DD297447A5 - Molekulare chimaere, retroviraler transportvektor, infektioeses virion und pharmazeutische formulierung zur krebstherapie sowie verfahren zur herstellung - Google Patents

Abstract

Es werden neue molekulare Chimaeren hergestellt, die durch rekombinante DNA Techniken beschrieben werden. Diese enthalten eine zielgewebespezifische transkriptionale Regulationssequenz (TRS), die mit einem heterologen Enzym, z. B. dem Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase (VZV TK) Gen verknuepft ist und die Expression dieses Gens kontrollieren. Eine molekulare Chimaere wird in ein synthetisches retrovirales Partikel verpackt, welches in der Lage ist, Saeugetiergewebe zu infizieren. Dieses Partikel kann einem Patienten verabreicht werden und das TRS wird selektiv transkriptional im Zielgewebe (zum Beispiel Krebsgewebe) aktiviert. Verabreichung von Verbindungen, die selektiv durch das Enzym metabolisiert werden, liefert zytotoxische oder zytostatische Metaboliten in situ, wodurch die Zielzelle selektiv getoetet oder ihr Wachstum blockiert wird.{molekulare Chimaere; retroviraler Transportvektor; infektioeses Virion; pharmazeutische Formulierung; Krebstherapie; Regulationssequenz; heterologes Enzym; Gen; Metabolit; Partikel}

Description

-3- 297 447 Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf molekulare Chimären, infektiöse Virionen, auf Methoden zu ihrer Herstellung, auf sie enthaltende pharmazeutische Formulierungen, auf ihre Anwendung in der Therapie, insbesondere der „virus-directed enzyme prodrug"-Therapie, besonders auch bei der Behandlung von Krebs und ganz besonders bei der Behandlung des Hepatozellularkarzinoms, und die Verwendung von Wirkstoffen, die durch heterologe enzymatische Katalyse zu zytotoxischen oder zytostatischen Metaboliten umgewandelt werden, wie Purinarabinoside und substituierte Pyrimidine in der Virus vermittelten Enzym-Prodrug-Therapie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Krebs in all seinen Erscheinungsformen ist eine der Hauptursachen von Krankheiten in der ganzen Welt. Die Forschung auf dem Gebiet der Krebschemotherapie hat zu einer Vielzahl von verschiedenen wirksamen Antitumoragenzien geführt. Zu den im klinischen Bereich standardmäßig verwendeten Mitteln gehören Adriamycin, Actinomycin D, Methotrexat, 5-Fluorouracil, cis-Platin, Vincristin und Vinblastin. Von den zur Zeit erhältlichen Antitumormitteln kennt man jedoch eine Reihe von Nachteilen wie Toxizität gegenüber gesunden Zellen und Resistenz von bestimmten Tumortypen. Andere Formen der Therapie wie chirurgischer Eingriff sind bekannt. Dem Fachmann ist jedoch bewußt, daß neue Ansätze und Wege zur Krebstherapie gefunden werden müssen.

Das Hepatozellularkarzinom (HCC) ist eine der häufigen bösartigen Krankheiten in der heutigen Welt mit dem häufigsten Auftreten in Japan, China, anderen Teilen von Asien und im Afrika südlich der Sahara. Jüngste Erkenntnisse legen nahe, daß das Auftreten von Hepatozellularkarzinom in Europa und Nordamerika im Ansteigen begriffen ist. Die Krankheit ist schätzungsweise verantwortlich oder beteiligt an ca. 1250000 Todesfällen pro Jahr und ist somit zahlenmäßig eine der häufigsten bösartigen Krankheiten in der Welt.

Die Prognose von HCC ist immer schlecht, wobei die weltweite Häufigkeitsrate beinahe der Sterblichkeitsrate entspricht. Die mittlere Überlebenszeit nach der Diagnose beträgt weniger als vier Monate. Längeres Weiterleben, definiert durch Weiterleben von mehr als einem Jahr nach Diagnose, kann nur gelegentlich boübachtet werden. Die meisten HCC-Patienten erliegen entweder den Komplikationen aufgrund von Leberversagen mit oder ohne massiven Blutungen oder den allgemeinen Auswirkungen einer schweren Tumorerkrankung mit Kachexie, Unterernährung, Infektion und Blutvergiftung. Obwohl Metastasen auftreten (bis zu 90% der Patienten haben Metastasen zum Zeitpunkt des Todes), limitiert meistens die örtliche Erkrankung die Lebensrate. Demzufolge sind Therapien, die auf die Kontrolle des Lebertumors gerichtet sind, geeignet, obwohl man nicht vergessen darf, daß die Behandlung der Metastasen ebenso von großer Wichtigkeit ist (Kew M.C, Postgraduate Medical Journal 59 [Suppl.) 78-87 [1983] und Berk. P., [Herausgeber] Seminars in Liver Disease 4, Nr. 2, Thieme-Stratton Inc. N. Y. N.Y.(1984]).

Die gegenwärtig dem Arzt zugänglichen Therapien erweisen sich insgesamt als unwirksam zur Heilung dieser Krankheit (Nerenstone et al, Cancer Treatment Reviews 15,1-31 (1988]). Bis heute bleibt der chirurgische Eingriff die einzig wirksame Heilmethode. Jedoch ist zum Zeitpunkt der Diagnose die überwältigende Mehrheit der Patienten nicht in der Lage, sich einem radikalen chirurgischen Eingriff zu unterziehen. In bestimmten Studien (Nerenstone et al siehe oben) wurde gefunden, daß weniger als 3% der Patienten für geeignet befunden wurden, sich einem chirurgischen Eingriff zu unterziehen und daß von dem kleinen Prozentsatz, der dies tut, ca. 50% an postoperativer Morbidität leiden (Nerenston et al siehe oben). Allgemeine Einzelanwendung und Kombination von Chemotherapie und Bestrahlung sind relativ unwirksam, was die Notwendigkeit von den neuen Lösungswegen und Therapien zur Behandlung dieser Krankheit betont. Eine Gentherapie umfaßt die stabile Integration der neuen Gene in die spezifischen Zielzellen und die Expression dieser Gene, nachdem sie ihren Platz eingenommen haben, wobei der Phenotyp der spezifischen Zielzelle verändert wird (zur Übersicht siehe Anderson, W. F., Science 226:401-409,1984; McCormick, D., Biotechnology 3:690-693,1985). Gentherapie, die den Ersatz eines defekten oder fehlenden Enzyms, wie zum Beispiel Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase bei der Lesch Nyhan-Krankheit; Purinnukleosidphosphorylase bei schwerer Immunschwäche und Adenosindeaminase bei schwerer kombinierter Immunschwäche, kann für die Behandlung einer genetisch bedingten Krankheit vorteilhaft sein. Bislang wird die Gentherapie noch nicht im klinischen Stadium angewandt, obwohl bei bestimmten Funktionsstörungen bestimmte Typen der Gentherapie wahrscheinlich sofort eingesetzt werden könnten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Es wurde von den Erfindern gefunden, daß es möglich ist, selektiv das Wachstum von Krebszellen von Säugetieren zu hemmen oder die Zellen mit chemischen Wirkstoffen abzutöten, die selektiv in zytotoxische oderzytostatische Metaboliten umgewandelt werden können. Dies wird erreicht durch die Konstruktion einer molekularen Chimäre, die eine .zielzellenspezifische" transkriptionale Regulationssequenz (TRS) enthält, die selektiv im Zielgewebe aktiviert wird, zum Beispiel in Krebszellen, und so die Expression eines heterologen Enzyms kontrolliert. Diese molekulare Chimäre kann mittels geeigneter Vektoren manipuliert werden und in ein infektiöses Virion inkorporiert werden. Nach Verabreichung eines infektiösen Virions mit der molekularen Chimäre an einem Patienten wird das Enzym selektiv in der Zielzelle exprimiert. Verabreichung von Verbindungen, die selektiv von dem Enzym zu Metaboliten umgesetzt werden, die entweder bereits zytotoxische oder zytostatische Agenzien sind oder weiter zu diesen umgesetzt werden, kann dann in situ erreicht werden.

Diese Erfindung ist allgemein anwendbar und wird anhand des Hepatozellularkarzinoms demonstriert. Wie oben erwähnt, stirbt ein überwältigender Prozentsatz der Patienten, die an Hepatozellularkarzinom leiden, an dem Primärtumor. Jedoch haben ca. 90% der HCC-Pstienten verborgene Metastasen zum Zeitpunkt des Todes. Diese Metastasen weisen den typischen Phenotyp des Primärtumors auf und daher werden diese Metastasen ebenso selektiv das heterologe Enzym expr Imieren und so verabreichte Verbindungen selektiv aktivieren, wie sie hier als zytotoxische oder zytostatische Metaboliten definiert sind.

Eine Anzahl von Enzym-Prodrug-Kombinationen kann verwendet werden, vorausgesetzt, das Enzym ist in der Lage, selektiv die verabreichte Verbindung entweder direkt oder über ein Intermediat zu einem zytostatischen oder zytotoxischen Metaboliten zu aktivieren. Genauso wird die Wahl der Verbindung vom verwendeten Enzymsystem abhängen, die selektiv vom Enzym entweder direkt oder indirekt zu einem zytotoxischen oder zytostatischen Metaboliten umgewandelt wird. Der Terminus „heterologes Enzym", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Enzym, das geeignete Selektivitätseigenschaften aufweist. Das Varicella-Zoster-Virus (VZV) kodiert ein spezifisches Thymidinkinaseprotein. Das Gen wurde koniert, sequenziert und charakterisiert (J. Gen. Virol. 67:1759—1816 [1986}). Die VZV Thymidinkinase wird, im Gegensatz zum Säugetierenzym, selektiv spezifische Purinarabinoside und substituierte Pyrimidinverbindungen monophosphorylieren. Weiterhin haben die Erfinder gefunden, daß bestimmte Purine und Pyrimidinanaloge, besonders solche der Formeln (I) und (II) wie unten definiert, in bestimmten Säugetierzellen, die genetisch modifiziert wurden um selektiv VZV Thymidinkinase zu exprimieren, zu zytotoxischen oder zytostatischen Metaboliten umgesetzt werden. Zum Beispiel 9-(ß-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin wird zu 9-ß-D-arabinofuranosyl-adenin-triphosphat [Ära ATP) umgewandelt.

