DD297836A5

DD297836A5 - Verfahren zur immobilisierung von zellen oder zellorganellen

Info

Publication number: DD297836A5
Application number: DD32528289A
Authority: DD
Inventors: Steffen Seidel; Hans-Georg Mueller; Dieter Kirchstein; Ullrich Schuelke
Original assignee: Zentralinstitut Fuer Molekularbiologie,De; Zentralinstitut Fuer Anorganische Chemie,De
Priority date: 1989-01-27
Filing date: 1989-01-27
Publication date: 1992-01-23

Abstract

Anwendungsgebiet ist die Biotechnologie. Erfindungsgemaesz werden Zellen oder Zellorganellen direkt oder ueber eine Ankersubstanz an ein schwerloesliches Traegermaterial gebunden, das mehrwertige Metallionen an der Oberflaeche enthaelt. Die Bindung erfolgt ueber heterobifunktionelle Verbindungen, in denen eine Gruppe direkt oder nach Aktivierung mit den Zellen oder Zellorganellen oder gegebenenfalls einer Ankersubstanz und eine zweite Gruppe unter Chelatbildung mit den Metallionen des Traegermaterials reagiert. Durch eventuelle Nachbehandlung des Immobilisates mit anderen bifunktionellen Verbindungen wird die Oberflaeche weiterhin modifiziert.{Immobilisierung; Zellen; Zellorganellen; Ankersubstanz; Traeger; Metallionen; Chelatbildner; Reagenzien, bifunktionell; Nachbehandlung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Zellen oder Zellorganellen an Oberflächen von Trägermaterialien. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Herstellung von Immobilisaten, die in der Biotechnologie (Stoffwandlung, Festphasendiagnostik, Biosensoren und Chromatographie) eingesetzt werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Vorteile, die sich durch die Immobilisierung von Zellen bieten, sind allgemein anerkannt; so wird z. B. festgestellt, daß die Zukunft der Biotechnik ganz wesentlich davon abhängt, ob es gelingt, verfahrenstechnisch vertretbare und im technischen Maßstab einsetzbare Immobilisierungstechniken für ganze Zellen zu entwickeln (M. Zlokarnik: „Immobilisierung ganzer Zelleneine Bestandsaufnahme aus bioverfahrenstechnischer Sicht", BTF 3[4], S. 212-218 (1986)).

Die Assoziierung der Zellen mit einem Trägermaterial wird bekanntermaßen durch unterschiedliche Methoden c f reicht, zu denen man Adhäsion an einen Träger, kovalente Bindung an einen Träger, Quarvernetzung, Geleinschluß und Einschluß in Mikrokapseln zählt (Birnbaum, S., u.a.: „Immobilized Cells", Solid Phase Biochemistry: Analytical Synthetic Aspects, Ed. by W. H. Scouten, Copyright 1983 by John Willy & Sons, Inc., S. 673-762).

Wie aus Übersichtsartikeln zu ersehen ist, wird die Immobilisierung von Zellen durch Einschlußmethoden am häufigsten beschrieben (siehe z. B. Scott, C. D., „Immobilized cells: a review of recent literature". Enzym Microb. Technol. [1987] 9, S. 66-73). Allerdings haben die Einschlußmethoden auch Nachteile. So kommt es zu einer Diffusionslimitierung des Stofftransportes, z.B. bei Substraten mit zu hohem Molekulargewicht, so daß diese nicht zu den Zellen gelangen können. Des weiteren kann bei Produkten mit sehr hohem Molekulargewicht eine Akkumulation des Produktes im Inneren der Partikel zu einer Reduzierung der Aktivität der Zellen führen. Bei wenig löslichen Produkten treten ebenfalls große Probleme auf; so kommt es bei Gasen häufig zum Zerstören des Trägermaterials und nicht zuletzt stehen den Einschlußmethoden, was die Wiederverwendbarkeit des Trägermaterials anbelangt, häufig keine Möglichkeiten offen, so daß das Trägermaterial in der Regel nur sehr begrenzte Zeit einsetzbar ist.

