DD221905B1 - Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des optisch-aktiven L(-)- bzw. R(-)-Carnitins aus einer optischinaktiven Vorstufe.
U-)-Carnitin (3-Hydroxy-4-trimethylaminobutyrat) ist ubiquitär im Tierreich verbreitet und auch in Pflanzen nachgewiesen worden. Es spielt bei der Oxidation von langkettigen Fettsäuren in den Mitochondrien eine entscheidende Rolle. Die Energiegewinnung aus der Hauptenergiereserve der Säugetiere und des Menschen, den langkettigen Fettsäuren, via mitochondria Ie/3-Oxidation ist an das Vorhandensein von L(-)-Carnitin gebunden. Die innere Mitochondrienmembran ist für die aktivierten Fettsäuren in Form von Acyl-Coenzym A nicht permeabel, so daß die Übertragung der Fettsäure auf das L(-)-Carnitin erfolgen muß, da die Acyl-L(-)-carnitine die Permeabilitätsschranke überwinden können. Dieser Schritt ist geschwindigkeitsbestimmend für den Ablauf der /3-Oxidation.
Kommt es zu einem Mangel an L(-)-Carnitin, so wird die mitochondriale /3-Oxidation stark gehemmt, es bilden sich U-)-Carnitinmangel-Syndrome heraus, die in den Kliniken durch Substitutionstherapie mit L(-)-Carnitin behandelt werden (Übersicht: „Carnitine biosynthesis, metabolism, and functions." Hrsg.: R. A. Frenkel and J. D. McGarry, Academic Press 1980). Da die notwendigen L(-)-Carnitin-Mengen nicht bereitgestellt werden konnten, wurde vielfach mit dem racemischen DL-Carnitin substituiert, das zwangsläufig bei der chemischen Totalsynthese des Carnitins anfällt. Dieses DL-Carnitin enthält aber die unphysiologische D( + )-Komponente und es zeigten sich Nebenwirkungen, die nach Anwendung von reinem L(-)-Camitin nicht auftraten (Curr. Ther. Res. 28 [1980], 195-198).
Es ist auch bekannt, daß die für die Funktion des L(-)-Carnitins notwendigen Transferasen, die Carnitin-Acetyl-Transferase (EC 2.3.1.7) und dieCarnitin-Palmitoyl-Transferase (EC 2.3.1.21) rein L(-)-spezifisch sind, während das D-Isomere hemmend wirkt. Durch Applikation von D-Carnitin kann es außerdem zur Depletion von L(-)-Carnitinausdem Herz-oder Skelettmuskel kommen,
wie bei Versuchstieren nachgewiesen wurde (Life Sciences 28 [1981], 2931-2938). Die unter L(-)-Carnitin-Behandlung gebesserten Symptome bei menschlicher Hyperthyreose verschlechterten sich unter D-Carnitin drastisch (Endokrinologie 38 [1959], 218-225). Die Acyl-D( +(-carnitine werden in der biochemischen Forschung als Blocker der mitochondrialen /3-Oxidation eingesetzt. Pharmakokinetik und Katabolite der beiden optischen Isomeren des DL-Carnitins unterscheiden sich ebenfalls beträchtlich, so daß für die Behandlung von Patienten heute nur noch das L(-)-Carnitin verwendet werden kann. Dies gilt auch und insbesondere bei Patienten mit chronischer Nieren Insuffizienz, die keine Möglichkeit zur aktiven Ausscheidung der D-Komponente haben. Bei einem Molekulargewicht von 161,2 wird das endogene L(-)-Carnitin den Patienten in den Dialysezentren mit dem Dialysat ausgewaschen und so ein sekundärer Carnitinmangel induziert. Orale Substitution oder L(-)-Carnitinzugabe zur Spüllösung verhinderte die Carnitindepletion bei Patienten.