Zu anderen Enzym-Prodrug-Kombinationen zählen das bakterielle Enzym Carboxypeptidase G 2 (zum Beispiel aus Pseudomonas) mit para-N-bis (2-Chloroethyl)aminobenzoylglutaminsäure als Prodrug. Spaltung der Glutaminsäureeinheit von dieser Verbindung setzt ein toxisches Benzoesäuresenfgas frei; alkalische Phosphotase aus Kälberdarm wandelt inaktive phosphorylierte Verbindungen wie Etoposid-phosphat, Doxorübirin-phosphat, Mitomycin-phosphat in toxische dephosphorylierte Metaboliten um. Penicillin-V Amidase konvertiert Phenoxyacetamidderivate von Doxorubicin und Melphalan zu toxischen Metuboliten und die Cytosindeaminase aus Pilzen (zum Beispiel aus Fusarium oxysporum) wandelt 5-Fluorocytosin zum toxischen 5-Fluorouracil um.

In Säugetierzellen werden bestimmte Gene allgegenwärtig exprimiert. Die meisten Gene werden jedoch in einer zeit- und/oder gewebespezifischen Art und Weise exprimiert oder werden als Reaktion auf extrazelluläre Inducer aktiviert. Zum Beispiel werden bestimmte Gene nur zu ganz bestimmten Zeiten während der Ontogenese in spezifischen Zelltypen oder als Reaktion auf einen induzierenden Stimulus aktiv transkribiert. Diese Regulation wird zum Teil durch die Interaktion zwischen transkriptionaler Regulationssequenz (zum Beispiel Promoter und Enhancer Regulations DNA Sequenzen) und durch sequsnzspezifische DNA bindende transkriptionale Proteinfaktoren vermittelt.

Die Erfinder haben gefunden, daß es möglich ist, bestimmtes Säugetiergewebe, ζ. B. Lebergewebe oder transformiertes Lebergewebe, zu verändern, wobei selektiv ein heterologes Enzym wie oben definiert, z. B. VZV Thymidinkinase, selektiv exprimiert wird. Dies wird durch Konstruktion einer molekularen Chimäre in einer Expressionskassette erreicht. Expressionskassetten selbst gehören zum Stand der Technikder Molekularbiologie. Eine solche Expressionskassette enthält alle wesentlichen DNA Sequenzen, die zur Expression des heterologen Enzyms in der Säugetierzelle erforderlich sind. Zum Beispiel enthält eine bevorzugte Expressionskassette eine molekulare Chimäre mit einer kodiei enden Sequenz für VZV TK, einem geeigneten Polyadenylierungssignal für ein Säugetiergen (d. h. ein Polyadenylierungssignal, das in der Säugetierzelle aktiv wird) und geeignete Enhancer- und Promotersequenzen in der richtigen Orientierung.

In der Säugetierzelle sind normalerweise zwei DNA Sequenzen zur kompletten und effizienten transkriptionalen Regulation der Gene, die Messenger RNAs in Säugetierzellen kodieren, erforderlich: Promotoren und Enhancer. Promotoren sind unmittelbar (5') stromaufwärts von der Startstelle der Transkription lokalisiert.

Promotersequenzen sind für die genaue und effiziente Initiierung der Transkription erforderlich. Verschiedene genspezifische Promotoren zeigen ein gemeinsames Organisationsmuster. Ein typischer Promoter umfaßt eine AT-reiche Region, genannt TATA box (die ca. 30 Basenpaare 5' stromaufwärts zur Startstelle der Transkriptionsinitiierung lokalisiert ist) und ein oder mehr stromaufwärts liegende Promoterelemente (UPE). Die UPEs sind ein prinzipielles Ziel für die Interaktion mit sequenzspezifischen nuklearen transkriptionalen Faktoren. Die Aktivität der Promotersequenzen wird durch andere Sequenzen, die sogenannten Enhancer, moduliert. Die Enhancersequenz kann weit von dem Promoter entweder an einer (5') stromaufwärts oder (3') stromabwärts liegenden Position entfernt sein. Daher operieren Enhancer in einer orientierungs- und positionsunabhängigen Weise. Jedoch ist aufgrund'einer ähnlichen strukturellen Organisation und einer austauschbaren Funktion die absolute Unterscheidung zwischen Promotoren und Enhancern etwas willkürlich. Enhancer erhöhen die Rate der Transkription von der Promotersequenz. Im wesentlichen bestimmt die Interaktion zwischen den sequenzspezifischen transkriptionalen Faktoren mit dem UPE und Enhancersequenzen die Fähigkeit von Säugetierzellen zur gewebespezifischen Genexpression. Die Gegenwart dieser transkriptionalen Proteinfaktoren (gewebespezifisch, transwirksame Faktoren), die an die UPE und Enhancer (cis-wirksam, regulative Sequenzen) gebunden sind, ermöglicht anderen Komponenten der transkriptionalen Maschinerie, einschließlich der RNA Polymerase, die Transkription mit gewebespezifischer Selektivität und Genauigkeit in Gang zu setzen. Die Selektion der transkriptionalen Regulationssequenzen, insbesondere der Promoter- und Enhancersequenz, hängt vom Zielgewebe ab. Als Beispiele kommen in Frage die Albumin (ALB) und alpha-Fetoprotein (AFP) transkriptionale Regulationssequenz (zum Beispiel Promoter und Enhancer), die spezifisch für normale Hepatozyten und transformierte Hepatozyten ist; die transkriptionale Regulationssequenz für das karzinoembryonische Antigen (carcino-embryonic antigen) (CEA) zur Verwendung in transformierten Zellen des Gastrointestinaltrakts, der Lunge, Brust und anderen Geweben; die transkriptionale Regulationssequenz für die Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase oder der neuronenspezifischen Enolase zur Verwendung in Neuroblastomen; die transkriptionale Regulationssequenz für das saure Glialfibroprotein (glial fibro acidic protein) zur Verwendung bei Gliomas; die transkriptionale Regulationssequenz für Insulin zur Verwendung bei Bauchspeicheldrüsentumoren.

Weitere Beispiele schließen mit ein die transkriptionale Regulationssequenz spezifisch für die gamma-Glutamyltranspeptidase zur Verwendung bei bestimmten Lebertumoren und dopa-Decarboxylase zur Verwendung bei bestimmten Lungentumoren. Zusätzlich können transkriptionale Regulationssequenzen von bestimmten Oncogenen verwendet worden, da diese bevorzugt in bestimmten Tumortypen exprimiert werden. Als gute Beispiele können erwähnt werden die HER-2/neu Oncogen Regulationssequenz, die bei Brusttumoren exprimiert wird und die für das N-myc Oncogen spezifische Regulationssequenz bei Neuroblastomen.

Die ALB und AFP Gene zeigen eine weitgehende Homologie im Hinblick auf ihra Nukleinsäuresequenz, Genstruktur, Aminosäuresequenz und sekundäre Proteinfaltung (zum Überblick siehe Ingram et al. PNAS 78:4694-4698 [1981)). Diese Gene werden unabhängig aber in reziproker Weise während der Ontogenese exprimiert. Bei der normalen Entwicklung wird die ALB Transkription kurz vor der Geburt initiiert und dauert bis ins Erwachsenenalter an.

Transkriptionale Expression ist beim Erwachsenen auf die Leber beschränkt. AFP wird normalerweise in der fetalen Leber, dem viszeralen Entoderm des Dottersacks und das fetalen Gastrointestinaltrakts exprimiert, fällt jedoch unter die Nachweisgrenze kurz nach der Geburt und wird nicht signifikant in der nlchtpathogenen oder nichtregenerierenden Leber oder in anderen normalen Geweben bei Erwachsenen exprimiert. Die AFP Transkription in der Leber bei Erwachsenen steigt jedoch oft dramatisch bei HCC an. Zusätzlich kann die AFP Transkription auch beim nichtseminomen (non-seminomatous) und gemischtem Karzinom des Hoden bei entodermalen Sinustumoren, bei bestimmten Teratokarzinomen und bei bestimmten Gastrointestinaltumoren gesteigert sein. Die leberspezifische Expression von AFP und ALB ist das Ergebnis von Interaktionen der Regulationssequenzen ihrer Gene mit transwirksamen transkriptiona'en Faktoren, die in Leberzellkernextrakten gefunden werden.Die AFP und ALB transkriptionalen Regulationssequenzen sind bevorzugt zur Herstellung hepatomaspezifischer oder allgemein leberspezifischer molekular kombinierter Gene, entsprechend auch zur Expression, da die AFP und ALB Gene auf der transkriptionalen Stufe reguliert werden und ihre mRNAs zu den am meisten in der Leber vorkommenden Polymerase Il Transkripten gehören.

