproLakton; TMC = węgLon t-met-Lenu; PHB = poLlhedroksemośLon; PHV = bdLihedroksewaLerian; PEO = po^oks-et-Len.

PoLimery użyteczne prz- otrzym-woniu w postaci mikrokapsułek zmodyfikowanych i brzebrdwadzonych w pochodną zwierzęcych somatdtrdbln rekombinantdwenh.

Pohmer	Ninh (rozpuszczaL-ik)	Środki (% wag)
Gly/dl-laStyd	0,36* (HFIP)	43,6/56,4A
Gly/dl-laStyd	0,52* (HFIP)	42,4/57^
Gle/dl-laStyd	0,63b(HFIP)	43,3/56,7B
Gly/dl-laStyd	0,66b (HFIP)	41,2/58,8B
GLy/di-LoktyZ	0,61A(HFIP)	41,6/58,4B
Gle/dl-laStyZ	0,22b (HFIP)	41,5/58,5B
Gly/dl-laStyd	0,26B (HFIP)	40,6/59,4B
Gly/Zl-laSted	0,27B (HFIP)	40,7/59,3B
Gly/L-lact	0,2B (CHCL3)	48/52B
Zl-Lact	0,46B(HFIP)	100B
ZL-Lact	0,27b (HFIP)	1(K)B
PHB	2,92a (HFAS)	KX)A
PHB/HV	3,27a (HFAS)	70/30A
CapΓC>/1-lant	0,45a (CHCLs)	84,6/15,4a
CapiO/Mact	0,46a (CHCb)	84,0/16^
Cabrd/l-lant	0,51A(CHCL3)	85,2/14^
Capro/1-Lact	0,50a (CHCb)	84,4/15©
Cabro/l-lant	0,39a (CHCU)	85,1/14©
Cabro/l-lant	0,36a (CHCL3)	86,1/13©
Capro/ Mact	0,31B(CHCb)	11,4/88,6B
Capro/gLy	0,34a (CHCb)	84,0/16,0A
gLy/PEO 8000/TMC	0,33B (CHCL3)	50,3/8,4/41©
gLy/PEO 8000/TMC	0,38b (CHCL3)	58,2/4,8/37©
gle(ιZL-laStyZ)	0,35B (CHCI3)	35,8/54,4/9©
PEO 8000
l-lant/TMC	0,26b (CHCL3)	85.4/14©
	0,23b (CHCLj)	69/31B

A/ = jako próbka 2bolimeryzdwana B/ = próbka po-ow-iw wytrącona.

Przykład XVII. Test na szczurach pozbawionych przysadki w celu określenia przyspieszenia wzrostu zwierząt otrzymujących zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną zwierzęce somatotropiny rekombinantowe.

Efektywność różnych zmodyfikowanych (z podstawieniem) lub przeprowadzonych w pochodne zwierzęcych somatotropin zekombinantooych wytwarzanych spoosbem według wynalazku w zmienianiu szybkości wzrostu zwierząt określa się wykorzystując test na szczurach pozbawionych przysadki (hypox). Szczur pozbawiony przysadki nie wytwarza swego własnego hormonu wzrostu i jest wrażliwy na wstrzyskiwany bydlęcy hormon wzrostu. Mierzoną odpowiedzią jest wzrost w ciągu okresu czasu takiego jak 10 dni.

Każdemu z pozbawionych przysadki szczurów albinosów (otrzymanych z Taconic Farms, Sprague Dawley) wstrzykuje się wystarczającą ilość środków otrzymanych jak w przykładzie XX w celu zapewnienia 10 - dniowej dawki 800pg / 80μg/dzloń, świńskiego hormonu wzrostu w 0,2 ml preparatu, jak wyszczególniono. Alternatywnie, każdemu z pozbawionych przysadki szczurowi albinosowi wstrzykuje się codziennie 80pg pochodnej świńskiego hormonu wzrostu.

Przed przeprowadzeniem testu zwierzęta wazy się i wybiera na podstawie wagi takie zwierzęta, których ma się użyć. Wybiera się tylko te zwierzęta, których waga ciała mieści się w jednym odchyleniu standardowym od średniej wagi ciała w grupie. Następnie utworzoną grupę losowo dzieli się na grupy, na które się działa, składające się z 8 szczurów/grupę na podstawie tworzonego za pomocą komputera sposobu postępowania losowego. Następnie zwierzęta przenosi się do czystej klatki utrzymując cztery szczury/klatkę. Pierwszego dnia badań zwierzęta testowe waży się i wszystkie, które wykazują nadmiar lub niedobór wagi (±5 g) odstawia się. Zwierzęta następnie przydziela się do grup testowych i poddaje działaniu.

Na koniec 10-dniowego okresu badań rejestruje się całkowity przyrost wagi każdego zwierzęcia i dla każdego działania określa średni przyrost wagi na szczura. Wyniki tych eksperymentów, które podsumowano w poniższej tabeli, wykazują aktywność użytych pochodnych.

