PL164081B1 - Sposób hamowania agregacji zwierzecej somatotropiny rekombinowanej PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

Sposób hamowania agregacji zwierzecej somatotropiny rekombinowanej, znamienny tym, ze utlenia sie cztery sposród cysternowych reszt aminokwasowych zwierzecej somato- tropiny rekombinowanej do kwasu cysternowego. P L 164081 B 1 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej.

Zgodnie z wynalazkiem w zwierzęcych somatotropinach rekombinowanych, co najmniej jedna z czterech cysternowych reszt aminokwasowych została utleniona. Aczkolwiek przystąpiono do produkcji i kontynuuje się wytwarzanie somatotropin na drodze rekombinacji, często występują trudności przy formułowaniu tych somatotropin w celu efektywnego podawania zwierzęciu. W przeciwieństwie do tych somatotropin będących wynikiem ekspresji, stwierdzono, ze utlenianie tych reszt cysternowych, z których cztery znajdują się w somatotropinach daje w wyniku związki biologicznie czynne o zwiększonej stabilności do formułowania w dozwolony sposób w celu podawania zwierzętom.

Okazało się, że możliwe jest zapewnienie nowych somatotropin zwierzęcych, w których co najmniej jedna spośród reszt cysteinowych somatotropiny zastąpiona została innym aminokwasem, zmodyfikowana, usunięta lub chemicznie przeprowadzona w pochodną, a także zastępowanie i/lub przeprowadzanie w pochodną dwu, trzech lub wszystkich czterech spośród tych reszt cysteinowych somatotropin zwierzęcych i zapewnienie odpowiadających im nowych związków. Dwie cysteiny znajdują się w małej pętli i dwie w dużej pętli.

Jest możliwe również zapewnienie środków zawierających wspomniane somatotropiny zwierzęce, w których nastąpiło podstawienie, zastąpienie (zmodyfikowanie), usunięcie i/lub przeprowadzenie w pochodną i które są biologicznie czynne i jeszcze ciągle stabilne pod względem podawania i zapewnienie środków zawierających biologicznie czynne zwierzęce somatotropiny rekombinowane, odpowiednie do podawania pozajelitowego, obejmujące zwierzęcą somatotropinę rekombinowaną, zmodyfikowaną i/lub przeprowadzoną w pochodną,lub jej farmaceutycznie i farmakologicznie dozwoloną sól, w ilości sprzyjającej wzrostowi, w farmaceutycznie lub farmakologicznie dozwolonym nośniku stałym lub płynnym, przy czym szybkość wzrostu zwierzęcia zostaje zwiększona w ciągu wydłużonego okresu czasu, pięciu lub więcej dni.

Według wynalazku sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej polega na tym, że utlenia się cztery spośród cysteinowych reszt aminokwasowych zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej do kwasu cysternowego.

W nowych zmodyfikowanych zwierzęcych somatotropinach rekombinowanych, jedna do czterech, cysteinowych reszt aminokwasowych tych somatotropin mogą być zastąpione jedną do czterech reszt aminokwasowych, osobno wybranych spośród aminokwasów takich jak arginina, lizyna, kwas asparginowy, kwas glutaminowy, asparagina, glutamina, histydyna, alanina, glicyna, izoleucyna, leucyna, walina, fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna, metionina, seryna, treonina lub prolina, albo w których wszystkie cztery cysteiny przeprowadzone zostały w kwas cysteinowy, albo w których obie cysteiny w małej pętli lub obie cysteiny w dużej pętli, lub wszystkie cztery cysteiny w obu tych pętlach zostały przeprowadzone z wykorzystaniem podstawników takich jak /CH2COOH/, [CH/CO2H/ /CH2/_XCO2H], /CH2CONR3R4/, /R5/, [/CH2/_nSO₃], /CHCH2CONR3CO/, /CH2/mNR₃R4, /CH2OCOCH2R5/

164 081 lub /SR6, w których to wzorach R3 i R4 każdy oznacza H, [/CH2/1CO2H], [CH/CC2H/ /CH2/xCO2H], C1-C6-alkil ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi, względnie glikolpoietylenowy,R5 oznacza Cj-Có-alkil lub C1- C4-alkoksymetyl i Re oznacza Ci-Có-alkil, glikol polietylenowy lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami kwasu karboksylowego lub kwasu sulfonowego, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4, m oznacza liczbę całkowitą od 2 do 4, a x oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, z tym, że gdy cysteinowe reszty aminokwasowe wspomnianych zwierzęcych somatotropin rekombinowanych zostają przeprowadzone w pochodną, obie reszty cysteinowe w małej pętli, lub obie reszty cysteinowe w dużej pętli danej somatotropiny zostają podstawione tą samą grupą, a również z tym, że podstawniki reszt cysternowych w małej pętli /labilnej i najbliższej C-końca/ mogą być takie same lub różniące się od podstawników cystein w dużej pętli/stabilnej i bliższej N- końca/, oraz dalej z tym, że gdy jedna cysteinowa reszta aminokwasowa jest utleniona do kwasu cysternowego, wszystkie takie reszty cysteinowe w danej somatotropinie są utleniane do kwasu cysternowego.

Inny sposób hamowania agregacji zwierzęcych somatotropin rekombinowanych polega na podstawieniu jednej lub więcej niż jednej cysternowej reszty aminokwasowej umiejscowionej w pozycji 55, 166, 183 lub 191 zwierzęcej somatotropiny rekombinowanych argininą, lizyną, kwasem asparaginowym, kwasem glutaminowym, asparaginą, glutaminą, histydyną, alaniną, glicyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, tryptotanem, tyrozyną, metioniną, seryną, treoniną lub proliną, lub utlenieniu wszystkich czterech ze wspomnianych reszt cysternowych do kwasu cysternowego.

Jeszcze inny sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej polega na redukcji co najmniej jednego z dwóch mostków disulfidowych między cysternowymi resztami aminokwasowymi w pozycjach między 55 a 166 oraz 183 a 191 wspomnianych somatotropin i przeprowadzeniu dzięki temu w pochodną każdej z cystein zredukowanego mostka lub mostków w pozycjach między 55 a 166 i/lub 183 a 191 z wykorzystaniem tej samej pochodnej, z tym, że pochodne cystein w pozycjach 55 i 166 mogą być utworzone z wykorzystaniem podstawników takich samych lub różniących się od podstawników cystein w pozycjach 183 i 191. Do podstawników stosowanych w otrzymaniu nowych, przeprowadzonych w pochodne zwierzęcych somatotropin rekombinowanych, somatotropin wytwarzanych sposoben według wynalazku należą podstawniki takie, jak (CH2COOH), /CH/CO2H/ /CHzĄCOaH/, /CH2CONR3R4/, /R5/, /CH2/_nSO3/, NR3R4, /SR/, /CHCH2CONR3CO/, /CH2/m lub /CH2OCOH2R5/, w których to wzorach R3 i R4 każdy oznacza H, [/CH2/1CO2H], [CH/CO2H/ /CH2/xCC2H], Ci-6-alkil ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi, lub glikol polietylenowy, R5 oznacza Ci.6-alkil lub Ci-4-alkoksymetyl, Re oznacza C1-6- alkil, glikol polietylenowy lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami kwasu karboksylowego lub kwasu sulfonowego, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4, a m oznacza liczbę całkowitą od 2 do 4 i x oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3.

W sposobie według wynalazku korzystnymi nowymi somatotropinami zwierzęcymi są rekombinantowe somatotropiny: świńska, bydlęca, owcza, ludzka i ptasia, w których mostek disulfidowy w małej pętli somatotropiny został zredukowany i cysteiny w pozycjach 183 i 191 przeprowadzone w pochodne z wykorzystaniem podstawników takich jak /CH2COOH/, [CH/CO2H//CH2/xCO2H], /CH2CONR3R4/, /Rs/, /CH2'_nSO3 lub /SR</, w których to wzorach R3, R4, R5, Re, n i x mają wyżej podane znaczenie.

Korzystne są także taicie somatotropiny, w których cysteiny zostały usunięte /od jednej do wszystkich czterech/.

Wszystkie z plazmidów, sekwencje DNA i drobnoustroje zdeponowane w związku z niniejszym zgłoszeniem patentowym, z wyjątkiem tych, które w przeciwieństwie do wspomnianych zostały wyszczególnione, są zdeponowane w muzeum szczepów American Cyanamid Company utrzymywanej w Princeton, New Jersey, oraz w American Type Culture Collection /ATCC/ w Rockville, Maryland 20952, USA.

Figura 1. Klonowanie świńskiego genu somatotropiny doM13mp11. RFDNAM13mp11 przecina się enzymami restrykcyjnymi ECoRI i HindUI i poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej

164 081 z jelita cielęcia. Ekspresyjny plazmid pEFF-902 trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll. Odpowiednie fragmenty oczyszcza się po elektroforezie w 1% żelu agarozowym. Liguje się je i transformuje nimi E. coli JM101. Przedstawiona jest struktura powstałego RF DNA M13mp11pST.

Figura 4. Jest to schematyczne przedstawienie schematu mutagenezy z użyciem oligonukleotydu AA1 i jednoniciowego DNA M13mp11pST.

Figura 3. Analiza sekwencji DNA dotycząca jednoniciowego DNA M13mp11ST i jednoniciowego DNA M13mp11pST34 metodą dideoksy- zakończenia łańcucha Sangera. Porządek ścieżek od lewej do prawej: GATC somatotropiny świńskiej /pST/ typu dzikiego, następnie GATC mutanta pSTA34.

Figura 2. Schematyczne przedstawienie schematów mutagenezy z użyciem oligonukleotydów GLU3 i GLU4 oraz jednoniciowego DNA M13mp11pST.

Figura 5. Schematyczne przedstawienie konstrukcji bakteryjnego wektora ekspresyjnego zawierającego zmutowany gen pST. Plazmidy nadają oporność na antybiotyk ampicylinę /amp^R/.

Korzystne zwierzęce somatotropiny rekombinantowe przedstawione są poniżej, ale wytwarza się też somatotropiny bez dodatkowych Asp- Gln dodatkowych podstawień względnie z innymi podstawieniami, otrzymywane na drodze rekombinacji. Dalsze somatotropiny zwierzęce z usunięciami odbijającymi się na długości łańcucha aminokwasów, uzupełnieniami odbijającymi się na długości łańcucha aminokwasów, zastąpieniami aminokwasów /poza cysteinami/, fragmenty zawierające część czynną itp. znajdują się w zakresie wynalazku. Numerowanie reszt aminokwasowych w niniejszym opisie odnosi się do analogów Met-Asp-Gln, ale jest zmienione, aby umożliwić fachowcom zidentyfikowanie mostków disulfidowych utworzonych przez cztery reszty cysternowe.

Świńska somatotropina rekombinantową

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-De-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-V al-T yr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly- Ser-Pro- Arg- Ala-Gly-Gln-Ile-Leu- Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R2a-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R1-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-Ru-Ala-Phe-OH.

Bydlęca somatotropina rekombinantową

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-ne-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-R2-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu164 081

Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr- Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rja-PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R1-Arg-Arg-Phe-Gly-GlLi-Ala-Ser-R.ia-Ala-Phe-OH. Owcza somatotropina rekombinantowa

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Aia-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gin-Leu-Aia-Aia-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu Arg-Thr-Tyr-De-Pro-Glu-G ly-Gbi-Arg-Tyr-Ser-De55

Gin-Asn-Thr-Gln-Vai-Aia-Phe-R2-Phe-Ser-GiL-ThrIle-Pro-Aia-Pro-Thr-Giy-Lys-Asp-Giu-Ala-Gin-GinLys-Ser-Asp-Leu-GiL-Leu-Leu-Arg-Πe-Ser-Leu-LeuLeu-Πe-Gin-Ser-TIp-LeL-Giy-PIΌ-Leu-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGiu-Giy-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Giu-AspVal-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Glb-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rja-PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Vai-Met-Lys-Rl-Arg-Arg-Phe-Giy-Giu-Ala-Ser-Rla-Ala-Phe-OH. Końska somatotropina rekombinantowa

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-ne-Pro-Glu-Gly-Gin-Ajg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Aia-Ala-Phe-R2-Phe-Ser-GiL-ThrIie-Pro-Ala-Pro-Thr-Giy-Lys-Asp-Glu-Aia-Gin-GinArg-Ser-Asp-Met-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Πe-Gln-Ser-TΓp-Leu-Giy-Pro-Val-Gln-LeL-LeuSer-Arg-V al-Phe-Thr- Asn- Ser- Leu-V al-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Vai-Tyr-Giu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-GluGiu-Giy-Πe-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Giu-AspGiy-Ser-Pro-Arg-Ala-Giy-Gin-Ile-Leu-Lys-Gin-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-LjSLi-Leu-Ser-FZa-PheLys-Lys-Asp-Leu-HLS-Lys-.Aia-Giu-Tl·lr-Tyr-Leu-Arg183 191

ValrMet-Lys-Rl-ArgrArgrPherVal-Giu-Ser-Ser-Rla-Ala-PherOH. Ludzka somatotropina rekombinantowa

H-MetrAsprGin-Phe-PIΌ-Th.IrIierPIΌ-LeurSerrArgr

LeurPhe-Asp-Asn-Ala-MetrLeurArg-Aia-His-ArgrLeur

HLS-GlnrLeu-Ala-PherAsp-ThΓrTyIrGin-Giu-Phe-Glur

164 081

Glu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe56

Leu-Gln- Asn- Pro-Gln-Thr-Ser- Leu- R2- Phe-Ser-GluSer-Ile-Pro-Tr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-GlnGln-Lys-Ser-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-LeuLeu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-PheLeu-Arg-Ser-Val-Phe-AJa-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-GlyAla-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-AspLeu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-LeuGlu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-LysGln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-AsnAsp-Asp-Ała-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr167

R2a-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe

184

Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Ri-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser191

Ru-Gly-Phe-OH.