Bei den in den Industrieländern verbreiteten Hyperlipoproteinämien wurde mit L(-)-Carnitin eine signifikante Senkung des Plasmaspiegels der Risikofaktoren Triglyceride und Cholesterol erzielt (Lancet Il [1978], 805—807). Gleichartige Wirkungen ließen sich auch bei Anwendung von Acylcarnitinen erreichen (DE-OS 2903579).
Seit der Entdeckung des L-Carnitins im Muskel gewinnt man L(-)-Carnitin in aufwendigen Isolierungs- und Reinigungsverfahren aus tierischem Material. In den 50er Jahren wurden mehrstufige chemische Synthesen ausgearbeitet, die aber alle zum DL-Carnitin führen. Für die Isolierung des L(-)-lsomeren werden bis in die Gegenwart Verfahren benutzt, die auf der Racematspaltung mittels zahlreicher Kristallisationsschritte unter Anwendung von optisch-aktiven Trennsäuren beruhen. Man geht sowohl von verschiedenen DL-Carnitinderivaten, wie DL-Carnitinnitril und DL-Carnitinamid, als auch vom DL-Carnitin in freier Betainform aus. Als Trennsäuren finden insbesondere die optischen Isomeren der Weinsäure, der Camphersäure und der Camphersulfonsäure Anwendung (z.B. DD-PS 23217; DD-PS 93347; DE-OS 2927 672).
Um die fraktionierte Kristallisation zu umgehen, wurde im vergangenen Jahrzehnt das Racemat mit Hilfe der L(-)-spezifischen Transferasen aufgespalten. Weil dabei aber zur Herstellung von 1 mol L(-)-Carnitin im mindestens stöchiometrischen Verhältnis Acyl-Coenzym A eingesetzt werden muß, ist dieses Verfahren zu teuer, um industriell Bedeutung zu erlangen. Allen chemischen Synthesen mit anschließender Racematspaltung haftet der weitere Nachteil an, daß von der synthetisierten Substanz selbst theoretisch nur maximal 50% als L(-)-Carnitin isoliert werden können. In den letzten Jahren wurde dieser Nachteil durch stereospezifische enzymatische Synthesen aus achiralen Vorstufen umgangen:
Inder US-PS 4,221,869 wird die Rückreaktion der Canitindehydro-genase (EC 1.1.1.108) genutzt, um Dehydrocarnitin zu L(-)-Carnitin zu hydrieren. Das Enzym wurde aus Bakterien der Pseudomonas fluoreszenz-Gruppe gewonnen. Für die Reaktion sind jedoch weitere B'rochemikalien und Hilfsenzyme zur Regenerierung des NADH notwendig, z. B. Glukose-Dehydrogenase oder Alkohol-Dehydrogenase. Erschwerend kommt hinzu, daß das Dehydrocarnitin sehr instabil ist und spontan in Acetonyltrimethylammonium und CO2 zerfällt.
In der DE-OS 31 23975 wird ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L(-)-Carnitin aus y-Butyrobetain beschrieben, wobei die -y-Butyrobetainhydroxyläse (EC 1.14.11.1.) aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa eingesetzt wird. Bei dieser Dioxygenasereaktion muß dem Ansatz noch a-Ketoglutarat und ein Reduktionsmittel, wie z. B. Ascorbinsäure zugesetzt werden. Um die L(-)-Carnitinausbeute zu optimieren, wird außerdem Katalase benötigt. Die -y-Butyrobetainhydroxylase wird nach Züchtung des Pilzes, Isolierung und Reinigung der Sporen aus diesen durch Behandlung mit Detergentien, mechanische Vorrichtungen oder Ultraschall-Desintegratoren gewonnen. Der anabole Stoffwechsel des L(-)-Carnitins ist in den letzten Jahren intensiv bearbeitet worden. Es ist bekannt, daß die Biosynthese des L(-)-Carnitins in Mikroorganismen, Säugern und im Menschen von L-Methionin und L-Lysin ausgeht. Über die Zwischenstufen ε-Ν,Ν,Ν-Trimethyllysin, ε-Ν,Ν,Ν-Trimethyl-ßhydroxylysin und Ν,Ν,Ν-Trimethyiaminobutyroaldehyd entsteht γ-Butyrobetain. Aus diesem wird durch die y-Butyrobetainhydroxylase in Gegenwart von molekularem Sauerstoff, a-Ketoglutarat, Eisen-ll-ionen und einem Reaktionsmittel L(-)-Carnitin direkt gebildet. Crotonobetain ist an diesem biogenen Syntheseweg nicht beteiligt.