Dane dotyczące szczurów pozbawionych przysadki

Pochodna			Wzrost (g)
0-2 dni	2-4 dni	4-7 dni	7-10 dni	Całkowity
1	2	3	4	5	6
rpST	7,5	5,6	6,8	10,1	30
(Cam-Cys 183, 191)rpST	7,6	5,3	8,4	8,4	29,7
(Sulfido-Cys 183, 191)rpST	8,9	4,8	>1,1	8,1	32,9
(Ala 183, 191)rpST	7,1	6,3	9,3	6,5	29,2
(SCH3-Cys 183, 191)rpST	7,0	6,4	6,9	9,5	29,8
(S-CH2COO’-Cys 183, 191)rpST	5,9	5,6	9,1	7,9	28,5
(S-CH2CH2SO3-Cys 183, 191)rpST	6,9	5,3	6,8	9,0	28,0

W powyższych danych staje się wodoczne, że każda ze zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną świńskich somatotropin rekombinantowych jest biologicznie aktywna i zapewnia doskonały wzrost zwierząt.

Przykład XVIII. Ocena świń otrzymujących przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropinę rekombinantową pod względem tuszy.

Świnie hoduje się w indywidualnych przegrodach. Początkowa waga świń wynosi około 60 kg. Świnie przeznacza się do uboju przy średniej żywej wadze 100 kg. Wstrzykiwanie środków testowych przy podstawie ucha rozpoczyna się po upływie 4-dniowego okresu przygotowawczego. Świnie karmi się standardową „Cy Hog ration do woli, wodę także dostarcza się do woli.

Osiągi wzrostu określa się przyjmując tydzień jako podstawę. Zbiera się następujące dane: średni przyrost dzienny, średnie dzienne pobranie paszy i wydajność paszy.

Po przyroście około 40 kg świnie poddaje się ubojowi i ocenia tusze. Przy uboju zbiera się następujące dane: waga ciepłej tuszy, waga mięśnia półśclognlstogo, waga narządów (wątroba, nerki, serce) i waga tłuszczu otaczającego wnętrzności. Po upływie 24 godzin schładzania rejestruje się wyniki następujących pomiarów: długość tuszy, głębokość tłuszczu grzbietowego (pierwsze żebro, ostatnie żebro, ostatni krąg lędźwiowy, trzyćwierciowa głębokość przy dziesiątym żebrze, P-2), grubość boczku, powierzchnia oczka polędwicy, barwa, jędrność, marmurkowatość i nacięcie mięśnia.

W tych ocenach kontrola negatywna otrzymuje codzienne wstrzyknięcia roztworu soli, CAMrpST stanowi (Cam-Cys 183, 191)rpST opisaną w przykładzie VII powyżej i kontrola pozytywna otrzymuje codzienne wstrzyknięcia natywnej PST. Ocena tuszy (Cam-Cys 183, 191)rpST.

Sześć świń (na jedno działanie) hoduje się indywidualnie i poddaje odpowiedniemu działaniu od 44 do 94 kg żywej wagi. Wzrost i wybrane dane dotyczące tuszy przedstawione są poniżej wraz z obliczeniem względnej efektywności. Wpływ karbamidometylowanej-rpST (Cam-rpST) na osiągi wzrostu i wybrane cechy charakterystyczne tuszy świni po obróbce wykańczającej (średnie liczone metodą najmniejszych kwadratów).

Kryterium	Kontrola negatywna	CAM-rpST	Kontrola pozytywna
Średni przyrost dzienny (kg)	0,99	1,07	1,09
Średnie dzienne pobranie paszy (kg)	3,11	3,03	2,75
Przyrost/pasza	0,32	0,35	0,40
Wątroba (g)	1726,1	1892,8	2085,5
Tłuszcz otaczający wnętrzności	762,4	765,5	563,3
Tłuszcz grzbietowy przy dziesiątym zebrze (cm)	2,22	2,00	1,88
Tłuszcz grzbietowy P-2 (cm)	1,80	1,50	1,45
Waga mięśnia półścięgnistego (g)	359,5	353,1	387,9
Powierzchnia oczka polędwicy	38,6	39,0	39,6

Przykład XIX. Eksperymenty dotyczące bilansu azotowego prowadzone z (Cam-Cys 183, 191)rpST.

Świnie hoduje się w indywidualnych klatkach ze stali nierdzewnej do pomiaru metabolizmu. Wstrzykiwanie przy podstawie ucha zaczyna się wtedy, gdy świnie wprowadza się do klatek. Świniom pozwala się na pięciodniowy okres czasu przystosowania się do nowego otoczenia. Podczas tego okresu rejestruje się pobranie paszy i doprowadza do tego, że wszystkie świnie komsumują tę samą ilość paszy każdego dnia (Cy Hog ration, 18% surowego białka). Zbieranie kału i moczu zaczyna się po upływie co najmniej trzech dni stałego przyjmowania. Świnie karmi się równymi ilościami paszy dwa razy dziennie, a wodę dostarcza się do woli.

Całkowity kał i mocz zbiera się dla pięciu dni (zbieranie przeprowadza się każdorazowo rano). W celu zmniejszenia utraty azotu dodaje się 35 ml 6 N HCl do wiader z tworzywa sztucznego do zbierania moczu na początku fazy eksperymentu polegającej na zbieraniu i po każdorazowym dziennym zbieraniu. Zwraca się uwagę na uniknięcie każdej możliwej straty moczu. Zebrany mocz rozcieńcza się do stałej, rejestrowanej objętości, następnie dzieli na 50 ml próbki zaopatruje w oznaczenia i zamraża aż do analizy. Kał zbiera się codziennie, umieszcza w woreczkach ze sztucznego tworzywa z oznaczeniami i zamraża aż do analizy. Zbiera się też resztki, waży i zamraża. Małe próbki paszy pobiera się codziennie, zamraża i puluje przed analizą.

