JPH03172189A - がん治療のための新規キメラ状分子 - Google Patents
がん治療のための新規キメラ状分子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、キメラ状分子、感染性ウイルス粒子、それら
の構築の方法、それら金含む薬剤用製剤、治療、特κウ
イルスよク標的を定められた酵素一プロドラグ治療、特
Ｋｌ！ｉｏ治療、さらに、特κ肝細胞がんの治療Ｖｃか
けるそれらの使用、及びウイルスによシ標的を定めらｆ
′Ｌた酵素−プ■ド２グ治療におけるプリンアラビノシ
ド中置換ビリミクンのような細胞毒性またはＩＩＩＡ＋
＠静止性代謝物へ、異種酵素によって触媒される薬剤の
使用に関する０すぺでの形のがんは、世界甲の病気の主
な原因の１つである０がん化学療法の領域ＫＴｈける研
究によシ、種々効力の異なる、様々な抗がん剤が産み出
されてきた０臨床的κ用いられる＃Ａ珈的な薬剤には、
アドリアマイシン、アクチノマイシンＤ１メトトレキセ
ー｝、５−７ルオロクラシル、シスプラチン、ピンクリ
スチン、及びピンプラスチンがあるｏしかし、これら現
在利用できる抗がん剤は、働全な細胞κ対する毒性、及
びあるがんのタイプの低抗性のような種々の欠点をもっ
ていることが知られている０手術のような他の形の治療
法が知られているｏしかし、こＯ道Ｋｆ１通している人
κよジ、がん治療孤ついての新規のアプローチと具体化
物が必要とされていることは正し＜ｉｉｉｍされている
０ 肺細胞のかん（ ＨＯＣ ）は、今日世界での主要な悪
性病の１つであｐ１ 日本、中国やその他のアグアの地
域、そしてサハラ砂漠以南のアフリカＫｓｉｐいて、発
病率が最大である．Ｎ−ロツバと北アメリカにおけるＨ
ＯＱが増加しつつあることが、最近の証拠から示唆てれ
ている０この病気は、約１．２ ５ ０，０ ０ ０人
の死亡の原因となっているか、死亡に関与しているもの
と推定され、それ自体数字的に世界の主要な悪性病の１
つでめるＯＨＯＯの予後は常に悪く、世界規模での発症
率は、ほとんど死亡率κ等しい０診断後の生存期間の中
央値は、４ケ月足らずである０診断後１年を越える生存
として定義される長期生存は、希にしかみられないｏ
Ｈｏｏ ｌＡ＠は、その大抵が、多量の出血を伴うか伴
わないか、いずれかの肝不全、または悪液質、栄養不良
、感染そして敗血症を伴う大きながんの重圧の一般的作
用で＠れる０離れた部位への転移も起るけれどもＣＩＢ
１１の９０１１でか、死亡時ｒｃは転移を起している）
、局所病巣κよ夕，生存が劃限されることが最も多い０
したがって、転移疾患の処置も極めて重要であると評価
されるが、肝臓がんの制御くむけられた治療が適切であ
る６ （ ｘ＠Ｗ Ｍ．Ｏ．Ｐｏｇｔｇｒａｄｔｉａｔ
ｅ Ｍｓｏｌｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ５９（補遺）７
８−８７（１９８３）及びＢｅｒｋ．Ｐ．（１（１）
８ｅｍｉｎａｒｓ ｌｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｓａｓｅ
４、ぬ２翫Ｔｈｉｅｍｅ−８ｔｒａｔｔｏｎ工ｎｃ．
Ｎ．Ｙ，Ｎ，Ｙ （ １ ９ ８ ４ ） ）ｏ臨床
家にとって、利用できる現在の治療法は、この病気が治
るかどうかという点からは、全般的には効果がない［
ＮｅｒｓｎＢｔｏｎｓら、Ｏａｎｃｅｒ丁ｒｅａｔｍｅ
ｎｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ １ ５、 １ −
３ １ （１９８８））．今日迄手術だけが治癒的
である可能性がある＠しかし、診断時にかいては、患者
の圧倒的多数は、根治手術を受けることができない０あ
る研究１ｃ＞いては（ Ｎｓｒｅｎｓｔｏｎｅら、上記
）％ｊＢ，１ｌの５嘩未満が手術を受けられ、そうする
ことができる百分率のうち５０嘩が、手術後の病気て苦
しむ（ Ｎｅｒｅｎｓｔｏｎｅら、上記）。
の構築の方法、それら金含む薬剤用製剤、治療、特κウ
イルスよク標的を定められた酵素一プロドラグ治療、特
Ｋｌ！ｉｏ治療、さらに、特κ肝細胞がんの治療Ｖｃか
けるそれらの使用、及びウイルスによシ標的を定めらｆ
′Ｌた酵素−プ■ド２グ治療におけるプリンアラビノシ
ド中置換ビリミクンのような細胞毒性またはＩＩＩＡ＋
＠静止性代謝物へ、異種酵素によって触媒される薬剤の
使用に関する０すぺでの形のがんは、世界甲の病気の主
な原因の１つである０がん化学療法の領域ＫＴｈける研
究によシ、種々効力の異なる、様々な抗がん剤が産み出
されてきた０臨床的κ用いられる＃Ａ珈的な薬剤には、
アドリアマイシン、アクチノマイシンＤ１メトトレキセ
ー｝、５−７ルオロクラシル、シスプラチン、ピンクリ
スチン、及びピンプラスチンがあるｏしかし、これら現
在利用できる抗がん剤は、働全な細胞κ対する毒性、及
びあるがんのタイプの低抗性のような種々の欠点をもっ
ていることが知られている０手術のような他の形の治療
法が知られているｏしかし、こＯ道Ｋｆ１通している人
κよジ、がん治療孤ついての新規のアプローチと具体化
物が必要とされていることは正し＜ｉｉｉｍされている
０ 肺細胞のかん（ ＨＯＣ ）は、今日世界での主要な悪
性病の１つであｐ１ 日本、中国やその他のアグアの地
域、そしてサハラ砂漠以南のアフリカＫｓｉｐいて、発
病率が最大である．Ｎ−ロツバと北アメリカにおけるＨ
ＯＱが増加しつつあることが、最近の証拠から示唆てれ
ている０この病気は、約１．２ ５ ０，０ ０ ０人
の死亡の原因となっているか、死亡に関与しているもの
と推定され、それ自体数字的に世界の主要な悪性病の１
つでめるＯＨＯＯの予後は常に悪く、世界規模での発症
率は、ほとんど死亡率κ等しい０診断後の生存期間の中
央値は、４ケ月足らずである０診断後１年を越える生存
として定義される長期生存は、希にしかみられないｏ
Ｈｏｏ ｌＡ＠は、その大抵が、多量の出血を伴うか伴
わないか、いずれかの肝不全、または悪液質、栄養不良
、感染そして敗血症を伴う大きながんの重圧の一般的作
用で＠れる０離れた部位への転移も起るけれどもＣＩＢ
１１の９０１１でか、死亡時ｒｃは転移を起している）
、局所病巣κよ夕，生存が劃限されることが最も多い０
したがって、転移疾患の処置も極めて重要であると評価
されるが、肝臓がんの制御くむけられた治療が適切であ
る６ （ ｘ＠Ｗ Ｍ．Ｏ．Ｐｏｇｔｇｒａｄｔｉａｔ
ｅ Ｍｓｏｌｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ５９（補遺）７
８−８７（１９８３）及びＢｅｒｋ．Ｐ．（１（１）
８ｅｍｉｎａｒｓ ｌｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｓａｓｅ
４、ぬ２翫Ｔｈｉｅｍｅ−８ｔｒａｔｔｏｎ工ｎｃ．
Ｎ．Ｙ，Ｎ，Ｙ （ １ ９ ８ ４ ） ）ｏ臨床
家にとって、利用できる現在の治療法は、この病気が治
るかどうかという点からは、全般的には効果がない［
ＮｅｒｓｎＢｔｏｎｓら、Ｏａｎｃｅｒ丁ｒｅａｔｍｅ
ｎｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ １ ５、 １ −
３ １ （１９８８））．今日迄手術だけが治癒的
である可能性がある＠しかし、診断時にかいては、患者
の圧倒的多数は、根治手術を受けることができない０あ
る研究１ｃ＞いては（ Ｎｓｒｅｎｓｔｏｎｅら、上記
）％ｊＢ，１ｌの５嘩未満が手術を受けられ、そうする
ことができる百分率のうち５０嘩が、手術後の病気て苦
しむ（ Ｎｅｒｅｎｓｔｏｎｅら、上記）。
全身的な単剤または複合剤楽による治療と放射線治療は
比較的効果がなく、このことによシ、この疾患の治療の
ための新しいアプローチと治療法の必要が強調される。
比較的効果がなく、このことによシ、この疾患の治療の
ための新しいアプローチと治療法の必要が強調される。
ひとたび遺伝子がその特殊標的細胞の表現型を変えるた
めκ配置されるならば、遺伝子療法には、新しい遺伝子
の特殊な標的細胞への安定的な統合と、これらの遺伝子
の発現が関与する（Ｗｇ説としては％Ａｎｌａｒｓｏｎ
．Ｗ，ＩＦ．，８ｃｉｅｎｅ●２２６；４０１−４ ０
９ 、１ ９ ８ ４ ； Ｍｅ Ｏｏｒｍｉｃｋ，
Ｄ，ＢｉｏｔｅａｈｎｏｌｏＵ３；６９０−６９３，１
９８５を参照のこと）０遺伝子治療は、Ｌｅｅｃｈ Ｎ
ｙｈａｎ病におけるヒボキサンチンーグアエンホスホリ
ボシルト２冫スフエラーゼ、宜篤な免疫不全病における
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び重篇な複合免疫
不全症κシけるアデノシンデアミナーゼのような、１つ
の欠陥性のまたは欠失した酔素の置換會含む遺伝学的病
気の治療のために有益であると思われるｏしかし、今迄
のところ、ある疾患では、ある型の遺伝子治療の使用が
近く行九そうではおるが、遺伝子治療が臨床で行われた
ことはない０ 本発明看によって、細胞毒性ｔｆｃは細胞静止性？謝物
に選択的■変換することができる化学薬剤で、選択的に
哺乳類のかん細胞の生長を止め九ｂ１細胞を殺したタす
ることが可能であることが見出さｆ′Ｌ７２：０こｆ′
Ｌ／Ｉｉ、がん細胞のような標的細胞において、選択的
に活性化される＠標的組織特異性”転写調節配列（テＲ
ｆｌ）：この配列は、異種酵素の発現七制御する〇 このキメラ状の分子は、適当なベクターを媒介として操
作され、また感染性のウィルス粒子中に組込むことがで
きる●このキメラ状分子を含むウイルス粒子ｔ−ｆｉ１
１に投与するとき、問題の酵素が標的細胞にかいて選択
的κ発現される０その酵素によって、さらκ細胞毒性ｌ
たは細胞静止性剤に代謝されるか、実際に細胞毒性１た
は静止性剤である代謝物へ選択的に代謝される化合物の
投与は、そのと１！生体位で達成されることができる〇
本発明は、一般的κ適用でき、肝細胞がんに関して具体
的に例証さＩＬる〇 上述の如く、肝細胞がんを患っている圧倒的な百分率の
．＠渚が、原発がんから死亡する０しかしＨＣＯ ！！
１渚の約９０％は、死亡時に明らかな転移がんを有して
いる０これらの転移は、原発がんの典型的な表現型を示
し、これらの転移癌それ自体も異種酵素を選択的に発現
し、かくして、投与された、本発明の詳細な説明にかい
て明確化されたような化合物を細胞毒性、またはｍｊＩ
ｉｌ静止性代謝物へと選択的に活性化する０ 多数の酵素とプロドラグの組合せを使用することができ
る；問題とする酵素を提供することκよク、投与さｔＬ
＊化合物を、直接または甲間体を通って細胞毒性１たは
細胞静止性代謝物へ選択的κ活性化することができる０
同様に、化合物の選択は、使用とれる酵素系に声存する
ｏしかし、化合物は、その＃素Ｋ：よって直接的または
間接的κ、細胞毒性１たは細胞静止性代謝物へ選択的に
代闘さｆ′Ｌなげればないー本発ＱｌｉＩＣかいて使用
されている異槽酵紮という用暗は，適切な選択性の特徴
を示す異種ｌＷ識ｔいうＯ ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｍｏ８ｔｅｒ ｖｉｒｕｓ （
（ＶＺＶ）、水痘一帯状疱疹ウィルス〕は、特異的なチ
ミジンキナーゼタンパク質をコードする０この遺伝子は
クローニングされ、配列を決め、そして、１！！ｆ徴づ
けが行われている（ Ｊ，（｝＠ｎ，Ｖｉｒｏｌ， ６
７ ： １ ７ ５ ９ −１ ８ １ ６ （ １
９ ８ ６ ） ） ． ｖｚｖチミクン９キナーゼ
は、補乳動物の酵素と対照的に、特定のプリンアラビノ
シド及び置換ビリミクン化合物を選択的κモノリン酸化
する０その上、発明名は、あるプリンとビリミゾ７類縁
体、特κ本発明中で定義された式（１）と（冨）の化合
物は、選択的にＶＺＶ ｆζゾンキナーゼを発現するよ
うに、遺伝的κ修飾されている脣定の哺乳細胞において
、細胞毒性または細胞静止性代謝物κ変換されることを
見出しｆｌｏ例えば、９−（β−Ｄ−アラピノ７−）ノ
シル）−６一メトキシー９Ｈ−プリンは、９−β−Ｄ−
アラピノフラノシルアデニントリホスフエート［ Ａｒ
ａＡＴＰ 〕κ変換される０ 他の酵素プロドラグの船合せには、バクテリアの（例え
ば、Ｐｓｅｕｌｏｍｏｎａｓから）酵素カルポキシペプ
チターゼＧ２とプロドラグ パラーＮ−ビス（２−クロ
ロエチル）アξノベンゾイルグルタミ冫酸がある０この
化合物からのグルタミン酸部分の開裂は、有毒な安息香
酸マスタードを遊離する；例えば、コウシの小腸からの
アルカリ性ホスファターゼ、エトボサイドーホス７エー
ト、ドキソルピシンーホス７エート、マイトマイシンホ
スフエートのような不活性リン酸化化合物を毒性の脱リ
ン酸化代謝物へ変換するＯペニシリンーＶアミダーゼは
、ドキンルビシンの７エノキシアセトアミド誘導体及び
メルファランを毒性代謝物へ変換？シンデアミナーぜは
、５−７ルオロシトシンを［毒な５−フルオロウラクル
κ変えるＯ哺乳動物細胞κかいては、ある遺伝子は、普
通的■発現されるｏしかし、遺伝子は、多くが、特定の
時期に、セして／ｌたは、組ＩＩ＆特異的万法で発現さ
れるか、細胞外部からのインデューサー■応答して活性
化されるＯ例えば、ある遺伝子は、個体発生の極めて特
定の時期に、特有の細胞型にかいてのみ、またある誘発
刺戟■答えて、活発６転写される０この鯛節は、一部は
、転写調節配列（例えばプロモーター及び工冫一冫サ一
の調節ＤＮＡ配列）と配列特異的なＤＮＡ一結合転写タ
ンパク質因子との間の相互作用によって媒介される０本
発明者らは、本発明中にかいてずでκ明確にされたよう
なＪ！種酵素、例えばテミクンキナーゼ′ｌｔ選択的κ
発現するためκ、ある啼乳動物の組織、例えば肝組織ま
たは形質転換した組織を変化させることが可能であるこ
とを見出した０このことは、発現カセットにおけるキメ
ラ状分子の構築によって達成される〇 発現カセットそれ自身は、分子生物学ではよく知られて
いる０このような発現カセクトは、補乳類細胞中の異種
酵素の発現に必要とされる必須のＤＮＡすべてを含んで
いる０例えば、よｐ好ましい発現カセットは、ＶＺＶτ
Ｋｔ−コードする配列、哺乳類遺伝子のための適切なボ
リアデエル化シグナル（すなわち、啼乳類細胞で機能す
る１つのポリアデニル化シグナル）と正しい配位にある
適切なエンハンサーとプロモーター配列を含むキメラ分
子を含む。
めκ配置されるならば、遺伝子療法には、新しい遺伝子
の特殊な標的細胞への安定的な統合と、これらの遺伝子
の発現が関与する（Ｗｇ説としては％Ａｎｌａｒｓｏｎ
．Ｗ，ＩＦ．，８ｃｉｅｎｅ●２２６；４０１−４ ０
９ 、１ ９ ８ ４ ； Ｍｅ Ｏｏｒｍｉｃｋ，
Ｄ，ＢｉｏｔｅａｈｎｏｌｏＵ３；６９０−６９３，１
９８５を参照のこと）０遺伝子治療は、Ｌｅｅｃｈ Ｎ
ｙｈａｎ病におけるヒボキサンチンーグアエンホスホリ
ボシルト２冫スフエラーゼ、宜篤な免疫不全病における
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び重篇な複合免疫
不全症κシけるアデノシンデアミナーゼのような、１つ
の欠陥性のまたは欠失した酔素の置換會含む遺伝学的病
気の治療のために有益であると思われるｏしかし、今迄
のところ、ある疾患では、ある型の遺伝子治療の使用が
近く行九そうではおるが、遺伝子治療が臨床で行われた
ことはない０ 本発明看によって、細胞毒性ｔｆｃは細胞静止性？謝物
に選択的■変換することができる化学薬剤で、選択的に
哺乳類のかん細胞の生長を止め九ｂ１細胞を殺したタす
ることが可能であることが見出さｆ′Ｌ７２：０こｆ′
Ｌ／Ｉｉ、がん細胞のような標的細胞において、選択的
に活性化される＠標的組織特異性”転写調節配列（テＲ
ｆｌ）：この配列は、異種酵素の発現七制御する〇 このキメラ状の分子は、適当なベクターを媒介として操
作され、また感染性のウィルス粒子中に組込むことがで
きる●このキメラ状分子を含むウイルス粒子ｔ−ｆｉ１
１に投与するとき、問題の酵素が標的細胞にかいて選択
的κ発現される０その酵素によって、さらκ細胞毒性ｌ
たは細胞静止性剤に代謝されるか、実際に細胞毒性１た
は静止性剤である代謝物へ選択的に代謝される化合物の
投与は、そのと１！生体位で達成されることができる〇
本発明は、一般的κ適用でき、肝細胞がんに関して具体
的に例証さＩＬる〇 上述の如く、肝細胞がんを患っている圧倒的な百分率の
．＠渚が、原発がんから死亡する０しかしＨＣＯ ！！
１渚の約９０％は、死亡時に明らかな転移がんを有して
いる０これらの転移は、原発がんの典型的な表現型を示
し、これらの転移癌それ自体も異種酵素を選択的に発現
し、かくして、投与された、本発明の詳細な説明にかい