Die Erfindung hat das Ziel, die Nachteile der bekannten Methoden zur L(-)-Carnitinherstellung zu überwinden und ein Verfahren anzugeben, das in ökonomisch vorteilhafter Weise die Herstellung dieser Verbindung auf biochemischem Weg gestattet.
Die Erfindung hat die Aufgabe, neue und technisch gangbare Verfahren aufzuzeigen, um L(-)-Carnitin aus leicht zugänglichen Ausgangsstoffen herzustellen, wobei die Reaktionsbedingungen und die Abtrennung von Begleitstoffen unkompliziert sein sollen.
Bisher war lediglich bekannt, daß
1. sowohl L(-)-Carnitin als auch D( +(-Carnitin und Crotonbetain zu y-Butyrobetain verstoffwechselt werden und daß
2. die Reduktion des Crotonbetains zu γ-Butyrobetain für die wachstumsstimulierende Wirkung auf Enterobakterien verantwortlich ist (Arch. Mikrobiol. 132 [1982], 91-95). Chlostridien sind fähig, Crotonosäure zu Buttersäure unter anaeroben Bedingungen zu hydrieren (FEBS Lett. 109 [1980], 244-246).
Überraschend stellte sich heraus, daß Bakterien an zugesetztes Crotonobetain unter bestimmten Bedingungen Wasser anlagern und daß diese Hydration stereospezifisch zum L(-)-Carnitin führt. Diese Reaktion ist an das Crotonobetain gebunden. Wird dem Inkubationsmedium z. B. -y-Butyrobetain zugesetzt, ist keine L(-)-Carnitinbildung aus diesem nachweisbar. Erfindungsgemäß geeignete Bakterienstämme sind z. B.:
Escherichia coli (E.coli 044K74; 055К5Э; 0111 K58; 0114K90)
Salmonella (S. typhimurium LT2; cottbus; anatum; newington)
Proteus (P. vulgaris; mirabilis)
Shigella (S. flexneri 1 a)
Hafnia (H. alvei Biotyp A und B)
Clostridium (C. kluyveri; sporogenes)
Citrobacter (C. freundii).
Den auf verschiedenen Komplex- oder Minimalmedien wachsenden oder gewachsenen Bakterien wird erfindungsgemäß das Crotonobetain (4-N,N,N-Trimethylaminocrotonat) oder eines seiner Salze, wie z.B. das Chlorid, Jodid, Perchlorat, Nitrat, Phosphat oder eines seiner Derivate, aus denen Crotonobetain entsteht, wie z.B. seinem Amid oder Nitril, sowie seinen Alkyl- oder Arylestern zugesetzt und nach einer bestimmten Inkubationszeit das gebildete (-(-(-Carnitin aus dem Reaktionsansatz isoliert. Die Konzentrationen des Crotonobetains in den Inkubationsmedien liegen zwischen 10yu.mol und 5mol/l, wobei gemäß Tabellen V, Vl und VII die Absolutmenge an L-Carnitin mit steigender Crotonobetainkonzentration zunimmt, die prozentuale Ausbeute, bezogen auf Crotonobetain, jedoch abnimmt. Das nicht umgesetzte Crotonobetain wird nach Abtrennung des U-)-Carnitins dem Inkubationsmedium wieder zugeführt. Als Medien für Ruhezellen finden Minimalmedien, Salzlösungen, anorganische oder organische Puffergemische Anwendung, die keine C- und/oder N-Quelle enthalten bzw. deren C- und N-Gehalt von den Bakterien nicht verwertet werden kann. Die Inkubationszeiten liegen zwischen 3 Stunden und 5 Tagen, bevorzugt werden 12 bis 48 h.