Próbki paszy i kału suszy się przez noc w temperaturze 100°C, albo dłużej w temperaturze niższej. Wysuszone próbki paszy i kału rozdrabnia się za pomocą młynka Wiley i pozostawia na 2 dni do zrównoważenia powietrzem. Oznacza się suchą masę i zawartość N w paszy i kale. Wszystkie próbki analizuje się pod względem zawartości azotu stosując zautomatyzowaną metodę Kjeldahla. Mocz analizuje się i określa całkowite dzienne wydalanie azotu w moczu. Z wyjątkiem moczu, wszystkie wartości N wyrażane są w oparciu o suchą masę.

Wagę świni rejestruje się pierwszego dnia przystosowywania się, pierwszego dnia zbierania i przy zakończeniu fazy zbierania. Zapewnia to, że świnie mają dodatni bilans energetyczny.

Bilans azotowy.

Ocena CAM-rpST w badaniu bilansu azotowego dotyczy ogółem 12 rosnących świń przy trzech sposobach działania: 1/ kontrola negatywna (codzienne wstrzykiwanie roztworu soli), 2/ CAM-rpPS, 3 mg/dzień, oraz 3/ kontrola pozytywna, 3 mg natywnej pST. Kał i mocz zbiera się w ciągu 7 dni po upływie 2-tygodniowego okresu przystosowywania się. Wyniki i obliczenia aktywności względnej są następujące: Wpływ karbamidometylowanej rpST (CAM-rpST) i natywnej pST na bilans azotowy rosnąych świń.

163 920

Kryterium	Kontrola negatywna	CAM-rpST	Kontrola pozytywna
Pobieranie azotu (g/dzień)	41,86	41,36	41,83
Wydalanie azotu (g/dzień) kał	5,25	5,21	4,65
mocz	23,06	16,74	15,12
Azot zaabsorbowany (g/dzień) Strawność azotu (%)	87.46	87,43	88,88
Retencja azotu (g/dzień)	13,56	19,41	22,06
Średni przyrost dzienny (g)	328,6	383,9	401,8

* CAM-pSCA(Cam-Cys 18m. l9l)rpST

Przykład XX. Otrzymywanie pasty przy zastosowaniu (Cam-Cys 183, 191)rpST.

Otrzymuje się mieszaninę (Cam-Cys 183, 191))^^ST zawierającą 7% wag/wag benzoesanu sodowego i 0,5% wag/wag kopolimeru blokowego tlenku etylenu z tlenkiem propylenu stosując sposób postępowania z suszeniem rozpyłowym opisany w przykładzie XIII.

Tak otrzymaną mieszaninę, w ilości 7,28 g, dodaje się przy mieszaniu do roztworu 19,5 g tristearynianu gliceryny w 71 ml 4/1 wag/wag mieszaniny triglicerydów kwasów: oktanowego, dekanowego, dodekanowego i heksanowego (Miglyol® 813/³) olej sojowy, w temperaturze 75-80°C. Mieszaninę miesza się w temperaturze 75-80°C aż stanie się ona homogeniczna, a następnie chłodzi. Utworzony w wyniku tego środek składa się (wagowo) z: 6,96% (Cam-Cys 183, 191)rpST, 0,51% benzoesanu sodowego, 0,03% środka powierzchniowo czynnego (kopolimer blokowy) i 73,0% nośnika. Podaje się go na ogół zwierzętom przez wstrzyknięcie podskórne, pod skórę tych zwierząt w regionie głowy lub karku.

Przykład XXI. Otrzymywanie lepkiego środka żelowego nadającego się do wstrzykiwania, zawierającego (Ala-Cys 183, 191)rpST.

Do 140 g wysoko oczyszczonego oleju sojowego w zlewce dodaje się 12 g monostearynianu glinowego. Mieszaninę miesza się do jednorodności i ogrzewa w ciągu 30 minut do około 140°C, gdy zachodzi oczywiste rozpuszczenie się monostearynianu w oleju sojowym. Zlewkę usuwa się z grzejnika i pozwala ochłodzić do temperatury około 60°C. Następnie dodaje się przy mieszaniu 2,66 g (Ala-Cys 183,191)rpST wysuszonej metodą rozpyłową w celu otrzymania jednolicie rozdzielonej zawiesiny. Lepką mieszaniną napełnia się 30 ml strzykawki jednorazowego użytku. Objętością wykorzystaną do napełnienia każdej strzykawki jest 20 ml i objętość ta zawiera 350 mg (Ala-Cys 183, 191)rpST. Po napełnieniu strzykawek żelową mieszaniną ścina się ona w kremowy, sztywny, ale dający się wycisnąć żel. Zapakowane strzykawki przechowuje się następnie w lodówce przed użyciem.

Przykład XXII. Otrzymywanie pasty z użyciem (Ala-Cys 183, 191)rpST.

4,18 g oleju sezamowmgo i Geluciee 46e07 (C7)tlefosse - 0,74g) mieszm eiz w pojemmem szklanym za pomocą bagietki. Następnie, przy mieszaniu, ogrzewa się do temperatury 65°C aż do jednorodności. Bagietkę wyjmuje się i dodaje 0,052g (Ala-Cys 183, 191)rpST, w celu utworzenia środka.