Ptasia somatotropina rekombinantowa

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-AsnLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Leu-Leu-Ala-Ala-Gln-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-De-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn55

Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Tyr-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Asp-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Met-Gly-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-ValLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Thr-Pro-Val-Gln-Tyr-LeuSer-Lys-Val-Phe-Thr-Asn-Asn-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Phe-Glu-Lys-Leu-Lys-A.sp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspArg-Ser-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Leu-Leu-Arg-Pro-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Ile-His-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp166

Ala-Leu-L^u-Lys-Asn^-Ty^i^^Gl)^^Ie:^^Ij;i-S^<5r^^a-Phe

Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Val-Glu-Thr-Tyr-Leu-Lys191

ValrMet-LysrRl-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ser-AsnrRla-Thr-Πe-OH, przy czym symbole R1, Ru, R2 i R2a odnoszące się do tych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych każdy, niezależnie, oznacza resztę aminokwasowa, taką jak reszta argininy, lizyny, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, asparaginy, glutaminy, histydyny, alaniny, glicyny, izoleucyny, leucyny, waliny, fenyloalaniny, tryptofanu, tyrozyny, metioniny, seryny, treoniny, proliny lub cysteiny, z tym, że co najmniej jedna z tych reszt aminokwasowych przedstawionych symbolami R1, Ru, R2 i R2a w powyżej zilustrowanych somatotropinach oznacza resztę aminokwasową inną niż cysteiny.

Specjalnie korzystnymi zmodyfikowanymi zwierzęcymi somatotropinami rekombinantowymi są te, w których jeden lub oba podstawniki o symbolach Rii Ru w pozycjach somatotropiny 183 i 191, lub w pozycjach 184 i 191 ludzkiej somatotropiny rekombinantowej oznaczają aminokwas inny niż cysteina.

Wytwarzanie wyżej wspomnianych zmodyfikowanych /podstawionych/ zwierzęcych somatotropin rekombinantowych przeprowadza się z zastosowaniem mutagenezy ukierunkowanej. Obecnie używane techniki zmieniania sekwencji DNA klonowanego segmentu DNA w specyficznie zdefiniowanym miejscu wymagają wytworzenia jednoniciowej postaci tego DNA. Jednoniciowy DNA łączy się z syntetycznym oligonukleotydem, który jest

164 081 komplementarny z jego częścią, z tym wyjątkiem, że oligonukleotyd zawiera w sobie region błędnego parowania, zazwyczaj umiejscowiony w środkowej części tego oligonukleotydu. Połączoną mieszaninę czyni się następnie dwuniciową i kowalencyjnie zamkniętą w wyniku dodania dużego fragmentu polimerazy DNA I E. coli i trifosforanów deoksynukleotydów w obecności ligazy DNA T4 i 5’-trifosforanu adenozyny. Dwuniciowym DNA transformuje się następnie odpowiedni szczep E. coli, w którym region DNA błędnego sparowania ulega naprawie i replikacji. Otrzymuje się dwie populacje klonów.

W zależności od tego, która nić zostanie wybrana jako matryca, do syntezy naprawczej, klon zawiera sekwencję albo typu dzikiego, albo zmienioną/zmutowaną/. Klony, które zawierają sekwencję zmutowaną, to jest taką która odpowiada sekwencji oligonukleotydu, selekcjonuje się na drodze hybrydyzacji z promieniotwórczo znakowanym oligonukleotydem. W zależności od błędnego sparowania między oligonukleotydem a sekwencją typu dzikiego, promieniotwórczo znakowany oligonukleotyd zostaje bardziej stabilnie związany z klonami, które zawierają zmutowaną sekwencję. Tak więc, inkubacja w odpowiedniej temperaturze różnicuje klony typu dzikiego i zmutowane. Zmiany w zidentyfikowanych klonach potwierdza się następnie za pomocą sekwencjonowania DNA odpowiednich regionów. W następującym dalej omówieniu wybiera się świńską somatotropinę rekombinantową jako reprezentatywną dla zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną somatotropin zwierzęcych i metod stosowanych w celu jej otrzymywania.

Klonowanie świńskiego genu somatotropiny /rpST/ do tworzącego pojedynczą nić wektora, bakteriofaga M13mp11 / ATCC osiąga się następującym ogólnym sposobem postępowania przedstawionym na figurze 1.

Fragment DNA zawierający świński gen somatotropiny /rpST/ wyodrębnia się z bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pEFF- 902 /ATCC za pomocą rozszczepienia enzymami restykcyjnymi EcoRI oraz HindIII. Fragment zawierający gen rpST oczyszcza się następnie za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Replikatywną postać /RF/ DNA M13mp11 trawi się następnie EcoRI i HindIII, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i oczyszcza duży fragment za pomocą elektoforezy w żelu agarozowym. Następnie dwa oczyszczone fragmenty miesza się razem i liguje ligazą DNA T4. Mieszaninę transformuje się E. coli JM101 /ATCC/i kilka utworzonych łysinek poddaje hodowli. Replikatywną postać/RF/ DNA otrzymuje się standardową metodą alkalicznej lizy i ustala strukturę trawieniem odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Wyodrębnia się klon zawierający oczekiwane fragmenty i oznacza go M13mp11pST /ATCCJ. Do potwierdzenia identyczności klonu stosuje się analizę sekwencji DNA.

Mutagenezę genu rpST w M13mp11pST osiąga się następnie tak, jak opisano poniżej i przedstawiono w zarysie na figurze 2. Celem programu mutagenezy jest wytworzenie cząsteczki rpST niezdolnej do utworzenia wiązania disulfidowego małej pętli, wiązania disulfidowego dużej pętli lub obydwóch za pomocą podstawienia odpowiednich reszt cysteinowych innymi aminokwasami. Wiązanie disulfidowe dużej pętli jest umiejscowione między cysteinami w pozycjach 55 i 166 w genie rpST. Wiązanie disulfidowe małej pętli znajduje się między cysteinami umiejscowionymi przy 183 i 191. Sposób numerowania jest taki jak opisano. Używa się dwóch zasadniczych protokołów do otrzymywania żądanych mutantów i przykłady każdego z nich są opisane w dalszej części niniejszego opisu.

W pierwszym sposobie, podstawienia cystein w wiązaniu disulfidowym małej pętli dokonuje się przy użyciu długiego syntetycznego oligonukleotydu. W sposobie tym stosuje się oligonukleotyd oznaczony AA1 o następującej sekwencji: 5’ GCT ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3’.

Zmienia to sekwencję genu pST tak, że kodon cysteiny w pozycji 183 przeprowadza się z TGT do GCG kodującego alaninę i kodon cysteiny w pozycji 191 przeprowadza się w z TGT do GCT, również kodującego alaninę. Tak więc, cysteiny w małej pętli obie zostają przeprowadzone w alaninę. Jednoniciowy DNA M13mp11pSt otrzymuje się z oczyszczonego faga według standardowego protokołu. Ogólny zarys sposobu mutagenezy jest przedstawiony na figurze 4. 1000 ng jednoniciowego DNA M13mp11pST miesza się z 50 ng oligonukleotydu AA1, który uprzednio został 5’-fosforylowany z użyciem 5’-trifosforanu

164 081 adenozyny i kinazy polinukleotydowej. Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. W ten sposób łączy się oligonukleotyd z jednoniciowym DNA. Następnie połączony DNA przeprowadza się w postać dwuniciową, kowalencyjnie zamkniętą, dodaniem ATP, dNTP /mieszanina czterech 5'- trifosforanów deoksyrybonukletydów/, ligazy DNA T4 i dużego fragmentu polimerazy DNA I. Mieszaninę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie transformuje się nią E. coli JM 101 standardową metodą z chlorkiem wapniowym. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C, na murawie JM 101 widoczne są łysinki. Przenosi się je na filtry nitrocelulozowe i poddaje hybrydyzacji zwykłymi metodami. Drugiego oligonukleotydu oznaczonego AA1D używa się do wykrycia mutantów. AA1D ma sekwencję następującą: 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Znakuje się go promieniotwórczo na końcu 5' z użyciem [γ- ³²P] -ATP i kinazy polinukleotydowej. Hybrydyzacje prowadzi się przez całą noc w temperaturze 37°C w 5x SSC /1x SSC stanowi 0,15 M chlorek sodowy, 0,15 M cytrynian sodowy pH 70/, 1x roztworze Denhardta /0,02% wag/obj. Ficoll, 0,02% wag/obj. bydlęca albumina surowicza, 0,02% poliwinylopirolidon/, 150 /ml tRNA po hybrydyzacji. Filtry przemywa się stosując kolejno 5x SSC w temperaturze 4°C, TAC/TAC stanowi 3 M chlorek tetrametyloamoniowy/, 50 mM tris/hydroksymetylo/aminometan pH 8,0, 1 mM EDTA /kwas etylenodiaminotetraoctowy/, 0,1% wag/obj. siarczan dodecylo-sodowy w temperaturze 37°C i ostatecznie TAC w pożądanej temperaturze. To ostatnie przemycie określa specyficzność. Dla AA1D temperatura ta wynosi 52,5°C. Po ekspozycji na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X obserwuje się tylko te klony, które są całkowicie komplementarne z AA1D. Kilka takich klonów analizuje się przez sekwencjonowanie DNA. Wszystkie z nich zawierają pierwszą mutację, ale żaden nie zawiera drugiej mutacji /przy cysteinie 191/.

W celu zmutowania cysteiny w pozycji 191 używa się drugiego nukleotydu oznaczonego A1 o następującej sekwencji: 5' GaG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3’.

Proces mutagenezy jest identyczny z powyżej opisanym z zastosowaniem AA1, z tą różnicą, że matrycą DNA jest M 13mp 11 pSTA3 /jest to klon wyodrębniony podczas mutagenezy AA1, który ma cysteinę w pozycji 183 przeprowadzoną w alaninę/ i hybrydyzacji dokonuje się z A1. Temperatura końcowego przemycia wynosi 56°C. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, że zidentyfikowane klony mają oczekiwaną sekwencję. Zmutowany klon jest oznaczony M13mp11pSTA34 /ATCC.

Sekwencja DNA jest przedstawiona na figurze 3.

W drugim sposobie podstawienie w wiązaniu disulfidowym małej pętli otrzymuje się stosując dwa nukleotydy w tej samej reakcji, jak przedstawiono na figurze 2. Te dwa nukleotydy mają następujące sekwencje:

5’ GCT ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3’ GLU3 GLU

5’ GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 3’ GLU4 GLU

Jednoniciowym DNA-matrycą jest M13 mp11pST /ATCC. Te dwa nukleotydy i DNAmatrycę łączy się w tej samej reakcji, wydłuża i liguje jak poprzednio. Mieszaninę transformuje się E. coli JM 101. Odmienność tego sposobu polega na tym, że wykonuje się tu dwa przeniesienia z każdej płytki. Po każdym przeniesieniu następuje oddzielna hybrydyzacja albo ze znakowanym 32p GLU3, albo ze znakowanym 32p GLU4. Temperatura końcowego przemycia dla każdego oligonukleotydu wynosi 56°C. Pobiera się tylko te łysinki, które są pozytywne wobec obu nukleotydów. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, że tak Cys 183 jak i Cys 191 przeprowadzone są w kwas glutaminowy. Klon oznaczony jest M13mp11pSTE34/ATCC. Sposobu tego używa się do otrzymywania mutacji zapobiegających tworzeniu wiązania disulfidowego dużej pętli w wyniku zastosowania dwóch odpowiednich oligonukleotydów jak opisano powyżej i M13mp11pST. Wyraźnie w wyniku użycia M13mp11pSTA34 jako DNA-matrycy i dwóch oligonukleotydów nadających się do zmiany Cys 55 i Cys 166 na alaninę, otrzymuje się klon, w którym wszystkie reszty cysteinowe przeprowadzone zostały w alaninę.

164 081

Zmienione /zmutowane/ klony wbudowuje się ponownie do bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pRO211 /ATCC jak przedstawiono na figurze 5 /opisano w EP 173280/. Klony M13 przecina się EcoRI i HindIII i wyodrębnia fragment genu pST. pRO211 trawi się tymi samymi enzymami, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i wyodrębnia duży fragment. Te dwie części liguje się ze sobą stosując ligazę DNA T4 i używa do transformacji odpowiedniego szczepu bakteryjnego, np. E. coli N99cI /ATCC.