Die Hydratation des Crotonobetains wird durch Bakterien ermöglicht, die auf den unterschiedlichsten komplexen oder definierten Medien, fester oder flüssiger Konsistenz wachsen oder gewachsen sind, so daß übliche kommerzielle Nährböden und zahlreiche komplexe Substrate, wie Fleisch-, Hefe-, Malzextrakte, Serum, Maisquellwasser, mit zusätzlichen C- und/oder N-Quellen, wie Ammoniak, Harnstoff, Alkohole, Kohlenhydrate, organische Säuren einschließlich der Fettsäuren verwendet werden können und unter einfach zu realisierenden Bedingungen, wie partiell anaeroben Verhältnissen, Stehen der Reaktionsgefäße ohne zusätzliche Begasung oder Schütteln gearbeitet wird.
Um Verluste an eingesetztem Crotonobetain über den Weg der Hydrierung zu inertem y-Butyrobetain zu vermeiden, müssen Bedingungen geschaffen werden, die die Reduktion des Crotonobetains verhindern, den Ablauf der Hydratation jedoch fördern.
Aus diesem Grund werden Elektronenakzeptoren der aeroben bzw. anaeroben Atmung und spezielle Substrate zugesetzt.
Nichtbeschränkende Beispiele im Sinne der Erfindung sind Sauerstoff und sauerstoffabgebende Verbindungen, Nitrat, Trimethylaminoxid und weitere N-Oxide, Dimethylsulfoxid, Glukose, Fructose, Saccharose, Maltose, Wasserstoffakzeptoren, Fumarat, Crotonat, Acrylat (Tabellen II, III, IV).
Obwohl bereits die nach Wachstum auf üblichen kommerziellen Standardmedien mit Zusatz von Fleischwasser oder pankreatischem Pepton gewonnenen Ruhezellen zur Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain fähig sind (Tabelle IX), ist der Umsatz pro Zeiteinheit in solchen Zellen größer, in denen die „Crotonobetain-Hydratase" durch Wachstum unter Zusatz von Crotonobetain, DL-Carnitin, D-angereicherten DL-Carnitinfraktionen (die bei der chemischen Racematspaltung anfallen), sowie deren Derivaten (z. B. Carboxylester, O-Acylcarnitine oder Doppelester) induziert wurde.
Crotonobetain bzw. seine verwendbaren Salze bzw. Derivate werden nach einem der bekannten Verfahren hergestellt:
1. Abspaltung von Wasser aus DL-Carnitin, D-Carnitin und D-angereichertem DL-Carnitin mittels Schwefelsäure oder Essigsäureanhydrid oder Eliminierung der Säure aus den O-Acyl-DL- bzw. -D-carnitinen,
2. Permethylierung von 4-Aminocrotonsäure mittels Methylhalogeniden,
3. Anlagerung von Trimethylamin an 4-Halogencrotonsäure.
Die Abtrennung des L(-)-Carnitins von nicht umgesetztem Crotonobetain bzw. gebildetem γ-Butyrobetain kann nach bekanntem Verfahren erfolgen, wie-es in „Recent research on carnitine" (Ed. G. Wolf) S. 11-21 [1965] bzw. in der US-PS 4,221,869 b zw. DE-OS 31 23975 beschrieben wird. Bei der begrenzten Trennfähigkeit der Ionenaustauscher für Zwecke der lonenaustauschchromatographischen Reinigung eng strukturverwandter Trimethylammoniumverbindungen ist diese Methode nur zur Abtrennung kleinerer Mengen, z. B. von radiaktiv-markiertem L(-)-Carnitin, von den Vorstufen bzw. Reaktionsprodukten geeignet.