Einen Ausweg aus dieser Problematik stellt die Variante dar, die Zellen an der Oberfläche des Trägermaterials zu positionieren, was bekanntermaßen durch Adhäsion und Adsorption odor kovalente Bindung möglich ist. Für die Adsorption und Adhäsion steht dem signifikanten Vorteil, durch direkten Kontakt mit der zirkulierenden Phase eine Reduzierung von Diffusionslimitierungen zu erreichen, der Nachteil des Ablösens von Zellen in das flüssige Medium gegenüber (Rouxhet, P. G., und N. Mozses: „Physico-chemical Bases of Microbial Adhesion", ed. by M. P. Ferranti, G. L. Ferrero u. P. L. Hormite, Elsevier Applied Science, London and New York, pp. 218-229 [1987]). Die Immobilisierung durch Adsorption ist außerdem in bezug auf ihre Prozeßstabilität bisher nur für wachsende Zellen beschrieben, so daß sie für tote oder ruhende Zellen mit noch vorhandener Enzymaktivität keine Möglichkeit zur Rückhaltung der Zellen im System darstellt; eine weitere Limitierung ergibt sich in jedem Fall durch deutliche Grenzen für die strömungstschnische Belastbarkeit und durch das Ablösen von Zellen bei nicht konstanten Prozeßparametern (Klein, J., u. H. Ziehr. „Immobilisierung von Mikroorganismen durch Adsorption", Bioeng. 3 [1987], S.8-16). Die kovalente Bindung an Oberflächen eines festen Trägers, die besonders gut zur Erzeugung stabiler Bindungen geeignet ist, ist deshalb von Interesse

Beispiele für die Immobilisierung von Zellen durch kovalente Bindung sind z.B. ersichtlich in:

- Nelson, R. P. US-PS 3,957,580 (1976);

- Jack, T. R., und J. E. Zajic: Biotechnol. Bioeng. 19 (1977) 631;

- Navarro, J.M., und G. Durand: Eur. J. Appl. Microbiol.4 (1977)243;

- Jirku, V., u.a.: Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6 (1979) 217;

- Gulaya, V.E., u.a.: Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 8 (1979)43;

- Jirku, V., u.a.: Biotechnol. Lett. 2(1980)451;

- Jirku, V., u.a.: Biotechnol. Lett. 2 (1980) 509;

- Jirku, V., u.a.: Biotechnol. Lett. 3 (1981)447;

- Kennedy, J.F., u.a.: Nature 261 (1976)242;

- Kennedy, J. F.: in Enzyme Engineering, Vol.4 (G.B. Broun, G. Manecke, and L. B. Wingard, Jr., Eds.; Plenum Press, N. Y. [1978], p.323);

- Kennedy, J.F.: inAmer. Chem. Soc. Symp. Ser. No. 106 (K. Venkatasubramian, Ed.) (1979), S. 119;

- Kennedy, J.F., u.a.: Enzyme Microb.Technol. 2 (1980) 209;

- Gainu, J.L.: Biotechnol. Biotechnol. Symp. 10(1980)35;

- Marek, M.: Biotechnol. Lett. 8 (1986) 721-724.

Die kovalente Bindung erfolgt hierbei nach einer chemischen Modifizierung (Aktivierung) des Feststoffes und/oder der zu immobilisierenden Zellen oder abweichend davon, durch Bindung der Zellen über wäßrige Metalloxide (über Chelatbildung). Als Trägermaterial werden vor allem natürliche Stoffe (z. B. CM-Cellulose, Cellulose, Tori-Cellulose und Aminoäthylcellulose) oder organische Polymere eingesetzt.