Mehrere Säugetiere ALB und AFP Promoter- und Enhancersequenzen sind identifiziert worden (zum Überblick siehe Genes and Develop. 1:268-276 [1987); Science 235:53-58 [1987); The Journal of Biol. Chemistry 262:4812-4818 [1987]). Diese Sequenzen ermöglichen die selektive und spezifischen Expression von Genen in Leberhepatozyten (normale und transformierte) und entsprechend Hepatomen.

Wie in Figur 1 gezeigt, ist zum Beispiel ein Säugetier ALB Promoter innerhalb einen 300 bp Fragments 5' zur Startstolle der Transkriptionsinitiierung des Albumingen enthalten. Die Sequenz zwischen 300 bp 5' und 8500bp 5' zur Startstelle der Transkriptionsinitiierur.g des Murinalbumingens ist entbehrlich für die leberspezifische Expression. Eine leberspezifische Enhancersequenz ist jedoch in dem Fragment zwischen 8500 bp 5' bis 10400 bp 5' zur Startstelle der Transkriptionsinitiierung (Fig. 1 A) enthalten. Falls die ALB Promoter- und Enhancerelemente anwesend sind, kann leberspezifische Expression eines heterologen Strukturgens, welches in der richtigen 3' Orientierung positioniert ist, stattfinden. Die leberspezifische Expression eines 3' heterologen Strukturgens, das in der richtigen Orientierung zu den ALB Promoter- und Enhancersequenzen positioniert ist, kann auch stattfinden wenn nichtessentielle dazwischenliegende Sequenzen zwischen 300 bp 5' und 8 500 bρ 5' zur Startstelle der Transkriptionsinitiierung entfernt werden (Fig. 1 C). Das Ausschneiden nichtessentieller Sequenzen wird durch standardmäßige molekularbiologische Methoden aus dem Stand der Technik erreicht und führt zu einer molekularen Chimäre, die zur direkten leberspezifischen Expression von VZV TK verwendet werden kann.

Ähnlich wie die Regulationsstruktur des ALB Gens fördern die Regulationselemente der AFP Gene gewebespezifische Expression von AFP bei bestimmten Leberkrankheiten, wie z. B. HCC (Mol. CeI. Biol. 6:477-487 [1987]; Science 235: 53-58 [1987]). Die Regulationselemente eines Säugetier AFP Gens bestehen aus einer spezifischen 5' promoterproximalen Region (bei einigen Säugetierarten zwit -hen 85 und 52 bp 5' zum Gen lokalisiert). Diese Sequenz ist für die Transkription in Hepatomas essentiell. Zusätzlich gibt es st.omaufwärts (b') Regulationselemente für die Murin AFP Gene, die als klassische Enhancer agieren (Mc!. CeI. Biol. 6:477-487 [1986]; Science 235:53-58 (1987)). Diese stromaufwärts liegenden Regulationselemente sind die gekennzeichneten Elemente I, Il und III und sind zwischen 1000 bis 7600 bp 5' zur Startstelle der Transkriptionsinitiierung für das AFP Muringen lokalisiert. Diese drei Enhancerdomänen sind nicht funktional äquivalent bei der Auslösung von gewebespezifischer Expression des AFP. Die Elemente I und Il besitzen die größte Fähigkeit zur direkten leberspezifischen Expression von AFP. Es ist wichtig zu betonen, daß die Regulationssequenzen des alpha-Fetoproteingens günstigerweise nicht nur Sequenzen für gewebespezifische transkriptionale Aktivierung, sondern auch für die Repression der Expression in Gewebe, das nicht AFP exprimioren sollte, enthält. In ähnlicher Weise sind die Regulationsregionen des humanon alpha-Fetoproteingens charakterisiert worden (J. B. C. 262,4812 [1987]). Ein in der richtigen Orientierung 3' zu den AFP Regulationssequenzen plaziertes Strukturgen wird eine selektive Expression des Strukturgens in der fetalen Leber, in Hepatomas, nichtseminatomen Karzinomen des Hoden, bestimmten Teratokarzinomas, bestimmten gastrointestinalen Tumoren und anderen normalen und pathologischen Geweben, die spezifisch AFP exprimieren, ermöglichen.

Die vorliegende Erfindung stellt eine molekulare Chimäre zur Verfügung, die eine DNA Sequenz mit der Kodierungssequenz des Gens für ein heterologes Enzym unter der Kontrolle einer transkriptionalen Regulationssequenz in einer Expressionskassette, und den Promoter, der in der Lage ist, selektiv in einer Zielkrebszelle wirksam zu werden, zur Verfügung (zum Beispiel zur Transformation einer Krebszelle zur selektiven Expression von VZV Thymidinkinase).

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin in einer bevorzugten Ausführung eine molekulare Chimäro, die eine transkriptionale Regulationssequenz, insbesondere einen Promoter, der selektiv im Säugetierzielgewebe aktiviert wird und funktional mit der kodierenden Sequenz für das Gen für die Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase (VZVTK) verbunden ist, zur Verfügung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine molekulare Chimäre, die eine DNA Sequenz der kodierenden Sequenz des Gens für das Enzym, das vorzugsweise VZV TK ist, einschließlich einer geeigneten Polyadenylierungssequenz, verknüpft in einer 3'-Position und in der richtigen Orientierung mit einer transkriptionalen Regulationssequenz spezifisch für das Säugetierzielgewebe zur Verfügung. Ganz besonders bevorzugt enthält die Expressionskassette auch eine Enhancersequenz. Die Promoter- und Enhancersequenzen werden vorzugsweise aus den transkriptionalen Regulationssequenzen für Albumin (ALB), alpha-Fetoprotein (AFP), karzino-embroynisches Antigen (CEA), Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase, neuronenspezifische Enolase, saures Glialfibroprotein, Insulin oder gamma-Glutamyltranspeptidase, dopa-Decarboxylase, HER2/neu oder N-myc Oncogen oder anderen geeigneten Genen ausgewählt. Ganz besonders bevorzugt werden Regulationssequenzen für ALB oder AFB für die direkte leberspezifische oder entsprechend hepatomaspezifische Expression eingesetzt.

Die molekulare Chimäre der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von standardmäßigen rekombinanten DNA Techniken hergestellt werden. So wird z. B. die Kodierungssequenz und das Polyadenylierungssignal des VZV Thymidinkinase-(TK)gens (siehe Fig. 2 A und 2 B) in die richtige 3' Orientierung zu den essentiellen ALB oder AFP transkriptionalen Regulationselementen gebracht. Diese molekularen Chimären ermöglichen die selektive Expression des VZVTK in Zellen, die normalerweise ALB oder entsprechend AFP exprimieren (Fig.3 A und 3B). Expression eines VZV TK Gens In der Leber von Säugetieren, Hepatomas, bestimmten Tumoren das Gastrointestinaltrakts, nichtseminatomen Karzinomen des Hoden, bestimmten Teratokarzinomen und anderen Tumoren wird eine selektive Metabolislerung von relativ nichttoxischen Arabinosiden und Pyrimidinen wie hier definiert zu zytotoxischen und/oder zytostatischen Metaboliten bewirken.

Entsprechend wird als zweiter Aspekt eine Methode zur Konstruktion einer molekularen Chimäre zur Verfügung gestellt, indem eine DNA Sequenz, die ein heterologes Enzymgen, z. B. VZV TK kodiert mit einem gewebespezifischen Promoter, verknüpft wird.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Konstruktion eines molekularen Chimäre wie hier definiert zur Verfügung, indem eine DNA Sequenz, die eine Kodesequenz und ein Polyadenylierungssignal des Gens für ein heterologes Enzym, z.B. der VZV Thymidinkinase mit einer säugetiergewebespezifischen transkriptionalen Regulationssequenz (z. B. Promotersequenz und Enhancersequenz) ligiert.

Die VZV Thymidinkinase kodierende Sequenz und das 3' Polyadenylierungssignal liegen in einem ca. 1381 bp Accl/Nde I Restrikt.ionsendonukleasefragment (siehe Fig. 2).

Vorzugsweise ist das 1831 bp Accl/Nde I Fragment mit der VZV TK kodierenden Sequenz und dem Polyadenylierungssignal mit säugetiergewebespezifischen Promoter- und Enhancersequenzen ligiert, obwohl zu berücksichtigen ist, daß auch andere DNA Fragmente mit dem VZV TK Gen verwendet werden können. Weiter könnte das VZV TK Polyadenylierungssignal durch ein anderes geeignetes Polyadenylierungssignal, z. B. vom SV40 Virus oder anderen Säugetiergenen, ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Promoter- und Enhancersequenzen aus transkriptionalen Regulationssequenzen für das Albumin (ALB), alpha-Fetoprotein (AFP), karzinoembryonisches Antigen (CEA), Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase, neuronenspezifische Enolase, saures Glialfibroprotein, Insulin, gamma-Glutamyltranspeptidase, dopa-Decarboxylase, HER2/ neu oder N-myc Oncogene oder anderen geeigneten Genen ausgewählt.

Diese molekularen Chimären können durch ein Übertragungssystem an den Wirkort gebracht werden. Zur Verabreichung am Patienten ist es notwendig, ein effizientes In-vlvo-Übertragungssystem zur Verfugung zu stellen, das die molekulare Chimäre auf stabile Weise in die Zellen integriert. Bekannte Methoden benutzen Techniken der Calciumphosphattransfection, Elektroporation, Mikroinjektion, liposamaler Transfer, ballistic barrage oder retrovirale Infektion. Zum Überblick über dieses Thema siehe BiotechniquaVol.6, Nr.7,1988.