Zur Abtrennung größerer L(-)-Carniti η mengen von Crotonobetain und -y-Butyrobetain wird auf die Reaktion der Hydroxylgruppe zurückgegriffen. Geeignet ist der Umsatz mit Säurechloriden lang- und mittelkettiger Fettsäuren. O-Acylcarnitine lassen sich durch Extraktion vom Carnitin abtrennen (Biochim. Biophys. Acta 280 [1972], 422—433). Bei der Extraktion der wäßrigen Phase mit n-Butanol oder iso-Butanol werden die Acyl-L-carnitine auch von Crotonobetain und γ-Butyrobetain abgetrennt. Nach Eindampfen der organischen Phase fallen die O-Acyl-L-carnitine an, die nach Umkristallisation als Substrate mehrerer Enzyme in der biochemischen Forschung direkt eingesetzt werden können. Ammoniakalische Hydrolyse führt zum L(-)-Carnitin, das für die Substitutionstherapie in den Kliniken genutzt wird. Crotonobetain verbleibt während der Extraktion quantitativ in der wäßrigen Phase und wird erneut dem Inkubationsmedium zugesetzt.
Umsatzkontrolle des Crotonobetains zu L(-)-Carnitin erfolgt mittels der Carnitin-Acetyl-Transferase nach Zusatz von Acetyl-CoA mit der DTNB-Methode. 10 bis lOOfacher Überschuß an Crotonobetain stört den L-Carnitinnachweis nicht. Einige Vorteile des Verfahrens sind:
1. D( + )-Carnitin und besonders D-angereicherte DL-Carnitinchargen, die in großen Mengen bei der chemischen Racematspaltung des DL-Carnitins als Abprodukte anfallen, werden durch wasserentziehende Mittel in Crotonobetain überführt und stellen jetzt eine preiswerte Ausgangssubstanz für die L-Carnitinsynthese dar.
2. Für die mikrobiologische Carnitinsynthese müssen keine weiteren Biochemikalien oder Hilfsenzyme eingesetzt werden.
3. Der Aufwand für Ausgangssubstanzen, Medien und Energie ist minimal.
Das Verfahren wird im folgenden an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert:
Mit der Impfsuspension (E.coli 044K74), von Blutagarplatten (5%) in steriler Kochsalzlösung (9g/l) abgeschwemmt, wird ein 500ml Reaktionsgefäß mit Crotonobetain-haltigem Komplexmedium (20g pankreatisches Pepton, 5g NaCI und SOmmol Crotonobetain/1 aqua bidest.) von pH7,0 angeimpft (AE540 = 0,050), anschließend mit Paraffinöl überschichtet und bei 37°C stehengelassen. Die Bildung von L(-)-Carnitin ist in Abhängigkeit von der Inkubationszeit und dem Wachstum der Bakterien in Tabelle I dargestellt.
Tabelle I: Zeitabhängigkeit der L-Carnitinsynthese durch wachsende Bakterien
Inku-
bations
Wachstum
[E5
Synthese von L(-)-Carnitin
[mmol/l]
L(-)-Carnitin[mol] Crotonobetain [mol'
x102
0,0
0,100
0,120
0,190
0,200
0,175
0,5 2,0 6,7 6,6
0,9 3,9
13,4 13,3
Gemäß Beispiel 1 24h in Komplexmedium + Crotonobetain gewachsene Bakterien (E.coli) werden bei 6000g abzentrifugiert, mit Sörensen-Phosphatpuffer 0,01 mol/l, pH7,5 (0,20g KH2PO4/! und 3,05g Na2HPO4 x 12H2O/I) gewaschen und in einem 11 Kolben mit Sörensen-Phosphatpuffer, der zusätzlich 5g Crotonobetain/I (34,9 mmol/l) enthält, resuspendiert (AE540 = 0,080) und 24h bei 37°C stehengelassen. Anschließend werden die Bakterien wieder abzentrifugiert. Im Kulturfiltrat lagen 9,08mmol L(-)-Carnitin/l vor, das entspricht 26% des eingesetzten Crotonobetains.