て明確化されたような化合物を細胞毒性、またはｍｊＩ
ｉｌ静止性代謝物へと選択的に活性化する０ 多数の酵素とプロドラグの組合せを使用することができ
る；問題とする酵素を提供することκよク、投与さｔＬ
＊化合物を、直接または甲間体を通って細胞毒性１たは
細胞静止性代謝物へ選択的κ活性化することができる０
同様に、化合物の選択は、使用とれる酵素系に声存する
ｏしかし、化合物は、その＃素Ｋ：よって直接的または
間接的κ、細胞毒性１たは細胞静止性代謝物へ選択的に
代闘さｆ′Ｌなげればないー本発ＱｌｉＩＣかいて使用
されている異槽酵紮という用暗は，適切な選択性の特徴
を示す異種ｌＷ識ｔいうＯ ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｍｏ８ｔｅｒ ｖｉｒｕｓ （
（ＶＺＶ）、水痘一帯状疱疹ウィルス〕は、特異的なチ
ミジンキナーゼタンパク質をコードする０この遺伝子は
クローニングされ、配列を決め、そして、１！！ｆ徴づ
けが行われている（ Ｊ，（｝＠ｎ，Ｖｉｒｏｌ， ６
７ ： １ ７ ５ ９ −１ ８ １ ６ （ １
９ ８ ６ ） ） ． ｖｚｖチミクン９キナーゼ
は、補乳動物の酵素と対照的に、特定のプリンアラビノ
シド及び置換ビリミクン化合物を選択的κモノリン酸化
する０その上、発明名は、あるプリンとビリミゾ７類縁
体、特κ本発明中で定義された式（１）と（冨）の化合
物は、選択的にＶＺＶ ｆζゾンキナーゼを発現するよ
うに、遺伝的κ修飾されている脣定の哺乳細胞において
、細胞毒性または細胞静止性代謝物κ変換されることを
見出しｆｌｏ例えば、９−（β−Ｄ−アラピノ７−）ノ
シル）−６一メトキシー９Ｈ−プリンは、９−β−Ｄ−
アラピノフラノシルアデニントリホスフエート［ Ａｒ
ａＡＴＰ 〕κ変換される０ 他の酵素プロドラグの船合せには、バクテリアの（例え
ば、Ｐｓｅｕｌｏｍｏｎａｓから）酵素カルポキシペプ
チターゼＧ２とプロドラグ パラーＮ−ビス（２−クロ
ロエチル）アξノベンゾイルグルタミ冫酸がある０この
化合物からのグルタミン酸部分の開裂は、有毒な安息香
酸マスタードを遊離する；例えば、コウシの小腸からの
アルカリ性ホスファターゼ、エトボサイドーホス７エー
ト、ドキソルピシンーホス７エート、マイトマイシンホ
スフエートのような不活性リン酸化化合物を毒性の脱リ
ン酸化代謝物へ変換するＯペニシリンーＶアミダーゼは
、ドキンルビシンの７エノキシアセトアミド誘導体及び
メルファランを毒性代謝物へ変換？シンデアミナーぜは
、５−７ルオロシトシンを［毒な５−フルオロウラクル
κ変えるＯ哺乳動物細胞κかいては、ある遺伝子は、普
通的■発現されるｏしかし、遺伝子は、多くが、特定の
時期に、セして／ｌたは、組ＩＩ＆特異的万法で発現さ
れるか、細胞外部からのインデューサー■応答して活性
化されるＯ例えば、ある遺伝子は、個体発生の極めて特
定の時期に、特有の細胞型にかいてのみ、またある誘発
刺戟■答えて、活発６転写される０この鯛節は、一部は
、転写調節配列（例えばプロモーター及び工冫一冫サ一
の調節ＤＮＡ配列）と配列特異的なＤＮＡ一結合転写タ
ンパク質因子との間の相互作用によって媒介される０本
発明者らは、本発明中にかいてずでκ明確にされたよう
なＪ！種酵素、例えばテミクンキナーゼ′ｌｔ選択的κ
発現するためκ、ある啼乳動物の組織、例えば肝組織ま
たは形質転換した組織を変化させることが可能であるこ
とを見出した０このことは、発現カセットにおけるキメ
ラ状分子の構築によって達成される〇 発現カセットそれ自身は、分子生物学ではよく知られて
いる０このような発現カセクトは、補乳類細胞中の異種
酵素の発現に必要とされる必須のＤＮＡすべてを含んで
いる０例えば、よｐ好ましい発現カセットは、ＶＺＶτ
Ｋｔ−コードする配列、哺乳類遺伝子のための適切なボ
リアデエル化シグナル（すなわち、啼乳類細胞で機能す
る１つのポリアデニル化シグナル）と正しい配位にある
適切なエンハンサーとプロモーター配列を含むキメラ分
子を含む。
咄乳動物の細胞に訃いては、通常啼乳動物細胞中のメツ
センゾヤーＲＮＡｓをコードする遺伝子の完全で能率の
よい転写調節のためκは、２つの１）ＨＡ 配列、つｔ
，ｐ、プロモーターとエンハンサーが必要である０プロ
モーターは、転写開始位置からすぐの上流（５′）に位
置しているＯプロモーター配列は、転写の正確で能率的
な開始のためκ必要である０異なる遺伝子特異性プロモ
ーターから共通な組織化のパターンが明らかとなるＯ典
型的なプロモーターには、ＡＴ Ｋ富んだＴＡＴＡボッ
クスと呼ばれる領域（転写開始部位κ対して、約５０塩
基５′側κ位置している）、そして、１つ以上の上流プ
ロモーター要素（ ｔｒｐｍ ）が含まれている０この
ＵＰＫｓが、配列Ｉｆ！ｆ異的核の転写因子との相互作
用の原則標的である０プロモーター配列の活性は、二冫
一冫サーと呼ばれる他の配列κよって調節されている０
工冫一冫サー配列は、上ｆＬ（５’）か下流（ぎ）＆Ｃ
位置していてプロモーターから太き＜ｍれでいてもよい
０それゆえ、エンハンサーは、方向と位置に無関係なや
シ万で作用するＯしかし、互いκ交換し得る同様危構造
的組織体と機能に基いて、プロモーターと工冫一ンサー
の間の絶対的区別は、幾分任意的である０工冫一ンサー
は、プロモーター配列による転写の速度を増す〇啼乳動
物ａ胞が、組織特異的遺伝子発現を達成できるようにす
るのは、主として配列特異的転写要因とエンハンサー配
列との間の相互作用であるＯＵＰＩＣに結合するこのよ
うな転写タンパク質要因（組織！Ａ的、トランス活性化
要因）及びエンーンサ−（シス−作用性、調節配列）の
存在κよク、ＲＮＡボリメ？−ｔ”ｔ−はじめとする転
写のからくシの他の！素がｍＩ＆特異的選択性及び精度
をもって転写ができるよ５Ｋなる〇 転写調節配列、特にプロモーターと二冫ハンサ−の配列
）の選択は、標的組織に依存する０例の中には、それぞ
れ、正常な肝細胞と形質転換肝細胞に特有なアルプミン
（ ＡＩ，Ｂ ）とアルファーフエトプロテイン（ Ａ
ＦＰ ）転写配列；胃腸管、肺、胸部及び他の組織の形
質転換細胞にかいて使用するためのがん胎児性抗Ｍ （
ＱＸＡ ） Ｋついての転写配？；神経芽腫において
使用するための、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンア
セチルトランスフェラーゼまたはニューロン特異性エノ
ラー＋！′Ｏための転写調節配列；神ｊ！膠腫において
使用するためのダリアフィラメント酸性タンパク質のた
めの転写調節配列；牌臓のがんにかいて使用するための
インスリンについての転写調節配列が含まれる０さらに
、例としては、ある肝がんκおいて使用するためのγ−
グルタミルトランスペプチターゼに特有な転写調節配列
と肺のある種のがんに使用するためのドーバデカルホキ
シラーゼ■ｌＦ！ｉ異的な調節配列が含まれる＠その上
、これらは、あるがんの型にかいては優先的に発現され
るので、ある腫ｇ％遺伝子からの転写調節配列全使用す
ることができる０これらの良い例には、胸部がんにかい
て発現されるＨＥＲ−２ ／ ｎｅｕ腫瘍遺伝子調節配
列、及び？！？ｌ経芽腫に対するＤ − ｍｙ ｃ腫瘍
逝伝子Ｋ特有な調節配列が含！れるＯ Ａ′ＬＢとＡＦＰの遺伝子は、核酸配列、遺伝子構造、
アミノ酸配列、タンパク質の２次的ｉｆｒｊ！）たたみ
（認説κは、工ｎｇｒａｍｃ）ＰＮＡＩ９ ７ ８
４ ６ ９ ４ −４６９８（ １９８１）ｔ−参照）
Ｋ″関して、広汎な相同性そ示している０これらの遺伝
子は、個体発生にかいて，独立して、しかし逆比例して
発現される。正常な発生にかいては，ＡＬＢ＆写は、鮎
生の少し前に始ま９、成人期を通じて継続する０戒人に
おけるＡＬＢの転写発現は、肝臓に限定されるＯＡＦＰ
は、通常胎児の肝臓、卵黄嚢の内臓内胚葉及び胎児胃Ｐ
＆管にかいて発現されるが、誕生後間もなく検知できな
い水？！１まで減少し、非病原性の肝、または、成人の
非再生肝、または成人の他の組織Ｖｃｉ？いては、有′
ＸＩＫＫは発現されない０しかし、ＡＦＰ Ｎ写は、成
人肝にシいては、Ｈｏｏの独、劇的に増〃ｎすることが
多い０その上．ｈｙｐＶｘ写は、非精上皮腫でないｙｉ
１ｌＩ巣がん及び混合型がん；内胚葉洞がん、ある奇型
がん、及びある胃腸がんκかいても上昇することがある
ｏ ＡＦ’ＰとＡＩｉＢの肝臓特異的発現は、それらの
遺伝子の調節性配列と肝臓からの抽出物に見出されたト
ランスー活性化転写因子との相互作用の結果であるｎｋ
アＰとＡＩｊ３遺伝子は、転写水準にかいて調節され、
それらのｍＲＮＡｇは、肝臓における最も豊富なポリメ
ラーゼ璽の転写物の１つ危ので、Ａｍ’ＰとＡＩＡＢの
転写調節配列が、分子的κ結合した遺伝子肝がん特異性
、または一般肝特異性発現に優先的に使われる０ いくつかの哺乳ａ（ＱＡＬＩ３とＡＬＰのプロモーター
とエンハンサーの配列が同定された〔総説としてはｓ
Ｇａｎ＠．ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ １ ； ２ ６
８ − ２ ７ ６（ ｊ ９ ８ ７ ） ，）
； Ｂａｎａｎａｓ ２ ３ ５ ； ５ ３ − ５
８（ １ ９ ８ ７ ） ； Ｔｈｏ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｔ Ｂｉｏｌ．Ｏｈ＠ｍｉｓｔｒ）ｒ２６２二
４２１２−４８１８（ １９８７）を参照のこと〕０こ
れらの配列を〔よク、それぞれ、肝臓ＯＨＦ細胞（正′
Ｍ及び形質転換した）、及び肝がんｒｃｓ？ける遍択的
で％ｊＪ４ｈな遺伝子の発現が可能になる〇 例えは、第１図に示してめるようκ、哺乳類ＡＸＡＥ３
プロモーターは、プルプミン転写開始部位κ対して、５
′のｂＯロｂｐ断片内κ含まれているＯネズミのアルプ
ミン遺伝子の転写開始部位κ対して、５′物の３ （Ｉ
Ｏ ｂｐと５′側の８，５ ０ ０ ｂｐｏ間κ？！
れている配列は、肝臓の特異的発現κなくても済む＠し
かし、肝臓特異的エンハンサー配列は、転写開始部位に
対して、５′の８，５ ０ ０ ｂｐと５′の１ ０，
４ ０ ０ ｂｐＯ間に位置している断片に含まれてい
る〔第１図（その１）〕ｏもし、ＡＬＢプロモーターと
エンハンサーの喪素が存在するならば、ｙ万向■適切に
位置している異ＳＳ造遺伝子の肝ｍ特異的発現を達成す
ることができる〔第２図（その２ ） ） ６ ＡＬＢ
プロモーターとエンハンサー配列に対して適切な方向κ
位置した３′側の異種構造遺伝子の肝臓特有の発現は、
転写開始部位に対して５′側の３ ０ ０ ｂｐ及び５
′側の８，５ ０ ０ ｂｐＯ間κ介在している非必須
配列が除かれたときも維持される〔第１図（その３）〕
ｏ非必須配列の切クつめは、分子生物学κおいてよく知
られている標準的万法κよって達或され、その結果、Ｖ
ＺＶ ＴＨの肝特異的発現を指示するのに使用すること
ができるキメラ状分子を生ずる０ Ａ′ＬＢ遺伝子の胴節遺伝子と同様に、ＡｌｆＰ ｆｆ
ｉ伝子の調節性喪木は、Ｂｏｏ Ｏようなある肝臓の病
気κ会けるＡＩＦＰＯ組ｍ特異的発現を促進する（ Ｍ
ＯＸ．Ｏｅｌ，Ｂｉｏｌ．６ ； ４ ７ ７ − ４
８ ７ （ １ ９ ８ ６ ） ；８ｃｉｓｎｃｅ
２ ３ ５ ； ５ ５ − ５ ８ （ １ ９
８ ７ ） ） ｏ喘乳類のＡＦＰ遺伝子の調節！！素
は、！＃興的５′側プロモーター近位領域（ある哺乳類
種では、その遺伝子κ対して、５′側の８ ５ ｂｐと
５ ２ ｂｐの，間κ位置している）から成立っている
Ｏこの配列は、肝がんκかける転写に対して必須である
Ｏその上、古典的工冫ハンサ−Ｃ Ｍｏｌ．Ｏ●１，Ｂ
ｔｏｘ． ６ ； ４ ７ ７ −４ ８ ７ （ １
９ ８ ６ ） ； ８ｃｉｅｎｃｅ ２ ３ ５
； ５ ３ −５８（１９８７））として挙動するネズ
ミＡＦＰ遺伝子のために十分明確化した上流（５′ノ側
の調節要素がある０これらの上流調節簀素は、要素Ｉ１
ｌ及び口と名付けられ、ＡＦＰネズミ遺伝子のための転
写開始部位に対して、５′側の１，０ ０ ０ ｂｐか
ら７，６ ０ ０ ｂｐＯ間に存在しているｏ？−ｎ−
ら５つのエンハンサー領域は、ＡＩＦｆｆの組織特異的
発現を発生するのκ機能的に等価ではないＯ喪素Ｉと夏
は、ＡＩＦＦの肝特異的発現を指示する最大の能力をも
っている０α−フエトプロテイン遺伝子の調節？域が組
織特異性転写活性のためのみならず、ＡＦＰ ｋ発現す
べきではない組織ＫＴｈいて発現の抑制のためにも、配
列を都合よくもっているということに注目することはＮ
要である０同様な具合κしで、ヒト、α−フエトプロテ
インの遺伝子の調如価域％％ｕうけらｒｉ．＊（ ．Ｔ
，Ｂ．０．２ ６ ２ ４８１２（ １ ９ ８ ７
） ｏ ＡＦＰ ｅ）９１節配列１こ対して、ｙの正
しい万同に立置し７ｃ４１１造遺伝子によク、その構造
遺仏子が、胎児肝、肝がん、精上皮腫でない精巣がんや
ＡＦＰを発現する他の正常、または病理的組紘に分いて
、選択的に発現されることが可能■なるＯ 本発ＩＰｉ―、発現カセット中における転写調節の制御
下で、異種酵素をコードする遺伝子のコード配列ｖｔむ
ＤＮＡ配列及び標的がん細胞において、選択的に機能す
ることができるプロモーター、例えは、ｖｚｖチミクン
キナーゼを選択的κ発現するためκ、かん細胞を形貴転
換できるプロモーターからなる分子状キメラ分子を提供
するＯ本発明は、さらによフ好ましい態様において、？
写調節配列、特に哺乳類標的ｍ織に選択的■活性化され
、遺伝子操作で水痘一帯状疱疹ウィルスのチミジンキナ
ーゼ（ ｖｚｖ Ｔｉｃ ） ｋ遺伝子ｔコードし゜Ｃ
いる配列κ連結したプロモーターｔ−含む分子状キメラ
分子ｔ−提供するＯ と９わけ、不発明は、好筐しくは’ｉＺＶ ＴＫであｐ
％適切なポリアデニル化配列／ｔ含み、晴乳＠標的組絨
に特異的てある′＃ｔ４節配列匝対して、ｙ側にνい゛
ｔｒｉ切な配位にνいて連結している酵ｇｋコードする
遺伝子のコード配列ｔ−富む分子状キメクを提供するｏ
ｆｉも好ましくは、発現カセットはエンハンサー配列も
含んでいるＯ グロモーターとエンハンサーの配列は、アルゾミン（
ＡＬＪ３ ）、α−フエトプロテイン（ ＡＦＰ ）、
がん胎児性抗原、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンア
セチルトランスフェラーゼ、３ユーロン特ＪＩｌｌ注エ
ノラーゼ、グリアルフィラメント讃性夕冫パク質、イン
スリン、またはｒ−グルメで冫トランスベプチターゼ、
ドーパデカルポキシラーぜ、１１！ｆＲ ２／ ｎｅｕ
％しくはＮ−ｍｙｏの腫瘍遺伝子や他の？切な遺伝子の
１つのための転写制御配列から選ばれる●最も好ましく
は、ＡＩＪ３ １たはＡＦＢの調節配列は、そｆＬそれ
肝幹異的または肝がん特異的発現に用いられる０ 本発明のキメラ状分子は、Ｓ準的ＤＮＡ組換え技術を利
用して作ることができるＯこのよう■して、例えばｖｚ
ｖチミクンキナーゼ（ ＴＫ）遺伝子〔第２図（その１
、２、６及び４）〕のコード配列とポリアデニル化シグ
ナルは、必須のＡｂＢ，またはＡＩＦＦ転写調節費素に
対して、適切な３′側の配位にかかれる０これらのキメ
ラ状分子によク、それぞれ、通常はＡＩ，ＢまたはＡＬ
Ｐ ′ｔ−発現する細胞において、ＶＺＶ ＴＫ ｏ遺
択的発現全可能にする［３図（その１及び２）］．＃乳
動物肝、肝がん、胃腸管のある種のがん、鞘上皮性かん
でない精巣がん、ある種の奇型がんにおけるＶＺＶ Ｔ
Ｋの発現は、比較的無毒性のアラピノシドやビリミタン
か、本発明で明らかにしたように選択的κ細胞毒性、セ
して／筐たは、細胞静止性の代謝物κ遺択的に代謝され
ることを可能くする０ したがって、第２の面にかいては、異種酵素、例えばＶ
ＺＶ ’！’Ｋ ′ｔ″コードするＤＮＡ配列全組織特
異性プロモーターに連結することを含むキメラ状分子１
構築する方法が提供される０ とシわけ、本発明は、異種酵素、例えば％ ｖｚｖチミ
クンキナーゼのための遺伝子のコード配列とポリアデニ
ル化シグナルをコードしているＩ）ＮＡ配列を哺乳動物
の組織に特異的な転写制御配列（例えば、プロモーター
配列とエンハンサー配列）につなげることからなる万法
である本発明で明確にされたキメラ状分子を構築する万
法を提供するＯｖｚｖチミジンキナーゼのコーティング
配列と、６′のボリアデニレーションシグナル扛、約１
，３ ８ １ｂｐ Ａｃｅ工／ｈｄｅ工制限エドヌク
レアーゼ断片中に存在している（第２図を参照）Ｏ ＶＺＶ ＴＫ遺伝子を含む他のＤＮＡ断片が用いられ得
ることも評価されるけれども、哺乳類組織に特異的なプ
ロモーター及びエンハンサー配列κつなげられるのは、
ＶＺＶ ＴＫのコーディング配列とポリアデニル化シグ