W szczepie tym obecny jest represor k typu dzikiego. Zapobiega on ekspresji z promotora Pl w pRO211. Gdy zostanie wyodrębniona odpowiednia konstrukcja, przenosi się ją do odpowiednich szczepów bakteryjnych, zawierających represor k wrażliwy na temperaturę, np. E. coli 4200 /ATCC. W tych szczepach ekspresja pST jest zależna od temperatury. W temperaturze 42°C represor jest nieaktywny i ekspresja zachodzi. W tym stadium pST otrzymuje się sposobami z EP 173280 /włączonego do niniejszego opisu jak odnośnik/, przy czym ekspresja zachodzi. Ekspresja pST nie jest ograniczona do tych szczególnych szczepów E. coli. Zamiast nich stosuje się inne szczepy o odpowiednich właściwościach. Plazmidowe wektory ekspresyjne są zdeponowane w ATCC. Szczepy bakteryjne są zdeponowane oddzielnie.

Podstawienie innymi aminokwasami przeprowadza się powyższymi sposobami przy wykorzystaniu odpowiednich kodonów i oligonukleotydów. Podobnie stosuje się te sposoby do zmodyfikowania somatotropin zwierzęcych /różnych/.

Wśród tych zmodyfikowanych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych łatwo otrzymywanych powyższymi sposobami są: /Ala 55,166/ rpST; /Ser 55,166/rpST; /Ala 183,191/rpST; /Glul83,191/rpST;/Glu 183 -Ala 191/roSt; Ser 183,191/roST; oraz /Glu 183-Ser 191/rpST.

. Przeprowadzone w pochodną somatotropiny zwierzęce, korzystnie rekombinantowe, otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia lub zdyspergowania somatotropiny zwierzęcej w wodzie lub wodnym roztworze chlorowodorku guanidyny, wodorowęglanu sodowego itp., którego pH doprowadza się do 8,4 wodnym roztworem zasady, takiej jak wodorotlenek sodowy lub amonowy. Do tego roztworu dodaje się później powoli ditiotreitol, to jest DL-treo-1,4-dimerkapto-2,3-butanodiol. Dodania dokonuje się na ogół w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej. Następnie do powstałego roztworu dodaje się jodoacetamid, kwas jodooctowy, tetrationian sodowy, metanotiosulfonian metylu, sulfon 1,3-propanowy lub jakikolwiek inny związek przeprowadzający w pochodną. Mieszaninę miesza się w ciągu około 1 do 4 godzin, a następnie odsala stosując ultrafiltrację. Roztwór zatęża się, a następnie przeprowadza kilka cykli ponownego rozcieńczenia wodą, wodnym roztworem chlorowodorku guanidyny itp., a potem ultrafiltracji. Następnie liofilizuje się pozostałość z końcowej filtracji w celu uzyskania przeprowadzonej w pochodną rpST.

Korzystnie, nowe somatotropiny zwierzęce są użyteczne w zwiększeniu szybkości wzrostu zwierząt, zwłaszcza zwierząt hodowanych na mięso i zwiększaniu efektywności spożytkowania przez nie paszy. Związki te są również skuteczne w polepszaniu tuszy tych zwierząt, to jest zwiększania stosunku chudego mięsa do tłuszczu u tych zwierząt. Oprócz tego, związki te są skuteczne w zwiększaniu wytwarzania mleka u zwierząt podczas laktacji i polepszaniu tworzenia wełny przez owoce i inne zwierzęta hodowane na futro.

Gdy zmodyfikowane /z podstawieniem/ lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny są skuteczne w działaniu na zwierzęta w celu osiągnięcia biologicznych korzyści powyżej opisanych, okazuje się, że polepszona skuteczność i użyteczność zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną somatotropin zwierzęcych jest w części przypisywana zahamowaniu agregacji somatotropiny wytworzonej za pomocą zmodyfikowania lub przeprowadzenia w pochodną w przypadku tych somatotropin. Zahamowanie to pozwala na otrzymanie znacznie polepszonych układów zaopatrujących o przedłużonym uwalnianiu, czego nie można łatwo lub skutecznie osiągnąć w przypadku somatotropin natywnych lub rekombinantowych, które nie zostały zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodne, jak to opisano w odniesieniu do niniejszego wynalazku.

Stwierdzono także, że zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny są w wysokim stopniu stabilne i zasadniczo nie wykazują agregacji zależnej od tworzenia dimerów. Oprócz tego, zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny nadają się do otrzymywania znacznie polepszonych środków o przedłużonym uwalnianiu. Podczas gdy

164 081 stwierdzono, że natywne somatotropiny zwierzęce agregują w jednym dniu, środki pozajelitowe zawierające zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny kontynuują uwalnianie zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropiny w ciągu 10 lub więcej dni.

W praktyce, środki zawierające omawiane związki podaje się na ogół zwierzętom za pomocą wstrzyknięcia, w postaci biologicznie czynnego środka pozajelitowego. Wśród środków pozajelitowych użytecznych jeśli chodzi o podawanie zwierzęcych somatotropin rekombinantowych są takie jak żele, pasty, mikrokuleczki, mikrokapsułki, implanty itp. Co do nich, istnieje zainteresowanie dostarczaniem postaci do dawkowania biologicznie czynnych substancji, które uwalniają substancję w sposób kontrolowany i zmniejszają przez to częstotliwość podawania.

Postęp dotyczący środków o przedłużonym uwalnianiu biologicznie czynnych makrocząsteczek przedstawia specjalne problemy w zależności od ich skomplikowanego sposobu działania i zawiłej budowy makrocząsteczek. Tak więc, ciągle wymagany jest postęp dotyczący skutecznych środków o przedłużonym uwalnianiu zawierających biologicznie czynną somatotropinę.

Środki użyteczne przy tym typie podawania otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropiny zwierzęcej w rozcieńczonym wodorotlenku amonowym, a następnie dodanie do roztworu bezoesanu metalu alkalicznego, laurynianu metalu alkalicznego, węglanu metalu alkalicznego itp. Do roztworu dodaje się domieszkę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i otrzymaną mieszaninę suszy metodą rozpyłową. Tak utworzone ciało stałe miesza się ze stopionym tłuszczem lub woskiem, albo ich mieszaniną i otrzymaną stopioną mieszaninę rozpyla się przez dyszę rozpylającą powietrze/ciecz wyposażoną w płaszcz grzejny w celu utrzymania dochodzącego powietrza i stopionej fazy w temperaturze powyżej temperatury topnienia. Gdy stopione kropelki ochłodzą się, tworzą się mikrokuleczki. Zbiera się je na zestawie sit o żądanym zakresie wielkości otworów, około 45 do 180 pm i zachowuje do użycia. Mikrokuleczki o wielkości nie mieszczącej się w pożądanym zakresie zawraca się do procesu. Alternatywnie, homogeniczną mieszaninę podaje się na wirującą tarczę i tak utworzone mikrokuleczki zbiera jak wyżej, lub też stopioną mieszaninę chłodzi i miele do cząstek o średniej wielkości w pożądanym zakresie.

Następnie biologicznie czynne mikrokuleczki dysperguje się w nośniku ciekłym, farmaceutycznie i farmakologicznie dozwolonym do wstrzykiwania zwierzęciu. Środek mikrokuleczki-płyn wstrzykuje się na ogół zwierzęciu podskórnie, zazwyczaj w okolicę głowy, karku lub uszu.

Zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny przygotowuje się także jako biologicznie zgodne implanty, które wstrzykuje się pod skórę zwierzęcia za pomocą zwykłego urządzenia do tabletek wszczepianych podskórnie. Te środki otrzymuje się przez zmieszanie sproszkowanej, zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropiny z woskiem, takim jak wosk rącznikowy, lub z mieszaniną kopolimeru glikolidu z laktydem, wodorotlenku magnezowego i kondensatu denku etylenu, otrzymanego z zasadą hydrofobową utworzoną na drodze kondensacji denku propylenu z glikolem propylenowym. Tak utworzone mieszaniny wprowadza się tabletkarki i formuje cylindryczne tabletki o średnicy około 3,2 mm. Tak utworzone tabletki podaje się za pomocą zwykłego urządzenia do tabletek wszczepianych podskórnie.

Wynalazek objaśniają dalej przykłady zamieszczone w dalszej części niniejszego opisu.

Przykład I. Podstawienia cystein wiązania disulfidowego małej pętli z zastosowaniem długiego oligonukleotydu syntetycznego.

Oligonukleotyd oznaczony AA1 ma sekwencję następującą: 5’ GCT ATG AAG GCG CGC CGC TTG GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3’.

Zmienia to sekwencję genu rpST tak, że kodon cysteiny w pozycji 183 zostaje przeprowadzony z TGT do GCG,-który koduje alaninę i kodon cysteiny w pozycji 191 zostaje przeprowadzony z TGT do GCT, który także koduje alaninę. Tak więc, obydwie cysteiny w małej pętli zostają przeprowadzone w alaniny. Jednoniciowy DNA M13mp11pST otrzymuje się z oczyszczonego faga na zasadzie standardowych protokołów. 1000 ng jednoniciowego DNA

164 081

M13mp11pST miesza się z 50 ng oligonukleotydu AA1, który został uprzednio 5’ - fosforylowany 5’ -trifosforanem adenozyny z wykorzystaniem kinazy polinukleotydowej, w końcowej objętości 10 pl z zawartością 1x buforu do łączenia/1x bufor do łączenia stanowi 75 mM KCl, 5 mM Tris pH 8,0/. Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Według tego protokołu łączy się oligonukleotyd z jednoniciowym Dna. Połączony DNA przeprowadza się następnie w postać dwuniciową kowalencyjnie zamkniętą przez dodanie 20 pl H20,4 pl 10x buforu uzupełniającego /10x bufor uzupełniający stanowi 27 5 m MgCl pH 7,5 2 mM DTT/, 1 pl 20 mM ATP, 2 pl dNTP /mieszanina czterech 5’- trifosforanów deoksyrybonukleotydów, każdy w stężeniu 2 mM/, 2 jednostek dużego fragmentu polimerazy DNA I, co do definicji jednostki patrz katalog New England Biolabs, 1986/. Mieszaninę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaniną tą transformuje się E. coli JM 101 z zastosowaniem zwykłego sposobu postępowania przy użyciu chlorku wapniowego. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C na murawie JM 101 widoczne mogą być łysinki. Łysinki przenosi się na filtry nitrocelulozowe i przygotowuje do hybrydyzacji na zasadzie standardowych protokołów. Do wykrycia mutantów używa się drugiego oligonukleotydu oznaczonego AA1D, o następującej sekwencji: 5’ C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3’. Jest on promieniotwórczo znakowany na końcu 5’ z użyciem [y³²p]-ATP i kinasy polinukleotydowej. Hybrydyzacja trwa przez noc w temperaturze 37°C w 5x SSC, 1x roztworze Denhardta 150 /ml tRNA. Filtry przemywa się kolejno 5x SSC w temperaturze 37°C, TAC w temperaturze 37°C i w końcu TAC w pożądanej temperaturze. To ostatnie przemycie określa specyficzność. Dla AA1D temperatura ta wynosi 52,5°C. Po ekspozycji na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X obserwuje się tylko te klony, które są całkowicie komplementarne z AA1D. Kilka takich klonów analizuje się przez sekwencjonowanie DNA. Wszystkie z nich zawierają pierwszą mutację, ale żaden nie zawiera drugiej mutacji, przy cysteinie 191. W celu zmutowania cysteiny w pozycji 191 używa się drugiego nukleotydu oznaczonego A1, o następującej sekwencji: 5’ gAg AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3’.

Proces mutagenezy jest identyczny z opisanym w przykładzie I /powyżej/, z tą różnicą, że matrycą jest M13mpl lpST3 /jest to klon wyodrębniony podczas mutagenezy AA1, który ma cysteinę w pozycji 183 przeprowadzoną w alaninę/ i hybrydyzacji dokonuje się z Al. Temperatura końcowego przemycia wynosi 62°C. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, że zidentyfikowane klony mają oczekiwaną sekwencję. Zmutowany klon oznaczony jest M 13mp11 pSTA34.

Przykład II. Podstawienia cystein w małej pętli świńskiej somatotropiny rekombinantowej.

Podstawienia w wiązaniu disulfidowym małej pętli otrzymuje się stosując dwa oligonukleotydy w tej samej reakcji.