L(-)-Carnitin-haltiges Komplexmedium (31 mmol L(-)-Carnitin/l = 5g/l), dem Elektronenakzeptoren der Atmungskette oder weitere Substrate zugesetzt worden waren, wurde gemäß Beispiel 1 mit verschiedenen Stämmen von Enterobakterien beimpft und 48 h inkubiert. Konzentration der Zusätze: Natriumsuccinat, Natriumfumarat und D-Clucose je 10g/l; Kaliumnitrat und Trimethylaminoxid (TMO) je 5g/l. Diey-Butyrobetainbildung ist in mol γ-Butyrobetain pro mol eingesetztem L(-)-Carnitin χ 102 (Mol.-%) angegeben.
Tabelle II: Einfluß von Elektronenakzeptoren bzw. weiteren Substraten auf den Abbau von L-Carnitin zu γ-Bütyrobetain Bakterienstämme γ-Butyrobetainbildung [Mol.-%]
| 71 | Succinat | Fumarat | KNO3 | TMO | Glucose | |
| Escherichia coli 044 K 74 | 45 | 77 | 13 | 0 | 0 | 0 |
| EscherichiacoliK12HfrH | 87 | 43 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| Salmonellatyphimurium LT2 | 79 | 89 | 68 | 0 | 8 | 71 |
| Proteusvulgaris | 81 | 17 | 0 | 17 | 0 | |
Dem Komplexmedium (KM) gemäß Beispiel 1 oder einem definierten Minimalmedium (MM), bestehend aus 15,0g Na2HPO4- 12H2O, 3,0g KH2PO4, 1,0g NH4CI, 0,15g MgSO4- 7H20,14mg CaCI2, 0,2mg FeCI3 und 7,5g D-Ribose/I aqua dest., die zusätzlich je 50mmol Crotonobetain/I enthalten, werden Natriumfumarat (10g/S), Kaliumnitrat (5g/l) oder Trimethylaminoxid (5g/l) zugesetzt, mit Paraffinöl-Überschichtung (O2-Ausschluß) oder ohne Paraffinöl (O2-Zutritt) bei 37°C mit E.coli 044K74 48h inkubiert.
Tabelle III: Einfluß von Elektronenakzeptoren auf die L-Carnitinbildung in wachsenden Bakterien
| Züchtungsmedium | Synthese von Ц-] | (-Carnitin | [mmol/l] | KNO3 | TMO |
| O2-Ausschluß | O2-Zutritt | Fumarat | 0,9 0 | 5,1 5,9 | |
| KM MM | 4,5 2,7 | 2,6 1,5 | 10,7 10,8 | ||
Bakterien (E. coli 044K74 werden im Komplex- (KM) oder im Minimalmedium (MM), die zusätzlich je 50mmol Crotonobetain/I enthalten, gezüchtet und nach 48h geerntet, 2x gewaschen und in 50mmol Crotonobetain/I enthaltendem Sörensen-Puffer, dem die Elektronenakzeptoren gemäß Beispiel 4 zugesetzt werden, 48 h inkubiert.
Tabelle IV: Einfluß von Elektronenakzeptoren auf die L-Carnitinbildung in Ruhezellen
| Züchtungsmedium | Synthese von | L(-)-Carnitin [mmoll] | Fumarat | KNO3 | TMO |
| O2-Ausschluß | O2-Zutritt | 0 0 | 7,8 9,8 | 8,4 10,4 | |
| KM MM | 7,5 9,1 | 8,3 12,1 | |||
Mit gemäß Beispiel 1 vorgezüchteten Bakterien (E. coli 044K74) werden Minimalmedien mit D-Ribose als C-Quelle (gemäß Beispiel 4), die unterschiedliche Crotonobetainkonzentrationen enthalten, angeimpft und 48h bei 37°C inkubiert.