Die Technik der retroviralen Infektion von Zellen :.ur Integration künstlicher Gene verwendet retrovirale Transportvektoren, die zum Stand der Technik gehören (siohe zum Beispiel Mol. CeI. Biol. Aug 86: 2895). Im wesentlichen werden retrovirale Transportvektoren unter Verwendung der DNA Form des in einem Plasmid enthaltenen Retrovirus erzeugt. Diese Plasmide enthalten auch die für die Selektion und Wachstum in Bakte. . ι notwendigen Sequenzen. Retrovirp.ie Transportvektoren werden unter Verwendung der zum Stand der Technik gehörenden standardmäßigen molekularbiolcgischen Techniken konstruiert. In retroviralen Transportvektoren sind die ursprünglichen endogenen retroviralen Gene (z. B. gag, pol und env) entfernt und die interessierenden DNA Sequenzen eingefügt, wie z. B. in der beschriebenen molekularen Chimäre. Sie enthalten jedoch geeignete retrovirale Regulationssequenzen zur viralen Verkapselung, zur proviralen Insertion in das Zielgenom, zum message splicing, Termination und Polyadenylierung. Retrovirale Transportvektoren sind aus dem Moloney Murinleukämievirus (Mo-MLV) gewonnen wordan, aber man sollte auch daran denken, daß auch andere Retroviren verwendet werden können, z. B. das eng verwandte Moloney Murinsarkomavirus. Bestimmte DNA Viren können sich ebenso als nützlich für ein Transportsystem herausstellen. Das Rinderpapillomavirus (BPV) repliziert extrachromosonal, was den Vorteil hat, daß ein hierauf basierendes Transportsystem das übertragene Gen in einem nicht integrierten Zustand enthält.

Es wird also entsprechend einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein retroviraler Transportvektor mit den zuvor beschriebenen Chimären zur Verfügung gestellt.

Die Vorteile eines retroviral vermittelten Gentransfersystems liegen in der hohen Effizienz der Genübertragung an das Zielgewebe in der sequenzspezifischen Integration im Hinblick auf das virale Genom (an den 5' und 3' langen terminalen Wiederholungssequenzen (long terminal repeat) (LTR) und den geringen Umlagerungen der übertragenen DNA im Vergleich zu anderen DNA Übertragungssystemen.

Demzufolge wird in einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung ein retroviraler Transportvektor zur Verfügung gestellt, der eine DNA Sequenz mit einer 5' viralen LTR Sequenz einer cis-wirksamen psi-Verkapselungssequenz, einer molekularen Chimäre wie oben beschrieben und einer 3' viralen LTR Sequenz (Fig.4A und Fig.4 B) enthält. In einer bevorzugten Ausführung, wobei die nicht gewebespezifischen Expression der molekularen Chimäre unterdrückt wird, wird die molekulare Chimäre in entgegengesetzter transkriptionaler Orientierung zum 5' retroviralen LTR (Fig.4 A und Fig.4 B) eingebaut. Zusätzlich kann auch ein dominant selektierbares Markergen mit eingebaut werden, das transkriptional von der 5' LTR Sequenz hergeleitet wurde. Ein solches dominant selektierbares Markergen kann das bakterielle Neomycin-Resistenzgen NEO (Aminoglycosid 3' phosphotransferase) vom Typ Il sein, das eukaryontischen Zellen Resistenz gegenüber dem Neomycinanalog G 418 Sulphat (Geneticin*) verleiht (Fig. 4 A und 4 B). Das NEO Gen unterstützt die Selektion bei der Verpackung der Zollen, die diese Sequenzen enthalten (siehe unten).

Der retrovirale Vektor in den Beispielen leitet sich vom Moloney Murinleukämievirus her, aber man sollte im Auge behalten, daß andere Vektoren ebenfalls verwendet werden kön. n. Solche ein NEO Gen enthaltende Vektoren sind als selektierbare Marker beschrieben worden, zum Beispiel der N2 Vektor (Science 230:1395-1398 [1985]).

Ein bei retroviralen Transportvektoren auftretendes theoretisches Problem ist die Fähigkeit der retroviralen langen-terminalen-Wiederholungs(LTR)-Regulationssequenzen ein zelluläres Oncogen an der Integrationsstelle in das Wirtsgenom zu aktivieren. Dieses Problem kann durch die Herstellung von SIN Vektoren (Fig.4A) vermindert werden. SIN Vektoren sind selbstinaktivierende Vektoren mit einer Deletion der Promoter- und Enhancerregionen in tier retroviralen LTR. Die LTR Sequenzen der SIN Vektoren aktivieren nicht transkriptional 5' oder 3' genomische Sequenzen. Die transkriptionale Inaktivierung der viralen LTR Sequenzen verringert die Insertionsaktivierung von angrenzenden Zielzeil DNA Sequenzen und unterstützt auch die selektive Expression der übertragenen molekularen Chimäre. SIN Vektoren werden durch Entfernung von ca. 299bp in der 3' viralen LTR Sequenz hergestellt (Biotechniques 4,504-512 [1986]).

Daher sind die bevorzugten retroviralen Transportvektoren der vorliegenden Erfindung SIN Vektoren. Da die ursprünglichen retroviralen gag, pol und env Gene aus diesen Transportvektoren entfernt wurden, kann ein Hilfsvirussystem eingesetzt werden, um die gag, pol und env retroviralen Genprodukte In trans zur Verpackung oder Verkapselung des retroviralen Vektors in ein infektiöses Virion zur Verfugung zu stellen. Dies wird durch Verwendung spezialisierter „Verpackungs"-Zellinien erreicht, die in der Lage sind, ein infektiöses synthetisches Virus herzust6ilen, jedoch die Fähigkeit zur Produktion eines detektierbaren Wildtyp-Virus verloren haben. Auf diese Weise enthält das künstliche synthetische

Virus eine Chimäre nach der vorliegenden Erfindung verpackt in synthetische künstliche infektiöse Virionen, die frei vom Hilfsvirus des Wildtyps sind. Dies beruht auf der Tatsache, daß das Hilfsvirus, das stabil in den Verpackungszellen integriert !st,

virale Strukturgene enthält aber keine psi Stelle besitzt, und eine cis-wirksame Regulationssequenz enthält, die im viralengenomischen RNA Molekül vorhanden sein muß, um in ein infektiöses vitales Partikel verkapselt zu werden.

Entsprechend wird als vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein infektiöses Virion zur Verfügung gestellt, das einen

retroviralen Transportvektor wie oben beschrieben enthält, und der Vektor mit viralen Proteinen verkapselt wird, wobei einkünstliches infektiöses replikationsdefektes Retrovirus erzeugt wird.

Vorzugsweise enthält der retrovirale Transportvektor einen Transportvektor, der eine molekulare Chimäre mit der

transkriptionalen Regulationssequenz AFP oder ALB enthält. Insbesondere enthält der Transportvektor eine AFP/VZV TK

Chimäre oder ALB/VZV TK Chimäre. Zusätzlich zur Entfernung der psi Stelle können weitere Änderungen an den Hilfsvirus LTR Regulationssequenzen durchgeführt

werden, um sicherzustellen, daß das Hilfsvirus nicht in Virionen verpackt wird und auf der Ebene der reverser) Transkription undder viralen Integration blockiert wird.

Alternativ können Strukturgene von Hilfsviren (z. B. gag, pol und env) individuell und unabhängig in die Verpackungszellinie

transferiert werden. Da diese viralen Strukturgene von dem Genom der Verpackungszelle getrennt sind, ist die

Wahrscheinlichkeit von unentdeckten Rekombinationen zur Erzeugung des Wildtyp-Virus gering. Als fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Herstellung von infektiösen Virionen gemäß der

vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt, indem ein künstlicher retroviraler Transportvektor mit einer molekularen

Chimäre nach der Erfindung wie oben beschrieben in eine Verpackungszellinie übertragen wird. Die Verpackungszellinie kann ein Helfervirus stabil integriert haben mit einer fehlenden psi Stelle und einer anderen Regulationssequenz wie oben beschrieben, oder alternativ kann die Verpackungszellinie so verändert werden, daß sie Strukturgene des Hilfsvirus im Genom besitzt. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein infektiöses Virion wie oben beschrieben zur Verwendung in der Therapie,

besondere zur Verwendung in der Krebstherapie und ganz besonders zur Verwendung in der Therapie von HCC,nichtseminatomen Karzinom des Hoden, bestimmten Teratokarzinomen und bestimmten gastrointestinal Tumoren zurVerfügung.

Selektive Expression des heterologen Enzyms, insbesondere des VZV Thymidinkintsegens wird unter Verwendung

gewebespezifischer transkriptionaler Regulationssequenzen (z.B. Enhancer und Promoter) erreicht. Zusätzlich kann die

Seiekiiviiäi durch söiaktivs Infektion von Leberzeüen erhöht werden. Das in der Verpackungszellinie vorhandene retrovirale env Gen beschränkt die Spezifität für die Wirtsinfektion. Das zur Konstruktion der Verpackungszellinie verwendete env Gen wird

modifiziert, wobei ein künstliches infektiöses Virion, das selektiv Hepatozyten infiziert, erzeugt wird. Zum Beispiel kann ein ineine Verpackungszellinie eingeführtes retrovirales env Gen in solcher Weise modifiziert werden, daß das Hüllglycoprotein deskünstlichen infektiösen Virions über eine spezifische rezeptorvermittelte Bindung, die durch das Hepatitis B Virus (HBV)bewerkstelligt wird, selektiv Hepatozyten infiziert. HBV infiziert primär Hepatozyten mittels einer spezifischenrezeptorvermittelten Bindung. Die durch die pre-S 1 und pre-S 2 Sequenzen kodierten HBV Proteine spielen eine Hauptrolle in der

Anheftung von HBV an Hepatozyten (Hepadna Viruses, herausgegeben von Robinson et al. 1989,203,205-221,1987). Das env Gen der Verpackungszelle wird so modifiziert, daß es die Hepatozyten-Bindungsstelle des großen S HBV Hüllproteins enthält. Solche in die Verpackungszelle eing aführten Modifikationen des env Gens können durch bekannte standardmäßige

molekularbiologische Techniken vollzogen werden, und sie vermitteln die Aufnahme des Virus in das Zielgewebe.