Te dwa oligonukleotydy mają następujące sekwencje:

5’ GTC ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3’ GLU 3 GLU

5’ GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 3’ GLU 4 GLU

Jednoniciowym DNA-matrycą jest M13mp11pST. Te dwa oligonukleotydy i DNAmatrycę łączy się w tej samej reakcji, wydłuża i liguje jak poprzednio. Mieszaninę transformuje się E. coli JM101. Różnica w tym sposobie polega na tym, że wykonuje się dwa przeniesienia z każdej płytki. Po każdym przeniesieniu przeprowadza się oddzielną hybrydyzację albo ze znakowanym ^p GLU3 albo GLU4. Temperatura końcowego przemycia dla każdego oligonukleotydu wynosi 56°C. Pobiera się tylko te łysinki, które są pozytywne wobec obu oligonukleotydów. Sekwencjonowanie dNa ujawnia, że tak Cys 183 jak i Cys 191 są przeprowadzone w kwas glutaminowy. Tego sposobu używa się do otrzymania mutacji zapobiegających tworzeniu wiązania disulfidowego dużej pętli w wyniku zastosowania dwóch odpowiednich oligonukleotydów jak opisano powyżej i M13mp11pST. Wyraźnie przez użycie M 13mp 11 pSTA34 jako DNA-matrycy i dwóch oligonukleotydów odpowiednich do zmiany Cys 55 i Cys 166 na alaninę, otrzymuje się klon, w którym wszystkie reszty cysteinowe zostały przeprowadzone w alaninę.

164 081

Przykład Π1. Ponowne wbudowanie do bakteryjnych plazmidów ekspresyjnych.

Zmienione /mutantowe/ klony wbudowuje się ponownie do bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pRO211, opisanego w EP 173280 włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik. Klony M13 przecina się EcoRI i HindIII i wyodrębnia fragment genu pST. pRO211 klonuje się z użyciem tych samych enzymów, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i wyodrębnia duży fragment. Te dwie części liguje się ze sobą z wykorzystaniem ligazy DNA T4 i używa do transformacji odpowiedniego szczepu bakteryjnego, np. N99cr. W szczepie tym obecny jest represor λ typu dzikiego. Zapobiega on ekspresji z promotora P2 w pRO2H. Gdy zostanie wydodrębniona odpowiednia konstrukcja, przenosi się ją do odpowiednich szczepów bakteryjnych, które zawierają represor λ wrażliwy na temperaturę, np. 4200. W tych szczepach ekspresja pST jest zależna od temperatury. W temperaturze 42°C represor jest nieaktywny i ekspresja zachodzi. W tym stadium, rpST otrzymuje się sposobami z EP 173280 /włączonego do niniejszego opisu jako odnośnik/. Szczepy E. coli, które stosuje się do ekspresji produktu genu pST, nie są ograniczone do E. coli 4200. Można użyć jakiegokolwiek szczepu E. coli.

Powtarzając sposoby postępowania z przykładów I, Ii i III /powyżej/ lecz podstawiając odpowiednie kodony alaniny, seryny, kwasu glutaminowego, argininy, tryptofanu lub asparaginy zamiast cysteiny w pozycjach 183 i 191, przeprowadza się TGT odpowiadający cysteinie w TCN, AGC lub AGT odpowiadające serynie, GAG lub GAA odpowiadające kwasowi glutaminowemu, CGN, AGA lub AGG odpowiadające argininie, AAT lub AAC odpowiadające asparaginie, GCN odpowiadający alaninie, względnie TGG odpowiadający tryptofanowi, we wspomnianej pozycji.

Przykład IV. Otrzymywanie /Cam-Cys 55, 166, 183 191/rpST.

Otrzymuje się roztwór 100 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpST/ w 33 ml 7M chlorowodorku guanidyny i pH doprowadza do 8,4 za pomocą NaOH. Do tego roztworu dodaje się 18 mg /20 równoważników/ ditiotreitolu i miesza mieszaninę reakcyjną w ciągu godziny w temperaturze pokojowej w atmosferze N2. Do tego roztworu dodaje się 84 mg /100 równoważników/ jodoacetamidu i miesza mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 35 ml H2O i chlorowodorku guanidyny i usuwa się nadmiar odczynników na drodze ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2/odcięcie przy masie cząsteczkowej około 1000 daltonów/ w komorze z mieszaniem Amicon model 8400. Po kilku cyklach powtórnego rozcieńczania i powtórnej filtracji, pozostały roztwór wodny liofilizuje się do stałej wagi z uzyskaniem 100 mg puszystego proszku o barwie białej. Ruchliwość elektroforetyczna produktu w żelu SDS-PAGE w warunkach nieredukujących różni się od wykazywanej przez rpST. Produkt jest to przeprowadzona w pochodną świńska somatotropina rekombinantową wskazana w powyższej części niniejszego opisu.

Przykład V. Otrzymywanie /Cam-Cys 183, 191/ rpST.

Do 225 ml odgazowanego 0,02 M roztworu NaCl dodaje się 3,375 g świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpST/, pH doprowadza się rozcieńczonym HCl do 8,1 i przy utrzymywaniu pH na tym poziomie dodaje się do roztworu rpST 15 mg/ml 0,9463 g ditiotreitolu rozpuszczonego w 31,5 ml wody. Mieszaninę odstawia się na godzinę w temperaturze pokojowej, po czym pH podnosi się do 8,4 i przy utrzymywaniu na tym poziomie, do roztworu rpST wkrapla się 5,7 g jodoacetamidu rozpuszczonego w 40,5 ml wody. Podczas tego wkraplania następuje tworzenie się drobnego osadu, który usuwa się za pomocą odwirowania. Sklarowany płyn stanowiący supematant usuwa się i przeprowadza przez kolumnę SephadexG-25 w celu usunięcia nadmiaru materiałów o niskiej masie cząsteczkowej. Zbiera się 342,8 g frakcji o wysokiej masie cząsteczkowej /rpST/ i liofilizuje, w wyniku czego otrzymuje się 2,2 g /Cam-Cys 183, 191/rpST.

Przykład VI. Otrzymywanie /Cm-Cys 183,191/rpST. Do roztworu 200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpST/ w 100 ml 0,5 N NaHCOs o pH doprowadzonym do około 8,4 wodnym roztworem wodorotlenku amonowego dodaje się 15 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną poddaje się mieszaniu w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Dodaje się 50 mg kwasu jodooctowego i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin, a następnie odsala na drodze ultrafiltracji przez membranę Amicon uM2 w komorze z mieszaniem Amicon model 8400. Po kilku cyklach powtórnego mieszania i powtórnej filtracji pozostały roztwór wodny liofilizuje się do stałej wagi. Otrzymuje się około 200 mg puszystego

164 081 ciała stałego o barwie białej. Otrzymany produkt jest świńską somatotropiną rekombinantową jak wskazano w niniejszym przykładzie.

Powtarza się powyższy sposób postępowania, z tą różnicą, że zamiast świńskiej somatotropiny rekombinantowej stosuje się bydlęcą somatotropinę rekombinantową, owczą somatotropinę rekombinantową, końską somatotropinę rekombinantową, ludzką somatotropinę rekombinantową lub ptasią somatotropinę rekombinantową , w wyniku czego otrzymuje iię , odpowiednio:

1/ /Cm-Cys 183, 191/rbST

2/ /Cm-Cys 183, 191/roST

3/ /CM-Cys 183, 191/rhoST

4/Cm-Cys 184, 191/rhST

5/Cm-Cys 183, 191/raST.

Przykład VII. Otrzymywanie /OjS-Cys 55, 166, 183, 191/ rpST.

Otrzymuje się roztwór 20θ mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpST/ w 50 ml 7N chlorowodorku guanidyny i pH doprowadza się do około 8,4 przy użyciu wodorotlenku sodowego. Do tego roztworu dodaje się 33 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną miesza w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Do tego roztworu dodaje się 200 mg tetrationianu sodowego. pH natychmiast obniża się do około 6 i doprowadza się je z powrotem o 8,4 przy użyciu NaOH. Mieszaninę poddaje się następnie mieszaniu w ciągu 2 godzin. Roztwór poddaje się ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2. Mieszaninę reakcyjną zatęża się do około 20 ml, rozcieńcza ponownie około 40 ml 3N chlorowodorku guanidyny i znów filtruje. Po zatężeniu do około 20 ml roztwór rozcieńcza się wodą i ponownie zatęża. Proces ten powtarza się dodatkowo dwa razy i pozostałość liofilizuje do stałej wagi. Otrzymuje się około 200 mg ciała stałego o barwie białej jako produkt. Stanowi on przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropinę rekombinantową opisaną powyżej.

Przykład VIII. Otrzymywanie /O3S-Cys 183, 191/rpST.

Do roztworu 250 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpSt/ w 100 ml H2O, której pH doprowadzono do około 8,4 za pomocą NaOH, dodaje się 70 mg ditiotreitolu. Roztwór miesza się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Do roztworu zredukowanej rpST dodaje się 400 mg tetrationianu sodowego i miesza się go w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną filtruje się przez membranę Amicon UM2 i zatęża do około 20 ml. Rozcieńcza się pozostałość do około 200 ml wodą i ponownie zatęża. Ten sposób postępowania powtarza się jeszcze dwa razy. Końcowy roztwór liofilizuje się do stałej wagi, w wyniku czego otrzymuje się około 240 mg proszku o barwie białej. Jest on przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropiną opisaną powyżej.

Przykład IX. Otrzymywanie /MeS-Cys 183, 191/rpST.

200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpST/ rozpuszcza się w 100 ml H2O. pH tego roztworu doprowadza się do około 8,4 wodnym roztworem NaOH. Do tego roztworu dodaje się 15 mg ditiotreitolu /DTT/ i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Po zakończeniu redukcji dodaje się 24 gl metanotiosulfonianu metylu i mieszaninę reakcyjną miesza sie w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Podczas prowadzenia reakcji pH jest utrzymywane na poziomie 8,4 przez dodanie 1% NaOH w miarę potrzeby. Roztwór poddaje się ultrafiltracji przez membranę UM2 i zatęża do około 20 ml. Pozostałość rozcieńcza się 200 ml H2O i zatęża ponownie. Następnie liofilizuje się roztwór, w wyniku czego otrzymuje się 210 mg wyżej opisanego produktu, to jest przeprowadzonej w pochodną świńskiej somatotropiny rzkombinantowzU opisanej w niniejszym przykładzie powyżej.

Powtarzając powyższy sposób postępowania z tą różnicą, że zamiast świńskiej somatotropiny tzkombinantowzj stosuje się bydlęcą somatotropinę rekombinantową, owczą somatotropinę rekombinantową, końską somatotropinę rekombinantową, ludzką somatotropinę tzkombinantową lub ptasią somatotropinę rekombinantową, w wyniku czego otrzymuje się następujące produkty:

/Mes-Cys 183, 191/ bydlęca somatotropina rekombinantową

2/Mes-Cys 183, Dl/ owcza somatotropina rekombinantową

164 081

3/Mes-Cys 183, 191/ końska somatotropina rekombinantową

Al /Mes-Cys 184, 191/ ludzka somatotropina rekombinantową

5/Mes-Cys 183, 191/ ptasia somatotropina rekombinantową.

Przykład X. Otrzymywanie /HOsSC^C^C^-Cys 183, 191/- rpST.

Do roztworu 200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej /rpST/ w 100 ml H2O, w której pH doprowadzono do 8,4, dodaje się 15 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Do tego roztworu dodaje się 50 mg sulfonu 1,3-propanowego i miesza się go w temperaturze pokojowej w ciągu 6 godzin. pH utrzymuje się na poziomie 8,4 dodawaniem 1% NaOH. Surowy produkt zatęża się na drodze ultrafiltracji przez membranę UM2 do objętości około 20 ml. Dwukrotnie rozcieńcza się go do 200 ml i zatęża ponownie. Liofilizuje się roztwór końcowy, w wyniku czego otrzymuje się 200 mg powyżej opisanego produktu w postaci ciała stałego o barwie białej, to jest przeprowadzonej w pochodną świńskiej somatotropiny rekombinantowej.

Korzystnie, zastępując w powyższym sposobie postępowania świńską somatotropinę rekombinantową odpowiednią zwierzęcą somatotropiną rekombinantową, otrzymuje się następujące somatotropiny:

1//HO3SCH2CH2CH2-Cys 183, Dl/bydlęca somatotropina rekombinantową

2//HO3SCH2CH2CH2-Cys 183, 191/ owcza somatotropina rekombinantową

3/HO3SCH2CH2CH2-Cys 183, DU końska somatotropina rekombinantową

4//HO3SCH2CH2CH2-Cys 184, D1/ ludzka somatotropina rekombinantową

5//HO3SCH2CH2CH2-Cys 183, D1/ ptasia somatotropina rekombinantową.

Przykład XI. Profile stabilności zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną zwierzęcych somatotropin rekombinantowych.

Otrzymuje się stężony roztwór pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej /do 100 mg/mlż w roztworze soli buforowanym fosforanami o pH 7,4 /3,45 g NaH2PO4H2O, 3,55 g Na2HPO4,9,50 g NaChrczpuszczone w wodzie destylowanej, do łącznej objętości 1000 ml/. Roztwór ten poddaje się filtracji przez miliporową jałową jednostkę filtracyjną Millex - 0,22 μm i 0,1 ml próbki umieszcza się w probówkach, które z kolei umieszcza się w piecu o temperaturze 45°C i pobiera w pożądanych odstępach czasu. Następnie zawartość rozcieńcza się buforowanym roztworem soli. Supernatant bada się za pomocą HPLC pod względem zawartości monomeru i dimeru, przeprowadza się zbilansowanie mas i rejestruje każdy wytrącony materiał. Wyniki porównuje się z wyjściowymi stężeniami i udokumentowuje profil stabilności.