Tabelle V: Synthese von L-Carnitin durch in einem Minimalmedium wachsende Bakterien bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen
| Crotonobetain | Synthese von | L-Carnitin | χ 102 | Wachstum |
| L-Carnitin [mol] | ||||
| [mmol/l] | [mmol/l] | Crotonobetain [mol] | [E540] | |
500 5,3 1,1 0,120
50 4,3 8,6 0,450
5 0,3 6,0 0,385
0,5 0,09 18,0 0,220
Die Bakterien (E. coli 044K74) werden entweder auf Komplexmedium gemäß Beispiel 1 (A) oder Minimalmedium + Ribose gemäß Beispiel 4 (B) gezüchtet, wobei die Wachstumsmedien zusätzlich 8g L-Carnitin/I enthalten. Nach 48h werden die Bakterien geerntet, 2 x gewaschen, auf Sörensen-Puffer, der unterschiedliche Crotonobetainkonzentrationen enthält, umgesetzt und 48h bei 37°C inkubiert.
Tabelle Vl: Synthese des L-Carnitins aus Crotonobetain durch L-Carnitin-induzierte Ruhezellen bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen
| Crotonobetain | Synthese von L-Carnitin | L-Carnitin [mol] | x 102 |
| Crotonobetain [mol] | |||
| [mmol/l] | [mmol/l] | ||
| 500 | 9,0 |
| 50 | 7,5 |
| 5 | 2,9 |
| 500 | 16,2 |
| 50 | 8,3 |
| 5 | 3,7 |
A) 500 9,0 1,8
15,1 58,4
B) 500 16,2 3,2
16^5 74,0
Bakterien (E. coli 044K74) werden auf crotonobetainhaltigem Komplexmedium gemäß Beispiel 1 gezüchtet, nach 48h abzentrifugiert, 2x gewaschen und in einem Minimalmedium ohne C- und N-Quelle, das unterschiedliche Crotonobetainkonzentrationen enthält, aufgenommen und 48h inkubiert.
Tabelle VII: Synthese des L-Carnitins durch Crotonobetaininduzierte Ruhezellen bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen
Crotonobetain Synthese von L-Carnitin
L-Carnitin [mol]
[mmol/l] [mmol/l] χ
Crotonobetain [mol]
500 24,3 4,9
50 12,2 24,5
5 2,4 48,8
0,5 0,47 94,0
Bakterien (E. coli 044K74) werden im definierten Minimalmedium gemäß Beispiel 4, das anstelle des Crotonobetains zusätzlich 50mmol Carnitin/I enthält, 48h gezüchtet, geerntet, 2x gewaschen und in einem Minimalmedium ohne C- und N-Quelle, aber mit SOmmol Crotonobetain/I, bei 37°C inkubiert. Optische Dichte zu Beginn der Inkubation AE540 = 0,210.
Tabelle VIII: Zeitabhängigkeit der L-Carnitinbildung durch Ruhezellen
Inkubationszeit Synthese von L-Carnitin
| [mol/l] | x 102 | Crotonobetain [mol] |
| 5,1 | ||
| 2,5 | 7,5 | |
| 3,7 | 13,2 | |
| 6,6 | 18,0 | |
| 9,0 | 20,3 | |
| 10,1 |
L(-)-Camitin[mol) [hj
Bakterien (E. coli 044K74) werden im Komplexmedium (KM) oder Minimalmedium (MM) ohne C-Quelle, dem die angegebenen Substanzen jeweils in einer Konzentration von 50mmol je I zugesetzt worden'waren, 48h gezüchtet, geerntet, 2x mit Sörensen-Puffer gewaschen und auf Sörensen-Püffer mit Crotonobetain (50mmol/l) 48h inkubiert.