Das infektiöse Virion gemäß der Erfindung kann durch bekannte Techniken formuliert werden und kann als Formulierung mit

einem pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoff vorliegen. Als pharmazeutisch verwendbare Trägerstoffe kommt zum Beispielein flüssiges Medium in Frage, das geeignet ist, das infektiöse Virion auf den Patienten zu übertragen. Ein Beispiel für einensolchen Trägerstoff ist Salzlösung. Das infektiöse Virion kann als Lösung oder Suspension in einem solchen Träger vorliegen.

Stabilisatoren und Antioxidantien und/oder andere Trägerstoffe können auch in solchen pharmazeutischen Formulierungen

vorhanden sein, die einem Säugetier durch konventionelle Methoden, z. B. oral oder parenteral, verabreicht werden können.

Insbesondere kann das infektiöse Virion durch intravenöse oder intraarterielle Infusion verabreicht werden. Im Fall zur Behandlung von HCC kann eine ititrahepatische arterielle Infusion vorteilhaft sein. Die Erfindung stellt demzufolge eine pharmazeutische Formulierung zur Verfügung, die ein infektiösos Virion in einer Mischung

mit einem pharmazeutisch verwendeten Trägerstoff enthält.

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Herstellungsmethoden für pharmazeutische Formulierungen wie hierin beschrieben

zur Verfügung, indem ein künstliches infektiöses Virion mit einer molekularen Chimäre mit einem pharmazeutisch verwendbaren

Trägerstoff vermischt wird. Es kann jede geeignete Verbindung, die selektiv durch ein Enzym umgewandelt werden kann, verwendet werden, die

vorliegende Erfindung stellt jedoch weiterhin die Verwendung von Verbindungen der Formeln I oder Il zur Herstellung eines

Medikaments für die Krebsbehandlung zur Verfügung, die in der Lage ist, VZV Thymidinkinase zu exprimieren; insbesondere zur Behandlung des Hepatozellularkarzinoms (HCC).

6-substituierte Purinarabinoside der Formel I, seiner Salze und physiologisch funktional entsprechender Substanzen wie untengezeigt

HO

OH

worin Ri ein Halogen, Ci^-Alkoxy, halogensubstituiertes C^-Alkoxy oder eine Aminogruppe ist, die mono- oder disubstituiert ist mit C|_₆-Alkyl, C_t^-Alkyl substituiert von einem oder mehr Fluoratomen, C^-Cycloalkyl, oder mit einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus mit C^-Kohlenstoffatomon und einer optionalen Doppelbindung; R₂ ist Wasserstoff, eine Halogenoder Aminogruppe, wie sie als anti VZV und Cytomegalovirusagentien bekannt sind, ihre Verwendung und Synthese sind in der europäischen Patentanmeldung Nr.0294119 beschrieben

Verbindungen der Formel Il wie unten gezeigt

OH

OH

worin X eine Vinylen- oder Ethynylengruppe darstellt; R₁ stellt eine Oxo- oder Iminogruppe dar; R₂ stellt ein Wasserstoffatom, eine C,_₂-Alkyl, eine verzweigte oder Cycloalkyl C^-Gruppe, z. B. Isopropyl oder Cyclopropyl dar; R₃ stellt ein Wasserstoffatom oder eine Acyl, ζ. B. eine C^-Alkanoyl- oder Bonzoylgruppe, die optional mit einem oder mehr Halogenatomen, Alkyl-, Hydroxyl- oder Alkoxysubstituenten substituiert sein kann, dar; und R₄ stellt ein Wasserstoffatom oder eino Hydroxylgruppe dar; vorausgesetzt, daß (a) wenn R?, Ra und R₄JeWCiIs ein Wasserstoffatom darstellen, Ri keine Oxogruppe ist. Man muß auch berücksichtigen, daß wenn R₃ keine Acy Inruppe ist, die Verbindung der Formeln I oder Il auch in ihrer tautomeren Form vorliegen kann. Bevorzugte Verbindungen der Formeln I und Il sind 9-ß-Arabinofuranosyl-6-methoxy-9H-purin und 1-(ß-D-arabinofuranosyl)-5-propyluracil.

Diese Verbindungen und die Methoden zu ihrer Herstellung sind in der europäischen Patentanmeldung Nr.O272065 offenbart und weisen anti VZV Aktivität auf.

Die oben erwähnten Pyrimidinnukleoside und Purinarabinoside schließen auch pharmazeutisch verwendbare Derivate solcher Verbindungen, z. B. jedes pharmazeutisch verwendbare Salz, Ester oder Salze dieser Ester mit ein, oder auch jede andere Verbindung, die nach Verabreichung am Menschen (direkt oder indirekt) in der Lage ist, die aktiven Metaboliten oder deren Rückstände zur Verfügung zu stellen. Vorzugsweise ist die Verbindung nach oraler Verabreichung aktiv.

Die Mengen und die genaue Dosierung bei der Behandlung wird natürlich in der Verantwortlichkeit des betreuenden Arztes liegen und wird auch von einer Anzahl Faktoren abhängig sein, einschließlich des Typs und der Schwere des zu behandelnden Zustands. Für HCC ist wahrscheinlich eine intrahepatische arterielle Infusion des künstlichen infektiösen Virions mit einem Titer von 2 χ 10⁶und2 χ 10⁷ kolonieformenden Einheiten pro ml (CFU/ml) an infektiösen Virionen für einen typischen Tumor geeignet. Die Gesamtmenge der infusierten Virionen hängt von der Tumorgröße ab und wird wahrscheinlich in mehreren Dosen verabreicht.

Medikamentöse Behandlung - anschließend an die Infektion mit dem infektiösen Virion werden Verbindungen gemäß der Erfindung verabreicht, die eine spezifische VZVTK Aktivität für den kritischen ersten Phosphorylierungsschritt im Anabolismus zu zytotoxischen oder zvtostatischen Metaboliten benötigen.

Die Dosierung des Medikaments liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 250 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag, vorzugsweise 0,1 bis 100mg pro Kilogramm Körpergewicht.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, aber sollten nicht auf sie beschränkt sein.

Beispiel 1

Konstruktion einer transkriptlonalen Regulationssequenz für eine Albumln/VZV Thymldlnklnase molekulare Chimäre Ein ca. 181 bp Accl/Ndel DNA Fragment (alle Restriktionsenzyme stammen entweder von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg MD, USA; New England Biolabs, Mass, USA; oder Promega, Madison, Wi, USA; alle enzymatischen Reaktionen werden wie vom Hersteller spezifiert durchgeführt), das die Kodierungssttquenz und das Polyadenylierungssignal des VZV TK Gens enthält, wurde durch Elektroelution unter Verwendung einer Elutrap-Elektrophoresekammer (Schleicher und Schuell, Keane NH, USA) aus einer Restriktionsendonukleaseverdauung eines ca. 4 896 bp Plasmids, gekennzeichnet als 22TK, das ein ca.

2 200 bp EcoRI/BamHI Fragment des VZV TK Genoms (Virology 149:1-9,1986; zur Verfügung gestellt von J. Ostrove, NIH, Bdthesda, Md.) enthält, gereinigt. Das gereinigte DNA Fragment enthält die gesamte VZV TK Kodierungssequenz -ind das Polyadenylierungssignal, aber es enthält keine VZV TK Promoterelemente (siehe Fig. 2 A und 2 B).

Die 5' überstehenden Enden des gereinigten 1381 bp Accl/Ndel VZVTK Fragments wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment aus E.coli DNA Polymerase I (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) und Deoxynukleotidtriphosphat (dNTPs) glattgemacht.

Ein ca. 5249bp Plasmid, gekennzeichnet als 2335A-1, mit einer ca. 2300bp einer ALB E/P Sequenz wurde von Richard Pamiter (University of Washington, Seatle, Washington, USA) zur Verfügung gestellt. Dieses Konstrukt enthält die für die leberspezifische Expression notwendigen Sequenzen aberweist keine nichtessentiellen intervenierenden Sequenzen auf. Eine einheitlich BamHI Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle ist bei +23 relativ zum Beginn der Transkription vorhanden. 2335A-1 wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdaut und die 5' überstehenden Enden wurde durch Behandlung mit Klonov und dNTPs wie oben beschrieben glattgemacht.