Nach Birnbaum, S., u.a. („Immobilized Cells", id.) führt allerdings vor allem der Aufwand an Kopplungsreagenzien und der Nachteil toxischer Chemikalien (siehe auch Ferlan, I.: „Neue Produkte durch immobilisierte Zellen und Enzyme", Umschau 21 [1984], S. 632-634) dazu, daß die kovalente Bindung ganzer Zellen für die Immobilisierung bisher von geringerer Bedeutung ist, obwohl das Ablösen der Zellen vom Träger minimiert werden kann. Auch die Wiederverwendbarkeit des Trägermaterials ist bisher kaum möglich. Weiter kommen die mechanischen Eigenschaften der eingesetzten Trägermaterialien nicht an diese heran, die von anorganischen Feststoffen, die für technisch durchgeführte Prozesse bevorzugt werden, bekannt sind. Noch ungünstiger fallen die mechanischen Eigenschaften in den Untersuchungen zur Immobilisierung über wäßrige Metalloxide aus. So ist es bis vor kurzem nicht gelungen (siehe Changui, C, u.a.: „Surface properties of polycarbonate and promotion of yeast cells adhesion", J. de chimie physique 84 [1987], S. 275-281) die mechanischen Eigenschaften ausreichend zu optimieren und es ist nach Zlokarnik (BTF 3[4], S. 212-218 (1986)) über den Einsatz von an wäßrige Metalloxide gebundene Zellen in größerem Maßstab noch nichts bskannt.

Umfangreiche Untersuchungen, um biologisches Material kovalent an Oberflächen anorganischer, mechanisch stabiler Träger zu immobilisieren, sind aus der Enzymfixierung bekannt. Allerdings ist die dort häufig beschriebene Funktionalisierung unter Verwendung von bifunktionellen Silanen relativ kostenaufwendig, wie auch die Herstellung der Silane selbst (U. Deschler, P. Kleinschmidt und P. Panster: Angew. Chem. 98 [1986), S. 237-253). Nachteilig ist auch der mehrstufige Prozeß dieser Verfahren.

Weiterhin sind seit einigen Jahren Verfahren patentiert worden, in denen die Silanisierung durch Anwendung heterobifunktioneller Verbindungen ersetzt wird (EP 218506, EP 273756). Diese heterobifunktionellen Verbindungen enthalten im Molekül mindestens eine reaktive Gruppe, die direkt oder nach Aktivierung mit einem Enzym reagiert sowie eine oder mehrere phosphorhaltige Gruppen, die mit einem metallionenhaltigen Trägermaterial wenig dissoziierende Verbindungen ergeben (Chelate). Mit diesem Verfahren sind guto Immobilisierungsausbeuten für Enzyme erzielt worden, allerdings bei nicht ausreichender Auswaschbeständigkeit. Für Zellen oder Zellorgan6llen liegen bisher keine Ergebnisse vor.

Darüber hinaus ist es gelungen (EP 273756) durch kurzkettige Phosphonsäurederivate einen nachträglichen Oberflächenschutz von oxidischen Oberflächen zu erzielen, der die Auflösung von Trägermaterialien unterdrückt.

Bei Chelatbildnern, die keinen Phosphor enthalten, ist bekannt, daß besonders stabile Komplexe entstehen, wenn die Bildung der Komplexe unter Ausbildung von 5- und 6-Ringstrukturen erfolgt. Dieser Effekt wird zur Herstellung stabiler „Farblacke" in der Färberei genutzt, ist aber für die Immobilisierung von biologischem Material bisher nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein einfaches Veifahren zur Immobilisierung von Zellen und Zellorganellen zu entwickeln, das zu wiederverwendbaren Trägermaterialien von ausreichend mechanischer Stabilität, bei gleichzeitiger Minimierung von Diffusionslimitierungen und Minimierung des Ablösens des verwendeten biologischen Materials durch hohe Auswaschstabilität führt.