Tabelle IX: Einfluß unterschiedlicher Züchtung auf die L-Carnitinbildung in Ruhezellen
| Wachsende Zellen | ^E540 | Ruhezellen | L-Carnitin- | |
| Medium | Zusätze | ^Es40 | synthese | |
| nach 48 h | [mmol/l] | |||
| 0,315 | am Start | 1,4 | ||
| KM | 0,196 | 0,225 | 0,3 | |
| MM | D-Ribose | 0,325 | 0,136 | 0,6 |
| MM | D-Glucose | 0,165 | 0,260 | 0 |
| MM | D-Ribose, Fumarat | 0,395 | 0,100 | 0,3 |
| MM | D-Ribose, GABOB* | 0,255 | 0,220 | 6,6 |
| MM | D-Ribose, L-Carnitin | 0,190 | ||
DL-y-Amino-jS-hydroxy buttersäure
Claims (16)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Herstellung von L(-)-Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß von Crotonbetain, von Salzen des Crotonbetains oder Derivaten des Crotonbetains ausgegangen wird, die durch biologische Systeme wie wachsende und/oder ruhende Bakterien oder deren katalysierende Bestandteile in L(-)Carnitin umgewandelt werden.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen von Escherichiacoli gearbeitet wird, wie z.B. E.coli K12 HfrH; 044K74; 055K59; 0111 K58; 0114K90.
- 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Salmonella-Stämmen gearbeitet wird, wie z. B. S. thyphimurium, S. Cottbus; S. aratum; S. newington.
- 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Shigella gearbeitet wird, wie z.B. S. flexneri 1 a.
- 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Citrobacter gearbeitet wird, wie z. B. C. freundii.
- 6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Clostridium gearbeitet wird, wie z. B. C. sporogenes; C. kluyveri.
- 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Hafnia gearbeitet wird, wie z. B. H. alvei.
- 8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Proteus gearbeitet wird, wie z.B. P. vulgaris; P. mirabilis.
- 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Crotonbetain, seinen Salzen und/oder Derivaten im Reaktionsansatz zwischen 10/nmol/l und 5mol/l liegen.
- 10. Verfahren nach Punkten 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung der Bakterien in einem üblichen kommerziellen Komplexmedium oder einem Minimalmedium erfolgt, wobei den wachsenden.und/oder ruhenden Bakterien weitere Elektronenakzeptoren der Atmung, Wasserstoffakzeptoren oder Substrate zugesetzt werden, die die Hydrierung des Crotonbetains zu -y-Butyrobetain verhindern, wie z. B. Fumarat, Nitrat, Sauerstoff, N-Oxide, Glucose.
- 11. Verfahren nach Punkten 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die L(-)-Carnitinsynthese mit induzierten Ruhezellen durchgeführt wird, wobei die Induktion durch carnitin- oder crotonbetainhaltige Komplexmedien oder durch Zusatz von L-, D-, oder DL-Carnitin, -derivaten und -salzen sowie Crotonbetain, -derivaten und -salzen zu den Züchtungsmedien ausgelöst wird.
- 12. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Crotonbetain sowohl direkt eingesetzt wird als auch erst im Ansatz aus Vorstufen gebildet wird und als Intermediat der Synthese des L-Carnitins dient.
- 13. Verfahren nach Punkt 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß mit komplexen biologischen Systemen gearbeitet wird, in denen die Stämme der angegebenen Gattungen in Reinkultur, in Mischungen untereinander oder in Mischungen mit anderen Stämmen vorhanden sind.
- 14. Verfahren nach Punkt 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß von Isotop-markiertem Crotonbetain, seinen Salzen und/oder Derivaten ausgegangen oder markiertes Wasser an Crotonbetain angelagert und auf diesem Weg Isotop-markiertes L(-)-Carnitin hergestellt wird.
- 15. Verfahren nach Punkt 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß das !.(-!Carnitin aus dem Reaktionsgemisch mit Crotonbetain als Acyl-L(-)-carnitin abgetrennt wird.
- 16. Verfahren nach Punkt 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß die L(-)-Carnitin-Synthese unter anaeroben, partiell anaeroben oder aeroben Bedingungen abläuft.
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