Przykład XXIII. Otrzymywanie (Ala-Cys 183,191)rpST w połączeniu z cynkiem i zawierającej ją pasty.

(Ala-Cys 183,191 )rpST rozpuszcza się w 0,09 M Tris w stężeniu 21,5 mg rpST/ml, w temperaturze 40°C, pH 9,5. Przeprowadza się ją w sól cynkową za pomocą dodania, przy mieszaniu, 1 M ZnCb. Wytrąca się sól cynkowa. Odzyskuje się ją za pomocą odwirowania przy 10000 X g w ciągu 30 minut przy utrzymywaniu temperatury roztworu 40^OC. Liofilizuje się ją z uzyskaniem proszku. Do 140 g oleju sezamowego w zlewce dodaje się 12 g monostearynianu glinowego. Zawartość ogrzewa się przy mieszaniu w temperaturze 153°C aż do rozpuszczenia się monostearynianu. Zlewkę usuwa się z grzejnika i pozwala się ochłodzić. W trakcie chłodzenia roztwór przechodzi w żel. Żel ten wprowadza się do młyna kulowego wyposażonego w wysoko ścinający mieszalnik i kule ze stali nierdzewnej. W młynie obniża się ciśnienie i powoli dodaje cynk w proszku aż do uzyskania jego zawartości w środku wynoszącej 40%. Mieszaninie kontynuuje się aż do zmniejszenia przeciętnej średnicy cząstek cynku do wielkości poniżej 10 pm. Kule ze stali nierdzewnej usuwa się z żelu, a ten wprowadza się do skrzykawek

Szczepy DNA przytaczane w poprzedniej części niniejszego opisu zostały zdeponowane w ATCC 23 sierpnia 1988. Były to: mp 11 pSTE34 (ATCC nr 40482), pRO211 (ATCC nr 40483) i pig24 (ATCC nr 40484). Fachowcy zdadzą sobie sprawę z tego, że te DNA można wprowadzić do każdego odpowiedniego układu ekspresyjnego w celu otrzymania somatotropin według wynalazku lub ich postaci zmutowanych.

Bakteryjne szczepy E. coli K12 wykazujące ekspresję pewnych nowych somatotropin zwierzęcych wytwarzanych sposobem według wynalazku również zostały zdeponowane w ATCC 23 sierpnia 1088. Te bakteryjne szczepy obejmują szczep E. coli 1655 (ATCC nr 67762), 1655(pROpSTA34 (ATCC nr 67763), 1655/pROpSTE34 (ATCC nr 67764), 4200 (ATCC nr 67766), 4200/pROpSTA34 (ATCC nr 67767), 4200/pROpSTA34 (ATCC nr 67768), 420/pROpST (ATCC nr 67769), 4255 (ATCC nr 67770), 4255/pROpSTA34 (ATCC nr 67771), 4255/pROpSTE34 (ATCC nr 67772), 4255/pROpST (ATCC nr 67773), 4300 (ATCC nr 67774), 1655/pROpST (ATCC nr 67765).

pROpST-SXAK182UAG (ATCC 68056) zdeponowano 14 lipca 1989. pROpST-SXC183, 191del (ATCC 68057) zdeponowano 14 lipca 1989.

Przykład XXIV. Usunięcie cystein z wiązania disulfidowego małej pętli z zastosowaniem 2 syntetycznych oligonukleotydów.

Syntetyczny oligonukleotyd oznaczony C183del ma sekwencję następującą:

5'CGG GTC ATG AAG AGA CGC TTC GTG GAG 3'

Oligonukleotyd ten różni się od analogicznej sekwencji DNA genu rpST pod dwoma względami. Po pierwsze, DNA kodujący kodon cysteiny w pozycji 183 jest woligonukleotyCzie usunięty. Po drugie, DNA kodujący kodon argininy w pozycji 184 jest zmieniony z CGC w AGA w oligonuklootyCzio, przy czym ten ostatni także koduje argininę. Tak więc, cysteina obecna w pozycji 183 zostaje usunięta.