ナルを含む１ ３ ８ １ ｂｐのＡｃｅエ／Ｎｄｅで
あるのが望ましい０その上，ＶｚｖＴＫボリーアデニル
化シグナルは、ｓｖ４０ウイルス、ｔＸは他の哺乳動物
遺伝子のような、別の適切なポリアデニル化シグナルで
置きかえることが可能である０ 望！Ｌ（ａ、プロモーターとエンハンサー配列は、アル
プミン（ ＡＬＢ ） 、α−フエトプロテイン（ Ａ
ＦＦ ）、がん胎児性抗原（ＯＩｉＡ），チロシンヒド
ロキシラーゼ、コリンアセテルトランス７エラーセ、ニ
ューロン９異的エノラーゼ、グリアル７イプリン酸性タ
ンパク質、インスリン、ｒ−グルタミルトランスペプチ
ターゼ、ドーパデカルボキシラーゼ、ＨＥＲ ２ ／
ｎｓｕ １たはＮ−ｍｙｃ ｍ 瘍遺伝子１たは他の適
切な遺伝子の１つのための転写請節配列から選ばれる０ これらのキメラ状の分子は、配送システムによって標的
細胞に配送さｆＬる０患名への投与のためには、キメラ
状分子を細胞中に安定に統合する効率的な１ｎ▼ｉｖｏ
配送システム金提供することが必要である０知られてい
る万法では、リン酸カルタ？ム■よるトランスフエクシ
ョン、エレクトロボーレーション、微量注射法、リポソ
ームκよる転移、贅撃連発乃至はレトロウイルス感染が
利用されている。この主題についての総説としては、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｖｏｗ．．６、幽７ １９
ＢＢを参照のこと０ 人工遺伝子を統合するための、細胞のレトロウイルスＫ
よる感染の遺伝子工学技術にかいて知られているレトロ
ウイルスのシャトルベクターを使用する（例えば、Ｍｏ
ｂ，ａｎｄ Ｏｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ａｕｇ ８ ６Ｐ２
８９５ｔ−参照）０本貿的κ、レトロウイルスシャトル
ベクターは、プラスミド甲に含ｔＴ′Ｌるレトロウイル
ス（Ｄ ＤＮＡ ’ｉ使用して生み出される０これらの
プラスミドは、バクテリア中での選択と生長κ必要な配
列も含んでいる０レトロウイルスのシャトルベクターは
、この分野でよく知られている標準的分子生物学的技術
を用いて構築されるＯレトロウイルスシャトルベクター
は、親の内生レトロウイルス遺伝子（例えば％ ｇａｇ
％ｐｏｐ及びｏｎｖ ）が除かれ１すでに記述されてい
るキメラ状の分子の様な、問題とするＩＩＮＡ配列を挿
入してあるｏしかし、それらは、ウイルスの工冫キャプ
シデーション、標的ゲノムへのプロウイルスの挿入、メ
ツセークスプライシング終結とボリアデエル化のための
適切なレトロウィルス劃御配列を含んでいる０レトロウ
イルスシャトルベクターは、ＭｏｌｏｎｅｙネズＺ白血
病ウィルス（ ＭＯ−ＭＬＶ ）から誘導されたが、他
のレトロウィルスが密接に関連したＭＯ１０ｎｅ７ネズ
ミ肉朧ウイルスのよう危他のレトロウイルスが使用でき
ることも評価される●あるＤＮＡウイルスも配送システ
ムとして有用であることがｉ明される＠ウシ乳頭腫ウィ
ルス（ ｎ：ｐｖ ）は染色体外で複製するので、ＢＰ
Ｖ ｒｃ基〈配送システムは、配送された遺伝子は非統
合的中９万で維持されているという利点をもっている〇
このようにして、本発明の３番目の面κよれば、本発明
において、こｎｔでに明確κされたキメラ状の分子を含
むレトロウイルスシャトルベクターが提供されている。
センゾヤーＲＮＡｓをコードする遺伝子の完全で能率の
よい転写調節のためκは、２つの１）ＨＡ 配列、つｔ
，ｐ、プロモーターとエンハンサーが必要である０プロ
モーターは、転写開始位置からすぐの上流（５′）に位
置しているＯプロモーター配列は、転写の正確で能率的
な開始のためκ必要である０異なる遺伝子特異性プロモ
ーターから共通な組織化のパターンが明らかとなるＯ典
型的なプロモーターには、ＡＴ Ｋ富んだＴＡＴＡボッ
クスと呼ばれる領域（転写開始部位κ対して、約５０塩
基５′側κ位置している）、そして、１つ以上の上流プ
ロモーター要素（ ｔｒｐｍ ）が含まれている０この
ＵＰＫｓが、配列Ｉｆ！ｆ異的核の転写因子との相互作
用の原則標的である０プロモーター配列の活性は、二冫
一冫サーと呼ばれる他の配列κよって調節されている０
工冫一冫サー配列は、上ｆＬ（５’）か下流（ぎ）＆Ｃ
位置していてプロモーターから太き＜ｍれでいてもよい
０それゆえ、エンハンサーは、方向と位置に無関係なや
シ万で作用するＯしかし、互いκ交換し得る同様危構造
的組織体と機能に基いて、プロモーターと工冫一ンサー
の間の絶対的区別は、幾分任意的である０工冫一ンサー
は、プロモーター配列による転写の速度を増す〇啼乳動
物ａ胞が、組織特異的遺伝子発現を達成できるようにす
るのは、主として配列特異的転写要因とエンハンサー配
列との間の相互作用であるＯＵＰＩＣに結合するこのよ
うな転写タンパク質要因（組織！Ａ的、トランス活性化
要因）及びエンーンサ−（シス−作用性、調節配列）の
存在κよク、ＲＮＡボリメ？−ｔ”ｔ−はじめとする転
写のからくシの他の！素がｍＩ＆特異的選択性及び精度
をもって転写ができるよ５Ｋなる〇 転写調節配列、特にプロモーターと二冫ハンサ−の配列
）の選択は、標的組織に依存する０例の中には、それぞ
れ、正常な肝細胞と形質転換肝細胞に特有なアルプミン
（ ＡＩ，Ｂ ）とアルファーフエトプロテイン（ Ａ
ＦＰ ）転写配列；胃腸管、肺、胸部及び他の組織の形
質転換細胞にかいて使用するためのがん胎児性抗Ｍ （
ＱＸＡ ） Ｋついての転写配？；神経芽腫において
使用するための、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンア
セチルトランスフェラーゼまたはニューロン特異性エノ
ラー＋！′Ｏための転写調節配列；神ｊ！膠腫において
使用するためのダリアフィラメント酸性タンパク質のた
めの転写調節配列；牌臓のがんにかいて使用するための
インスリンについての転写調節配列が含まれる０さらに
、例としては、ある肝がんκおいて使用するためのγ−
グルタミルトランスペプチターゼに特有な転写調節配列
と肺のある種のがんに使用するためのドーバデカルホキ
シラーゼ■ｌＦ！ｉ異的な調節配列が含まれる＠その上
、これらは、あるがんの型にかいては優先的に発現され
るので、ある腫ｇ％遺伝子からの転写調節配列全使用す
ることができる０これらの良い例には、胸部がんにかい
て発現されるＨＥＲ−２ ／ ｎｅｕ腫瘍遺伝子調節配
列、及び？！？ｌ経芽腫に対するＤ − ｍｙ ｃ腫瘍
逝伝子Ｋ特有な調節配列が含！れるＯ Ａ′ＬＢとＡＦＰの遺伝子は、核酸配列、遺伝子構造、
アミノ酸配列、タンパク質の２次的ｉｆｒｊ！）たたみ
（認説κは、工ｎｇｒａｍｃ）ＰＮＡＩ９ ７ ８
４ ６ ９ ４ −４６９８（ １９８１）ｔ−参照）
Ｋ″関して、広汎な相同性そ示している０これらの遺伝
子は、個体発生にかいて，独立して、しかし逆比例して
発現される。正常な発生にかいては，ＡＬＢ＆写は、鮎
生の少し前に始ま９、成人期を通じて継続する０戒人に
おけるＡＬＢの転写発現は、肝臓に限定されるＯＡＦＰ
は、通常胎児の肝臓、卵黄嚢の内臓内胚葉及び胎児胃Ｐ
＆管にかいて発現されるが、誕生後間もなく検知できな
い水？！１まで減少し、非病原性の肝、または、成人の
非再生肝、または成人の他の組織Ｖｃｉ？いては、有′
ＸＩＫＫは発現されない０しかし、ＡＦＰ Ｎ写は、成
人肝にシいては、Ｈｏｏの独、劇的に増〃ｎすることが
多い０その上．ｈｙｐＶｘ写は、非精上皮腫でないｙｉ
１ｌＩ巣がん及び混合型がん；内胚葉洞がん、ある奇型
がん、及びある胃腸がんκかいても上昇することがある
ｏ ＡＦ’ＰとＡＩｉＢの肝臓特異的発現は、それらの
遺伝子の調節性配列と肝臓からの抽出物に見出されたト
ランスー活性化転写因子との相互作用の結果であるｎｋ
アＰとＡＩｊ３遺伝子は、転写水準にかいて調節され、
それらのｍＲＮＡｇは、肝臓における最も豊富なポリメ
ラーゼ璽の転写物の１つ危ので、Ａｍ’ＰとＡＩＡＢの
転写調節配列が、分子的κ結合した遺伝子肝がん特異性
、または一般肝特異性発現に優先的に使われる０ いくつかの哺乳ａ（ＱＡＬＩ３とＡＬＰのプロモーター
とエンハンサーの配列が同定された〔総説としてはｓ
Ｇａｎ＠．ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ １ ； ２ ６
８ − ２ ７ ６（ ｊ ９ ８ ７ ） ，）
； Ｂａｎａｎａｓ ２ ３ ５ ； ５ ３ − ５
８（ １ ９ ８ ７ ） ； Ｔｈｏ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｔ Ｂｉｏｌ．Ｏｈ＠ｍｉｓｔｒ）ｒ２６２二
４２１２−４８１８（ １９８７）を参照のこと〕０こ
れらの配列を〔よク、それぞれ、肝臓ＯＨＦ細胞（正′
Ｍ及び形質転換した）、及び肝がんｒｃｓ？ける遍択的
で％ｊＪ４ｈな遺伝子の発現が可能になる〇 例えは、第１図に示してめるようκ、哺乳類ＡＸＡＥ３
プロモーターは、プルプミン転写開始部位κ対して、５
′のｂＯロｂｐ断片内κ含まれているＯネズミのアルプ
ミン遺伝子の転写開始部位κ対して、５′物の３ （Ｉ
Ｏ ｂｐと５′側の８，５ ０ ０ ｂｐｏ間κ？！
れている配列は、肝臓の特異的発現κなくても済む＠し
かし、肝臓特異的エンハンサー配列は、転写開始部位に
対して、５′の８，５ ０ ０ ｂｐと５′の１ ０，
４ ０ ０ ｂｐＯ間に位置している断片に含まれてい
る〔第１図（その１）〕ｏもし、ＡＬＢプロモーターと
エンハンサーの喪素が存在するならば、ｙ万向■適切に
位置している異ＳＳ造遺伝子の肝ｍ特異的発現を達成す
ることができる〔第２図（その２ ） ） ６ ＡＬＢ
プロモーターとエンハンサー配列に対して適切な方向κ
位置した３′側の異種構造遺伝子の肝臓特有の発現は、
転写開始部位に対して５′側の３ ０ ０ ｂｐ及び５
′側の８，５ ０ ０ ｂｐＯ間κ介在している非必須
配列が除かれたときも維持される〔第１図（その３）〕
ｏ非必須配列の切クつめは、分子生物学κおいてよく知
られている標準的万法κよって達或され、その結果、Ｖ
ＺＶ ＴＨの肝特異的発現を指示するのに使用すること
ができるキメラ状分子を生ずる０ Ａ′ＬＢ遺伝子の胴節遺伝子と同様に、ＡｌｆＰ ｆｆ
ｉ伝子の調節性喪木は、Ｂｏｏ Ｏようなある肝臓の病
気κ会けるＡＩＦＰＯ組ｍ特異的発現を促進する（ Ｍ
ＯＸ．Ｏｅｌ，Ｂｉｏｌ．６ ； ４ ７ ７ − ４
８ ７ （ １ ９ ８ ６ ） ；８ｃｉｓｎｃｅ
２ ３ ５ ； ５ ５ − ５ ８ （ １ ９
８ ７ ） ） ｏ喘乳類のＡＦＰ遺伝子の調節！！素
は、！＃興的５′側プロモーター近位領域（ある哺乳類
種では、その遺伝子κ対して、５′側の８ ５ ｂｐと
５ ２ ｂｐの，間κ位置している）から成立っている
Ｏこの配列は、肝がんκかける転写に対して必須である
Ｏその上、古典的工冫ハンサ−Ｃ Ｍｏｌ．Ｏ●１，Ｂ
ｔｏｘ． ６ ； ４ ７ ７ −４ ８ ７ （ １
９ ８ ６ ） ； ８ｃｉｅｎｃｅ ２ ３ ５
； ５ ３ −５８（１９８７））として挙動するネズ
ミＡＦＰ遺伝子のために十分明確化した上流（５′ノ側
の調節要素がある０これらの上流調節簀素は、要素Ｉ１
ｌ及び口と名付けられ、ＡＦＰネズミ遺伝子のための転
写開始部位に対して、５′側の１，０ ０ ０ ｂｐか
ら７，６ ０ ０ ｂｐＯ間に存在しているｏ？−ｎ−
ら５つのエンハンサー領域は、ＡＩＦｆｆの組織特異的
発現を発生するのκ機能的に等価ではないＯ喪素Ｉと夏
は、ＡＩＦＦの肝特異的発現を指示する最大の能力をも
っている０α−フエトプロテイン遺伝子の調節？域が組
織特異性転写活性のためのみならず、ＡＦＰ ｋ発現す
べきではない組織ＫＴｈいて発現の抑制のためにも、配
列を都合よくもっているということに注目することはＮ
要である０同様な具合κしで、ヒト、α−フエトプロテ
インの遺伝子の調如価域％％ｕうけらｒｉ．＊（ ．Ｔ
，Ｂ．０．２ ６ ２ ４８１２（ １ ９ ８ ７
） ｏ ＡＦＰ ｅ）９１節配列１こ対して、ｙの正
しい万同に立置し７ｃ４１１造遺伝子によク、その構造
遺仏子が、胎児肝、肝がん、精上皮腫でない精巣がんや
ＡＦＰを発現する他の正常、または病理的組紘に分いて
、選択的に発現されることが可能■なるＯ 本発ＩＰｉ―、発現カセット中における転写調節の制御
下で、異種酵素をコードする遺伝子のコード配列ｖｔむ
ＤＮＡ配列及び標的がん細胞において、選択的に機能す
ることができるプロモーター、例えは、ｖｚｖチミクン
キナーゼを選択的κ発現するためκ、かん細胞を形貴転
換できるプロモーターからなる分子状キメラ分子を提供
するＯ本発明は、さらによフ好ましい態様において、？
写調節配列、特に哺乳類標的ｍ織に選択的■活性化され
、遺伝子操作で水痘一帯状疱疹ウィルスのチミジンキナ
ーゼ（ ｖｚｖ Ｔｉｃ ） ｋ遺伝子ｔコードし゜Ｃ
いる配列κ連結したプロモーターｔ−含む分子状キメラ
分子ｔ−提供するＯ と９わけ、不発明は、好筐しくは’ｉＺＶ ＴＫであｐ
％適切なポリアデニル化配列／ｔ含み、晴乳＠標的組絨
に特異的てある′＃ｔ４節配列匝対して、ｙ側にνい゛
ｔｒｉ切な配位にνいて連結している酵ｇｋコードする
遺伝子のコード配列ｔ−富む分子状キメクを提供するｏ
ｆｉも好ましくは、発現カセットはエンハンサー配列も
含んでいるＯ グロモーターとエンハンサーの配列は、アルゾミン（
ＡＬＪ３ ）、α−フエトプロテイン（ ＡＦＰ ）、
がん胎児性抗原、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンア
セチルトランスフェラーゼ、３ユーロン特ＪＩｌｌ注エ
ノラーゼ、グリアルフィラメント讃性夕冫パク質、イン
スリン、またはｒ−グルメで冫トランスベプチターゼ、
ドーパデカルポキシラーぜ、１１！ｆＲ ２／ ｎｅｕ
％しくはＮ−ｍｙｏの腫瘍遺伝子や他の？切な遺伝子の
１つのための転写制御配列から選ばれる●最も好ましく
は、ＡＩＪ３ １たはＡＦＢの調節配列は、そｆＬそれ
肝幹異的または肝がん特異的発現に用いられる０ 本発明のキメラ状分子は、Ｓ準的ＤＮＡ組換え技術を利
用して作ることができるＯこのよう■して、例えばｖｚ
ｖチミクンキナーゼ（ ＴＫ）遺伝子〔第２図（その１
、２、６及び４）〕のコード配列とポリアデニル化シグ
ナルは、必須のＡｂＢ，またはＡＩＦＦ転写調節費素に
対して、適切な３′側の配位にかかれる０これらのキメ
ラ状分子によク、それぞれ、通常はＡＩ，ＢまたはＡＬ
Ｐ ′ｔ−発現する細胞において、ＶＺＶ ＴＫ ｏ遺
択的発現全可能にする［３図（その１及び２）］．＃乳
動物肝、肝がん、胃腸管のある種のがん、鞘上皮性かん
でない精巣がん、ある種の奇型がんにおけるＶＺＶ Ｔ
Ｋの発現は、比較的無毒性のアラピノシドやビリミタン
か、本発明で明らかにしたように選択的κ細胞毒性、セ
して／筐たは、細胞静止性の代謝物κ遺択的に代謝され
ることを可能くする０ したがって、第２の面にかいては、異種酵素、例えばＶ
ＺＶ ’！’Ｋ ′ｔ″コードするＤＮＡ配列全組織特
異性プロモーターに連結することを含むキメラ状分子１
構築する方法が提供される０ とシわけ、本発明は、異種酵素、例えば％ ｖｚｖチミ
クンキナーゼのための遺伝子のコード配列とポリアデニ
ル化シグナルをコードしているＩ）ＮＡ配列を哺乳動物
の組織に特異的な転写制御配列（例えば、プロモーター
配列とエンハンサー配列）につなげることからなる万法
である本発明で明確にされたキメラ状分子を構築する万
法を提供するＯｖｚｖチミジンキナーゼのコーティング
配列と、６′のボリアデニレーションシグナル扛、約１
，３ ８ １ｂｐ Ａｃｅ工／ｈｄｅ工制限エドヌク
レアーゼ断片中に存在している（第２図を参照）Ｏ ＶＺＶ ＴＫ遺伝子を含む他のＤＮＡ断片が用いられ得
ることも評価されるけれども、哺乳類組織に特異的なプ
ロモーター及びエンハンサー配列κつなげられるのは、
ＶＺＶ ＴＫのコーディング配列とポリアデニル化シグ
ナルを含む１ ３ ８ １ ｂｐのＡｃｅエ／Ｎｄｅで
あるのが望ましい０その上，ＶｚｖＴＫボリーアデニル
化シグナルは、ｓｖ４０ウイルス、ｔＸは他の哺乳動物
遺伝子のような、別の適切なポリアデニル化シグナルで
置きかえることが可能である０ 望！Ｌ（ａ、プロモーターとエンハンサー配列は、アル
プミン（ ＡＬＢ ） 、α−フエトプロテイン（ Ａ
ＦＦ ）、がん胎児性抗原（ＯＩｉＡ），チロシンヒド
ロキシラーゼ、コリンアセテルトランス７エラーセ、ニ
ューロン９異的エノラーゼ、グリアル７イプリン酸性タ
ンパク質、インスリン、ｒ−グルタミルトランスペプチ
ターゼ、ドーパデカルボキシラーゼ、ＨＥＲ ２ ／
ｎｓｕ １たはＮ−ｍｙｃ ｍ 瘍遺伝子１たは他の適