Die ALB E/P VZK TK Chimäre wurde durch Ligation der glatten Enden des Accl-Ndel Fragments mit dem VZV TK kodierenden polyadenylierenden Sequenzen, mit der glatten BamHI Stelle der 2335A-1 unter Verwendung der T4 DNA Ligase zur Herstellung von pCR73 verbunden (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) (Fig. 5). Ähnlich wie bei allen beschriebenen Ligationen wurde die Orientierung der verbundenen Fragmente durch Restriktionsendonukleaseverdauung nach bekannten Methoden bestimmt. Ähnlich wie bei allen Plasmiden, die in den Beispielen beschrieben sind, enthält pCR73 die zur Replikation in Bakterien notwendigen und für die Amplifikation nach Standardmethoden geeigneten essentiellen Sequenzen. Die ALB E/P VZV TK Chimäre wurde durch Elektroelution aus pCR73 als ein ca. 3880bp Sstl/Kpnl Restriktionsendonukleasefragment (Fig.5) gereinigt. Die 3' überstehenden Enden wurden durch Bdhandlung mit T4 DNA Polymerase und dNTPs glattgemacht. Dieses glatte Sstl/Kpnl Restriktionsfragment wurde anschließend in ein retrovirales Transportvektorsystem eines Moloney Murineleukämievirus eingeschleust (siehe unten Beispiel 3).

pCR73 wurde am ATTC am 18. August 1989 unter der Hinterlegungsnummer ATTC68077 hinterlegt.

Beispiel 2

Konstruktion der transkriptlonalen Regulationssequenz der elpha-Fetoproteln/VZV Thymldlnklnase Die VZV Thymidinkinase kodierende Sequenz und die Polyadenylierungsstelle wurde als ein ca. 3300bp BamHI-Xmnl Restriktionsendonukleasefragment aus pCR73 (Fig.6) isoliert. Das 5' überstehende Ende der BamHI Restriktionsendonukleasestelle wurde durch Behandlung mit Klenow und dNTPs glattgemacht. Dieses DNA Fragment enthält die komplette Kodierungssequenz und die Polyadenylierungsstelle des VZV TK Gens aber es enthält keine Enhancer- oder Promotersequenzen. Ein ca. 9996bp Plasmid, pAF5.1-CAT, mit einem ca. 5100bp einer humanen AFP 5' flankierenden DNA wurde von T.Tamaoki, Univ. of Calgary, Kanada zur Verfügung gestellt. Ein DNA Fragment aus dem Bereich von ca. -5,1 kb bis +29 aus dem humanen AFP Gen wurde durch Verdauung von pAF5.1-CAT durch Xmnl und partieller Verdauung mit Hindlll isoliert. Dieses Xmnl/Hindll Fragment wurde mit dem BamHI/Xmnl VZV TK Fragment unter Verwendung einer T4 DNA Ligase unter Erhalt des pCR77 (Fig.6) verbunden. Die AFP E/P VZV TK Chimäre wurde durch Elektroelution aus pCR77 als ca. 6699bp Aatll/Pstl Restriktionsendonukleasefragment gereinigt. Dieses Fragment wurde anschließend mit T4 DNA Polymerase zu dNTPs nach Beispiel 1 unter Erhalt eines glatten Restriktionsfragments behandelt.

pCR77 wurde am ATCC am 18. August 1989 unter der Hinterlegungsnummer ATCC68079 hinterlegt.

Beispiel 3

Konstruktion eines retroviralen Transportvektorkonstrukts enthaltend die mo'iekulare Chimäre aus Beispiel 1 Der retrovirale Transportvektor, pCR74, mit der ALB E/P VZVTK Chimäre wurde durch Ligation des gereinigten Sstl/Kpnl glatten Fragments aus pCR73 mit einem Moloney Murinleukämie retroviralen Vektor, ς^βηηζθίεηηβΐ als N2(XM5) (Science 230:

1395-1398,1985) zur Verfügung gestellt von S.Karrlson, NIH, Bethesda, MD, USA. konstruiert. N 2(XM 5) wurde mit der

Restriktionsendonuklease Xhol ve'daut und die 5' überstehenden Enden wurden durch Behandlung sowohl mit Klenow und dNTPs vor der Ligation mit dem pCR73 Sstl/Kpnl Fragments unter Verwendung von T4 DNA Ligase (Fig. 5) glattgemacht. Der retrovirale Transportvektor pCR74 mit der ALB E/P VZV TK Chimäre wurde durch Restriktionsendonukleasekartierung und DNA Sequenzierung zur Bestätigung der Primärsequenz charakterisiert. Die die Bindungsstelle des ALB E/P zu den VZV TK Sequenzen flankier tnde Sequenz ist in Figur 7 gezeigt

pCR74 wurde am ATCC am 18. August 1989 unter der Hinterlegungsnummer ATCC68078 hinterlegt.

DelspleU

Konstruktion eines retroviralen Transportvektorkonstrukts enthaltend die molekulare Chimäre aus Beispiel 2 Der retrovirale Transportvektor pCR78 (Fig.6) wurde durch Ligation eines gereinigten Aatll/Pstl Fragments aus pCR77 mit der AFP E/P VZV TK Chimäre mit N 2(XM 5) verknüpft, welches mit Xhol verdaut wurde und mit T4 DNA Polymerase und dNTPs, wie

in Beispiel 3 beschrieben, glattgemacht wurde. Der retrovirale Transportvektor pCR78 mit de· AFP E/P VZV TK Chimäre wurdedurch Restriktionsendonukleasekartierung und DNA Sequenzierung zur Bestätigung der Primärsequenz charakterisiert. Die die

Verbindungsstelle von AFP E/P zur VZV TK Sequenz flankierende Sequenz ist in Figur 8 gezeigt.

pCR78 wurde am ATCC am 18. August 1989 unter der Hinterlegungsnummer ATCC68080 hinterlegt.

Beispiel 5 Virusproduktion

Die vom ATCC (ATCC CRL 9078) zur Verfügung gestellte Verpackungszellinie PA 317, die bereits früher beschrieben wurde, besitzt drei Veränderungen innerhalb der 5' LTR psi Regulationssequenz und 3' LTR (Mol. CeI. Biol. 6 Nr.8:2895-2902 [1986]). Die künstlichen retroviralen Konstrukte aus Beispiel 3 und 4 werden durch Elektroporation oder -Infektion in die Verpackungszellinie eingebracht. Für die Elektroporation werden 20pg von linearisierter Plasmid DNA in 2 Millionen PA317 Zellen in einer phosphatgepufferten Saccharoselösung von einem Gesamtvolumen von 0,8ml bei 280 Volt und 25 Mikrofarad Kapazität elektroporiert. Man kann mindestens 150 G418 resistente ΚοΙοηίβη/20μς Plasmid DNA/2 Millionen PA37 Zellen erhalten. Zur Infektion werden 20pg linearisierter Plasmid DNA in 2 Millionen ekotropische Verpackungszellen, zum Beispiel Psi 2 Zellen, elektroporiert. Nach zwei Tagen wird das überstehende Kulturmedium zur Infektion der amphotropischen Verpackungszellinie PA 317 verwendet und G418 resistente Kolonien isoliert. Sowohl bei den Elektroporations- und Infektionstechniken sind die G 418 resistente Kolonien Einzelzellen, die durch die limitierende Verdünnungsmethode Moniert, durch Southern blots analysiert und in NIH 3 T3 Zellen (ATCC) titriert werden, um die höchst produzierende Linie für einen Virus von voller Länge zu identifizieren. Aus den PA317 Zellen mit pCR74 wurden 17 Einzelzellklone isoliert und die DNA aus 10 dieser Klone extrahiert. Extensive Southern blot Analyse unter Verwendung verschiedener Restriktionsendonukleaseenzyme und NEO und VZVTK Sequenzen als radioaktive Hybridisierungssonden wurde mit diesen 10 DNA Proben durchgeführt. Von den 10 analysierten Klonen zeigten zwei keinen Hinweis auf Verkürzung und wurden daher als in voller Länge vorhanden betrachtet. Aus PA317 Zellen mit pCR 78 wurden 29 einzelne Zellklone isoliert und die DNA aus 25 Klonen erhalten. Extensive Southern blot Analyse unter Verwendung verschiedener Restriktionsendonukleaseenzyme und AFP, NEO und VZV TK Sequenzen als radioaktive Hybridisierungssonden wurde mit diesen 25 Proben durchgeführt. Von den 25 analysierten Klonen zeigten 5 keinen Hinweis auf die Verkürzung und wurden als in voller Länge vorhanden angesehen. Jede Verpackungszellinie, die die volle Länge der viralen Sequenz enthielt, wurde in NIH 3T3 Zellen titriert, die unter Verwendung von Standardtechniken Thymidinkinase minus/minus waren.

Beispiel 6 Infektion einer humanen Hepatomazellinie (positive Kontrolle) mit Infektiösen Virionen von voller Länge aus Beispiel 5

enthaltend ALB/VZV TK oder AFP/VZV TK mit anschließender Messung der VZV TK Aktivität, ara ATP Produktion und

Empfindlichkeit Die replikationsdefekten, künstlichen Retroviren mit voller Länge, die die ALB/VZV TK Chimäre oder AFP/VZV TK Chimäre

enthalten, wurden zur Infektion einer humanen Hepatomazellinie, bezeichnet als Hep G 2 (ATCC HB 8065) verwendet.

YnschliePend an die 6nfektion und lelektion auf Amg 4eneticin*/ml wurden die Zellen auf VZV TK Aktivität untersucht. Zusätzlich

wurden die Zellen in Gegenwart von (³H) markierten 9-(B-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin (bezeichnet als ara-m in denfolgenden Tabellen und Figuren) inkubiert und anschließend das ara ATP gemessen Abschließend wurden die Zellen in

Gegenwart der oben erwähnten Verbindung kultiviert und die IC₆O (Wachstumshinhibition) wurden bestimmt. Zellen, die nicht

mit dem Virus oder N 2 Virus infiziert wurden, dienen dabei als Kontrollproben für diese Experimente. Der N 2 Virus enthält kein

VZV TK genetisches Material. In Tabelle 1 wird gezeigt, daß die humanen Hepatomazsllen, die mit Viren, die entweder pCR74 oder pCR78 enthalten, infiziert

sind, 904χ oder 52χ mehr VZV TK Aktivität aufweisen im Vergleich zu den Kontrollzellen.