JoCnoniciowy DNA pGEM-3z(f+)pST-SX jest substraktem mutagenezy. Ten DNA jest złożony ze zmodyfikowanego genu rpST, zawartego w handlowo dostępnym fagem^^, pGEM3z(f+). Modyfikacja genu rpST powoduje zmianę sekwencji DNA pozwalającą na wprowadzenie miejsca rozszczepiania endonukleazy restrykcyjnej SacI w pozycjach 225-230 regionem kodującego i wprowadzenie miejsca rozpoznawania onConukleazy restrykcyjnej Xbal w pozycjach 285-290. To zmiany w sekwencjach DNA nie zmieniają sekwencji aminokwasów białka rpST. Fragment EcoRI/HinCIΠ rozszczepiony tymi enConukleazami restrykcyjnymi przy zastosowaniu standardowych sposobów postępowania daje w rezultacie fagemid pGEM-3z(f + )pST-SX. Jodnoniciowy DNA pGEM-3z(f +) otrzymuje się z oczyszczonego faga zgodnie ze zwykłymi protokołami. 2000 ng tego DNA miesza się ze 10 ng oligonukleotydu C^del, przy czym ten ostatni został uprzednio UosUozylooany na swoim końcu 5' z użyciem 5'-trifosforanu adenozyny i kinazy polinuklootyCowoJ. Mieszanina zawarta jest w całkowitej objętości 10pl 1 X buforu do łączenia (1 X bufor do łączenia stanowi 75 mM KCl i 5mM Tris-Cl, pH 8,0). Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, z natępującą następnie 10-minutową inkubacją w temperaturze pokojowej. Ten sposób postępowania pozwala na połączenie oligonukleotydu z jednoniciowym DNA stanowiącym substrat. Połączone cząsteczki przeprowadza się w kowalencyjnie zamknięty, dwuniciowy DNA dodatkiem 22pl H2O, μΐ 20 mM ATP, 2 jednostek ligazy DNA T4 i dużego fragmentu polime^zy DNA I (co do definicji jednostki patrz katalog New England Biolabs, 1986), 2μΐ 20 X dNTP (mieszanina czterech 5'-triUosUoranów CooksyrybonukleotyCów, każdy w stężeniu 2 mM) i 4pl 10 X buforu uzupełniającego (1 X bufor uzupełniający stanowi 27,5 mM Tris-Cl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 2 mM DDT). Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, połowę mieszaniny reakcyjnej wprowadza się do kompetentnych komórek HB101 zgodnie ze zwykłym protokołem transformacji. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C kolonie przenosi się na filtry nitrocelulozowe i przeprowadza hybrydyzację przez wykrycie pożądanej mutacji z wykorzystniem promieniotwórczego znakowania odpowiedniego końca 5' za pomocą [y-32P]-ATP i kinazy oligonuklootydowej. Po upływie 3 godzin prehybrydyzacji w 37°C w 5 X SSC, 1 X roztworze Denhardta 1 150 pg/ml drożdżowym tRNA, dodaje się promieniotwórczo znakowany oligonukleotyd i dopuszcza się do jego hybrydyzacji z DNA na filtrach przez noc w temperaturze 37°C w 5XSSC, z następującym potem 30-minutsoym przemyciem w TAC w temperaturze 61,5°C.

Podczas tego ostatniego przemycia tylko te kolonie, których plazmidowy DNA zawiera pożądaną mutację, będą kontynuwać hybrydyzację z promieniotwórczo znakowaną sondą oligonukleotydową. Kolonie te wykrywa się po ekspozycji przemytych filtrów na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X. Plazmidowy DNA otrzymuje się z kilku spośród tych kolonii z wyjściowej płytki Petn'ego, wprowadzonych do kompetentnych komórek HB101, jak uprzednio opisano, i poddanych ponownemu screeningowi z promieniotwórczo znakowaną sondą oligonukleotydową, jak powyżej. Plazmidowy DNA otrzymuje się z kolonii, których DNA hybrydyzuje z sondą i analizuje pod względem pożądanej sekwencji DNA. Wszystkie analizowane klony zawierają mutację C183del. Plazmidowy DNA z jednego klonu oznaczonego pGEM-3z(f + )pST-SXC183del wprowadza się do kompetentnych komórek JM 101 na drodze transformacji i jednoniciowy DNA otrzymuje się z oczyszczonego faga pochodzącego z pojedynczego transformanta.

W celu usunięcia DNA kodującego cysteinę w pozycji 191, syntetyzuje się następujący oligonukleotyd oznaczony c191del:

5' TTC GTG GAG AGC TCG TTC TAG TTG 3'

Ten oligonukleotyd różni się od analogicznego DNA genu rpST pod dwoma względami. Po pierwsze, DNA kodujący kodon cysteiny w pozycji 191 jest usunięty z oligonukleotydu. Po drugie, DNA kodujący serynę w pozycji 190 jest zmieniony z AGC w TCG w oligonukleotydzie, przy czym ten ostatni także koduje serynę.

DNA-matrycę z jednoniciowego DNA z pGEM-3z(f + )pST-SXC 183del i oligonukleotyd C191 del łączy się. wydłuża i liguje jak uprzednio. Mieszaninę wprowadza się do kompetentnych komórek HA 101 i transformanty analizuje się względem obecności mutacji dokładnie tak, jak to opisano w przypadku C183del. Oligonukleotydu C191dei używa się jako promieniotwórczo znakowanej sondy wykrywającej. Warunki hybrydyzacji i przemywania są dokładnie takie, jak opisano dla C183del. Kilka klonów zawierających mutację C183del identyfikuje się na podstawie analizy sekwencji DNA. Plazmidowy DNA z usunięciem C183 i C191 jest oznaczony pGEM-3z(f+--pST-SXC183, 191del.