切な遺伝子の１つのための転写請節配列から選ばれる０ これらのキメラ状の分子は、配送システムによって標的
細胞に配送さｆＬる０患名への投与のためには、キメラ
状分子を細胞中に安定に統合する効率的な１ｎ▼ｉｖｏ
配送システム金提供することが必要である０知られてい
る万法では、リン酸カルタ？ム■よるトランスフエクシ
ョン、エレクトロボーレーション、微量注射法、リポソ
ームκよる転移、贅撃連発乃至はレトロウイルス感染が
利用されている。この主題についての総説としては、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｖｏｗ．．６、幽７ １９
ＢＢを参照のこと０ 人工遺伝子を統合するための、細胞のレトロウイルスＫ
よる感染の遺伝子工学技術にかいて知られているレトロ
ウイルスのシャトルベクターを使用する（例えば、Ｍｏ
ｂ，ａｎｄ Ｏｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ａｕｇ ８ ６Ｐ２
８９５ｔ−参照）０本貿的κ、レトロウイルスシャトル
ベクターは、プラスミド甲に含ｔＴ′Ｌるレトロウイル
ス（Ｄ ＤＮＡ ’ｉ使用して生み出される０これらの
プラスミドは、バクテリア中での選択と生長κ必要な配
列も含んでいる０レトロウイルスのシャトルベクターは
、この分野でよく知られている標準的分子生物学的技術
を用いて構築されるＯレトロウイルスシャトルベクター
は、親の内生レトロウイルス遺伝子（例えば％ ｇａｇ
％ｐｏｐ及びｏｎｖ ）が除かれ１すでに記述されてい
るキメラ状の分子の様な、問題とするＩＩＮＡ配列を挿
入してあるｏしかし、それらは、ウイルスの工冫キャプ
シデーション、標的ゲノムへのプロウイルスの挿入、メ
ツセークスプライシング終結とボリアデエル化のための
適切なレトロウィルス劃御配列を含んでいる０レトロウ
イルスシャトルベクターは、ＭｏｌｏｎｅｙネズＺ白血
病ウィルス（ ＭＯ−ＭＬＶ ）から誘導されたが、他
のレトロウィルスが密接に関連したＭＯ１０ｎｅ７ネズ
ミ肉朧ウイルスのよう危他のレトロウイルスが使用でき
ることも評価される●あるＤＮＡウイルスも配送システ
ムとして有用であることがｉ明される＠ウシ乳頭腫ウィ
ルス（ ｎ：ｐｖ ）は染色体外で複製するので、ＢＰ
Ｖ ｒｃ基〈配送システムは、配送された遺伝子は非統
合的中９万で維持されているという利点をもっている〇
このようにして、本発明の３番目の面κよれば、本発明
において、こｎｔでに明確κされたキメラ状の分子を含
むレトロウイルスシャトルベクターが提供されている。
レトロウイルスによって媒介された遺伝子転移システム
の利点は、標的組織に対する遺伝子配送が高能率である
こと、ウイルスｒノム（ ５’ ト３’のロングター電
ナルリピート（ ＩＩＴＲ ）配列〕に関する配列特異
的統合、及び他のＤＮＡ配送システムに比べて、配送さ
ｆ′Ｌ２ ＤＮＡの転位がほとんどないことである０ したがって、よク好ましい本発明の態様にかいては、５
′ウィルスＬＴＲ配列、シス作用性プサイエンキャプシ
デーション配列、本発明において、これまで明確にした
ようなキメラ状分子及びｙウイルスＬＴＲ配列〔第４図
（その１及びその２）〕を含むＤＮＡ配列からなるレト
ロウイルスシャトルベクターが提供されている● よシ好１しい態様Ｋかいては、そして、キメラ状分子の
非一組織特異性発現の除去を助けるためには，キメラ状
分子は、５′レトロウイルスＬＴＲ〔第４図（その１及
びその２）〕に対して反対の転写方向に位置さｆｔ．る
〔第４図（その１及びその２）〕ｏその上、ｓ ＬＴＲ
配列から転写的に駆動される主要な選択マーカー遺伝子
も含まれていてよい０このような主要選択性マーカーは
、バクテリアのネオマイシン耐性遺伝子ａｍｏ （アミ
ノグリコシド３′ホスホトランスフエラーゼ）ｉｍであ
ってもよく、それによって、ネオマイシン類縁体Ｇ４１
８サルフエート（ Ｇｅｎｓｔ４ｃｉｎ ） （商ｌｇ
！）Ｋ対して真核細胞に抵抗性を付与する●この１１ｌ
Ｏ遺伝子は、これらの配列を含むバクケーゾング細胞選
択において役立つ（下記を参照）０ 例にかいて用いられるレトロウイルスのベクターは、Ｍ
Ｏ１０ｎｅｙネズミ白血病ウィルスに基いているが、他
のベクターを使用することも価値があるＯＮＫＯ遺伝子
を選択可能なマーカーとして含むこのようなベクターが
記述されている０例えば、Ｎ２ベクター（ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２ ３ ０ １ ３ ９ ５ − １ ５ ９
８１９８５）］である０ レトロウ．イルスシャトルベクターκ関連する理論的問
題は、宿主ｒノ▲における統合部位の細胞＃ｌ瘍遺伝子
を、転写的κ活性化するレトロウイルスの口冫グターミ
ナルリビー｝ （ ＩＪＴＲ ）制御配列の潜在能力で
ある●この問題は、ＢＩＮベクターを創ることによって
減少する可能性がある〔第４図（その１）〕ａｓ工Ｎベ
クターは、レトロウイルスＬＴＲ中のプロモーターとエ
ンハンサー領域から念る欠失を含む自己一不活性化ベク
ターである。
の利点は、標的組織に対する遺伝子配送が高能率である
こと、ウイルスｒノム（ ５’ ト３’のロングター電
ナルリピート（ ＩＩＴＲ ）配列〕に関する配列特異
的統合、及び他のＤＮＡ配送システムに比べて、配送さ
ｆ′Ｌ２ ＤＮＡの転位がほとんどないことである０ したがって、よク好ましい本発明の態様にかいては、５
′ウィルスＬＴＲ配列、シス作用性プサイエンキャプシ
デーション配列、本発明において、これまで明確にした
ようなキメラ状分子及びｙウイルスＬＴＲ配列〔第４図
（その１及びその２）〕を含むＤＮＡ配列からなるレト
ロウイルスシャトルベクターが提供されている● よシ好１しい態様Ｋかいては、そして、キメラ状分子の
非一組織特異性発現の除去を助けるためには，キメラ状
分子は、５′レトロウイルスＬＴＲ〔第４図（その１及
びその２）〕に対して反対の転写方向に位置さｆｔ．る
〔第４図（その１及びその２）〕ｏその上、ｓ ＬＴＲ
配列から転写的に駆動される主要な選択マーカー遺伝子
も含まれていてよい０このような主要選択性マーカーは
、バクテリアのネオマイシン耐性遺伝子ａｍｏ （アミ
ノグリコシド３′ホスホトランスフエラーゼ）ｉｍであ
ってもよく、それによって、ネオマイシン類縁体Ｇ４１
８サルフエート（ Ｇｅｎｓｔ４ｃｉｎ ） （商ｌｇ
！）Ｋ対して真核細胞に抵抗性を付与する●この１１ｌ
Ｏ遺伝子は、これらの配列を含むバクケーゾング細胞選
択において役立つ（下記を参照）０ 例にかいて用いられるレトロウイルスのベクターは、Ｍ
Ｏ１０ｎｅｙネズミ白血病ウィルスに基いているが、他
のベクターを使用することも価値があるＯＮＫＯ遺伝子
を選択可能なマーカーとして含むこのようなベクターが
記述されている０例えば、Ｎ２ベクター（ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２ ３ ０ １ ３ ９ ５ − １ ５ ９
８１９８５）］である０ レトロウ．イルスシャトルベクターκ関連する理論的問
題は、宿主ｒノ▲における統合部位の細胞＃ｌ瘍遺伝子
を、転写的κ活性化するレトロウイルスの口冫グターミ
ナルリビー｝ （ ＩＪＴＲ ）制御配列の潜在能力で
ある●この問題は、ＢＩＮベクターを創ることによって
減少する可能性がある〔第４図（その１）〕ａｓ工Ｎベ
クターは、レトロウイルスＬＴＲ中のプロモーターとエ
ンハンサー領域から念る欠失を含む自己一不活性化ベク
ターである。
Ｂ工ＮベクターのＩ＋ＴＲ配列は、転写的に５′または
ｙゲノム配列を活性化しない０ウイルスＬＴＲ配列の転
写不活性化は、隣接標的ＤＮＡ配列の挿入活性化を減少
し、配送さ′ｒＬたキメラ状分子の選択的発現κ役立つ
ＯＳＩＮベクターは、ｙウイルスＬＴＲ配列［ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｌｑｕｅ ４ ５ ０４ − ５ １ ２
（ １９８６）］ＩＣ＞ける約２ ９ ９ ｂｐを除去
するととくよって創られる０ このようにして、本発明のレトロウイルスシャトルベク
ターは８工Ｎベクターであることがよク望宣しい◎ 子は、これらのシャトルベクターから除去されたので、
レトロウイルスベクターを感染性ウイルス粒子に包み込
み、キャプシッドでかかうために、？遺伝子産物を提供
するために、ヘルパーウィルスが利用されることがある
■こｎは、感染性の合成ウィルスを発生することができ
るが％いかなる梗出可能な野生型のウィルスも産生ずる
能力に欠けている特殊化した１バツケーゾング細胞系を
利用することによって達成される０このようにして人工
的合戒ウィルスは、野性型ヘルパークィルスを含まない
合或的人工感染性クィルス粒子の中κ包み込會れた本発
明のキメラを含む●これは、安定κバツケークング細胞
に統合されているヘルパーウイルスは、ウィルス構造遺
伝子を含むが、ウイルス粒子ｒノムＲＮＡ分子が感染性
ウィルス粒子κ包み込まれるためκ、その中に含ｔｔｔ
てぃなければなら■いシスに作用する調節配列ｐｓｉ
ｓ位に欠けている事実に基いている◎ したがって、本発明の４番目の面にかいては、本発明中
こＴ′Ｌｌで記述されたようなレトロウイルスシャトル
ベクターから危る感染症ウイルス粒子が提供される０誼
ベクターは、人工的に感染性の複製欠損性レトロウィル
スを創るために、ウィルスタンパク質内に包み込ちれて
いる〇 好ましくは、レトロウイルスシャトルベクターは、ＡＦ
ＦまたはＡＬＢの転写ｖ４節性配列を有するキメラ状分
子を含むシャトルベクターからなる。と夕わけ、該シャ
トルベクターは、ＡＦＦ ／ ＶＺＶ ＴＸキメラｔｆ
ｃはＡ′ＬＢ／ ＶＺＶ ＴＫキメラを含んでいろＯｐ
１！１部位の除去に加えて、ヘルパーウィルスがウイル
ス粒子κ包み込まれず、そして、逆転写酵素とウイルス
の統合のレベルにかいて組止とれることｔ確実に行うた
めに、ヘルパーウィルス調節配列に対して、さらに変更
を行うことができる〇代替策として、ヘルパーウィルス
構造遺伝子（すなわち−ｈｇａｇｓ ｐｏ１及びｏｎｖ
）は、個々に、そして独立にパンケーゾング細＃ａ未
κ移すことができる０これらのウイルス構造遺伝子は、
バツクータンク細胞のｒノム内で分離されているので、
野性拒のウィルス″ｆ：発生するか＜ｆｌ．７ｃ逝伝子
組換見のチャンスは、殆どない〇 本発明の５＠目の面において、この中においてすでに述
ぺらｊＬたよりな本発明の卑メラ状分子を？ｔｒ人工的
レトロウイルスシャトルベクターをパツケークング細胞
系κ配送することによって、本発明の感染性ウイルス粒
子産生ずるための方法を提供する０ バックークング細胞系は、その中κ％ ｐｓｉ部位と、
本発明ですでに述べられたよう危他のｌｉＩｊＩ配列に
欠けているヘルパーウイルスを、安定に統合しているか
、代替としてパック−７細胞系は、ヘルパーウイルスの
構造遺伝子を、そのｒノム中に含むようκ工作すること
ができる０ 本発明は、さらκ治療用、特ｅｃ Ｂｏｏ ，精上皮腫
で危い精巣がん、ある種の奇型がん及びある種の胃腸が
んの治療の使用のため、本発明中で、これまでκ述べら
′１′Ｌたような感染性のウイルス粒子を提併してぃる
＠ 異種酵素、特Ｋ ＶＺＶ ｆζゾンキナーぜ遺伝子の選
択的発現は、組織一％異的転写調節（例えば、エンハン
サーとプロモーター）配列を利用することによって達成
されゐ●選択性は、肝細胞の選択的感染■よってさらκ
改善される●バククーｙｍ？中に存在するレトロウイル
スの●ｎｖ遺伝子が宿主感染についての特異性を決める
０パツケークング細胞系を構築するのに使用されるｏｎ
ｖ遺伝子は、選択的κ肝細ＩＩ＆■感染する人工感染ウ
イルス粒子を発生するようにＦｓｃ変されるｏ１例とし
ては、パッケージング細胞中に導入されたレトロウイル
ス●ｎ▼遺伝子が、人工的な感染ウイルス粒子の工冫ベ
ロープの糖タンパク質が、Ｂ！＄！肝炎ウイルス（ ｌ
ｉＢＶ ）によって利用される特異的レセプター媒介結
合を経て肝細胞κ選択的に感染するや９万にかいて改変
することができるＯ ＢＢＶは、主として特異的レセプター媒介結合を経て肝
細胞κ感染する０プレ−８１とプレー８２配列によって
コードされるＨＢＶタンパクが、ＢＢＶの肝ＪａｌｌＪ
ｉ （ ｌＨｅｐａｃＬｎａウイルス、Ｒｏｂｉｎｓｏ
ｎら編１８９−２０３、２０５−２２１、１９８７）へ
の付着κかいて、主要な役割を演ずる０パツケークング
ａｙｓの●ｎ▼遺伝子は、大きな８ ＨＢＶ工冫ペロー
プタンパク質の肝細胞結合部位を含むようにＦｋ瞥ざれ
ス。バツケージング釧胸Ｋ温λ貞乳ふ？ｎｖ遺伝子のこ
のような改変は、本分野κシいて十分知られている分子
生物学の技術によって遂行されることができ、またこの
改変によシ標的組織でのウイルスの取込みが促進される
０ 本発明による感染性ウイルス粒子は、この分野にかいて
よく知られている技術■よって作出すことができ、桑剤
として受入れられる指体を伴った製剤として提供するこ
とができる０この場合における桑剤として受入れられる
相体は、感染性ウイルス粒子を患者中に導入するための
溶媒として使用するのに適した液体媒地を含むことがあ
る０このような如体の１例は食塩水である０感染性ウイ
ルス粒子は、このような媒体中の溶液または懸濁液であ
ることができる０安定剤及び抗酸化剤、セして／または
他の賦形剤が、どのような従来の方法、例えば経口また
は非経口ルートκよって補乳類に投与されることができ
るような医梁品の製剤として存在することができる０と
クわけ、感染症ウイルス粒子は、静脈内または動脈内注
入κよって投与されうるＱ ＨＯＯを治療する場合には
、肝臓内動脈注入が有利であると思われる。
ｙゲノム配列を活性化しない０ウイルスＬＴＲ配列の転
写不活性化は、隣接標的ＤＮＡ配列の挿入活性化を減少
し、配送さ′ｒＬたキメラ状分子の選択的発現κ役立つ
ＯＳＩＮベクターは、ｙウイルスＬＴＲ配列［ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｌｑｕｅ ４ ５ ０４ − ５ １ ２
（ １９８６）］ＩＣ＞ける約２ ９ ９ ｂｐを除去
するととくよって創られる０ このようにして、本発明のレトロウイルスシャトルベク
ターは８工Ｎベクターであることがよク望宣しい◎ 子は、これらのシャトルベクターから除去されたので、
レトロウイルスベクターを感染性ウイルス粒子に包み込
み、キャプシッドでかかうために、？遺伝子産物を提供
するために、ヘルパーウィルスが利用されることがある
■こｎは、感染性の合成ウィルスを発生することができ
るが％いかなる梗出可能な野生型のウィルスも産生ずる
能力に欠けている特殊化した１バツケーゾング細胞系を
利用することによって達成される０このようにして人工
的合戒ウィルスは、野性型ヘルパークィルスを含まない
合或的人工感染性クィルス粒子の中κ包み込會れた本発
明のキメラを含む●これは、安定κバツケークング細胞
に統合されているヘルパーウイルスは、ウィルス構造遺
伝子を含むが、ウイルス粒子ｒノムＲＮＡ分子が感染性
ウィルス粒子κ包み込まれるためκ、その中に含ｔｔｔ
てぃなければなら■いシスに作用する調節配列ｐｓｉ
ｓ位に欠けている事実に基いている◎ したがって、本発明の４番目の面にかいては、本発明中
こＴ′Ｌｌで記述されたようなレトロウイルスシャトル
ベクターから危る感染症ウイルス粒子が提供される０誼
ベクターは、人工的に感染性の複製欠損性レトロウィル
スを創るために、ウィルスタンパク質内に包み込ちれて
いる〇 好ましくは、レトロウイルスシャトルベクターは、ＡＦ
ＦまたはＡＬＢの転写ｖ４節性配列を有するキメラ状分
子を含むシャトルベクターからなる。と夕わけ、該シャ
トルベクターは、ＡＦＦ ／ ＶＺＶ ＴＸキメラｔｆ
ｃはＡ′ＬＢ／ ＶＺＶ ＴＫキメラを含んでいろＯｐ
１！１部位の除去に加えて、ヘルパーウィルスがウイル
ス粒子κ包み込まれず、そして、逆転写酵素とウイルス
の統合のレベルにかいて組止とれることｔ確実に行うた
めに、ヘルパーウィルス調節配列に対して、さらに変更
を行うことができる〇代替策として、ヘルパーウィルス
構造遺伝子（すなわち−ｈｇａｇｓ ｐｏ１及びｏｎｖ
）は、個々に、そして独立にパンケーゾング細＃ａ未
κ移すことができる０これらのウイルス構造遺伝子は、
バツクータンク細胞のｒノム内で分離されているので、
野性拒のウィルス″ｆ：発生するか＜ｆｌ．７ｃ逝伝子
組換見のチャンスは、殆どない〇 本発明の５＠目の面において、この中においてすでに述
ぺらｊＬたよりな本発明の卑メラ状分子を？ｔｒ人工的
レトロウイルスシャトルベクターをパツケークング細胞