Alternatywnie, pochodną somatotropiny wykazującą słabą rozpuszczalność w pH 7,4 rozpuszcza się w mniej korzystnym pH /4-10/ lub ocenia się jako zawiesinę.

Próbka	2 dni Roztwór frakcji /Dimer/	5 dni Roztwór frakcji/Dimer/	6 dni Roztwór frakcji /Dimer/	7 dni Roztwór frakcji /Dimer/
rpST techn.	93,1/17,2/	92,4/27,6/	92,0/34,9/	85,9/29,4/ 89,5/31,0/
rpST techn.	-	79,8/20,7/	-	-
rpST techn.	-	81,5/18,6/	-	-
/Can-Cys 183-191/ rpST	-	75,2/2,0/	-	-
/Can-Cys 183, 191/ rpST	-	72,8/1,0/	-	-
/Can-Cys 183, 191/rpST	-	-	57,8 /2,0/	-
/Can-Cys 183, 191/rpST	-	-	-	73,0/3,0/
/Mes-Cys 183, 19UrpST	79,7 /2,2/	-	-	73,4/3,9/
Disulfidowa rpST	83,2/1,0/	-·	-'	*73,9/1,5/ 85,0/1,6/

Wyekstrahowano do buforu PBS. Pozostałe w całości ekstrahowano do CBS.

164 081

Opis	Frakcja rozpuszczalna /Dimer/
2 dni	7 dni
Karboksymetylowa pochodna rpST	92,18 /5,3/	85,6/5,9/
Pochodna rpST z sufidem dimetylowym	77,6 /2,4/	63,5 /3,0/
Pochodna rpST z kwasem
hydroksybursztynowym	91,5/7,8/	69,9/5,6/
Karboksyamidometylowana /CAM/
pochodna rpSt	78,0/1,0/	57,4/1,0/
rpST techniczna sena produkcyjna	89,5/16,6/	75,5/30,9/

Przykład XII. Otrzymywanie nadających się do wstrzykiwania mikrokuleczek do pozajelitowego podawania pochodnych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych.

Otrzymywanie nowych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych w zakresie wielkości odpowiednim do włączenia w mikrokuleczki drogą suszenia rozpyłowego przeprowadza się za pomocą rozpuszczenia pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej w rozcieńczonym roztworze wodorotlenku amonowego, a następnie dodanie roztworów pożądanych soli, takich jak benzoesan sodowy. Dodaje się niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak blokowy kopolimer denku etylenu z tlenkiem propylenu i rozpuszcza przy stałym łagodnym mieszaniu. Następnie roztwór suszy się rozpyłowo. Można do tego celu użyć minisuszarki rozpyłowej Buchi model nr 190.Otrzymuje się homogeniczną mieszaninę przygotowanego tak składnika czynnego i dodatków w stopionym tłuszczu,wosku, lub ich mieszaninie i tak otrzymaną mieszaninę rozpyla się przez dyszę rozpylającą powietrze-ciecz wyposażoną w płaszcz grzejny w celu utrzymania dochodzącego powietrza i stopionej fazy w temperaturze powyżej temperatury topnienia. Gdy stopione kropelki ochłodzą się, tworzą się mikrokuleczki, które się zbiera na zestawie sit o żądanym zakresie wielkości otworów około 45 do 180 gm i zachowuje do użycia. Mikrokuleczki o wielkości nie mieszczącej się w pożądanym zakresie zawraca się do procesu. Alternatywnie, homogeniczną mieszaninę podaje się na wirującą tarczę i tak utworzone mikrokuleczki zbiera jak wyżej, lub też stopioną mieszaninę chłodzi i miele do cząstek o średniej wielkości w pożądanym zakresie.

Woski i tłuszcze, które nadają się do użycia mają na ogół temperaturę topnienia wyższą od 40°C. Woski te zdefiniowane są jako niskotopliwa organiczna mieszanina lub związek o wysokiej masie cząsteczkowej, stały w temperaturze pokojowej i na ogół podobny w składzie do tłuszczów i olejów, z tym wyjątkiem, że nie zawierają one glicerydów. Niektóre są węglowodorami, inne estrami kwasów tłuszczowych z alkoholami. Zaliczone są one do lipidów. Woski są termoplastyczne, ale ponieważ nie są polimerami o dużej masie cząsteczkowej, nie uważa się ich za przynależne do grupy tworzyw sztucznych. Wspólnymi właściwościami są: hydrofobowość, wyrównana tekstura, nietoksyczność, brak nieprzyjemnego zapachu i barwy. Są one palne i mają dobre własności dielektryczne. Rozpuszczalne są w większości rozpuszczalników organicznych, nierozpuszczalne w wodzie. Główne typy są następujące:

I. Naturalne

1. Zwierzęce /wosk pszczeli, lanolina, szelak, wosk chiński z owadów/.

2. Roślinne /wosk karnauba, wosk kandella, wosk mirtowy, wosk otrzymywany z trzciny cukrowej przy produkcji cukru/.

3. Mineralne

The Condensed Chemical Dictionary, wyd. 10, str. 1094

Van Nostrand Reinhold Publisher.

/a/ woski kopalne czyli ziemne /ozokeryt, ceryzyna, wosk montana/ b/ woski pochodzące z ropy naftowej /parafina, mikrokrystaliczna/ /gacz parafinowy lub parafina w łuskach/.

II. Syntetyczne

1. Polimery etylenowe i etery - estry polioli /Carbowax, sorbit/.

164 081

2. Chlorowane naftaleny /Halowax/

3. Typu węglowodoru via synteza Fischera-Tropscha.

Tłuszcz można zdefiniować jako ester gliceryny i wyższego kwasu tłuszczowego, takiego jak stearynowy lub palmitynowy. Estry te i ich mieszaniny sa stałe w temperaturze pokojowej i wykazuja strukturę krystaliczna. Przykładowo można wymienić smalec i łój. Nie istnieje chemiczna różnica między tłuszczem a olejem, jedynym rozróżnieniem jest to, że tłuszcze sa stałe w temperaturze pokojowej, a oleje płynne. Termin tłuszcz odnosi się specyficznie do triglicerydów, podczas gdy lipid jest terminem ogólnym, obejmujacym je.

Korzystnie, tłuszczem jest długołańcuchowy C1024- kwas tłuszczowy, alkohol, ester, sól, eter i ich miszanina z mono-, di- lub triglicerydami złożonymi głównie ze stearynianów, palmitynianów, laurynianów, linolenianów, linoleinianów, oleinianów, ich produktów lub mieszanin, przy czym najkorzystniejsze sa spośród nich te, których temperatura topnienia wynosi powyżej 50°C. Tristearynian gliceryny jest najkorzystniejszym tłuszczem. Oprócz tego, nadaja się tu lipofilowe sole kwasów tłuszczowych, takie jak stearynian magnezowy itp.

Mikrokuleczki dysperguje się w farmaceutycznie i farmakologicznie dozwolonym płynie w celu otrzymania środków do podawania pozajelitowego o przedłużonym uwalnianiu. Nośnik jest buforowym układem wodnym lub olejowym. Olej jest to olej roślinny lub zwierzęcy. Korzystnym olejem jest obojętny triglicerydowy tłuszcz płynny. Olejem obojętnym jest taki olej, który nie zawiera resztkowego kwasu. Do nośników odpowiednich do użycia w środkach należa układy wodne, takie jak buforowane roztwory soli, rozpuszczalniki organiczne, takie jak glikole i alkohole, oraz ciecze niemieszajace się z woda, takie jak oleje, w zależności od rozpuszczalności składnika czynnego, który ma być podawany. Otrzymane dane zamieszczone sa w tabeli 1.

Tabela 1

Środki w postaci mikrokuleczek

Środek nr	Podłoże	Pochodne rpST	Dodatki /%/
bufor/środek konserwujący	środek powierzchniowo czynny
1	2	3	4	5
1	GMS	2,5
2		20	-	-
3	GMS/olej sojowy	30	-	-
4	GDS	10	-	-
5		10	Laurynian Na/1,4/	-
6		25	Benzoesan Na/1,6	środek powierzchniowo czynny
7		25	Węglan /wodorowęglan Na/1,3/	B /0,12/ środek powierzchniowo czynny
8	GTS/GDS/19:1/	15		A/0,18/
9		10	Benzoesan Na /0,6/	środek powierzchniowo czynny
10	GTS/GDS/9:1/	10	-	B /0,05/ środek powierzchniowo czynny
11	GTS/wosk pszczeli/9:1/	7,5	-	B/0,1/
12	GTS/GMS/19:1/	15	Benzoesan Na/1,4/	-
13	GTS/olej sojowy/19:1/		7,5	-
14	GMS/wosk karnauba/1:2/	20
15		10	Benzoesan Na /0,8/	-

164 081

Tabela 1 (ciąg dalszy)

1	2	3	4	5
16		10	-	środek powierzchniowo czynny
17		25	Benzoesan Na /0,75/	B /0,05/ środek powierzchniowo czynny
18		25	Benzoesan Na /3,2/	B /0,12/ środek powierzchniowo czynny
19		25		B/0,12/ środek powierzchniowo czynny
20		25	-	B/0,12/ środek powierzchniowo czynny
21		25	Węglan/wodorowęglan Na/1,2/	A /0,48/
22	GTL	33	Benzoesan Na/2,1/	środek powierzchniowo czynny
23	GTS/GDS /12:1/	15	Benzoesan Ca/1,1/	A/0,17/ środek powierzchniowo czynny
24 25	Wosk pszczeli/olej sojowy /2:1/ GTS	30 7,5		A/0,17/
26	GMS/olej sojowy/47,25/24/	25	-	Sorbitan
27		15	-	Monooleinian /3,75/
28	GMS	10	-	POE/23//stearynian//9,0/
29	GMS	20	-	PEG 6000/9,0/
30	GMS	20	-	PEG 6000/4,0/
31	GMS	20	-	PEG 6000 /0,8/
32	GMS	20	-	PEG 400 /distearynian//8,0/
33	GMS	20	-	PEG 400 /distearyman//1,57/
34	GMS	20	-	PEG 15‘4)/distearynian//16,0/
35	Monostearynian glikolu etylenowego	25	-	-

Tabela 2

Preparaty zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej w postaci mikrokuleczek

Pochodna zwierzęcej somatotropiny rekombi- nantowej %	Kwas cholowy %	Rdzeń Kwas deoksycholowy %	Cholesterol %	Cholesterol %	Powłoka Tristearynian gliceryny %	PVP %	Wosk pszczeli %	Fosfatydylocholina %
50	50	-	-	42,5	42,5	5		-
20	80	-	-	42,5	42,5	5	-	-
75	25	-	-	42,5	42,5	5	-	-
50	-	50	-	40	-	5	40	5
20	-	80	-	40	-	5	40	5
75	-	25	-	40	-	5	40	5
50	-	-	50	42,5	42,5	5	-	-
20	-	-	20	42,5	42,5	5	-	-
75	-	-	75	42,5	42,5	5	-	-

164 081

Przykład XIII. Mikrokuleczki z kwasem żółciowym.

Buforowany roztwór pochodnej rpST i kwasu żółciowego rozpyla się w suszarce rozpyłowej Buchi Model 190.10 części tego drobnocząsteczkowego proszku zawiesza się w roztworze 1 części materiałów powłokowych, w chlorku metylenu. Zawiesinę tę suszy się metodą rozpyłową. Powleczone mikrokuleczki zawiesza się przed wstrzyknięciem w odpowiednim nośniku do zawieszania. Te środki opisane są w tabeli 2. Zgodnie z opisem w tabeli 2 otrzymuje się w postaci mikrokuleczek inne przeprowadzone w pochodne lub zmodyfikowane zwierzęce somatotropiny rekombinantowe, w tym zmodyfikowane świńskie, bydlęce, owcze, końskie, ludzkie i ptasie somatotropiny rekombinantowe, w których cysteiny w małej pętli w pozycjach 183 i 191 /184 i 191 w przypadku ludzkich/ zwierzęcych somatotropin rekombinantowych zostały zastąpione alaniną, seryną, kwasem glutaminowym, argininą, lizyną itp.

Przykład XIV. Otrzymywanie implantów zawierających zwierzęcą somatotropinę rekombinantową.

Implanty otrzymuje się za pomocą odważenia wystarczającej ilości rozdrobnionej homogenicznej mieszaniny pożądanej pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej i pożądanych rozcieńczalników. Następnie mieszaninę ściska się w prasie wykrawającej pod ciśnieniem od 6,9-10³ kPa do 34,5-10³ kPa w cylindrycznej matrycy o średnicy 4,76 lub 3,17 mm, względnie tabletkarce obrotowej stosując wymagany stempel i matrycę. Tak otrzymane implanty powleka się następnie albo ulegającymi metabolizmowi, albo nie ulegającymi metabolizmowi powłokami, z wykorzystaniem sposobów postępowania A i B.