163 920

ECoRI

Hind ID

M13ml1pST-jednoniciowy DNA połączyć z oigonukleotydami

5¹ GTC ATG AAG GAA CGC CGC TTC , 3¹GLU3

5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TA3 31 GUJ4

65°C,7mm temperatura pokojowa 10 min

CAG TAC TTCACAGCG GCGA^GCACCTĆ TGG TC

GLU 4

GAC GCC TTC TAG 3 oligonukleotydy

A2AĆGG AACAIĆ-—---dNTP ATP

ECOLI DNA polimerąza DNOI E Coli, duży fragment ligaza DNA T4

FIG 2(4)

163 920

transtormcwac EColi JM 101 poddać screemngowi fysinki przez hybrydyzację albo z GLU 3 znakowanym 32p albo z GLU4 znakowanym 32_p przeprowadzić sekwencjono wame DNA tysinek hybrydy zujących z obydwoma oligonukleotydami

GLU

GTC ATG AAG GAA CGC OGC TTC GTG GAG AGC AGC

FIG.2 (2)

Sekwencja DNA pST i warianta p STA 34

PST PSTA34

FIG. 3

163 920

ECoRl

Hindn

M 13mp11pST-jednoniciowy DNA l.potączyc z digonukleotydem 5^ GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 2 65°C,7min ₃1

3.temperatura pokojowa _t ) GCG GC

GTC ATG AAG ęęę CGC TTC QTC GAG AGC AQC ĆŻG TAC f TĆ ACAGCG GĆG AA3CŻĆCTC TCG TCG AC T GCC TTC TAG 3’

A ĆGG AAG ATĆ min oligonukleotydy

⁵ tagowy DNA dNTP, ATP

EColi polimeraza DNA EColi duży Iragment; liga2a

ECoRl

Hind III

DNA TA il. transformować EColi JM Dl

2. poddać screemngcwi tysinki przez hybrydyzacją z AA 1 Oznakowanym 32θ

3. sekwencjonować DNA ^μ

FIG. 4 (1

ALA

GTC ATG A AG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC CYS

AGC TGT GCC TTC TAG

ECoRI

Hindlll

M13mpHpSTA 3

FIG .4 (i)

Hind III Hind ID

Hind III

ECoRI pEFF-902

Ml3mpll -RFDNA

ECoRI

Hindlll oczyścić fragment zawierający gen pST

ECoRI Hind ID fosfataza alkaliczna z jelita cielęcia, oczyścić duży fragment

Hind III

M 13 mp 11 p ST-RFDNA FIG 5

FIG. 1

ECoRI

Hind III

Hind

M 13mp||pSTA 34-RFDNA

I przeciąć ECoRI i Hind III 2oczyscic fragment zawierający gen pST pRO 211 ^EC0RI przeciąć ECoRI i Hind ΠΙ fosfataza alkaliczna z jelita cielęcia

3.oczyścić duży fragment transformować E.Coli N99cf 3.wyselekcjonować ampR l ligowac

pROpSIA 3 Z.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej, znamienny tym, ze rozpuszcza się zwierzęcą somatotropinę rekombinowaną w wodzie lub roztworze wodnym zawierającym chlorowodorek guanidyny albo wodorowęglan sodowy, koryguje się pH tego roztworu do wartości 8 · 4, działa się na ten skorygowany pod względem pH roztwór ditiotreitolem, a następnie działa się na tak utworzoną mieszaninę halogenoacetamidem, kwasem halogenooctowym, tetratiomanem metylu alkalicznego, metanotiosulfonianem Ci-C4-alkilu lub sulfonem Ci-Ce-alkilowym, odsala się powstałą mieszaninę na drodze ultrafiltracji i poddaje się powstałą odsoloną mieszaninę ponownemu rozcieńczeniu, ponownej filtracji i liofilizacji, w wyniku czego co najmniej jeden, albo oba mostki disulfidowe przy resztach cysteiny zostają zredukowane i cysteinowa reszta aminokwasowa przeprowadzona jest w pochodną.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się zwierzęcą somatropinę rekombinowaną stanowiącą świńską somatotropinę rekombinowaną

   H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-Ala-Asn-AlaVal-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu

   Phe-Glu-Arg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

   Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-Ala-Pro-ThrGly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln-Arg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrS er- Asjp-Ag-Yal- Tyr- Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu- GluGlu- Gly-Ile-Gln-Ala-Ieu-Ket-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-S er-Pro-Arg-Ala-Gly- Gin- Ile-Leu-Lys-Gin- ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-LCTi-Aig-Ser-Asp-Aep166

   ALa-Leu-leu-Lys-Asn-TyT-Gly-Ieu-Leu-Ser-Rga-PheLys-Lye-Aep-Leu-His-Lye-Ala-Glu-Bir- Tyr-Leu—Arg—

   183. 191

   S S

   V£L-Met-Lys-R .-Arg-Arg-Phe-Yea-Glu-Ser-Ser-R .a ALa-Phe-CS.

   163 920 bydlęcą somaaotropinę rekombinantową H-Met-Asp-Gln-Ph^-Ero-Ala-Met- Ser-Leu-Ser- GlyLeu-Ri e- Ala- Asn- Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp- Thr-Bie-Lys-Glu-Hie-GluArg- Thr- Typ- II e- Pro-Glu- Gly-Gln-JAg- Tyr-S er-Il e55

   Gin-As n- Thr- Gin-V saL-Ala- Phe-R 2~ Eh e- Ser- Glu- ThrHe-Pro-ALa-Pro- Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-GlnLy s-S er-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-JArg-II fr-S er-leu-leuLeu-11 e- Gin- S er- Tr p- L eu- Gly- Pro- L eu- Gin- Ri e-L euS er-Arg-V2a.-Eh e- Thr-Asn-S er-Leu-V^-Ph e-Gly- ThrS er- A sp- Arg-VsaL- Tyr- Glu- Ly s- L eu- lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-eeu-Ala-Leu-MIet-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Thir-Rro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr'Tyr-As ρ-Ly s-Rh e-As p-Th r-Asn-M e t-Arg-S er-Asp-As p166