系κ配送することによって、本発明の感染性ウイルス粒
子産生ずるための方法を提供する０ バックークング細胞系は、その中κ％ ｐｓｉ部位と、
本発明ですでに述べられたよう危他のｌｉＩｊＩ配列に
欠けているヘルパーウイルスを、安定に統合しているか
、代替としてパック−７細胞系は、ヘルパーウイルスの
構造遺伝子を、そのｒノム中に含むようκ工作すること
ができる０ 本発明は、さらκ治療用、特ｅｃ Ｂｏｏ ，精上皮腫
で危い精巣がん、ある種の奇型がん及びある種の胃腸が
んの治療の使用のため、本発明中で、これまでκ述べら
′１′Ｌたような感染性のウイルス粒子を提併してぃる
＠ 異種酵素、特Ｋ ＶＺＶ ｆζゾンキナーぜ遺伝子の選
択的発現は、組織一％異的転写調節（例えば、エンハン
サーとプロモーター）配列を利用することによって達成
されゐ●選択性は、肝細胞の選択的感染■よってさらκ
改善される●バククーｙｍ？中に存在するレトロウイル
スの●ｎｖ遺伝子が宿主感染についての特異性を決める
０パツケークング細胞系を構築するのに使用されるｏｎ
ｖ遺伝子は、選択的κ肝細ＩＩ＆■感染する人工感染ウ
イルス粒子を発生するようにＦｓｃ変されるｏ１例とし
ては、パッケージング細胞中に導入されたレトロウイル
ス●ｎ▼遺伝子が、人工的な感染ウイルス粒子の工冫ベ
ロープの糖タンパク質が、Ｂ！＄！肝炎ウイルス（ ｌ
ｉＢＶ ）によって利用される特異的レセプター媒介結
合を経て肝細胞κ選択的に感染するや９万にかいて改変
することができるＯ ＢＢＶは、主として特異的レセプター媒介結合を経て肝
細胞κ感染する０プレ−８１とプレー８２配列によって
コードされるＨＢＶタンパクが、ＢＢＶの肝ＪａｌｌＪ
ｉ （ ｌＨｅｐａｃＬｎａウイルス、Ｒｏｂｉｎｓｏ
ｎら編１８９−２０３、２０５−２２１、１９８７）へ
の付着κかいて、主要な役割を演ずる０パツケークング
ａｙｓの●ｎ▼遺伝子は、大きな８ ＨＢＶ工冫ペロー
プタンパク質の肝細胞結合部位を含むようにＦｋ瞥ざれ
ス。バツケージング釧胸Ｋ温λ貞乳ふ？ｎｖ遺伝子のこ
のような改変は、本分野κシいて十分知られている分子
生物学の技術によって遂行されることができ、またこの
改変によシ標的組織でのウイルスの取込みが促進される
０ 本発明による感染性ウイルス粒子は、この分野にかいて
よく知られている技術■よって作出すことができ、桑剤
として受入れられる指体を伴った製剤として提供するこ
とができる０この場合における桑剤として受入れられる
相体は、感染性ウイルス粒子を患者中に導入するための
溶媒として使用するのに適した液体媒地を含むことがあ
る０このような如体の１例は食塩水である０感染性ウイ
ルス粒子は、このような媒体中の溶液または懸濁液であ
ることができる０安定剤及び抗酸化剤、セして／または
他の賦形剤が、どのような従来の方法、例えば経口また
は非経口ルートκよって補乳類に投与されることができ
るような医梁品の製剤として存在することができる０と
クわけ、感染症ウイルス粒子は、静脈内または動脈内注
入κよって投与されうるＱ ＨＯＯを治療する場合には
、肝臓内動脈注入が有利であると思われる。
したがって、本発明は、薬剤として受入れられる相体と
混合した感染性ウイルス粒子からなる医薬品製剤を提供
する０ さらに、本発明は、ここにかいて述べられているキメラ
状分子を含む人工的感染性のウイルス粒子を、薬剤とし
て受入れられる担体と混合することからなる医薬品製剤
を作る方法を提供する０選択的に酵素によって変換する
ことができるどのような適切な化合物も利用することが
できるが、本発明は、さらにＶＺＶテミクンキナーゼを
発現することができるがんを治療するための、と９わけ
肝細胞がん（ １！００ ）の治療κ使用するための薬
剤の製造κシいて、構造式Ｉまたはｌの化合物の使用を
提供する０ 本発明の詳細にかいて以下κ示すようにＲ１が、ハロ％
ＯＸ−５アルコキシ、ハロゲンｆｌ換０１−５アル
コキン； Ｃ１−５アルキル、１ヶ以上のＯＢ ？素原子κよって置換さｆＬたＣ１−５アルキル、Ｃ
シクロアルキルκよってモノまたはゾ置換３−６ さｆ′Ｌたアミノ基、または、０４−？炭素原子そして
任意に１この２重結合を含んでいてよい異項環を含む窒
素であクＲ２が木素、ハロまたはアミノ基である構造式
（１）の６ｔ換プリンアラピノシト゜、その塩及びその
生理学的機能■かける等価物は抗ｖｚｖ及び抗サイトメ
ガロウイルス剤として知られてか９、それらの使用と合
或は、隠０２９１１４の下忙公告されたヨーロッパ特許
出ａＫ．記述されているＯ ここにおいて、構造式璽の化合物は、下に示されている
通シである〇 Ｒｌ ○Ｈ ただ６シ、ｘは、ピニレン１たはエチレン基を表わし；
Ｒｌは、オキンまたはイミノ基ｔ表し；Ｒ２は水素原子
、○ｌ−２アルキル、０３−４枝分れまたはシクロアル
キル基、たとえば、インプロビルまたはンクロプロビル
を表し；ＲＳは、水素原子ｔたはアシル基、たとえば、
１つ以上のハロｒ冫、アルキル、ハイドロキシまたはア
ルコキシ置換基によって任意に置換された、例えばＯＬ
−４アルカノイルまたはぺ冫ゾイル基を表し、そしてＲ
４は水素原子またはーイドロキシル基を表し；Ｒｓ％Ｒ
３とＲ４が、各々＊素原子ｔ−表すときは（ａ） Ｒｌ
はオキノ？を表さないことを条件とするＯ Ｒ３がアシル基でないときは、構造式（１）または（１
）は、その互変異性形として存在し得ることが評価され
る■特Ｋ％式（ｆ）と（１）のよ夕好ましい化合物は、
９−β−アクピノフラノシル−６−メトキシ−９Ｈ−プ
リンと１−（β−Ｄ−アラピノフラノシル）−５−プロ
ビルウラシルである〇これらの化合物とそれらの合或の
方法は、抗ＶＺＶ活性をもつとして、ｂ０２７２０６５
の下に公もされたヨーロッパ特許中に明らかにされてぃ
るＯ 上に述べたビリミクンヌクレオシドとプリンアラビノシ
ドは、會た、このような化合物の医薬品として受入れら
れる誘導体、すなわち医藁品として受入れられる塩、エ
ステルまたはこのようなエステルの塩、ｔたは、ヒト患
者に投与したとき、その活性代謝物または残留物を提供
（直接または間接κ）することができる他の化合物すべ
ても含む０よ夕好ましくは、化合物は経口的に活性であ
るＯ 補乳動一を処置する場合の用量と厳密な療法は、勿論相
当医の責任てあるが、処置すべき型と重篤度をはじめと
する多数の要因に依存する●しかしＨａｃについては、
ｄあたシ２ Ｘ １ ０５と２ Ｘ １ ０？の間のコ
ロニー形或単位（ＯＦＵ／ｓｇ）の力価の人工的感染性
ウィルス粒子の肝臓内動脈注入が、典型的ながんには適
切であるようである０注入されるウィルス粒子の全ｉｋ
は、がんの大きさに依存し、恐らく何回かに分けて投与
されることになろう＠集物処理 感染性ウィルス粒子で
の感染に続いて、本発明による細胞毒性または細！ｉ７
！Ａ静止性代謝物への同化における不可欠に重要な最初
のり冫陵化段階にｖｚｖ ＴＫ ｍ性ｔ−％異的に必賛
とする化合物が投与される〇 薬物の用量は、受容者のｑ体Ｘあた夕０．１から２５０
１ｖｏ範囲Ｋあるのが有益であシ、ゆ体！ｉあ７ｔ５０
．１から１００ＷＩｇであるのがよシ好ましい〇以Ｆの
例は、本発明を分シやすく説明するのに役立つが、それ
によって、本発明が制限を受けると解釈されるべきでは
ない〇 例１ アルフミンの転写！！ｌ！節配列／ ｖｚ７テミクンキ
ナーゼ分子状キメラの構築 ＺＶＺ ＴＫ遺伝子のコーティング配列とポリアデニル
化シグナルを含む、約１ ３ ８ １ ｂｐｏ人ａａ
工／ Ｎｄｅ Ｘ ＤＮＡ断片（制限酵素はすぺてＢｅ
ｓｔｈｅｓｃｌａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ，１７８Ａ
；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｉ３１ｏ１ａｂｓ．Ｍａ
ｓｓ，１７８ＡまたはＦｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉａｏｎ
，Ｗｉ，ＵＳＡから得らｆＬた；酵素反応は、すべて供
給者によって特定化された如く遂行さｆＬた）は、エリ
ュートラップ電気泳動檜（ ８ｃｈｌｅｉｃｈｅｒＰＬ
ｎｄ ｓｏｈｕ６１１，Ｋ’ｓｅｎＯ ＮＨ，ｔＴＯＡ
による）を使用して、ｚｖｚ ＴＫゲノＡ （ ｖｉｒ
Ｏ１ｏｇｙ １ ４ ９ ： １ − ９、ｌ ９ ８
６ ； ．Ｔ．Ｏｅｔｒｏｖｅ ， Ｎ工Ｂ ， Ｂ
ｅｓｔｈｅｓｌａ ，Ｍ（１，によって供給）の約２
２ ０ ０ ｂｐのＩｅ（！ＯＲ工／ Ｂａｎ Ｔ１工
断片を含む２ ２ ７Ｋと名付けられている約４８９６
′ｂｐのプラスζドの制限エンドヌクレアーゼ消化物か
ら電気溶出によって精製した０和製したＤ｝ｌＡ断片は
、全ＶＺＶ ’ｒＫ ：Ｆ−ディング配列とポリアデニ
ル化シグナルを含んでいるが、ｖｚｖτＫのグロモーシ
ョンを行う要素〔第２図（その１、２、５及び４）〕を
含んでい女いＯ ｎｆＪ＃Ｌ，＊１ ３ ８ １ ｂｐＡｃｃ Ｉ／Ｎｄ
ｅ Ｉ ＶＺＶＴＫ断片の５′突゛出端を、Ｊｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼエのＫ１ｅｎＯＷ ｆ！Ｒ片（
Ｂａｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｇ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ’ｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｔ
ＪＩ３Ａ ）とデオキシヌクレオテドトリホスフエー｝
（ ａＮ’ｌ’Ｆθ）で処理することによシプラント
したＯ Ａび１７Ｐ配列のうち，約２ ３ ０ ０ ｂｐを含む
２３３５Ａ− １と名付けた約５ ２ ４ ９ ’ｂｐ
のプラスミドは、Ｒｉｃｈａｒｌ Ｆａｌｍｉｔｏｒ
（ワシントン大学、シアトル、ワシントン，ｔｙｓＡ）
から得られた。この構築物は、肝特異的発現に必要を配
列を含んでいるが、非必須介在ｎ列を含んでい々い０特
異なＢａｍ ’１１工制限ヌクレアーゼ認識部位は、転
写開始部位を基準にして、下流方向＋２ ３ ｂｐに存
在している．２５３５Ａ− １は、制限工冫ドヌクレア
ーゼＢａｍ Ｙｌ工で消化し、５′の突出端は、上述の
如（ Ｋｌｅｎｏｙ断片とｄＮＴＦｓで処理してプラン
トとしたＯ ＡＩＪＢ Ｋ ／ Ｐ ｖｚｖ ＴＫキメラが、Ｔ４
リガーゼ（ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ−ｂｕ
ｒｇ，ＭＤ ） （第５図）を使用して．ＶＺＶＴＫコ
ーディングとボリアデニレーション配列を含む、プラン
トエンドとしたＡｃｅエーＮｄ●工断片を、２３３５Ａ
− １のプラントエンドとしたＢａｎ Ｈ工部位につな
ぐことによって構築され、１）ＯＲ７３が創製された０
記述されたすべての連結と同様に、連結された断片の方
向は、この分野の技術でよく知られている方法によって
、制限エンドヌクレアーゼ消化κよって決定されたＯす
べでの例にかいて記述されたすべてのプラスミドと同様
に、ｐＯＲ７３は、本分野の技術Ｋｂいてよく知られて
いる方法によシ、バクテリアにおける複製のためκ必景
とされる増幅κ適切な必須配列を含んでいるＯＡＩＪ３
ｖＰ ＶＺ”ｌ ７Ｋキメラは、約３ ８ ８ ０
′ｂｐ Ｂａｔ Ｉ／ Ｋｐｎ Ｘ 制Ｆｌ％工冫ドス
クレアーゼ断片（第５図）から、電気溶出κよって精製
されたＯｙの突出端を７４ＤＮＡポリメラーゼと（ｌＮ
ＴＰ８で処理することくよってプラントとしたＯこの８
ｓｔ工／ Ｋｐｎ工のプラントエンドにした制限断片は
、続いてＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのレトロ
ウイルスシャトルベクターシステム（下記例３を参照）
Ｋ導入された０ １）ＯＲ ７ ３は、受付番号ＡＴＴＯ ６ ８ ０
７ ７の下κ１９８９年８月１８日にＡＴＴＯに寄託さ
れたＯ例２ 転写調節配列の構築 ｖｚｖチミジンキナーゼ コーディング配列とポリアデ
ニル化部位は、ＦＯＲ ７ ３の約３．３ ０ ０ ｂ
ｐＢａｎ ＴｉエーＸｍｎ工制限工冫ドヌクレアーゼ断
片として単離された（第６図） ｏ Ｂａｎ Ｈ工制限
工冫ドヌクレアーゼ部位の５′突出端は、Ｋｌｅｎｏｗ
とｄＮＴＰＩ！ ＫよクプラントとしたＯこのＩ）ＮＡ
断片は、ｖｚ７ ＴＫ遺伝子の完全なコーディング配列
とポリアデニル化部位を含んでいるが、エンハンサーま
たはプロモーターの配列は含んでいないＯヒトＡＦＰ５
′隣接ＤＮＡの約５．１００ｂｐｔ−含むｐＡ ５．１
−ＣＡＴである約９ ９ ９ ６ ｂｐのプラスミド
は、Ｕｎｉｖ ．ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ，Ｃａｎａｄａ
（２） Ｔ．Ｔａｍａｏｋｉから入手したＯヒトＡＰ
Ｉ’遺伝子の約−５．１１から＋２９にわたるＤＮＡ断
片が、ｐＡ？ ５． １ − ＯＡＴからＩｎｎ Ｉで
の消化と、Ｈｉｎｌ Ｎでの部分的消化κよって単離さ
れた０このＩｎｎ工／ Ｈｉｎｄ Ｉ断片は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｎ Ｈ工／ Ｘｍｎ工ＶＺ
Ｖ ’ｒＫ断片へつなぎ、ｐａｒｔ ７ ７を形成した
（第６図） ｏ ＡＦＦ Ｂ’ＰＶＺＶ ＴＫキメラを
ｐＯＲ ７ ７ カら約６ ６ ９ ９ ｂｐのＡａｔ
ｌ ／ Ｐｅｔ工制限工冫ドメクレアーゼ断片として
、電気溶出によってｒＩＩｍシた＠この断片は、次に、
例１のようにＴ４ ＤＮＡポリメラーぜとｄｌＪ？Ｐｓ
で処理して、プラントエンド制限酵素断片を産生じたＯ ｐＯＲ ７ ７はへ受付番号ＡＴＯＯ ６ ８ ０ ７
９の下に、１９８９年８月１８日にＡＴＯＯに寄託し
た〇例３ 例１のキメラ状分子を含むレトロウイルスシャトルベク
ター構築物の構築 人ＬＢ １！，／Ｐ ＶＺＶ ＴＫキメ′ｙｔ−含むレ
トロウイルスシ’ｒ ｝ ｋ ヘ／ ｆｉ − ｐＣＲ
７ ４ １ｄ．、ｐＯ１ ７ ５ Ｏｎｍ？ｓｔ工／
Ｋｐｎエプラント末端化断片を、Ｂ．ＫａｒｒｌＲＯ
ｎ，Ｎ工Ｈ，Ｂｅｌｌｔｈｅｌａ＆，ＭＤ，ＵＳＡ力１
ら入手したＮ２（ＸＭ５） （ ８ａｉｅｎａｅ２５０
； １ ３９５−１３９８、１９８５）と名付けたＭ
ｏｌｏｎｅｙネズミ白血病レトロウイルスベクターに連
結することによって構築したＯ Ｎ２（ ＸＭ５）は、
制限工冫ドヌクレアーゼｘｈｏ工で消化し、５′の突出
端は、１ｎｅｎＯｖとｄＮＴＰａで処理することκよシ
プラントとしてからＴ４ ＤＮＡりがーぜを用いて、ｐ
ＯＲ ７ ３ Ｂａｔ工／Ｋｐｎ工断片に連結した（１
５図）Ｏ ＡＩＪ３ Ｋ／Ｐ ＶｚＶ ＴＫキメラを含むレトロウ
イルスのシャトルベクターＦＯＲ ７ ４は、制限エン
ドヌクレアーゼマツビングと、ＤＮＡ配列決定によって
特徴づけを行い、基本配列をｓ！＆！！！した６ ＡＩ
Ｊ３ Ｆ，／Ｐ配列が、ＶＺＶ ＴＫ配列に接合部で横
■並んでいる配列は、第７図に示されているＯ ＰＯＲ ７ ４は、受付番号＆ ＡＴＯＯ ６ ８ ０
７ ８の下に１９８９年８月１８日にＡＴＯＯに寄託
されたＯ例４ ルベクター構築物の構築 レトロウイルスシャトルベクターｐＯＲ ７ ８ （
第６図）は、ＡＩＦＰ Ｅ／Ｐ ’ＶＺＶ ＴＫキメラ
を含むＰＯＲ ７ ７の精製Ａａｔ ｊ ／ Ｐｓｔ工
断片を、ＸｈＯ工で消化し、例３で記述したよ５Ｋ％丁
４ ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰａでプラント末端と
したＮ２（ＸＭ５）に連結することによって栴築したｅ
ＡＦ？ Ｆ，／アＶＺ’Ｖ ’！’Ｋキメラを含むレ
トロウイルスシャトルベクターｐ（Ｊｊ ７ ８は、制
限エンドヌクレアーゼとＤＮＡ配列決定によって特徴づ
けを行い、基本配列を確認したｏ ＡＦＰ Ｂ／Ｐ配列
がＶＺＶ ’Ｉ’Ｋ配列への接合部で、横に並んでいる
配列は、第８図に示されているＯＰＯＲ ７ ８は、受
付番号−ＡＴＯ０ ６ ８ ０ ８ ０の下に、１９８
９年８月１８日にＡＴＯＯに寄託された０例５ ウイルス産生 人ＴＯＯ （ ＡＴＯＯ ＯＲＬ ９ ０ ７ ８ ）
カら得らｎたＰＡ５１７と呼ばれる以曲に記述された
バククークング細胞系は、５’ ＬＴＲ ％ ｐｓｉ
ｉｌｌ節配列及び３’ ＬＴＲ（人Ｔ００ ０ＲＬ ９
０ ７ ８ ）内に含まれた５つの改変部を有してい
る（ Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｏｅ１１Ｂｉｏ１． ６ Ｎａ
８２８９５−２９０２１９８６））。例３と例４に記述
された人工的レトロウイルス構築物は、ノくツケークン
グ細胞系の中にエレクトロボーレ−ションが感染によっ