Sposób postępowania A. Nie ulegający metabolizmowi polimer silikonowy.

części elastomeru silikonowego, czystego, miesza się szpatułką z 1 częścią utwardzacza na szkle wodnym i następnie odpowietrza się w eksykatorze w ciągu 30 minut. Implanty chwyta się za końce pincetą, obtacza w polimerze silikonowym, umieszcza końcem na folii aluminiowej i utwardza w temperaturze 40°C w ciągu 5 godzin. Jeden, lub obydwa końce obcina się żyletką pozostawiając trzonek powleczonego cylindra.

Alternatywnie, implanty powleka się, przez maczanie, 20 do 40% spoiwem medycznym, sprzedawanym pod znakiem towarowym SiLaSTIC® przez firmę Dow Corning, które zostało zdyspergowane w heksanie, oraz suszy i utwardza w temperaturze 40 do 50°C przez noc przed usunięciem powłoki z jednego lub obydwu końców stanowiących podstawy.

Sposób postępowania B. Powłoki ulegające metabolizmowi.

część polimeru lub kopolimeru rozpuszcza się w 3 do 8 części chloroformu. Każdy implant chwyta się za końce pincetą, zanurza w roztworze polimeru, a następnie odparowuje chloroform w temperaturze pokojowej. Każdy implant powleka się dwukrotnie. Po wysuszeniu powłok przez noc w temperaturze pokojowej, końce z polimerem usuwa się przez obcięcie żyletką, pozostawiając długi cylindryczny trzonek powlekany.

Otrzymywanie implantów

Pochodna świńskiej somatotropiny rekombinantowej %	Stearynian magnezowy %	Etyloceluloza %	Wosk. rącznikowy %
50	-	5,0	45
40	-	5,0	50
20	-	5,0	75
50	0,5	3,5	46
20	0,5	3,5	76
Pochodna rpST	Cholesterol	Środek	Tristearynian
%	%	powierzchniowo czynny %	gliceryny %
30	68	2
15	41,5	2	41,5

164 081

Pochodna rpST	Kwas stearynowy
%	%
50	50
20	80

Alternatywnie, rpST lub inne zwierzęce somatotropiny rekombinantowe miesza się ze środkami powierzchniowo czynnymi, buforowanymi roztworami soli i/lub środkami konserwującymi w roztworze wodnym. Roztwór ten następnie suszy się metodą rozpyłową w suszarce rozpyłowej Buchi Model 190, w wyniku czego otrzymuje się proszek o małej wielkości porów. Proszek ten miesza się następnie z tłuszczem lub woskiem w stanie stopionym i formuje w cylindryczne implanty. Implanty otrzymane jak wyżej powleka się następnie albo ulegającym metabolizmowi, albo nie ulegającym metabolizmowi polimerem z zastosowaniem sposobu postępowania A lub B.

Preparaty implantów

Pochodna rpST %	Tristearynian gliceryny %	Benzoesan sodowy %	Środek powierzchniowo czynny %
28	69,9	2,0	0,15
15	82,9	2,0	0,15
50	48,5	1,5	0

Przykład XV. Otrzymywanie implantów przy zastosowaniu /Cam-Cys 183,191/rpST i ocena tych implantów na podstawie rozpuszczalności in vitro.

Do 1,3 ml CH2O2 dodaje się 92,4 mg kopolimeru glikolidu z laktydem, 5,3 g niejonowego blokowego kopolimeru tlenku etylenu z tlenkiem propylenu sprzedawanego przez firmę BASF Wyandottee Corp. jako pluronic 127 o średniej masie cząsteczkowej 12500, temperaturze topnienia 56°C, lepkości metodą Brookfielda 3100 /cps/³⁵, 5,3 mg/200 mesh mg/OH/2 i 74,6 mg sproszkowanej /Cam- Cys 183, 191/ rpST. Mieszaninę miesza się, wylewa na płytkę Petri’ego o dużej powierzchni i dopuszcza do odparowania CH2O2 w temperaturze pokojowej, a następnie suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Zbiera się wysuszoną pozostałość i formuje w implanty o średnicy 3,17 mm stosując prasę wykrawającą przy około 6,9-103 kPa. Tak utworzone implanty o wadze 60 do 70 mg każdy oznacza się I-1.

Drugi zestaw implantów otrzymuje się przez zmieszanie ze sobą w mikserze 128 g sproszkowanego wosku rącznikowego /-270 mesh/ i 32 mg sproszkowanej /Cam-Cys 183, 191/rpST. Tak otrzymaną mieszaninę formuje się następnie w cylindryczne implanty o średnicy 3,17 mm w sposób powyżej opisany. Tabletki ważą 60 do 70 mg każda i oznacza się je I-2.

Trzeci zestaw implantów otrzymuje się także powyższymi sposobami postępowania stosując 96 mg /-270 mesh/ wosku rącznikowego i 64 mg sproszkowanej /Cam-Cys 183, 191/ rpST. Cylindryczne implanty o średnicy 3,17 mm otrzymane jak powyżej opisano ważą 60 do 70 mg i oznacza się je I-3.

Tak otrzymane implanty poddaje się następnie ocenie rozpuszczalności in vitro. Każdy z implantów umieszcza się w oddzielnej probówce z tworzywa sztucznego zawierającej 10 ml buforu fosforanowego o pH 7,4 /z 0,05% azydkiem sodowym/ i probówki umieszcza w stojaku wstrząsanym w wodzie, gdzie probówki są wstrząsane, podczas gdy temperaturę wody w urządzeniu utrzymuje się na poziomie 39°C. Probówki wstrząsa się w ciągu jednego dnia, a następnie z każdej pobiera się roztwór i analizuje pod względem rpST za pomocą HPLC, a następnie roztwór odrzuca. Dodaje się nowy bufor fosforanowy do każdej probówki i wstrząsa je po tym w ciągu trzech dodatkowych dni. Roztwór z każdej probówki znowu analizuje się pod względem rpST za pomocą HPLC i znów odrzuca. Nowy bufor fosforanowy znowu dodaje się do każdej probówki i ponownie je wstrząsa w ciągu trzech dni, po czym znowu analizuje pod względem rpST.

164 081

Implanty użyte w tych oznaczeniach są opisane poniżej wraz z otrzymanymi wynikami. Bufor fosforanowy stanowi 3,45 g NaH2PO4.H2O, 3,55 g Na2HPO4, 9,5 g NaCl, rozpuszczone w wodzie destylowanej do łącznej objętości 1000 ml.

Otrzymywanie i oznaczenia implantów

rpST w implancie Pochodzenie implantu	Waga implantu	Teoretycznie mg
I-1	69,6 mg	29,23 mg
I-2	68,7 mg	28,85 mg
I-3	62,8 mg	12,56 mg
I-4	63,3 mg	12,66 mg
I-5	66,8 mg	26,72 mg
I-6	66,2 mg	26,48 mg

Wyniki rozpuszczania in vitro

Objętość środowiska do którego następowało uwalnianie /ml/	Dzień	I-1 Dimer %	I-2 Dimer %	I-3 Dimer %	I-4 Dimer %	I-5 Dimer %	I-6 Dimer %
10	-	początek	początek	początek	początek	początek	początek
10	1	1,59 /niski/	1,184 /1,3%/	0,485 /niski, niemierzalny	0,499 /niski, niemierzalny	1,605 /niski/	1,570 /niski/
10	4	0,417 /niski/	0,459 /1,7%/	0,063 /niski/	0,068 /niski/	0,136 /niski/	0,140 /niski/
10	7	0,044 /niski, niemierzalny/	0,038 /niski, niemierzalny/	0,007 /niski, niemierzalny/	0,007 /niski, niemierzalny/	0,019 /niski, nizmletralnz/	0,019 /niski, niemierzalny/

Kumulatywne uwalnianie rpSt

I-1 + I-2

Dzień	Kumulatywnie Uwalnianie /mg/	Kumulatywnie % początkowo uwalnianej
1	11,72	40,4%
4	16,10	55,4%
7	16,51	56,9%
I-3+ I-4
1	4,92	39,02%
4	5,58	44,25%
7	5,65	44,81%

164 081

I-5 + I-6
1	15,88	59,7%
4	17,26	64,89%
7	17,45	65,6%

Przykład XVI. Otrzymywanie zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej w postaci mikrokapsułek.

0,85 g kopolimeru glikolidu z laktydem rozpuszcza się w 29,8 g chloroformu i zawirowuje w ciągu 2 minut. Następnie, do roztworu polimeru w chloroformie dodaje się 0,150 g pochodnej świńskiej somatotropiny rekombinantowej /Cam-Cys 183, 191/rpST, która została przesiana na sucho przez 25 pm sito ze stali nierdzewnej i zawirowuje w ciągu 3 minut. Powstałą zawiesinę białkową wprowadza się następnie do 50 ml kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło mechaniczne. Szybkość mieszania nastawia się na 700 obr/min w temperaturze otoczenia. Dodatkowych 3,2 g chloroformu używa się do przemycia wyjściowego naczynia. Całkowita ilość chloroformu wynosi po tym 32,95 g. Następnie dodaje się 350 oleju silikonowego /13,1 g w okresie 8 minut/ w celu wytrącenia kopolimeru glikolidu z laktydem. Następnie zawartość kolby przenosi się do 1720 g heptanu przy mechanicznym mieszaniu w 4-litrowej kolbie. Po upływie 3 godzin utwardzone mikrokuleczki sączy się przez zestaw sit ze stali nierdzewnej i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem.

Inne polimery i rozpuszczalniki, użyteczne przy otrzymywaniu w postaci mikrokapsułek zmodyfikowanych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych, w których cysteinowe reszty aminokwasowe w pozycjach 55,166, 183 lub 191 zostały zastąpione resztą innego aminokwasu albo somatotropin rekombinantowych przeprowadzonych w pochodną, w których jeden lub obydwa mostki disulfidowe między cysteinami w pozycjach 55 i 166 lub w pozycjach 183 i 191 zostały zredukowane i przeprowadzone w pochodną, zostały wyliczone poniżej.

Przy wyliczaniu materiałów zamieszczonych poniżej użyto następujących skrótów:

A = jako próbka spolimeryzowana

B = próbka ponownie wytrącona gly = glikolid lact = laktyd capro = kaprolakton TMC = węglan trimetylenu PHB = polihydroksymaślan PHV = polihydroksywalerian PEO = polioksyetylen.

Polimery użyteczne przy otrzymywaniu w postaci mikrokapsułek zmodyfikowanych i przeprowadzonych w pochodną zwierzęcych somatotropin rekombinantowych

Polimer	Ninh /Rozpuszczalnik/	Środki /% wag/
1	2	3
Gly/dl-laktyd	0,36A /HFIP/	43,6/56,4A
Gly/dl-laktyd	0,52A/HFIP/	42,4/57,4A
Gly/dl-laktyd	0,63b /HFIP/	43,3/56,7B
Gly/dl-laktyd	0,66B /HFIP/	41,2/58,8B
Gly/dJ-laktyd	0,6fA/HFIP/	41,6/58,4A
Gly/dl-laktyd	0,22B /HFIP/	41,5/58,5B
Gly/dl-laktyd	0,26B /HFIP/	40,6/59,4B
Gly/dJ-laktyd	0,27B/HFIP/	40,7/59,3B
Gly/L-lact	0,2B /CHCl3/	48/52B
dl-lact	0,46B /HFIP/	10()B

164 081 ciąg dalszy

1	2	3
dl-lact	0,27b /HFIP/	10(0*
PHB	2,92a /HFAS/	100A
PHB/HV	3,27a /HFAS/	70/30A
Capro/l-lact	0,45A /CHCl3/	84,6/15,4A
Capro/l-lact	0,46* /CHCl3/	84,0/16^
Capro/l-lact	0,51A/CHCl3/	85,2/14,8A
Capro/l-lact	0,50A /CHCl3/	84,4/15,óA
Capro/l-lact	0,39A /CHCl3/	85,1/14,S»a
Capro/l-lact	0,36A /CHCl3/	86,1/13,9A
Capro/l-lact	0,31B/CHCl3/	11.4/88^
Capro/gly	0,34A /CHCl3/	84,0/16^
gly/PEO 8000/TMC	0,33B /CHCl3/	50,3/8,4/41^
gly/PEO 8000/TMC	0,38B /CHCl3/	58,2/4,8/37,0^
gly/dl-laktyd/ PEO 8000	0,35B /CHCl3/	35,8/54,4/9,8B
l-lact/TMC	0,26B /CHCl3/ 0,23B /CHCl3/	85,4/14,6B 69/3^

AJ = jako próbka spokmeryzowana

B/ = próbka ponownie wytrącona.

Przykład XVII. Test na szczurach pozbawionych przysadki w celu określenia przyspieszenia wzrostu zwierząt otrzymujących zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną zwierzęce somatotropiny rekombinantowe.