   Ala-Llu-Ieu-Iιy8-Asn-Tyr-Gly-Leu-LlU-Ser-R2a“PhlArg-Lys-Asjpl euuHis-lys- (Dir- Glu—(nur- Tyr-Leu-Arg183 191

   S S

   Yal-Met-Lys-Ri-Arg-Arg-Ehe-Gly-Glu-Ala-Sei^Hj Ala-He-OH.

   owczą somaaotropinę rekombinantową H-Met-^Asp-^Ln-Phi^l^irj-j^l^-Mi^t-Seir-Leu-Seir-GlyLeu-Eh e-Al a-Asn-JA a-Val-L eu-Arg-Al a-Gln-H is-LeuHis-Gln-leu-Ala-Ala-Asp- Thir-Fhe-Lys-Glu-Ehe-GluArg-Tir-TyT-Ile-Ero-Glu-Gly-Gl.n-Arg-iTyr-Serrlle55

   Gin-A sn-Th r-· Gin-V al-Al a- H e- R 2~ Pb. e- S er- Glu- Th rIle-Pra-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln4

   163 920

   Lyjs-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-jAg-Ile-Ser-Leu-LeuLeu-Il u- Gin- S ei-- Tap-Luu- Gly-Pro-Leu-Gln-Ph e-LuuS er-Αηξ-ν al- Ha e- Thr-Asn- S er-Leu-ViOL- Ph u- Gly-ThrS ur-Asp-Arg-Y AL- Tyr- Hu-Iys-Leu- Lys -Asp- Leu- GluGlu-Gly-Ile-Leu-Al-LLm-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspVAL- Tar-Hro-Arg- ALa-Gly-Gln-Ilt^-Leu-Lys-Gln- TiarT-r-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-MeL-.—u-Ser-Asp-Asp166

   ALa-LLU-LLU-Lys-Asn-TyΓ-Gly-LLu-LLU-SLΓ-R a-PhuAg-Lyjs-Asjp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-L uu-Arg183 191

   VćOL-Me t-Lys-Ri-Arg-A?g-Ph ^-Gly-GGu--Aa-Ser-R ^Ala-Phu^OH.

   ptasią somatotropinę reskombinantową H-MeL-ABp-Gln-Phe-Pro-,Al·a-MeL-Pro-Ieu-Sei^—snLeu-Haee-Aa- Asn- Ala-Vca.-Leu-Arg-Ala-G]la-His-LeuHi s- L lu- Leu- Ala- Ala- Gin- Thar- Tyr- Lys- Glu- Hi l- GluA:g-Ώlh-Ty-rIle-]rroGGlu-Aip-lln-Arg-T-τ-Thr-Asn55

   Ly s-Asn-Sur- Gin- Al a- A la- Tyr-· R g- Hi iL-Ser- Glu- Thrll--PΓO-Ala-PΓOτ hlΓ-Gly-Iys3-Asp--sp-Ala-Gln-GlnLy8-S ur-Asp-M e t- Gly-Luu- leu- Arg-Phu- S er-Leu- V alL eu-1 le-Hn- Sur- Trp- L uu- Thr-Pro-V AL- Gin- Ąyr- L euSur-Lys^ed-Phe-Ba n-Asn-A sn- L uu-V AL-Phe- Gly- ThrSur-Asp-A?g-VAL-PhL-Glu-Lys-LLu-Lys-Asp-LLU-GluGlu- Gly-Ilu- Gin- Al a- Leu-Met- Arg- Glu- Leu- Glu-Asp—g-SLr-Pro-—Γg-Gly-Pao-Gln-Lel-lLU-—?g-Pro-ThΓ¾'-rA8rρLy--IHhLA-ppIl¢-Hi8-Iιeu--r^,g-Asn-Gll-—ap166

   Ala-LLU-lul-Iys-A3n-Tyr-ll--Leu-lel-SeI-R2 a- Hil163 920

   Lys-LyB-Asp-Leu-His-Ly3-Vsa.-Glu- Thr- Tyr-Leu-Lyg183 191

   VaL-Met- Lys -Ri -Arg-Arg-Ph e Gly- Glu- S er-Asn- R i 1 I2LThr-Ile-OH.

   końską somaaotropinę rekombinantową H-Met-As p-Gln-Ri^-ft?o-.A.a-Met-Pro-I<ai-Se3>-SerLeu-Rie-Ala-Asn-.ALa-V£aL-Leu-Acg-ALa-Gln-H is-LeuHis-Gln-leu-Ala-Ala-Asp- Thr- iiya^-Lys-Glu-Rie-GUuArg- AL a-T Γ“ Ile- Pro- Glu- Gly- Gln-Arg- T/r-S eir- II e55

   Gln-Asn-ALa- Gln-ALa-Ala- Phe-^-Phe-Ser- Glu- Thr— Ile-Pro-Ala- Pr o - Ihr-- Gly- Ly s - As p-Glu-Ala- Gin- GlnArg- Ser-^Asp-^^^^it^-Gl.u-Let^-Leu-Ar^-Hie-Se^Leu-LeuL eu- Ile- Gin- S er- Trp- L eu- Gly- Pro-VaL- Gin- Leu- LeuSer-Arg-Vaa.-Ph e-ϊhΓ-Asn-Ser-LJeu-ValePhe-lly-ThΓSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-GluGlu-Gl.yIle—Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly- S er-Pro- Arg- ALa- Gly- Gin-11 e- Leu- Lys- Gin- Tir¾yrAs]>-Lys-Phe-A8]p-!Πlr-AsneLeu-Arg-Ser-Asp-A8p166