て導入し７２：ＯエレクトロボーＶ一ションのためκは
、２０μｇの直線化したプラスミドＤＮＡを、ホスフエ
ートバソファ一一庶糖溶液中で、０，８−の全容積で、
２ＢＯ＄ルト２５マイクロファラッドのキャパシタンス
で、２百万のＰＡ３ １ ７細胞に工Ｖクトロボーレー
ショイを行った。これによシ、少くとも１５０Ｇ４１Ｂ
抵抗性コロニー７２０μタプラスζドＩＩＮＡ／２百万
ＰＡ３１７細胞を得ることができるＯｇ染のためには、
２０μ′９の直線化したブラスミドＤＮＡを、Ｐｓｉ
２細胞のような２百万の同種志向性パックークング細胞
中に、エレクトロボーレーションヲ行った０２日後、培
養上滑を用いて、両鵡志向性ノくツケーンング細胞系Ｆ
Ａ３ １ ７″ｌｒ：感染とせ、４１８の抵抗性コロニ
ーを単離したＯエレクトロボーレーションと感染の技術
の両力について，０４１８抵抗性コロニーを限界希釈法
によって単細胞クローニングし、サデンプロットκよっ
て分析し、Ｎ工Ｈ３Ｔ３細胞（ ＡＴＣＯ ）甲で力価
を測定し、全長ウイルスの最高産生細胞を同定した●ｐ
ＯＲ ７ ４を含むＰＡ３ １ ７細胞について、１７
単細胞クローンが単離され、これらのクローンのうち１
０こからＤＮＡが抽出された＠異なる制限工冫ドヌクレ
アーゼ酵素と・ＮＫＯとＶＺＶ Ｔｉｃ配列を放射活性
のハイブリッド形成プローデとして用いて、これらの１
０このＤＮＡ Ｅ 料について広範なサデンプロット分
析を遂行した０分析した１０このクローンのうち、２つ
は、切ｐつめの証拠がなく、完全長をもつと考えられる
ｏｐＯＲ７８ｔ−含むＰＡ ５ １ ７細胞κついては
、２９の単細胞クローンが単離され、ＤＮＡが２５のク
ローンから得らｎた０これら２５試料について、異なる
劃限工冫ドヌクレアーゼ酵素、及び、一イプリクド形成
プローデとしてＡＩＦＰ，ＮＭＯとＶ’ＺＶ ＴＫの放
射性配列を用い広範なサデンプロフト分析を行った０分
析した２５のクローンのうち、５つが、切クつめの証拠
を示さず、全長を有すると考察さ−ｎ． ｆＣ ｏ全長
ウイルス配列を含む各パッケージング細胞は、テミクン
キナーゼがマイナス／マイナスであったＮＩＢ ３ Ｔ
３細胞において、標準技術で力価を測定し九〇 例６ 備えた例５の感染性ウイルス粒子によるヒト肝がん細胞
系（正の対照）の感染と引続いてのＶＺ７ ７Ｋ活性、
ａｒａ ＡＴＰ産制と薬剤感受性の測定ＡＩＪ３ ／
ｖＺＶ ＴＫキメラまたはＡＩＦＰ ／ ＶＺＶ ＴＫ
キメラを含む複製が欠損性で、全長の人工的レトロウイ
ルスが、Ｈｅｐ Ｇ ２ （ ＡＴＯ（） ＨＢ ８
０ ６ ５ ）と名付けられたヒト肝がん細胞系を感染
するのκ用いられ九〇感染と１ １１５Ｆ Ｇｅｎ＠ｔ
ｉａｉｎ ／ ｄ （商標）上で選択した後、細胞は、
ＶＺＶ ＴＫ活性について測定した０さらに細胞は、（
３Ｂ）標１１！？ − （β一Ｄ−アラピノフラノシル
）−６−メトキシー９Ｈプリン（以下の表と図にかいて
ａｒａ−ｍと呼ぶ）の存在κかいてインキエペートし、
その後、ａｒａ ＡＴＰ Ｏ ６１Ｊ定を行った●最後
に、細胞は、上記の化合物の存在にかいて培養し、工Ｏ
ｓｏ （生長阻害）を測定しタ０ウィルスで感染しない
細胞や、Ｎ２ウイルスで感染した細胞は、これらの実験
の対照試料として用いられる６Ｎ２クィルスはＶＺＶ
ＴＫ遺伝物質を含んていない〇 表１は、ｐＯＲ ７ ４またはｐＯ１ ７ ８のいずれ
かで感染したヒト肝がん細胞が、それぞれ対照にくらべ
、９０４ｘまたは５２ｘ以上のｖｚｖ ’ｒｘ活性をも
っていることを示している０ ？−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）−６−メトキシー
９Ｈプリ：’ （ ａｒａ−ｍと呼ぶ）は、ｖｚｖＴＫ
Ｋよシ選択的にモノリン酸化され、引続いて細胞毒性ａ
ｒａ ＡＴＦに同化されることができる０第９図はＰＯ
Ｒ ７ ４または］；ＩＯＲ ７ ８ｔ−含んでいるウ
ィルスで感染させ、（３１１）で標識した９−β一Ｄ一
アラピノ７ラノシル）−６−メトキシー９ Ｋ３プリン
の存在下でインキエペートしたＲａｐ Ｇ ２細胞は、
有意な量の細胞毒性（’Ｈ） ａｒａ ＡＴＰの生成を
起したことを示しているＯ ＡＬＢ ／ ＶＺＶ ＴＫキメラ（ １）ＯＲ ７ ４
）かＡＩＦＰ ／ＶＺＶ ＴＫ （ ｐａＲ７ ８
）キメラを含む複製欠損性の全長の、人工的レトロウイ
ルスで感染したＨｏｐ Ｇ２細胞を、９−（β一Ｄ−ア
ラビノ７ラノシル）−６−メトキ７−９Ｈプリンの存在
量を変化させて５日間インキエベートし、生長阻害を、
細胞数とＤＮＡ含量によって測定した０ 表２ｔｉ，９−（β−Ｄ−アラピノフラノシル）−６−
メトキシー９Ｅプリンの工Ｃｓｏ （ ５ ０ ％生長
阻害）は、対照とＮｓ ＩＩＡ染Ｇ２細胞において、２
０００μＭよ夕大きいことを示しているｏ ＡＬＢ／
ＶＺＶ ＴＫキメラ（ｐＯＲ７４）ｔ７ｊはＡＰＰ ／
ＶＺＶＴＫ （ ｐＯＲ ７ ８ ）キメラを含む複
製欠損性の全長を備えた、人工的レトロウイルスで感染
したＨｏｐ Ｇ ２では、その工０５０は、それぞれ、
５μｙと１７５μｍであ’：） ｆｃｏ ＡＦＰ ／
ＶＺＶ ＴＫ （ ｐＯＲ７８）キメラを含むＨｅｐ
Ｇ ２細胞の単細胞クローニングによＤ、？−（β−Ｄ
−アラピノ７ラノシル）−６−メトキシー９Ｈプリンの
工０５ｏレベルは、さらに約４０μ西に減少し得ること
が示されたＯ 例７ ＶＺＶ ＴＫの発現の選択性 ５つのヒトＡＬＢ ／ ＶＺＶ ＴＫキメラ（ ｐＯＲ
７ ４ ）を含む非肝ガン細胞系を、複製欠損性全長
、人工的レトロウイルスで患染させたＯこれらの細胞系
は、ＷＩＬＩＩＲ Ｃ ＡＴａａ ａａＩｌ２ １ ８
）、ｘｘｘ ９ ０ （ ｈｒｏｏａｃｓ １ ８
６ ） 、ＭＣＩＰ ７ （ ＡＴＯＯ ｕｒＢ２ ２
）、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５ ５ ５ （ ＡＴＯＯ ｏ
ａＩ，１ １ ０ ）及び８Ｗ４８。
混合した感染性ウイルス粒子からなる医薬品製剤を提供
する０ さらに、本発明は、ここにかいて述べられているキメラ
状分子を含む人工的感染性のウイルス粒子を、薬剤とし
て受入れられる担体と混合することからなる医薬品製剤
を作る方法を提供する０選択的に酵素によって変換する
ことができるどのような適切な化合物も利用することが
できるが、本発明は、さらにＶＺＶテミクンキナーゼを
発現することができるがんを治療するための、と９わけ
肝細胞がん（ １！００ ）の治療κ使用するための薬
剤の製造κシいて、構造式Ｉまたはｌの化合物の使用を
提供する０ 本発明の詳細にかいて以下κ示すようにＲ１が、ハロ％
ＯＸ−５アルコキシ、ハロゲンｆｌ換０１−５アル
コキン； Ｃ１−５アルキル、１ヶ以上のＯＢ ？素原子κよって置換さｆＬたＣ１−５アルキル、Ｃ
シクロアルキルκよってモノまたはゾ置換３−６ さｆ′Ｌたアミノ基、または、０４−？炭素原子そして
任意に１この２重結合を含んでいてよい異項環を含む窒
素であクＲ２が木素、ハロまたはアミノ基である構造式
（１）の６ｔ換プリンアラピノシト゜、その塩及びその
生理学的機能■かける等価物は抗ｖｚｖ及び抗サイトメ
ガロウイルス剤として知られてか９、それらの使用と合
或は、隠０２９１１４の下忙公告されたヨーロッパ特許
出ａＫ．記述されているＯ ここにおいて、構造式璽の化合物は、下に示されている
通シである〇 Ｒｌ ○Ｈ ただ６シ、ｘは、ピニレン１たはエチレン基を表わし；
Ｒｌは、オキンまたはイミノ基ｔ表し；Ｒ２は水素原子
、○ｌ−２アルキル、０３−４枝分れまたはシクロアル
キル基、たとえば、インプロビルまたはンクロプロビル
を表し；ＲＳは、水素原子ｔたはアシル基、たとえば、
１つ以上のハロｒ冫、アルキル、ハイドロキシまたはア
ルコキシ置換基によって任意に置換された、例えばＯＬ
−４アルカノイルまたはぺ冫ゾイル基を表し、そしてＲ
４は水素原子またはーイドロキシル基を表し；Ｒｓ％Ｒ
３とＲ４が、各々＊素原子ｔ−表すときは（ａ） Ｒｌ
はオキノ？を表さないことを条件とするＯ Ｒ３がアシル基でないときは、構造式（１）または（１
）は、その互変異性形として存在し得ることが評価され
る■特Ｋ％式（ｆ）と（１）のよ夕好ましい化合物は、
９−β−アクピノフラノシル−６−メトキシ−９Ｈ−プ
リンと１−（β−Ｄ−アラピノフラノシル）−５−プロ
ビルウラシルである〇これらの化合物とそれらの合或の
方法は、抗ＶＺＶ活性をもつとして、ｂ０２７２０６５
の下に公もされたヨーロッパ特許中に明らかにされてぃ
るＯ 上に述べたビリミクンヌクレオシドとプリンアラビノシ
ドは、會た、このような化合物の医薬品として受入れら
れる誘導体、すなわち医藁品として受入れられる塩、エ
ステルまたはこのようなエステルの塩、ｔたは、ヒト患
者に投与したとき、その活性代謝物または残留物を提供
（直接または間接κ）することができる他の化合物すべ
ても含む０よ夕好ましくは、化合物は経口的に活性であ
るＯ 補乳動一を処置する場合の用量と厳密な療法は、勿論相
当医の責任てあるが、処置すべき型と重篤度をはじめと
する多数の要因に依存する●しかしＨａｃについては、
ｄあたシ２ Ｘ １ ０５と２ Ｘ １ ０？の間のコ
ロニー形或単位（ＯＦＵ／ｓｇ）の力価の人工的感染性
ウィルス粒子の肝臓内動脈注入が、典型的ながんには適
切であるようである０注入されるウィルス粒子の全ｉｋ
は、がんの大きさに依存し、恐らく何回かに分けて投与
されることになろう＠集物処理 感染性ウィルス粒子で
の感染に続いて、本発明による細胞毒性または細！ｉ７
！Ａ静止性代謝物への同化における不可欠に重要な最初
のり冫陵化段階にｖｚｖ ＴＫ ｍ性ｔ−％異的に必賛
とする化合物が投与される〇 薬物の用量は、受容者のｑ体Ｘあた夕０．１から２５０
１ｖｏ範囲Ｋあるのが有益であシ、ゆ体！ｉあ７ｔ５０
．１から１００ＷＩｇであるのがよシ好ましい〇以Ｆの
例は、本発明を分シやすく説明するのに役立つが、それ
によって、本発明が制限を受けると解釈されるべきでは
ない〇 例１ アルフミンの転写！！ｌ！節配列／ ｖｚ７テミクンキ
ナーゼ分子状キメラの構築 ＺＶＺ ＴＫ遺伝子のコーティング配列とポリアデニル
化シグナルを含む、約１ ３ ８ １ ｂｐｏ人ａａ
工／ Ｎｄｅ Ｘ ＤＮＡ断片（制限酵素はすぺてＢｅ
ｓｔｈｅｓｃｌａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ，１７８Ａ
；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｉ３１ｏ１ａｂｓ．Ｍａ
ｓｓ，１７８ＡまたはＦｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉａｏｎ
，Ｗｉ，ＵＳＡから得らｆＬた；酵素反応は、すべて供
給者によって特定化された如く遂行さｆＬた）は、エリ
ュートラップ電気泳動檜（ ８ｃｈｌｅｉｃｈｅｒＰＬ
ｎｄ ｓｏｈｕ６１１，Ｋ’ｓｅｎＯ ＮＨ，ｔＴＯＡ
による）を使用して、ｚｖｚ ＴＫゲノＡ （ ｖｉｒ
Ｏ１ｏｇｙ １ ４ ９ ： １ − ９、ｌ ９ ８
６ ； ．Ｔ．Ｏｅｔｒｏｖｅ ， Ｎ工Ｂ ， Ｂ
ｅｓｔｈｅｓｌａ ，Ｍ（１，によって供給）の約２
２ ０ ０ ｂｐのＩｅ（！ＯＲ工／ Ｂａｎ Ｔ１工
断片を含む２ ２ ７Ｋと名付けられている約４８９６
′ｂｐのプラスζドの制限エンドヌクレアーゼ消化物か
ら電気溶出によって精製した０和製したＤ｝ｌＡ断片は
、全ＶＺＶ ’ｒＫ ：Ｆ−ディング配列とポリアデニ
ル化シグナルを含んでいるが、ｖｚｖτＫのグロモーシ
ョンを行う要素〔第２図（その１、２、５及び４）〕を
含んでい女いＯ ｎｆＪ＃Ｌ，＊１ ３ ８ １ ｂｐＡｃｃ Ｉ／Ｎｄ
ｅ Ｉ ＶＺＶＴＫ断片の５′突゛出端を、Ｊｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼエのＫ１ｅｎＯＷ ｆ！Ｒ片（
Ｂａｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｇ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ’ｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｔ
ＪＩ３Ａ ）とデオキシヌクレオテドトリホスフエー｝
（ ａＮ’ｌ’Ｆθ）で処理することによシプラント
したＯ Ａび１７Ｐ配列のうち，約２ ３ ０ ０ ｂｐを含む
２３３５Ａ− １と名付けた約５ ２ ４ ９ ’ｂｐ
のプラスミドは、Ｒｉｃｈａｒｌ Ｆａｌｍｉｔｏｒ
（ワシントン大学、シアトル、ワシントン，ｔｙｓＡ）
から得られた。この構築物は、肝特異的発現に必要を配
列を含んでいるが、非必須介在ｎ列を含んでい々い０特
異なＢａｍ ’１１工制限ヌクレアーゼ認識部位は、転
写開始部位を基準にして、下流方向＋２ ３ ｂｐに存
在している．２５３５Ａ− １は、制限工冫ドヌクレア
ーゼＢａｍ Ｙｌ工で消化し、５′の突出端は、上述の
如（ Ｋｌｅｎｏｙ断片とｄＮＴＦｓで処理してプラン
トとしたＯ ＡＩＪＢ Ｋ ／ Ｐ ｖｚｖ ＴＫキメラが、Ｔ４
リガーゼ（ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ−ｂｕ
ｒｇ，ＭＤ ） （第５図）を使用して．ＶＺＶＴＫコ
ーディングとボリアデニレーション配列を含む、プラン
トエンドとしたＡｃｅエーＮｄ●工断片を、２３３５Ａ
− １のプラントエンドとしたＢａｎ Ｈ工部位につな
ぐことによって構築され、１）ＯＲ７３が創製された０
記述されたすべての連結と同様に、連結された断片の方
向は、この分野の技術でよく知られている方法によって
、制限エンドヌクレアーゼ消化κよって決定されたＯす
べでの例にかいて記述されたすべてのプラスミドと同様
に、ｐＯＲ７３は、本分野の技術Ｋｂいてよく知られて
いる方法によシ、バクテリアにおける複製のためκ必景
とされる増幅κ適切な必須配列を含んでいるＯＡＩＪ３
ｖＰ ＶＺ”ｌ ７Ｋキメラは、約３ ８ ８ ０
′ｂｐ Ｂａｔ Ｉ／ Ｋｐｎ Ｘ 制Ｆｌ％工冫ドス
クレアーゼ断片（第５図）から、電気溶出κよって精製
されたＯｙの突出端を７４ＤＮＡポリメラーゼと（ｌＮ
ＴＰ８で処理することくよってプラントとしたＯこの８
ｓｔ工／ Ｋｐｎ工のプラントエンドにした制限断片は
、続いてＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのレトロ
ウイルスシャトルベクターシステム（下記例３を参照）
Ｋ導入された０ １）ＯＲ ７ ３は、受付番号ＡＴＴＯ ６ ８ ０
７ ７の下κ１９８９年８月１８日にＡＴＴＯに寄託さ
れたＯ例２ 転写調節配列の構築 ｖｚｖチミジンキナーゼ コーディング配列とポリアデ
ニル化部位は、ＦＯＲ ７ ３の約３．３ ０ ０ ｂ
ｐＢａｎ ＴｉエーＸｍｎ工制限工冫ドヌクレアーゼ断
片として単離された（第６図） ｏ Ｂａｎ Ｈ工制限
工冫ドヌクレアーゼ部位の５′突出端は、Ｋｌｅｎｏｗ
とｄＮＴＰＩ！ ＫよクプラントとしたＯこのＩ）ＮＡ
断片は、ｖｚ７ ＴＫ遺伝子の完全なコーディング配列
とポリアデニル化部位を含んでいるが、エンハンサーま
たはプロモーターの配列は含んでいないＯヒトＡＦＰ５
′隣接ＤＮＡの約５．１００ｂｐｔ−含むｐＡ ５．１
−ＣＡＴである約９ ９ ９ ６ ｂｐのプラスミド
は、Ｕｎｉｖ ．ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ，Ｃａｎａｄａ
（２） Ｔ．Ｔａｍａｏｋｉから入手したＯヒトＡＰ
Ｉ’遺伝子の約−５．１１から＋２９にわたるＤＮＡ断
片が、ｐＡ？ ５． １ − ＯＡＴからＩｎｎ Ｉで
の消化と、Ｈｉｎｌ Ｎでの部分的消化κよって単離さ
れた０このＩｎｎ工／ Ｈｉｎｄ Ｉ断片は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｎ Ｈ工／ Ｘｍｎ工ＶＺ
Ｖ ’ｒＫ断片へつなぎ、ｐａｒｔ ７ ７を形成した
（第６図） ｏ ＡＦＦ Ｂ’ＰＶＺＶ ＴＫキメラを
ｐＯＲ ７ ７ カら約６ ６ ９ ９ ｂｐのＡａｔ
ｌ ／ Ｐｅｔ工制限工冫ドメクレアーゼ断片として
、電気溶出によってｒＩＩｍシた＠この断片は、次に、
例１のようにＴ４ ＤＮＡポリメラーぜとｄｌＪ？Ｐｓ
で処理して、プラントエンド制限酵素断片を産生じたＯ ｐＯＲ ７ ７はへ受付番号ＡＴＯＯ ６ ８ ０ ７
９の下に、１９８９年８月１８日にＡＴＯＯに寄託し
た〇例３ 例１のキメラ状分子を含むレトロウイルスシャトルベク
ター構築物の構築 人ＬＢ １！，／Ｐ ＶＺＶ ＴＫキメ′ｙｔ−含むレ