9-(B-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin (gekennzeichnet als ara-m) kann selektiv durch VZVTK monor losphoryliertwerden mit anschließender Anabolisierung zum zytotoxischen ara ATP. Figur 9 zeigt, daß Hep G 2 Zellen, die mit Viren, welcheentweder pCR74 oder pCR78 enthalten, infiziert wurden und in Gegenwart von (3H) markierten 9-(B-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9³H-purin inkubiert wurden, signifikante Bildung von zytotoxischen (³H) ara ATP zeigten.

Hep G 2 Zellen, die mit replikationsdefekten, künstlichen Retroviren von voller Länge, die die ALB/VZV TK Chimäre (pCR 74) oder AFP/VZV TK (pCR78) Chimäre enthielten, wurden in Gegenwart einer variierenden Menge von 9-(B-D-arabinofuranoxyl)-6-

methoxy- 9 H-purin 5 Tage lang inkubiert und die Wachstumshemmung durch Messung der Zellzahl und des DNA Gehaltsbestimmt.

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die IC₆₀ (50%ige Wachstumshemmung) von 9-(B-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9 H-purin

größer als 2000μΜ in Kontor»- und N2 infizierten Zellen ist. Hep G2 Zellen, die mit replikationsdefekten, künstlichen Retrovirenvon voller Länge, die die ALB/VZV TK Chimäre (pCR 74) oder AFP/VZV TK (pCR78) Chimären enthielten, infiziert wurden, zeigteneine IC₆₀ von 5μΜ bzw. 175μΜ. Einzelzellklonierung von Hep G 2 Zellen mit der AFP/VZV TK (pCR78) Chimäre zeigte, daß die IC₆₀

Werte von 9-'B-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin weiter auf ca. 40μΜ erniedrigt werden können. Beispiel 7 Selektivität der Expression von VZV TK

Fünf humane nichthepatoma Zellinien wurden mit replikationsdefekten, künstlichen Retroviren von voller Länge, die die ALB/VZV TK Chimäre (pCR74) enthielten, infiziert. Diese Zellinien waren WiDR (ATCC CCL218), IMR90 (ATCC CCL186), MCF7 (ATCC HTB 22), Detroit 555 (ATCC CCL110) und SW480 (ATCC CCL228). Nach der Infektion und Selektion auf Geneticin* wurden diese Zellen auf VZV TK Aktivität und Wachstumshemmung in Gegenwart von 9-{B-0-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin wie oben beschrieben untersucht. Es war kein Anstieg der VZV TK Aktivität oder der Empfindlichkeit gegenüber 9-(B-D-arabinofuranosyl)-6-methoxy-9H-purin in diesen fünf nichthepatomen Zellinien, die mit replikationsdefekten, künstlichen Retroviren von voller Länge, welche die ALB/VZV TK Chimäre (pCR74) enthielten, infiziert wurden, festzustellen im Vergleich zu den ursprünglichen nichtinfizierten Zellinien. Dies demonstriert die Selektivität der Expression für VZV TK in Hepatoma im Gegensatz zu nichthepatoma Zellen.

Legende zu den Figuren

Figur 1: schematische Darstellung der Albumin Enhancer- und Promotersequenzen in bezug auf das Albumingen (IA), ein

heterologes Gen (IB) und ein heterologes Gen ohne nichtessentielle Sequenzen

Figur 2: Diagramm des Varicella-Zostor-Thymidinkinase-Gons

Figur2B: VZVTK Gen-TCSequenz

Figur 3A: Albumin transkriptionale Regulationssequeⁿz/VZVTK molekulare Chimäre

Figur 3 B: alpha-Fetoproteln transkriptionale Regulationssequenz/VZV TK molekulare Chimäre

Figur 4: Provirale Form eines die alpha-Fetoprotein/VZV TK molekulare Chimäre enthaltenden Retrovirus

Figur4B: pCR78

Figur 5: Flußdiagramm der Konstruktion des pCR74

Figur 6: Flußdiagramm der Konstruktion des pCR 78

Figur 7: Flanklerende Sequenz von ALB E/P zu VZV TK in pCR 74

Figur8: FlankierendeSequenzvonAFPE/PzuVZVTKinpCR78

Figur 9: Produktion von ara atp in mit Kontrollen, pCR 74 und pCR 78 infizierten Zellen

Tabelle 1

VZVTK Aktivität in Hep G 2 Zellen, die mit replikationsdefekten, künstlichen Retroviren von voller Länge enthaltend die ALB/VZV TK Chimäre (pCR 74) oder die AFP/VZV TK Chimäre (pCR 78) infiziert wurden. Die VZV TK Aktivität wurde als die Menge des innerhalb 30 Minuten phosphorylierten ara M pro mg zelluläres Protein quantifiziert.

Virus VZVTK Enzymaktivität Anstieg

nMol ara MP/ Mg Protein/30 Min. (xfach)

0 0

904 52

Tabelle 2

Wachstumshemmung in Hep G 2 Zellen, die mit replikationsdefekten, künstlichen Retroviren von voller Länge enthaltend die ALB/VZV TK Chimäre (pCR74) oder die AFP/VZV TK Chimäre (pCR 78) infiziert wurden.

—	9
N2	4
pCR74	4521
pCR78	258

Virus IC₆₀ für 9-(B-D-arabinofuranosyl)6-methoxy-9H-purin

>2000μΜ

N2 >2000μΜ

pCR74 5μΜ pCR78 175μΜ

>?9 7 44

Fig. 2 A

Diagramm des Varicella-Zoster-Thymidinkinase-Gens

Acc I

*i*

Ndel

Schlüssel

/77/,

*l*

proteinkodierende Region

Startstelle der Transkriptionsinitiierung Polyadenylierungssignal

Fig. 2 B

Sequenz der Varicella-Zoster-Thymidinkinase-Domäne

Gezeigt ist die Sequenz des VZV TK Gens und die 5' und 3' flankierenden Regionen (Basen 64276 bis 66255 wie berichtet in Gen. Virol. 67: 1759-1816 (1986). Die VZV TATA box und die Polyadenylierung sind unterstrichen. Die Accl und Ndel Restriktionsendonukleasestellen zur Subklonierung des 1.381 bp Accl/Ndel Fragments mit der VZV TK kodierenden Sequenz und dem Polyadenylierungssignal sind dargestellt. Dieses 1.381 bp Fragment ist in der richtigen Orientierung 3' mit leberspezifischen oder hepatomaspezifischen transkriptionalen Regulationssequenzen ligiert, wobei eine leberspezifische oder entsprechende hepatomaspezifische Expression erreicht wird.

FigAA

Provirale Form eines künstlichen retroviralen Transportvektors enthaltend die künstliche molekulare Chimäre der AFP transkriptionalen Regulationssequenzen und die kodierende Sequenz für das VZV TK Gen

,TP

Schlüssel

Richtung der Transkription

Protein kodierende Sequenz

Startstelle der Transkriptionsinitiierung

Polyadenylierungssignal für das VZV TK Gen in 3¹ LTR

JJR Ψ

long terminal repeat Regulationssequenz

psi Stelle, cis-wirkende Regulationssequenz

transkriptionale Regulationssequenzen sind aus dem 3¹ LTR entfernt, wobei ein SIN Vektor (selbst-inaktivierender Vektor)erzeugt wird, SIN Vektoren produzieren einen Provirus, da in die Zielzelle inkorporiert wird, wobei beide LTR transkriptionalen Regulationssequenzen entfernt sind. Auf diese Weise wird ein Provirus mit AFP transkriptionalen Regulationssequenzen (oder anderen wie gezeigt) als einzig wirksame Promotoren und Enhancer im Provirus hergestellt.

FigAB

Provirale Form des künstlichen retroviralen Transportvektors enthaltend die künstliche molekualre Chimäre der AFP transkriptionalen Regulationssequenzen und die Kodierungssequenz für das VZV TK Gen. Dargestellt wird dieser künstliche Transportvektor als Bestandteil eines Plasmids zur Amplifikation in Bakterien. Das dargestellte Plasmid ist ein Derivat von PBR 322, Der Transportvektor ist ein Derivat des Moloney Murinleukämievirus. Solche Transportvektoren aus dem Moloney Murinleukämievirus sind beschrieben worden, wie am N2 Vektor erläutert (Sience 230: 1395-1398 (1985)).

ENZYM

^Stellen

1 HIND3 5 Verknüpfungen'·

2 PST1/XH01 1

3 AAT2/XH01 1

Tic = 1600

pCR78 16322 bp

orH

ι 9 7 A 4

Sequenzen flankierend die Verknüpfungsstelle des Murin ALB E/P mit der VZV TK Sequenz in pCR74. Sequenzen 1-140 sind aus Murin ALB E/P. Sequenzen 141-276 sind aus VZV. Das ALB proximale Promoterelement ist doppelt unterstrichen. Der Beginn der RNA Transkription ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet. Die BamHI Stellt ist unterstrichen. Die senkrechte Linie markiert die Verknüpfungsstelle zwischen den ALB und VZV Sequenzen. Die dargestellte VZV kodierende Sequenz ist translatiert.