   Ala-Leu-Leu-Ly s-Asn-Tyr-Gly-L eu-Ieu-Ser-Rgg-Hbe Lys-Lys_-Asp_-L eu-His-Lys_-Ala-Glu-Thr- Tyr-L _eU-Arg1B3 191

   V al-M et- Lys-R 1 -Arg-Arg- Eh e-V AL- Glu- S er- S er-R 1 aAla-Eh*-OH.

   ludzką somaaotropinę rekombinantową, H-Met-Asip-Gln-Ph e-Pro-T- rieie-Pro-Leu-S-A-A-gLeu- ehe-Asp-Asn-ALa-Met-Leu-Arg-AL a-His-Arg-LeuHis-Gln-Leu-ALa- Phe-Asp- Dur- Tyr- Hn- Glu- Pb e-Hu6

   163 920

   Glu-Al a- Tyr- H w- Pro-Lys - Glu- GlmLys - Ąyr- S er- Ph e56

   Leu-Gln-Asn-Pro-Gln- Tur-S er-Leu-R₂- Phe-Ser-GluSer-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-.GlnGln-Lys-S er-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg- Ile-S er-leuL eu- L eu-1 le- Gin- S er-Trp-L eu- Glu- Pro- Val- Gin- Ph eLei^^A^i^-Ser-^V^L-Phe-^Alć^-^Asn-Sei-^Leu-VELL-Ty^GlyAla-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lya-AspLeu- Glu- Glu- Gly- Ile- Gin- Tur-Leu-MeW-Gly-Arg-LeuGlu-AsppGlyySer--Pro-Arg-ITr-Gly-GGi-Ile-Ehe-Lys“

   Gln-Tir-T;;y;r.Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-AsnAap-Asp-AŁa-^u-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-leu-Tyr167

   R2_a ^_ih e-Arg-Lys-Asp-M et-Asp-L;y3-Vi^L-Glu-Thi--Phe184

   L eu-Arg-11 e-Vi^L-Gln-R 1 - Arg-S erv Val-Glu-Gly-S er191

   S S

   R1o“Hy“Piw-OH.

   w których jeden Lub dwa mostki disuLfidowe przy reszcie cysternowej oznaczonej R1 i R_u względnie R 2 1 R 2a zostały zredukowane 1 cysternowe reszty aminokwasowe stanowią niezaLeznie: C-s,C-s(CH2COOH), C-s(CH2CONR3R4), Cys(R5), Cys(CH2)-SO3^_ , Cys(CHCH2CONR3CO), Cys(CH2)mNR3R4, Cys(SO3), Cys(CH2OCOCH2R5) Lub Cys(SRe), R3 i R4 każdy oznacza H, (CH2/xCO2H), (CH/CO2H)(CH2/xCO2H), C1-Ce-aLkiL ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi Lub gLikoL polietylenowy, R 5 oznacza Cj-Ce-aLkiL Lub C-i-Ce-aLkoksymetyL i Re oznacza Cj-Ce-aLkiL, głikoL polietyLe-ow-, fenyL ewentuałnie podstawiony jedną łub dwiema grupami kwasu karboksyLowego Lub kwasu suLfonowego, n oznacza Liczbę całkowitą od 1do 4, a m oznacza Liczbę całkowitą od L do 6, z tym, ze w przypadku gdy R1 i R 2 oznaczają Cys, R2 i R2a muszą oznaczać C-s przeprowadzoną w pochodną, a gdy R2 i R2a oznaczają Cys, R1 musi oznaczać C-s przeprowadzoną w pochodną, oraz z tym, ze w przypadku gdy R11 Rn aLbo R 21 R2a oznaczają C-s, wtedy mostek disuLfidowy utworzony jest między dwiema funkcjami Cys przedstawionymi tymi symboLami R1 i R1a aLbo R2 i R2a
3. 3 SposSb wedli^g zastrz. 2, zn aminami enm, ze re de keje się i pręeprowadza w po chodnh mnstmk disuLfidowy położony bLiżej C-końca somatotrobi-y i ętwdrzo-y międz- dwiema nysteindw-mi resztami aminokwasow-mi w LabUnej mniejszej pętLi zwierzęcej sdmotdtrdpi-y ^kombinowanej.
4. 4. SposSp wed-jg zastrp. 2t zn amżea^^ w--,, z- me de reże ku i pręeprowbdzu oz zo chbdne mnetmk disęLfidouy prze N-końcu somatotrdbl-e 1 ętworpo-e między dwiema nystelndwymi resztami aminokwasow-mi stabiLnej większej pę^i zwierzęcej 2dmatdtrdbi-e rekombindwo-ej.

   163 920
5. 5. SposSp według zastrz. zrmmienny tym, że redukuje się i przeprowadza w pochpdne obydwa mostki disulfiWdwe utworzone między dwiema cysternowymi resztami nmieokuasouymi w dużej pętli somatdtkdpiey i między dwiema cysternowymi resztami nmiedkwasoużmi w małej labilnej pętli somatotropiny.