トロウイルスシ’ｒ ｝ ｋ ヘ／ ｆｉ − ｐＣＲ
７ ４ １ｄ．、ｐＯ１ ７ ５ Ｏｎｍ？ｓｔ工／
Ｋｐｎエプラント末端化断片を、Ｂ．ＫａｒｒｌＲＯ
ｎ，Ｎ工Ｈ，Ｂｅｌｌｔｈｅｌａ＆，ＭＤ，ＵＳＡ力１
ら入手したＮ２（ＸＭ５） （ ８ａｉｅｎａｅ２５０
； １ ３９５−１３９８、１９８５）と名付けたＭ
ｏｌｏｎｅｙネズミ白血病レトロウイルスベクターに連
結することによって構築したＯ Ｎ２（ ＸＭ５）は、
制限工冫ドヌクレアーゼｘｈｏ工で消化し、５′の突出
端は、１ｎｅｎＯｖとｄＮＴＰａで処理することκよシ
プラントとしてからＴ４ ＤＮＡりがーぜを用いて、ｐ
ＯＲ ７ ３ Ｂａｔ工／Ｋｐｎ工断片に連結した（１
５図）Ｏ ＡＩＪ３ Ｋ／Ｐ ＶｚＶ ＴＫキメラを含むレトロウ
イルスのシャトルベクターＦＯＲ ７ ４は、制限エン
ドヌクレアーゼマツビングと、ＤＮＡ配列決定によって
特徴づけを行い、基本配列をｓ！＆！！！した６ ＡＩ
Ｊ３ Ｆ，／Ｐ配列が、ＶＺＶ ＴＫ配列に接合部で横
■並んでいる配列は、第７図に示されているＯ ＰＯＲ ７ ４は、受付番号＆ ＡＴＯＯ ６ ８ ０
７ ８の下に１９８９年８月１８日にＡＴＯＯに寄託
されたＯ例４ ルベクター構築物の構築 レトロウイルスシャトルベクターｐＯＲ ７ ８ （
第６図）は、ＡＩＦＰ Ｅ／Ｐ ’ＶＺＶ ＴＫキメラ
を含むＰＯＲ ７ ７の精製Ａａｔ ｊ ／ Ｐｓｔ工
断片を、ＸｈＯ工で消化し、例３で記述したよ５Ｋ％丁
４ ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰａでプラント末端と
したＮ２（ＸＭ５）に連結することによって栴築したｅ
ＡＦ？ Ｆ，／アＶＺ’Ｖ ’！’Ｋキメラを含むレ
トロウイルスシャトルベクターｐ（Ｊｊ ７ ８は、制
限エンドヌクレアーゼとＤＮＡ配列決定によって特徴づ
けを行い、基本配列を確認したｏ ＡＦＰ Ｂ／Ｐ配列
がＶＺＶ ’Ｉ’Ｋ配列への接合部で、横に並んでいる
配列は、第８図に示されているＯＰＯＲ ７ ８は、受
付番号−ＡＴＯ０ ６ ８ ０ ８ ０の下に、１９８
９年８月１８日にＡＴＯＯに寄託された０例５ ウイルス産生 人ＴＯＯ （ ＡＴＯＯ ＯＲＬ ９ ０ ７ ８ ）
カら得らｎたＰＡ５１７と呼ばれる以曲に記述された
バククークング細胞系は、５’ ＬＴＲ ％ ｐｓｉ
ｉｌｌ節配列及び３’ ＬＴＲ（人Ｔ００ ０ＲＬ ９
０ ７ ８ ）内に含まれた５つの改変部を有してい
る（ Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｏｅ１１Ｂｉｏ１． ６ Ｎａ
８２８９５−２９０２１９８６））。例３と例４に記述
された人工的レトロウイルス構築物は、ノくツケークン
グ細胞系の中にエレクトロボーレ−ションが感染によっ
て導入し７２：ＯエレクトロボーＶ一ションのためκは
、２０μｇの直線化したプラスミドＤＮＡを、ホスフエ
ートバソファ一一庶糖溶液中で、０，８−の全容積で、
２ＢＯ＄ルト２５マイクロファラッドのキャパシタンス
で、２百万のＰＡ３ １ ７細胞に工Ｖクトロボーレー
ショイを行った。これによシ、少くとも１５０Ｇ４１Ｂ
抵抗性コロニー７２０μタプラスζドＩＩＮＡ／２百万
ＰＡ３１７細胞を得ることができるＯｇ染のためには、
２０μ′９の直線化したブラスミドＤＮＡを、Ｐｓｉ
２細胞のような２百万の同種志向性パックークング細胞
中に、エレクトロボーレーションヲ行った０２日後、培
養上滑を用いて、両鵡志向性ノくツケーンング細胞系Ｆ
Ａ３ １ ７″ｌｒ：感染とせ、４１８の抵抗性コロニ
ーを単離したＯエレクトロボーレーションと感染の技術
の両力について，０４１８抵抗性コロニーを限界希釈法
によって単細胞クローニングし、サデンプロットκよっ
て分析し、Ｎ工Ｈ３Ｔ３細胞（ ＡＴＣＯ ）甲で力価
を測定し、全長ウイルスの最高産生細胞を同定した●ｐ
ＯＲ ７ ４を含むＰＡ３ １ ７細胞について、１７
単細胞クローンが単離され、これらのクローンのうち１
０こからＤＮＡが抽出された＠異なる制限工冫ドヌクレ
アーゼ酵素と・ＮＫＯとＶＺＶ Ｔｉｃ配列を放射活性
のハイブリッド形成プローデとして用いて、これらの１
０このＤＮＡ Ｅ 料について広範なサデンプロット分
析を遂行した０分析した１０このクローンのうち、２つ
は、切ｐつめの証拠がなく、完全長をもつと考えられる
ｏｐＯＲ７８ｔ−含むＰＡ ５ １ ７細胞κついては
、２９の単細胞クローンが単離され、ＤＮＡが２５のク
ローンから得らｎた０これら２５試料について、異なる
劃限工冫ドヌクレアーゼ酵素、及び、一イプリクド形成
プローデとしてＡＩＦＰ，ＮＭＯとＶ’ＺＶ ＴＫの放
射性配列を用い広範なサデンプロフト分析を行った０分
析した２５のクローンのうち、５つが、切クつめの証拠
を示さず、全長を有すると考察さ−ｎ． ｆＣ ｏ全長
ウイルス配列を含む各パッケージング細胞は、テミクン
キナーゼがマイナス／マイナスであったＮＩＢ ３ Ｔ
３細胞において、標準技術で力価を測定し九〇 例６ 備えた例５の感染性ウイルス粒子によるヒト肝がん細胞
系（正の対照）の感染と引続いてのＶＺ７ ７Ｋ活性、
ａｒａ ＡＴＰ産制と薬剤感受性の測定ＡＩＪ３ ／
ｖＺＶ ＴＫキメラまたはＡＩＦＰ ／ ＶＺＶ ＴＫ
キメラを含む複製が欠損性で、全長の人工的レトロウイ
ルスが、Ｈｅｐ Ｇ ２ （ ＡＴＯ（） ＨＢ ８
０ ６ ５ ）と名付けられたヒト肝がん細胞系を感染
するのκ用いられ九〇感染と１ １１５Ｆ Ｇｅｎ＠ｔ
ｉａｉｎ ／ ｄ （商標）上で選択した後、細胞は、
ＶＺＶ ＴＫ活性について測定した０さらに細胞は、（
３Ｂ）標１１！？ − （β一Ｄ−アラピノフラノシル
）−６−メトキシー９Ｈプリン（以下の表と図にかいて
ａｒａ−ｍと呼ぶ）の存在κかいてインキエペートし、
その後、ａｒａ ＡＴＰ Ｏ ６１Ｊ定を行った●最後
に、細胞は、上記の化合物の存在にかいて培養し、工Ｏ
ｓｏ （生長阻害）を測定しタ０ウィルスで感染しない
細胞や、Ｎ２ウイルスで感染した細胞は、これらの実験
の対照試料として用いられる６Ｎ２クィルスはＶＺＶ
ＴＫ遺伝物質を含んていない〇 表１は、ｐＯＲ ７ ４またはｐＯ１ ７ ８のいずれ
かで感染したヒト肝がん細胞が、それぞれ対照にくらべ
、９０４ｘまたは５２ｘ以上のｖｚｖ ’ｒｘ活性をも
っていることを示している０ ？−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）−６−メトキシー
９Ｈプリ：’ （ ａｒａ−ｍと呼ぶ）は、ｖｚｖＴＫ
Ｋよシ選択的にモノリン酸化され、引続いて細胞毒性ａ
ｒａ ＡＴＦに同化されることができる０第９図はＰＯ
Ｒ ７ ４または］；ＩＯＲ ７ ８ｔ−含んでいるウ
ィルスで感染させ、（３１１）で標識した９−β一Ｄ一
アラピノ７ラノシル）−６−メトキシー９ Ｋ３プリン
の存在下でインキエペートしたＲａｐ Ｇ ２細胞は、
有意な量の細胞毒性（’Ｈ） ａｒａ ＡＴＰの生成を
起したことを示しているＯ ＡＬＢ ／ ＶＺＶ ＴＫキメラ（ １）ＯＲ ７ ４
）かＡＩＦＰ ／ＶＺＶ ＴＫ （ ｐａＲ７ ８
）キメラを含む複製欠損性の全長の、人工的レトロウイ
ルスで感染したＨｏｐ Ｇ２細胞を、９−（β一Ｄ−ア
ラビノ７ラノシル）−６−メトキ７−９Ｈプリンの存在
量を変化させて５日間インキエベートし、生長阻害を、
細胞数とＤＮＡ含量によって測定した０ 表２ｔｉ，９−（β−Ｄ−アラピノフラノシル）−６−
メトキシー９Ｅプリンの工Ｃｓｏ （ ５ ０ ％生長
阻害）は、対照とＮｓ ＩＩＡ染Ｇ２細胞において、２
０００μＭよ夕大きいことを示しているｏ ＡＬＢ／
ＶＺＶ ＴＫキメラ（ｐＯＲ７４）ｔ７ｊはＡＰＰ ／
ＶＺＶＴＫ （ ｐＯＲ ７ ８ ）キメラを含む複
製欠損性の全長を備えた、人工的レトロウイルスで感染
したＨｏｐ Ｇ ２では、その工０５０は、それぞれ、
５μｙと１７５μｍであ’：） ｆｃｏ ＡＦＰ ／
ＶＺＶ ＴＫ （ ｐＯＲ７８）キメラを含むＨｅｐ
Ｇ ２細胞の単細胞クローニングによＤ、？−（β−Ｄ
−アラピノ７ラノシル）−６−メトキシー９Ｈプリンの
工０５ｏレベルは、さらに約４０μ西に減少し得ること
が示されたＯ 例７ ＶＺＶ ＴＫの発現の選択性 ５つのヒトＡＬＢ ／ ＶＺＶ ＴＫキメラ（ ｐＯＲ
７ ４ ）を含む非肝ガン細胞系を、複製欠損性全長
、人工的レトロウイルスで患染させたＯこれらの細胞系
は、ＷＩＬＩＩＲ Ｃ ＡＴａａ ａａＩｌ２ １ ８
）、ｘｘｘ ９ ０ （ ｈｒｏｏａｃｓ １ ８
６ ） 、ＭＣＩＰ ７ （ ＡＴＯＯ ｕｒＢ２ ２
）、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５ ５ ５ （ ＡＴＯＯ ｏ
ａＩ，１ １ ０ ）及び８Ｗ４８。
（ ＡＴＯＯ ｃａＬ２ ２ ８ ）であった０感染と
（｝＠ｎｅｔｉｃｉｎ（商標）に関しての選択に続いて
、これらの細胞５ ｖｚｖ ’ｒｘ活性と、？一（β一
Ｄ−アラピノ７ラノシル）−６−メトキシー９Ｈプリン
の存在下での生長の阻害について、上述の如く測定した
ＯＡＬＢ ／ ＶＺＶ ＴＫキメラ（ ＰＯＲ ７ ４
） ｔ含む複製一欠損性の、全長を備，ｔた人工的レ
トロウイルスで感染させたこれら５つの細胞系は、感染
させなかった親の細胞系にくらべ、ＶＺＶ ＴＫ活性ま
たは９一（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−６−メトキ
シー？■プリンに対する薬剤感受性において、増加はな
かった０これは、肝がん対非肝がん細胞におけるｖｚｖ
’ｒｘの発現の選択性を証明してぃる＠表１ ＡＬＢ ／ ＶＺＶ ’１’ＫキメラまたはＡＦＰ ／
ＶＺＶ ＴＩＣキメラ（ ｐｏｌｔ ７ ８ ） ｔ
−含む複製欠損性、全長、人工レトロウィルスで感染し
たｍｅｐ Ｇ ２細胞ＫシけるＶＺＶ ＴＫの活性、Ｖ
ＺＶ ＴＫ Ｃ）活ａａ、Ｗ細胞１：／パク質あたク、
３０分間でのリン酸化されたアラｙの量として定量され
た〇 ウイルス ＶＺＶ ＴＫ酵業活性 増加 なし ９ ′Ｎ２ ４ ｐＯＲ７４ ４５２１ ｐｃｘ７８ ２５８ ０ｌ Ｏｘ ９０４ｘ ５２Ｘ 表２ ＡＩＪ３ ／ ７ｚｖＴＫキメラ（ ｐＯＲ ７ ４
）またはＡＩｉＦＰ／ ＶＺＶ ’ｒＫキメラ（ ｐＯ
Ｒ ７ ８ ）’ｔ含む複製欠損性、全長、人工的レト
ロウィルスで感染したＨｅｐ （｝２細胞における生長
阻害 ウイルス ｉし 封２ ｐＯＲ７４ ｐａｎ７８ ９−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）−６−メトキシ−
９Ｈ−プリンに対する工”＋５０＞２０００μｙ ＞２０００μｙ ５μｙ １７５μ塾
（｝＠ｎｅｔｉｃｉｎ（商標）に関しての選択に続いて
、これらの細胞５ ｖｚｖ ’ｒｘ活性と、？一（β一
Ｄ−アラピノ７ラノシル）−６−メトキシー９Ｈプリン
の存在下での生長の阻害について、上述の如く測定した
ＯＡＬＢ ／ ＶＺＶ ＴＫキメラ（ ＰＯＲ ７ ４
） ｔ含む複製一欠損性の、全長を備，ｔた人工的レ
トロウイルスで感染させたこれら５つの細胞系は、感染
させなかった親の細胞系にくらべ、ＶＺＶ ＴＫ活性ま
たは９一（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−６−メトキ
シー？■プリンに対する薬剤感受性において、増加はな
かった０これは、肝がん対非肝がん細胞におけるｖｚｖ
’ｒｘの発現の選択性を証明してぃる＠表１ ＡＬＢ ／ ＶＺＶ ’１’ＫキメラまたはＡＦＰ ／
ＶＺＶ ＴＩＣキメラ（ ｐｏｌｔ ７ ８ ） ｔ
−含む複製欠損性、全長、人工レトロウィルスで感染し
たｍｅｐ Ｇ ２細胞ＫシけるＶＺＶ ＴＫの活性、Ｖ
ＺＶ ＴＫ Ｃ）活ａａ、Ｗ細胞１：／パク質あたク、
３０分間でのリン酸化されたアラｙの量として定量され
た〇 ウイルス ＶＺＶ ＴＫ酵業活性 増加 なし ９ ′Ｎ２ ４ ｐＯＲ７４ ４５２１ ｐｃｘ７８ ２５８ ０ｌ Ｏｘ ９０４ｘ ５２Ｘ 表２ ＡＩＪ３ ／ ７ｚｖＴＫキメラ（ ｐＯＲ ７ ４
）またはＡＩｉＦＰ／ ＶＺＶ ’ｒＫキメラ（ ｐＯ
Ｒ ７ ８ ）’ｔ含む複製欠損性、全長、人工的レト
ロウィルスで感染したＨｅｐ （｝２細胞における生長
阻害 ウイルス ｉし 封２ ｐＯＲ７４ ｐａｎ７８ ９−（β一Ｄ−アラビノフラノシル）−６−メトキシ−
９Ｈ−プリンに対する工”＋５０＞２０００μｙ ＞２０００μｙ ５μｙ １７５μ塾
第１図（その１、２．及び３，）は、アルプミンの遺伝
子（工Ａ）、異ｇ＋遺伝子（工Ｂ）と非必須配列なしの
異ｎ遺伝子との関係におけるアルデミンのエンハンサー
とプロモーター配列の模式図を示すＯ 第２１Ｖｌ（その１）は、水痘一帯状范疹ウィルスのチ
ミジンキナーゼ遺伝子を示し、第２図（その２、３及び
４）は水痘一帝状庖疹ウィルスのチミクンキナーゼ領域
の配列を示す。ここに示されているのは、ＶＺＶ ＴＫ
遺伝子とその５′と３′の並列領域の配列（ Ｇａｎ．
Ｖｉｒ０１。６７；１７５９−１８１６、１９８６にか
いて報告さｒｔ．た塩基６４２７６から６６２５５）で
ある。ｖｚＶ Ｏ ＴＡ’ｒＡボックストホリアデニル
化部位■は、下線が引いてあるｏ ＶＺＶＴＫのコーデ
ィング領域と、ボリデニル化シグナルを含む１ ３ ８
１ ｂｐのＡｃｅ工／Ｎｔｌｅ工断片をサブクローン
するために用い７’ｊＡｃａ工とＮ改ｅ工制限エンドヌ
クレアーゼ部位が示されている。この１ ３ ８ １
’ｂｐ断片を、それぞれ肝％異的１たは肝がん特異的発
現を達成するために肝特異的または肝がん竹異的転写調
節配列の３′に正しい方向に結合される。 第３図（その１及び２）は、アルデζ冫転写調節配列／
Ｖ：ｌＶ ＴＸキメラ状分子及びα−フエトプロテイ
ン転写調節配列／ ’Ｖ’ＺＶ ＴＫキメラ状分子を示
すＯ Ｗ，４図（その１）はα−フェトプロテイン／ｖｚｖ
’ｒｘキメラ状分子を含むレトロウィルスのプロウィル
ス形、第４図（その２）はｐＯＲ ７ ８を示すＯ 第４図（その１）において、８工Ｎベクター（自己不活
化ベクター）ｔ−創るために３’ ＩＪＴＲから転写調
節配列を欠失させた０８工Ｎベクターは、標的細胞に組
込まれた両刀のＬＴＲの転写調節配列が欠失したグロウ
ィルスを生ずる０これにょタ、ＡＦＩ’転写調節配列（
ｔたは標示された通タの他の調節遺伝子）ｔ−、そのプ
ロウィルスにおける唯一の機能的７’Ｏモーター及び二
冫ハンサーとすルプロウィルスを生ずる。 第４図（その２）はＡＦＰ転写調節配列とｖｚｖ ’ｒ
ｘ遺伝子のコーディング配列の人工的キメラ状の分子を
含む人工的レトロウイルスシャトルベクターのプロウイ
ルス形を示す０図解されているのはバクテリア中で増幅
するためのプラスξド中に含會れたこの人工的シャトル
ベクターである０図解されているプラスミドはＰＢＲ
３ ２ ２の誘導体である〇本シャトルベクターはＭＯ
１０ｎ＠７ネズミ白血病ウイルスの誘導体であるｏ Ｍ
ｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルスに基いたこのよう危
シャトルベクターは、Ｎ２ベクター（ ８ｃｉｅｎｃｅ
２ ３ ０ ： １ ３ ９ ５ −１３９８［１９
８５］）によって例証されるようκ記述されている＠ 第５図はＦＯＲ ７ ４の構築を示す７ローチャートを
示す０ 第６図はｐＯＲ ７ Ｂの構築を示すフローチャートを
示す０ 第７図はｐＯＲ ７ ４ Ｋ ｋ イテ、ＡＩＩＢ ／
ｐがＶＺＶ ＴＫの横につながっている配列を示す● ｐＯＲ ７ ４ Ｋ ＪｉＰ ’ＩｈてネズミＡＩＪ３
１’ＰをＶＺＶ Ｔｉｃ配？に横につなげている配列
が示されている０配列１−１４０はネズミＡＬＢ ＶＰ
由来である０１４１−２７６の配列はＶＺＶ由来である
ｏ ＡＬＢの近位プロモーターｌ！素は２重下線が引い
てあるｏ ＲＮＡ転写開始部位は星印（脣）がつけられ
ている■ＢａｍＨ Ｘ部位は下線が引かれてある０垂直
線はＡＩｊ３配列とＶＺＶ配列の間の接合部の９Ａ＠で
ある０表示されたＶＺＶコーディング配列が翻訳さｎる
０第８図は１）ＯＲ ７ ８に＞イて、ＡＥＩ’ ＶＰ
がＶＺＶ ＴＩＥの横につながっている配列を示すＯ ｐＯＲ ７ ８にカイてヒトＡＩＦＰ ＶＰ ｔ’ Ｖ
ＺＶ ＴＫ Ｋ横につなげている配列が示されている．
１−７３の配列はヒトＡＦＰ ＶＦ由来である．９３−
２２８の配列はＶＺＶ由来である０２本の垂直線の間は
り７カー配列であるｏ ＡＦＴの近位プロモーター賛素
は２重線が引かれているＲＮＡ転写の開始部位は星印（
骨）がつけられている０表示されたｖｚｖコーディング
配列が転写される〇 第９図は、対照、ＰＯＲ ７ ４、ｐＯＲ ７ ８で感
染した細胞でのａｒａ ａｔｐの生産を示すグラ７であ