Efektywność różnych zmodyfikowanych /z podstawieniem/ lub przeprowadzonych w pochodne zwierzęcych somatotropin rekombinantowych w zmienianiu szybkości wzrostu zwierząt określa się wykorzystując test na szczurach pozbawionych przysadki /hypox/. Szczur pozbawiony przysadki nie wytwarza swego własnego hormonu wzrostu i jest wrażliwy na wstrzykiwany bydlęcy hormon wzrostu. Mierzoną odpowiedzią jest wzrost w ciągu okresu czasu takiego jak 10 dni.

Każdemu z pozbawionych przysadki szczurów albinosów /otrzymanych z Taconic Farms, Sprague Dawley/ wstrzykuje się wystarczającą ilość środków otrzymanych jak w przykładzie XX w celu zapewnienia 10-dniowej dawki 800 gg/80 gg /dzień/ świńskiego hormonu wzrostu w 0,2 ml preparatu, jak wyszczególniono. Alternatywnie, każdemu z pozbawionych przysadki szczurowi albinosowi wstrzykuje się codziennie 80 μg pochodnej świńskiego hormonu wzrostu.

Przed przeprowadzeniem testu zwierzęta waży się i wybiera na podstawie wagi takie zwierzęta, których ma się użyć. Wybiera się tylko te zwierzęta, których waga ciała mieści się w jednym odchyleniu standardowym od średniej wagi ciała w grupie. Następnie utworzoną grupę losowo dzieli się na grupy, na które się działa, składające się z 8 szczurów/grupę na podstawie tworzonego za pomocą komputera sposobu postępowania losowego. Następnie zwierzęta przenosi się do czystej klatki utrzymując cztery szczury/klatkę. Pierwszego dnia badań zwierzęta testowe waży się i wszystkie, które wykazują nadmiar lub niedobór wagi /± 5 g/ odstawia się. Zwierzęta następnie przydziela się do grup testowych i poddaje działaniu.

Na koniec 10-dniowego okresu badań rejestruje się całkowity przyrost wagi każdego zwierzęcia i dla każdego działania określa średni przyrost wagi na szczura. Wyniki tych eksperymentów, które podsumowano w poniższej tablicy, wykazują aktywność użytych pochodnych. Dane dotyczące szczurów pozbawionych przysadki.

164 081

Pochodna	Wzrost /gi
0 - 2 dni	2 - 4 dni	4 - 7 dni	7 - 10 dni	Całkowity
rpST	7,5	5,6	6,8	10,1	30
/Cam-Cys 183, 191/rpST	7,6	5,3	8,4	8,4	29,7
/Sulfido-Cys 183, 191/ rpST	8,9	4,8	11,1	8,1	32,9
/Ala 183, 191/rpST	7,1	6,3	9,3	6,5	29,2
/SCH3-Cys 183, 191/rpST	7,0	6,4	6,9	9,5	29,8
/S-CH2COO‘-Cys 183, 191/rpST	5,9	5,6	9,1	7,9	28,5
/S-CH2CH2SO3-Cys 183, 191/rpST	6,9	5,3	6,8	9,0	28,0

Z powyższych danych staje się widoczne, że każda ze zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną świńskich somatotropin rekombinantowych jest biologicznie aktywna i zapewnia doskonały wzrost zwierząt.

Przykład XVIII. Ocena świń otrzymujących przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropinę rekombinantową pod względem tuszy.

Świnie hoduje się w indywidualnych przegrodach. Początkowa waga świń wynosi około 60 kg. Świnie przeznacza się do uboju przy średniej żywej wadze 100 kg. Wstrzykiwanie środków testowych przy podstawie ucha rozpoczyna się po upływie 4-dniowego okresu przygotowawczego. Świnie karmi się standardową Cy Hog ration do woli, wodę także dostarcza się do woli.

Osiągi wzrostu określa się przyjmując tydzień jako podstawę. Zbiera się następujące dane: średni przyrost dzienny, średnie dzienne pobranie paszy i wydajność paszy.

Po przyroście około 40 kg świnie poddaje się ubojowi i ocenia tusze. Przy uboju zbiera się następujące dane: waga ciepłej tuszy, waga mięśnia półścięgnistego, waga narządów /wątroba, nerki, serce/ i waga tłuszczu otaczającego wnętrzności. Po upływie 24 godzin schładzania rejestruje się wyniki następujących pomiarów: długość tuszy, głębokość tłuszczu grzbietowego /pierwsze żebro, ostatnie żebro, ostatni krąg lędźwiowy, trzyćwierciowa głębokość przy dziesiątym żebrze, P-2/, grubość boczku, powierzchnia oczka polędwicy, barwa,jędrność, marmurkowatość i nacięcie mięśnia.

W tych ocenach kontrola negatywna otrzymuje codzienne wstrzyknięcia roztworu soli, CAM-rpST stanowi /Cam-Cys 183, 191/rpST opisaną w przykładzie VII powyżej i kontrola pozytywna otrzymuje codzienne wstrzyknięcia natywnej PST. Ocena tuszy /Cam-Cys 183, 191/rpST.

Sześć świń /na jedno działanie/ hoduje się indywidualnie i poddaje odpowiedniemu działaniu od 44 do 94 kg żywej wagi. Wzrost i wybrane dane dotyczące tuszy przedstawione są poniżej wraz z obliczeniem względnej efektywności. Wpływ karbamidometylowanej-rpST /Cam-rpST/ na osiągi wzrostu i wybrane cechy charakterystyczne tuszy świni po obróbce wykańczającej /średnie liczone metodą najmniejszych kwadratów/.

Kryterium	Kontrola negatywna	CAM-rpST	Kontrola pozytywna
1	2	3	4
Średni przyrost dzienny /kg/	0,99	1,07	1,09
Średnie dzienne pobranie paszy w /kg/	3,11	3,03	2,75
Przyrost /pasza	0,32	0,35	0,40
Wątroba, /g/	1726,1	1892,8	2085,5
Tłuszcz otaczający wnętrzności	762,4	765,5	563,3

164 081

1	2	3	4
Tłuszcz grzbietowy przy dziesiątym zebrze /cm/	2,22	2,00	1,88
Tłuszcz grzbietowy P-2 /cm/	1,80	1,50	1,45
Waga mięśnia półścięgmstego /g1	359,5	353,1	387,9
Powierzchnia oczka polędwicy /cm2/	38,6	39,0	39,6

Przykład XIX. Eksperymenty dotyczące bilansu azotowego prowadzone z /Cam-Cys 183, 191/rpST.

Świnie hoduje się w indywidualnych klatkach ze stali nierdzewnej do pomiaru metabolizmu. Wstrzykiwanie przy podstawie ucha zaczyna się wtedy, gdy świnie wprowadza się do klatek. Świniom pozwala się na pięciodniowy okres czasu przystosowania się do nowego otoczenia. Podczas tego okresu rejestruje się pobranie paszy i doprowadza do tego, że wszystkie świnie konsumują tę samą ilość paszy każdego dnia /Cy Hog ration, 18% surowego białka/. Zbieranie kału i moczu zaczyna się po upływie co najmniej trzech dni stałego przyjmowania. Świnie karmi się równymi ilościami paszy dwa razy dziennie, a wodę dostarcza się do woli.

Całkowity kał i mocz zbiera się dla pięciu dni /zbieranie przeprowadza się każdorazowo rano/. W celu zmniejszenia utraty azotu dodaje się 35 m16N HCldo wiader z tworzywa sztucznego do zbierania moczu na początku fazy eksperymentu polegającej na zbieraniu i po każdorazowym dziennym zbieraniu. Zwraca się uwagę na uniknięcie każdej możliwej straty moczu. Zebrany mocz rozcieńcza się do stałej, rejestrowanej objętości, następnie dzieli na 50 ml próbki zaopatruje w oznaczenia i zamraża aż do analizy. Kał zbiera się codziennie, umieszcza w woreczkach ze sztucznego tworzywa z oznaczeniami i zamraża aż do analizy. Zbiera się też resztki, waży i zamraża. Małe próbki paszy pobiera się codziennie, zamraża i puluje przed analizą.

Próbki paszy i kału suszy się przez noc w temperaturze 100°C, albo dłużej w temperaturze niższej. Wysuszone próbki paszy i kału rozdrabnia się za pomocą młynka Wiley i pozostawia na 2 dni do zrównoważenia powietrzem. Oznacza się suchą masę i zawartość N w paszy i kale. Wszystkie próbki analizuje się pod względem zawartości azotu stosując zautomatyzowaną metodę Kjeldahla. Mocz analizuje się i określa całkowite dzienne wydalanie azotu w moczu. Z wyjątkiem moczu, wszystkie wartości N wyrażane są w oparciu o suchą masę.

Wagę świni rejestruje się pierwszego dnia przystosowywania się, pierwszego dnia zbierania i przy zakończeniu fazy zbierania. Zapewnia to, że świnie mają dodatni bilans energetyczny.

Bilans azotowy.

Ocena CAM-rpST w badaniu bilansu azotowego dotyczy ogółem 12 rosnących świń przy trzech sposobach działania: 1/ kontrola negatywna/codzienne wstrzykiwanie roztworu soli/, 21 CAM-rpST, 3 mg/dzień, oraz 3/ kontrola pozytywna, 3 mg natywnej pST. Kał i mocz zbiera się w ciągu 7 dni po upływie 2-tygodniowego okresu przystosowywania się. Wyniki i obliczenia aktywności względnej są następujące: Wpływ karbamidometylowanej rpST /CAM-rpST/ i natywnej pST na bilans azotowy rosnących świń.

Kryterium	Kontrola negatywna	CAM-rpST	Kontrola pozytywna
Pobieranie azotu /g/dzień/	41,86	41,36	41,83
Wydalanie azotu /g/dzień/
Kał	5,25	5,21	4,65
Mocz	23,06	16,74	15,12
Azot zaabsorbowany /g/dzień/	36,61	6,15	37,18
Strawność azotu /%/	87,46	87,43	88,88
Retencja azotu /g/dzień/	13,56	19,41	22,06
Średni przyrost dzienny /g/	328,6	383,9	401,8

CAM-pST = /Cam-Cys 183, 191/rpST.

164 081

Przykład XX. Otrzymywanie pasty przy zastosowaniu /Cam- Cys 183, 191/rpST.

Otrzymuje się mieszaninę/Cam-Cys 183,191/rpST zawierającą 7% wag/wag benzoesanu sodowego i 0,5% wag/wag kopolimeru blokowego denku etylenu z denkiem propylenu stosując sposób postępowania z suszeniem rozpyłowym opisany w przykładzie XIII.

Tak otrzymaną mieszaninę, w ilości 7,28 g, dodaje się przy mieszaniu do roztworu 19,5 g tristearynianu gliceryny w 71 ml 4/1 wag/wag mieszanina trigHcerydów kwasów: oktanowego, dekanowego, dodekanowego i heksanowego /Miglyol® 813/3/ olej sojowy, w temperaturze 75-80°C. Mieszaninę miesza się w temperaturze 75- 80°C aż stanie się ona homogeniczna, a następnie chłodzi. Utworzony w wyniku tego środek składa się /wagowo/ z 6,96% /Cam- Cys 183, 191/rpST, 0,51% benzoesanu sodowego, 0,03% środka powierzchniowo czynnego /kopolimer blokowy/ i 73,0% nośnika. Podaje sie go na ogół zwierzętom przez wstrzyknięcie podskórne, pod skórą tych zwierząt w regionie głowy lub karku.

Przykład XXI. Otrzymywanie lepkiego środka żelowego nadającego się do wstrzykiwania, zawieraJącego/AlarCys 183, 191/rpST.

Do 140 g wysoko oczyszczonego oleju sojowego w zlewce dodaje się 12 g monostearynianu glinowego. Mieszaninę miesza się do jednorodności i ogrzewa w ciągu 30 minut do około 140°C, gdy zachodzi oczywiste rozpuszczenie się monostearynianu w oleju sojowym. Zlewkę usuwa się z grzejnika i pozwala ochłodzić do temperatury około 60°C. Następnie dodaje się przy mieszaniu 2,66 g /Ala-Cys 183, 191/rpST wysuszonej metodą rozpyłową w celu otrzymania jednolicie rozdzielonej zawiesiny. Lepką mieszaninę napełnia się 30 ml strzykawki jednorazowego użytku. Objętością wykorzystaną do napełnienia każdej strzykawki jest 20 ml i objętość ta zawiera 350 mg / Ala-Cys 183, DUrpST. Po napełnieniu strzykawek żelową mieszaniną ścina się ona w kremowy, sztywny, ale dający się wycisnąć żel. Zapakowane strzykawki przechowuje się następnie w lodówce przed użyciem.

Przykład XXII. Otrzymywanie pasty z użyciem /Ala-Cys 183, 191/rpST.

4,18 g oleju sezamowego i Gelucire 46/07 /Cattlefosse - 0,74 g/ miesza się w pojemniku szklanym za pomocą bagietki. Następnie, przy mieszaniu, ogrzewa się do temperatury 65°C aż do jednorodności. Bagietkę wyjmuje się i dodaje 0,052 g /Ala-Cys 183, 191/ rpST, w celu utworzenia środka.