10 20 30 40 50 60 ATGGTATGATTTTGTAATGGGGTAGGAACCAATGAAATGCGAGGTAAGTATGGTTAATGA

70 80 90 100 110 * 120 TCTACAGTTATTGGTTAAAGAAGTATATTAGAGCGAGTCTTTCTGCACACAGATCACCTT

130 1401 150 160 170 180

TCCTATCAACCCCGGGATCarACAATAAACATGTCAACGGATAAAACCGATGTAAAAATG

BamHI I MetSerThrAspLysThrAspValLysMet

190 200 210 220 230 240 GGCGTTTTGCGTATTTATTTGGACGGGGCGTATGGAATTGGAAAAACGACCGCCGCCGAA GlyValLeuArglleTyrLeuAspGlyAlaTyrGlylleGlyLysThrThrAlaAlaGlu

250 260 270 GAATTTTTACACCACTTTGCAATAACACCAAACCGG GluPheLeuHisHisPheAlalleThrProAsnArg

Ί 9 7 4 4 7

Sequenzen flankierend die Verknüpfungsstelle des humanen AFP E/P mit den VZV TK Sequenzen in pCR78. Die Sequenzen 1-73 sind aus dem humanen AFP E/P. Die Sequenzen 93-228 sind aus VZV. Die Sequenzen zwischen den beiden senkrechten Linien sind Linkersequenzen. Das AFP proximale Promoterelement ist doppelt unterstrichen. Der Beginn der RNA Transkription ist durch einen Stern (*) markiert. Die dargestellte VZV kodierende Sequenz ist translatiert.

10 20 30 40 * 50 60 GCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACC

70 I 80 90 I 100 110 120

ACTGCCAATAACACCGGATCGCAAGCTGATCCtrACAATAAACATGTCAACGGATAAAACC

I I MetSerThrAspLysThr

130 140 150 160 170 180 GATGTAAAAATGGGCGTTTTGCGTATTTATTTGGACGGGGCGTATGGAATTGGAAAAACG AspValLysMetGlyValLeuArglleTyrLeuAspGlyAlaTyrGlylleGlyLysThr

190 200 210 220

ACCGCCGCCGAAGAATTTTTACACCACTTTGCAATAACACCAAACCGG ThrAlaAlaGluGluPheLeuHisHisPheAlalleThrProAsnArg

Claims (36)

1. Verfahren zur Herstellung einer molekularen Chimäre, dadurch gekennzeichnet, daß eine transkriptionale Regulationssequenz, die selektiv in Säugetierzielzellen aktiviert werden kann, mit einer ein heterologes Enzym kodierenden DNA Sequenz verknüpft wird; das Enzym ist in der Lage, die Produktion eines für die Zielzelle toxischen Wirkstoffs zu katalysieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die transkriptionale Regulationssequenz einen Promoter enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die das Enzym kodierende DNA Sequenz zusätzlich ein Polyadenylierungssignal stromabwärts vom Enzym enthält.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Enhancersequenz mit der das heterologe Enzym kodierenden DNA Sequenz verknüpft wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Promoter aus den Promotoren für Albumin, alpha-Fetoprotein, karzinoembryones Antigen, Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase, neuronenspezifischerEnolase, saurem Glialfibroprotein, Insulin, gamma-Glutamyltranspoptidase, dopa-Decarboxylase, HER2/neu und N-myc Oncogenen ausgewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Enhancer ausgewählt wird aus den Enhancern für Albumin, alpha-Fetoprotein, karzinoembryones Antigen, Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase, saurem Glialfibroprotein, Insulin, gamma-Glutamyltranspeptidase, dopa-Decarboxylase, HER2/neu und N-myc Oncogenen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt wird aus Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase, Carboxypeptidase G 2, alkalischer Phosphatase, Penicillin-V Amidase und Cytosindeaminase aus Nichtsäugetieren.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym die Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase ist.

9. Verfahren zur Herstellung einer molekularen Chimäre, dadurch gekennzeichnet, daß eine

DNA Sequenz, die das Gen für die Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase kodiert, wirksam mit der transkriptionalen Regulationssequenz für Albumin verknüpft wird, wobei in diesem Verfahren die DNA Sequenz mit der transkriptionalon Regulationssequenz verknüpft wird.

10. Verfahren zur Herstellung einer molekularen Chimäre, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA Sequenz, welche die Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase kodiert, wirksam mit der transkriptionalen Regulationssequenz für das alpha-Fetoprotein verknüpft wird, wobei in diesem Verfahren die DNA Sequenz mit der transkriptionalen Regulationssequenz verknüpft wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines retroviralen Transportvektors enthaltend eine molekulare Chimäre hergestellt nach einem Verfahren d&r Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA Sequenzen ligiert werden, die eine 5' virale LTR Sequenz, eine cis-wirkende psi Verkapselungssequenz, die molekulare Chimäre hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, und ein 3' virales LTR enthalten.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die molekulare Chimäre entgegengesetzt zur transkriptionalen Orientierung zur 5' viralen LTR Sequenz eingebaut wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein selektierbares Markergen zusätzlich in den retroviralen Transportvektor inkorporiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das selektierbare Markergen das Aminoglycosid3'-phosphotransferaseTyp Il (NEO) Gen ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Virions, dadurch gekennzeichnet, daß ein retroviraler Transportvektor, hergestellt nach einem der Ansprüche 11 bis 14, in das Virion verkapselt wird.

16. Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Virions, dadurch gekennzeichnet, daß ein retroviraler Transportvektor in eine Verpackungszellinie übertragen wird.

17. Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Virions, das zur selektiven Infektion einer Zielzelle in der Lage ist, dadurch gekennzeichnet, daß das env Protein des Virions modifiziert wird, um die Zellbindung am Zielgewebe zu vermitteln.

18. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß ein infektiöses Virion, hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 11 bis 15, mit einem pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoff gemischt wird.

19. Molekulare Chimäre, dadurch gekennzeichnet, daß eine transkriptionale Regulationssequenz, die se'ektiv in Säugatierzellen aktiviert werden kann, mit einer ein heterologes Enzym kodierenden DNA Sequenz verknüpft ist, wobei das Enzym in der Lage ist, die Produktion eines für das Zielgewebe toxischen Wirkstoffs zu katalysieren.

20. Molekulare Chimäre nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die transkriptionale Regulationssequenz einen Promoter enthält.

21. Molekulare Chimäre nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die das Enzym kodierende DNA Sequenz zusätzlich ein Polyadenylierungssignal stromabwärts vom Enzym enthält.

22. Molekulare Chimäre nach den Ansprüchen 19,20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Enhancersequenz mit der das heterologe Enzym kodierenden DNA Sequenz verknüpft ist.

23. Molekulare Chimäre nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Promoter aus den Promotoren für Albumin, alpha-Fetoprotein, karzinoembryones Antigen, Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase, neuronenspezifischer Enolase, saurem Glialfibroprotein, Insulin, gamma-Glutamyltranspeptidase, dopa-Decarboxylase, HER2/neu und N-myc Oncogenen ausgewählt ist.

24. Molekulare Chimäre nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Enhancer ausgewählt ist aus den Enhancern für Albumin, alpha-Feroprotein, karzinoembryones Antigen, Tyrosinhydroxylase, Cholinacetyltransferase, saurem Glialfibroprotein, Insulin, gamma-Glutamyltranspeptidase, dopa-Decarboxylase, HER2/neu und N-myc Oncogenen.

25. Molekulare Chimäre nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt ist, aus Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase, Carboxypeptidase G 2, alkalischer Phosphatase, Penicilin-V Amidase und Cytosindeaminase aus Nichtsäugetieren.

26. Molekulare Chimäre nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym die Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase ist.

27. Molekulare Chimäre, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA Sequenz, die das Gen für die Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase kodiert, wirksam mit der transkriptionalen Regulationssequenz für Albumin verknüpft ist, wobei die DNA Sequenz mit der transkriptionalen Regulationssequenz verknüpft ist.

28. Molekulare Chimäre, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA Sequenz, welche die Varicella-Zoster-Virus-Thyrnidinkinase kodiert, wirksam mit der transkriptionalen Regulationssequenz für das alpha-Fetoprotein verknüpft ist, wobei die DNA Sequenz mit der transkriptionalen Regulationssequenz verknüpft ist.

29. Retroviraler Transportvektor enthaltend eine molekulare Chimäre nach Anspruch 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet daß die DNA Sequenzen iigiert sind, die eine 5' virale LTR Sequenz, eine cis-wirkende psi Verkapselungssequenz, die molekulare Chimäre nach einem der Ansprüche bis 28, und ein 3' yirales LTR enthalten.

30. Transportvektor nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die molekulare Chimäre entgegengesetzt zur'' ^nskriptionalen Orientierung zur 5^r viralen LTR Sequenz eingebaut ist.

31. Transportvektor nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß ein selektierbares Markergen zusätzlich in den retroviralen Transportvektor inkorporiert ist.

32. Transportvektor nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das selektierbare Markergen das Aminoglycosid 3'-phosphotransferaseTyp Il (NEO) Gen ist.

33. Infektiöses Virion, dadurch gekennzeichnet, daß ein retroviraler Transportvektor nach einem der Ansprüche 29 bis 32, in dem Virion verkapselt ist.

34. Infektiöser Virion, dadurch gekennzeichnet, daß ein retroviraler Transportvektor in eine Verpackungszellinie übertragen ist.

35. Infektiöser Virion, das zur selektiven Infektion eines Zielgewebes in der Lage ist, dadurch gekennzeichnet, daß das env Protein des Virions modifiziert ist, um die Zellbindung am Zielgewebe zu vermitteln.

36. Pharmazeutische Formulierung zur Krebstherapie, dadurch gekennzeichnet, daß ein infektiöses Virion nach Anspruch 29 bis 32, im Gemisch mit einem pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoff vorliegt.

Hierzu 14 Seiten Zeichnungen