るＯｓｉの浄書（内容に変更なし） 第１図 （その１） 〃己辻Ｐと七赴血辷と』１ 第１図 （その２） 第１図 （その３） 「６写贅鉋優位 第２図 （その１） 木痘 苓ぴ復疹ウノルスのデミジンニ７−づ０這乞÷区乙ヨ タンパク質コーディング量屋 「 Ｆｉ写力叩位 ＊富 ボ′リアデニル仁シグナル 第２図 （その２） ＴＡＴＡポヲクλ 第２図 （その３） 第２図 （その４） 第３図 （その１） 第３図 （その２） だ゛アデニ・〆化シデヲル ニ 転写！虻！！じ 第４図 （その１） キー −一●− 乙Ｚ２ 「 回 甲 転写のＭ向 タシバク質コーディング配列 転写Ｉ姶部位 Ｖ２ＶＴＫｌ伝子と３′ＬＴＲのためのポリアデニル化
ングナルＯングターミナルリピート調べ配列 Ｐｓ１Ｉｌ位，シス作帛性１ｆｆｉｉ！Ｉｌｌ第４図 （その２） 第５図 倒１と９！３【お：１て昇Ｉ！ゴ遥べられて１−る９Ｃ
Ｒ７４のＩＩのため０フＤ−テヤートの置譬 第７図 ＧｌｕＰＭＬＡｕｌｌｌｉＨｉｆｉＰＭＡ上ａ工上＠Ｔ
ｈｒＰｒＯＡｇｎＡｒｑ第８区
子（工Ａ）、異ｇ＋遺伝子（工Ｂ）と非必須配列なしの
異ｎ遺伝子との関係におけるアルデミンのエンハンサー
とプロモーター配列の模式図を示すＯ 第２１Ｖｌ（その１）は、水痘一帯状范疹ウィルスのチ
ミジンキナーゼ遺伝子を示し、第２図（その２、３及び
４）は水痘一帝状庖疹ウィルスのチミクンキナーゼ領域
の配列を示す。ここに示されているのは、ＶＺＶ ＴＫ
遺伝子とその５′と３′の並列領域の配列（ Ｇａｎ．
Ｖｉｒ０１。６７；１７５９−１８１６、１９８６にか
いて報告さｒｔ．た塩基６４２７６から６６２５５）で
ある。ｖｚＶ Ｏ ＴＡ’ｒＡボックストホリアデニル
化部位■は、下線が引いてあるｏ ＶＺＶＴＫのコーデ
ィング領域と、ボリデニル化シグナルを含む１ ３ ８
１ ｂｐのＡｃｅ工／Ｎｔｌｅ工断片をサブクローン
するために用い７’ｊＡｃａ工とＮ改ｅ工制限エンドヌ
クレアーゼ部位が示されている。この１ ３ ８ １
’ｂｐ断片を、それぞれ肝％異的１たは肝がん特異的発
現を達成するために肝特異的または肝がん竹異的転写調
節配列の３′に正しい方向に結合される。 第３図（その１及び２）は、アルデζ冫転写調節配列／
Ｖ：ｌＶ ＴＸキメラ状分子及びα−フエトプロテイ
ン転写調節配列／ ’Ｖ’ＺＶ ＴＫキメラ状分子を示
すＯ Ｗ，４図（その１）はα−フェトプロテイン／ｖｚｖ
’ｒｘキメラ状分子を含むレトロウィルスのプロウィル
ス形、第４図（その２）はｐＯＲ ７ ８を示すＯ 第４図（その１）において、８工Ｎベクター（自己不活
化ベクター）ｔ−創るために３’ ＩＪＴＲから転写調
節配列を欠失させた０８工Ｎベクターは、標的細胞に組
込まれた両刀のＬＴＲの転写調節配列が欠失したグロウ
ィルスを生ずる０これにょタ、ＡＦＩ’転写調節配列（
ｔたは標示された通タの他の調節遺伝子）ｔ−、そのプ
ロウィルスにおける唯一の機能的７’Ｏモーター及び二
冫ハンサーとすルプロウィルスを生ずる。 第４図（その２）はＡＦＰ転写調節配列とｖｚｖ ’ｒ
ｘ遺伝子のコーディング配列の人工的キメラ状の分子を
含む人工的レトロウイルスシャトルベクターのプロウイ
ルス形を示す０図解されているのはバクテリア中で増幅
するためのプラスξド中に含會れたこの人工的シャトル
ベクターである０図解されているプラスミドはＰＢＲ
３ ２ ２の誘導体である〇本シャトルベクターはＭＯ
１０ｎ＠７ネズミ白血病ウイルスの誘導体であるｏ Ｍ
ｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルスに基いたこのよう危
シャトルベクターは、Ｎ２ベクター（ ８ｃｉｅｎｃｅ
２ ３ ０ ： １ ３ ９ ５ −１３９８［１９
８５］）によって例証されるようκ記述されている＠ 第５図はＦＯＲ ７ ４の構築を示す７ローチャートを
示す０ 第６図はｐＯＲ ７ Ｂの構築を示すフローチャートを
示す０ 第７図はｐＯＲ ７ ４ Ｋ ｋ イテ、ＡＩＩＢ ／
ｐがＶＺＶ ＴＫの横につながっている配列を示す● ｐＯＲ ７ ４ Ｋ ＪｉＰ ’ＩｈてネズミＡＩＪ３
１’ＰをＶＺＶ Ｔｉｃ配？に横につなげている配列
が示されている０配列１−１４０はネズミＡＬＢ ＶＰ
由来である０１４１−２７６の配列はＶＺＶ由来である
ｏ ＡＬＢの近位プロモーターｌ！素は２重下線が引い
てあるｏ ＲＮＡ転写開始部位は星印（脣）がつけられ
ている■ＢａｍＨ Ｘ部位は下線が引かれてある０垂直
線はＡＩｊ３配列とＶＺＶ配列の間の接合部の９Ａ＠で
ある０表示されたＶＺＶコーディング配列が翻訳さｎる
０第８図は１）ＯＲ ７ ８に＞イて、ＡＥＩ’ ＶＰ
がＶＺＶ ＴＩＥの横につながっている配列を示すＯ ｐＯＲ ７ ８にカイてヒトＡＩＦＰ ＶＰ ｔ’ Ｖ
ＺＶ ＴＫ Ｋ横につなげている配列が示されている．
１−７３の配列はヒトＡＦＰ ＶＦ由来である．９３−
２２８の配列はＶＺＶ由来である０２本の垂直線の間は
り７カー配列であるｏ ＡＦＴの近位プロモーター賛素
は２重線が引かれているＲＮＡ転写の開始部位は星印（
骨）がつけられている０表示されたｖｚｖコーディング
配列が転写される〇 第９図は、対照、ＰＯＲ ７ ４、ｐＯＲ ７ ８で感
染した細胞でのａｒａ ａｔｐの生産を示すグラ７であ
るＯｓｉの浄書（内容に変更なし） 第１図 （その１） 〃己辻Ｐと七赴血辷と』１ 第１図 （その２） 第１図 （その３） 「６写贅鉋優位 第２図 （その１） 木痘 苓ぴ復疹ウノルスのデミジンニ７−づ０這乞÷区乙ヨ タンパク質コーディング量屋 「 Ｆｉ写力叩位 ＊富 ボ′リアデニル仁シグナル 第２図 （その２） ＴＡＴＡポヲクλ 第２図 （その３） 第２図 （その４） 第３図 （その１） 第３図 （その２） だ゛アデニ・〆化シデヲル ニ 転写！虻！！じ 第４図 （その１） キー −一●− 乙Ｚ２ 「 回 甲 転写のＭ向 タシバク質コーディング配列 転写Ｉ姶部位 Ｖ２ＶＴＫｌ伝子と３′ＬＴＲのためのポリアデニル化
ングナルＯングターミナルリピート調べ配列 Ｐｓ１Ｉｌ位，シス作帛性１ｆｆｉｉ！Ｉｌｌ第４図 （その２） 第５図 倒１と９！３【お：１て昇Ｉ！ゴ遥べられて１−る９Ｃ
Ｒ７４のＩＩのため０フＤ−テヤートの置譬 第７図 ＧｌｕＰＭＬＡｕｌｌｌｉＨｉｆｉＰＭＡ上ａ工上＠Ｔ
ｈｒＰｒＯＡｇｎＡｒｑ第８区
Claims (29)
- （１）哺乳動物標的組織において、選択的に活性化され
ることができる転写調節配列と遺伝子操作的に転写調節
配列に結合され標的組織に対して、毒性のある薬剤の産
生を触媒する酵素である異種酵素をコードしているＤＮ
Ａ配列からなるキメラ状分子。 - （２）転写調節配列がプロモーターを含む特許請求の範
囲第１項記載のキメラ状分子。 - （３）異種酵素をコードしているＤＮＡ配列の下流に位
置しているポリアデニル化シグナルをさらに含む特許請
求の範囲第１項または第２項記載のキメラ状分子。 - （４）転写調節配列がさらにエンハンサー配列を含む特
許請求の範囲第１項または第２項記載のキメラ状分子。 - （５）プロモーターがアルブミン、α−フエトプロテイ
ン、がん胎児性抗原、チロシンヒドロキシラーゼ、コリ
ンアセチルトランスフェラーゼ、ニューロン特異性エノ
ラーゼ、グリアルフイブリン酸性タンパク質、インスリ
ン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ドーパデカ
ルボキシラーゼ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＮ−ｍｙｃ腫瘍
遺伝子のプロモーターから選ばれる特許請求の範囲第２
項から第４項までのいずれかの１つに記載のキメラ状分
子。 - （６）エンハンサーが、アルブミン、α−フエトプロテ
イン、がん胎児性抗原、チロシンヒドロキシラーゼ、コ
リンアセチルトランスフェラーゼ、グリアルフイブリン
酸性タンパク質、インスリン、γ−グルタミルトランス
ペプチターゼ、ドーパデカルボキシラーゼ、ＨＥＲ２／
ｎｅｕ及びＮ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子のエンハンサーから選
ばれる特許請求の範囲第４項記載のキメラ状分子。 - （７）酵素が、 ｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ（水痘−帯
状疱疹ウィルス）のチミジンキナーゼ； カルボキシペプチダーゼＧ２； アルカリ性ホスファターゼ； ペニシリン−ｖアミダーゼ； 及び、非−哺乳動物シトシンデアミアーゼから選ばれる
特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１つに記載
のキメラ状分子。 - （８）酵素が、水痘−帯状疱疹ウィルスのチミジンキナ
ーゼである特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか
１つに記載のキメラ状分子。 - （９）アルブミンについての転写調節配列に遺伝子操作
によつて結合させた水痘−帯状疱疹ウイルスチミジンキ
ナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含むキメラ状分子
。 - （１０）α−フエトプロテインについての転写調節配列
に遺伝子操作によつて結合させた水痘−帯状疱疹ウイル
スチミジンキナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含む
キメラ状分子。 - （１１）特許請求の範囲第１項から第１０項までのいず
れか１つに記載されているキメラ状分子を含むレトロウ
イルスシヤトルベクター。 - （１２）ウィルス５′ロングターミナルリピート（ＬＴ
Ｒ）配列、シス−作用性ｐｓｉエンキヤプシデーシヨン
配列、特許請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１
つのキメラ状分子及びウィルス３′ＬＴＲ配列を含む特
許請求の範囲第１１項記載のベクター。 - （１３）キメラ状分子が、５′レトロウイルスＬＴＲに
対して反対の方向に向いている特許請求の範囲第１２項
に記載のベクター。 - （１４）５′ＬＴＲ配列に遺伝子操作によつて結合され
た主要な選択可能なマーカーをコードしているＤＮＡ配
列を更に含む特許請求の範囲第１２項または第１３項記
載のベクター。 - （１５）選択可能なマーカー配列がＮＥＯ遺伝子である
特許請求の範囲第１４項記載のベクター。 - （１６）特許請求の範囲第１１項から第１５項のいずれ
か１つに記載された、自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）
であるベクター。 - （１７）特許請求の範囲第１１項から第１６項のいずれ
かに記載のベクターをキヤプシドに包み込んでいる感染
性ウィルス粒子。 - （１８）標的組織に選択的に感染するように遺伝子操作
された特許請求の範囲第１７項において記載された感染
性のウィルス粒子。 - （１９）特許請求の範囲第１７項または第１８項のいず
れかにおいて記載された複製−欠損性である感染性ウィ
ルス粒子。 - （２０）ウイルス粒子のｏｎｖ遺伝子が細胞への結合を
容易にするように修飾されている特許請求の範囲第１７
項から第１９項のいずれかに記載された感染性ウィルス
粒子。 - （２１）ｏｎｖ遺伝子が、大きなＳＨＢＶエンベロープ
タンパク質の肝細胞結合部位を含むように改変されてい
る特許請求の範囲第２０項において記載された感染性ウ
ィルス粒子。 - （２２）特許請求の範囲第１項から第１０項のいずれか
に記載された医学的治療に使用するためのキメラの分子
。 - （２３）医薬品として受入れることができる、そのため
の担体を伴つた特許請求の範囲第１７項から第２１項の
いずれか１つに記載された感染性ウィルス粒子を含む医
薬品製剤。 - （２４）特許請求の範囲第１７項から第２１項のいずれ
か１つに記載された医学的治療に使用するための感染性
ウィルス粒子。 - （２５）特許請求の範囲第１７項から第２１項のいずれ
か１つに記載された感染性ウィルス粒子の哺乳動物のが
んの治療に使用するための薬剤の製造における使用。 - （２６）異種酵素を発現することができるがんを治療す
るための薬剤の製造における化合物の使用。該化合物は
、該酵素によつて、直接的か、中間体を通つて、細胞毒
性か細胞静止性代謝物に選択的に触媒される。 - （２７）ｖｚｖチミジンキナーゼを発現することができ
るがんを治療するのに使用するための薬剤の製造におい
てのある化合物、またはその塩、またはその生理学的機
能 誘導体の使用で あって；該化合▲数式、化学式、表等があります▼（
I ） 物は構造式 I で あり、Ｒ＿１はハ ロ、Ｃ＿１＿−＿５アルコキシ、ハロゲン置換Ｃ＿１＿
−＿５アルコキシ；Ｃ＿１＿−＿５アルキル、１こ以上
の弗素原子によつて置換されたアルキル、Ｃ＿３＿−＿
６シクロアルキルによつてモノまたはジ置換されている
アミノ基、またはＣ＿４＿−＿７の炭素原子及び任意的
に２重結合を含む異項環を含む窒素；そしてＲ＿２は水
素、ハロ、アミノである；もしくは、該化合物は、構造
式II； ▲数式、化学式、表等があります▼（II） であり、ただし、ｘはビニレンまたはエチニレン基を表
し；Ｒ＾１は、オキリまたはイミノ基を表し；Ｒ＾２は
、水素原子、Ｃ＿１＿−＿２アルキル、Ｃ＿３＿−＿４
枝分れ、またはシクロアルキル基、例えばイソプロピル
またはシクロプロピルを表し；Ｒ＾３は、水素原子また
はアシル基、例えば、Ｃ＿１＿−＿４アルカノイル、ま
たは、例えば１こ以上のハロゲン、アルキル、ハイドロ
キシまたはアルコキシ置換基によつて任意に置換されて
いるベンゾイル基を表し、そして、Ｒ＾４は、水素原子
またはハイドロキシ基を表す；ただし、（ａ）Ｒ＾２、
Ｒ＾３とＲ＾４のそれぞれが水素原子を表すとき、Ｒ＾
１は、オキソ基を表さないことを条件とする。 - （２８）特許請求の範囲第１７項から第２１項において
記載された感染性ウィルス粒子と、治療法において同時
使用するための、異種酵素によつて細胞静止性、または
細胞毒性代謝物への変換が触媒されることができる化合
物の使用。 - （２９）ｐｃＲ７３、ｐｃＲ７４、ｐｃＲ７７またはｐ
ｃＲ７８のいずれか１つ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB898919607A GB8919607D0 (en) | 1989-08-30 | 1989-08-30 | Novel entities for cancer therapy |
| GB8919607.5 | 1989-08-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03172189A true JPH03172189A (ja) | 1991-07-25 |
Family
ID=10662268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2227883A Pending JPH03172189A (ja) | 1989-08-30 | 1990-08-29 | がん治療のための新規キメラ状分子 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH03172189A (ja) |
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| AT (1) | ATE236260T1 (ja) |
| AU (3) | AU647747B2 (ja) |
| CA (1) | CA2024253C (ja) |
| DD (1) | DD297447A5 (ja) |
| DE (1) | DE69034054T2 (ja) |
| DK (1) | DK0415731T5 (ja) |
| ES (1) | ES2194833T3 (ja) |
| FI (1) | FI904257A7 (ja) |
| GB (1) | GB8919607D0 (ja) |
| HU (2) | HUT58814A (ja) |
| IE (1) | IE903125A1 (ja) |
| IL (1) | IL95515A0 (ja) |
| MY (1) | MY107402A (ja) |
| NZ (1) | NZ235093A (ja) |
| PT (1) | PT95134B (ja) |
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