Przykład XXIII. Otrzymywanie /Ala-Cys 183, 191/rpST w połączeniu z cynkiem i zawierającej ją pasty.

/Ala-Cys 183, 191/rpST rozpuszcza się w 0,09 M Tris w stężeniu 21,5 mg rpST/ml, w temperaturze 40°C, pH 9,5. Przeprowadza się ją w sól cynkową za pomocą dodania, przy mieszaniu, 1M ZnCk. Wytrąca się sól cynkowa. Odzyskuje się ją za pomocą odwirowania przy 10000 x g w ciągu 30 minut przy utrzymywaniu temperatury roztworu 40°C. Liofilizuje się ją z uzyskaniem proszku. Do 140 g oleju sezamowego w zlewce dodaje się 12 g monostearynianu glinowego. Zawartość ogrzewa się przy mieszaniu w temperaturze 153°C aż do rozpuszczenia się monostearynianu. Zlewkę usuwa się z grzejnika i pozwala się ochłodzić. W trakcie chłodzenia roztwór przechodzi w żel. Żel ten wprowadza się do młyna kulowego wyposażonego w wysoko ścinający mieszalnik i kule ze stali nierdzewnej. W młynie obniża się ciśnienie i powoli dodaje cynk w proszku aż do uzyskania jego zawartości w środku wynoszącej 40%. Mieszanie kontynuuje się aż do zmniejszenia przeciętnej średnicy cząstek cynku do wielkości poniżej 10 gm. Kule ze stali nierdzewnej usuwa się z żelu, a ten wprowadza się do strzykawek.

Szczepy DNA przytaczane w poprzedniej części niniejszego opisu zostały zdeponowane w ATCC 23 sierpnia 1988. Były to: mp11pSTE 34/ATCC nr 40482/, pRO211 /ATCC nr 40483/ o pig24/ATCC nr 40484/. Fachowcy zdadzą sobie sprawę z tego, że te DNA można wprowadzić do każdego odpowiedniego układu ekspresyjnego w celu otrzymania somatotropin lub ich postaci zmutowanych.

Bakteryjne szczepy E. coli K12 wykazujące ekspresję pewnych nowych somatotropin zwierzęcych wytwarzanych sposobem według wynalazku również zostały zdeponowane w ATCC 23 sierpnia 1988. Te bakteryjne szczepy obejmują szczep E. coli 1655 /ATCC nr 67762/, 1655/pROpSTA34 /ATCC nr 67763/, 1655/pROpSTE34 /ATCC nr 67764/, 4200 /ATCC nr 67766/, 4200/pROpSTA34 /ATCC nr 67767/, 4200/pROpSTE34 /ATCC nr 67768/, 420/pROpST /ATCC nr 67769/, 4255 /ATCC nr 67770/, 4255/pROpSTA34 /ATCC nr 67771/,

164 081

4255/pROpSTE34 /ATCC nr 6ΊΊΊ2Ι,4255/pROpST /ATCC nr 67773/, 4300 /ATCC nr 67774/, 1655/pROpST nr 67765/.

pROpST-SXAK182UAG /ATCC 68056/ zdeponowano 14 lipca 1989. pROpSTSXC183, 191del /ATCC 68057/ zdeponowano 14 lipca 1989.

Przykład XXIV. Usuniecie cystein z wiazania disulfidowego małej pętli z zastosowaniem 2 syntetycznych oligonukleotydów.

Syntetyczny oligonukleotyd oznaczony C183del ma sekwencję następujaca:

5’CGG GTC ATG AAG AGA CGC TTC GTG GAG 3’.

Oligonukleotyd ten różni się od analogicznej sekwencji DNA genu rpST pod dwoma względami. Po pierwsze, DNA kodujacy kodon cysteiny w pozycji 183 jest w oligonukleotydzie usunięty. Po drugie, DNA kodujacy kodon argininy w pozycji 184 jest zmieniony z CGC w AGA w oligonukleotydzie, przy czym ten ostatni także koduje argininę. Tak więc, cysteina obecna w pozycji 183 zostaje usunięta.

Jednoniciowy DNA pGEMr3z/f+/pST-SX jest Substratem mutagenezy. Ten DNA jest złożony ze zmodyfikowanego genu rpST, zawartego w handlowo dostępnym fagemidzie, pGEM-3z/f+/. Modyfikacja genu rpST powoduje zmianę sekwencji DNA pozwalajaca na wprowadzenie miejsca rozszczepiania endonukleazy restrykcyjnej SacI w pozycjach 225-230 regionu kodujacego i wprowadzenie miejsca rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej XbaI w pozycjach 285-290. Te zmiany w sekwencji DNA nie zmieniaja sekwencji aminokwasów białka rpST. Fragment EcoRI/ Hind III rozszczepiony tymi endonukleazami restrykcyjnymi przy zastosowaniu standardowych sposobów postępowania daje w rezultacie fagemid pGEM3z^f+/pST-SX. Jednoniciowy dNa pGEM-3z/f+/ otrzymuje się z oczyszczonego faga zgodnie ze zwykłymi protokołami. 2000 ng tego DNA miesza się ze 10 ng oligonuklotydu C183del, przy czym ten ostatni został uprzednio fosforylowany na swoim końcu 5’ z użyciem 5’- trifosforanu adenozyny i kinazy polinukleotydowej. Mieszanina zawarta jest w całkowitej objętości 10 μi 1x buforu do łaczenia / 1x bufor do łaczenia stanowi 75 mM KCl i 5 mM Tris-Cl, pH 8,0/. ieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciagu 7 minut, z następujaca następnie 10-minutowa inkubacja w temperaturze pokojowej. Ten sposób postępowania pozwala na połaczenie oligonukleotydu z jednoniciowym DNA stanowiacym substrat. Połaczone czasteczki przeprowadza się w kowalencyjnie zamknięty, dwuniciowy DNA dodatkiem 22 μΐ H2O, gl 20 mM ATP, 2 jednostek ligazy DNA T4 i dużego fragmentu polimerazy DNA I / co do definicji jednostki patrz katalog New England Biolabs, 1986/, 2 gl 20x dNTP /mieszanina czterech 5’-trifosforanów deoksyrybonukleotydów, każdy w stężeniu 2 mM/ i 4 gl 10x buforu uzupełniajacego /1x bufor uzupełniajacy stanowi 27,5 mM Tris-Cl, pH 7,5,15 mM MgCh, 2 mM DDT/. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, połowę mieszaniny reakcyjnej wprowadza się do kompetentnych komórek HB101 zgodnie ze zwykłym protokołem transformacji. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C kolonie przenosi się na filtry nitrocelulozowe i przeprowadza hybrydyzację przez wykrycie pożadanej mutacji z wykorzystaniem promieniotwórczego znakowania odpowiedniego końca 5’ za pomoca [y-pj-AlP i kinazy oligonukleotydowej. Poupływie 3 godzin prehybrydyzacji w 37°C w 5x SSC, 1x roztworze Denhardta i 150 gg/ml drożdżowym tRNA, dodaje się promieniotwórczo znakowany oligonukleotyd i dopuszcza się do jego hybrydyzacji z DNA na filtrach przez noc w temperaturze 37°C w 5x SSC, z następujacym potem 30-minutowym przemyciem w TAC w temperaturze 61,5°C. Podczas tego ostatniego przemycia tylko te kolonie, których plazmidowy DNa zawiera pożadana mutację, będa kontynuować hybrydyzację z promieniotwórczo znakowana sonda oligonukleotydowa. Kolonie te wykrywa się po ekspozycji przemytych filtrów na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X. Plazmidowy DNA otrzymuje się z kilku spośród tych kolonii z wyjściowej płytki Petri’ego, wprowadzonych do kompetentnych komórek HB101, jak uprzednio opisano i poddanych ponownemu screeningowi z promieniotwórczo znakowana sonda oligonukleotydowa, jak powyżej. Plazmidowy DNA otrzymuje się z kolonii, których DNA hybrydyzuje z sonda i analizuje pod względem pożadanej sekwencji DNA. Wszystkie analizowane klony zawieraja mutacje C18del. Plazmidowy DNA z jednego klonu oznaczonego pGEM- 3z/f+/pSTrSXC183del wprowadza się do kompetentnych komórek JM101 na drodze transformacji i jednoniciowy DNA otrzymuje się z oczyszczonego faga pochodzacego z pojedynczego transformanta.

164 081

W celu usunięcia DNA kodującego cysteinę w pozycji 191, syntetyzuje się następujący oligonukleotyd oznaczony c 191 del:

5' TTC GTG GAG AGC TCG TTC TAG TTG 3'.

Ten oligonukleotyd różni się od analogicznego DNA genu rpST pod dwoma względami. Po pierwsze, DNA kodujący kodon cysteiny w pozycji 191 jest usunięty z oligonukleotydu. Po drugie, DNA kodujący serynę 190 jest zmieniony w TCG w oligonukleotydzie, przy czym ten ostatni także koduje serynę.

DNA-matrycę z jednoniciowzgo DNA z pGEM-3r/f+/pST-SXC183dzl i oligonukleotyd C191 del łączy się, wydłuża i liguje jak uprzednio. Mieszaninę wprowadza się do kompetentnych komórek Ha101 i transformanty analizuje pod względem obecności mutacji dokładnie tak, jak to opisano w przypadku C183del. Oligonukleotyd C191del używa się jako promieniotwórczo znakowanej sondy wykrywającej. Warunki hybrydyzacji i przemywania są dokładnie takie, jak opisano dla C183del. Kilka klonów zawierających mutację C183del identyfikuje się na podstawie analizy sekwencji DNA. Plazmidowy DNA z usunięciem C183 i C191 jest oznaczony pGEM-3z-/f+/-pST- SXC183, 191del.

164 081

FIG. 1

ECoRI

Hind Ili

pRO 211

EGoRI

M 13mp1lpSTA 3Ó-RFDNA przeciąć ECoRI i Hind III oczyscic fragment zawierający gen pST przeciąć ECoRI i Hmd ΙΠ

2.fosfataza alkaliczna z jelita cielęcia

Soczyście duży fragment

2. transformować E.Coli N99cL⁺

3. wyselekcjonować ampR

Uigować

Hindlll

ECoRI pROpSTA 3A

164 081

ECoRI

HindlD

M13 mflpST-jednoniciowy DNA

1.połączyć z oGgonukleotydami 5¹ GTC ATG AAG GAA CGC CGC TTC , 3' GLU 3

5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 31 GLU 4

2.65°C.7min

3. temperatura pokojowa 10 min

GLU 4

CAG TAC TTCACAGCG GCGAA3CACCTC TGG TCG

GCC TTC TAG Poligonu kleotydy

A3A ĆGG AA3 ATCL_____ dNTP ATP

E.COLI DNA polimerąza DNOI E.Coli, duży fragment ligaza DNA TA

FIG. 2 (i

164 081

transformować E.Coli JM 101

2. poddać screeningowi tysmki przez hybrydyzację albo z GLU 3 znakowanym 32p albo z GLUó znakowanym 32_p

3. przeprowadzić sekwencjono wame DNA tysinek hybrydy zujących z obydwoma oligonukleotydami

GLU

GTC ATG AAG GAA CGC OGC TTC GTG GAG AGC AGC

FIG. 2 (2)

164 081

Sskwencja DNA pST i warianta p STA 34

Cys

191

Cys

183

PST PSTA34

c Ala

G 191

G c Ala

G 183

FIG. 3

164 081

ECoRl ^Hind lii

M 13mp11pST-jedncniciowy DNA

l.potączyć z oligonukleotydem 5^ GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG

2.65°C_ł7min β1

3.temperatura pokojowa j 10 min.

GCG GC

GTC ATG AAG CGC CGC TTC GTC GAG AGC ACę GAG TAC T TĆ ACAGĆG GÓG AA3ĆZĆCTC TĆG TĆG AC

T GCC TTC TAG 3¹ oligonukleotydy ’

A CGG AAG ATĆ___

5’tagowy DNA

^SryHindlll dNTP, ATP

E.Coli polimerąza DNA E.Coli duży Iragment; ligaza

DNA K

ECoRl

Hind III il.transformować E.Coli JM 101

2.poddać screemngowi łysin ki przez hybrydyzację z AA1 D znakowanym 32 sekwencjonować DNA ^μ

FIG. 4 (i

164 081

ALA

GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC GYS

AGC TGT GCC TTC TAG

ECoRI

Hind ID

M 13 mp 11 p STA 3

FIG. 4 (2)

164 081

Hind III Hind ΙΠ

Hind III

ECoRl pEFF-902

M13mp11 -RFDNA

ECoRl

HindIII oczyścić fragment zawierający gen pST

ECoRl Hind III fosfataza alkaliczna z jelita cielęcia oczyścić duży fragment

M 13 mp 11 p ST -RFDNA

FIG. 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej, znamienny tym, że utlenia się cztery spośród cysternowych reszt aminokwasowych zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej do kwasu cysternowego.