Darlegung de« Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Immobilisierung von Zellen oder Zellorganellen zu entwickeln, das eine zuverlässige Bindung der Zellen oder Zellorganellen an Oberflächen schwerlöslicher, stabiler Trägermaterialien garantiert und dabei gleichzeitig eine reversible Bindung zum Träger darstellt.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die gestellte Aufgabe gelöst werden kann, indem erfindungsgemäß Zellen oder Zellorganellen, über heterobifunktionelle Verbindungen, an schwerlösliche Trägermaterialien gebunden werden, die an inneren oder äußeren Oberflächen Ionen mehrwertiger Metalle enthalten. Man verwendet hierbei als heterobifunktionelle Verbindungen Substanzen, bei denen eine funktionell Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung einer Aktivierungsreagenz, mit den zu immobilisierenden Zellen oder Zellorganellen oder gegebenenfalls der Ankersubstanz und eine zweite Gruppierung mit den Metallionen der Matrix geeignet. Die Oberfläche des Trägers kann gegebenenfalls durch Nachbehandlung mit einer weiteren bifunktionellen Verbindung modifiziert werden.

Die verwendeten Trägermaterialien sind anorganische Materialien, organische Materialien oder Composite aus beiden, an deren äußeren Oberflächen und/oder an der Oberfläche ihrer Poren im Innern des Materials, gegebenenfalls als nachträglich aufgebrachte Überzugsschicht, sich Ionen mehrwertiger Metalle befinden. Diese metallionenhaltigen Überzugsschichten werden durch Umsetzung des Trägermaterials mit einer metallorganischen Verbindung (z. B. Tetraethoxyzirkonat), einem Metallsalz (z.B. Ammoniummolybdat), einem Metallkomplex (z. B. Eisen-(lll)-hoxacyar oferrat-(ll)), einem Metallhalogenid (z. B.

Titantetrachlorid), einem Oxy- oder Hydroxysalz (z. B. Zirkonoxychlorid) erzeugt. Gegebenenfalls ist das Trägermaterial ferromagnetisch odor enthält feriomagnetische Bereiche.

Als anorganische Trägermaterialien werden schwer lösliche natürliche oder synthetisch hergestellte Oxide, Salze, Mineralien, Gläser oder Keramiken eingesetzt, die geforderten Druckstabilitäten in Festbettreaktoren Rechnung tragen, als organische Trägermaterialien Polymere, die mit den beschriebenen Metallverbindungen unter Bildung oiner metallionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.

Zur Variierung der mechanischen Eigenschaften der verwendeten Trägermaterialien werden Composite verwendet. Eine Verbesserung der Eigenschaften bevorzugter anorganischer Träger, vor allem bezüglich Abriebfestigkeit oder Verformbarkeit, wird durch Zusätze von organischem Material erreicht, indem anorganisch-organische Composite eingesetzt werden; das organische Material ist hierbei ein nicht reaktives Material zur Varriierung der physikalischen Eigenschaften des Trägers, oder es besitzt einen metallionenhaltigen Überzug zur Immobilisierung von Zellen oder Zellorganellen oder es ist ein Material, in dem oder an dem nach bekannten Verfahren Biomaterialien (z.B. Zellen, Proteine, Polysaccharide u.a.) immobilisiert sind. Die ungenügende Druckstabilität, die bei den bisher zur kovalenten Fixierung von Zellen benutzten organischen Trägern zu verzeichnen ist, wird erfindungsgemäß durch Zusätze von anorganischem Material verbessert, wobei das organische Material einen Metallionenüberzug erhält, der zur Immobilisierung von Zellen oder Zellorganellen benutzt wird, und das anorganische Material gegebenenfalls seinerseits zur Immobilisierung von weiteren Biomaterialien dienen kann.

Die an den Oberflächen der Trägermaterialien zur Immobilisierung verwendeten Metallionen sind Ionen von Elementen der zweiten bis fünften Haupt- oder der Nebengruppen des Periodensystems, einschließlich der Lanthanides Das heterobifunktionelle Reagenz enthält als funktionell Gruppe, die mit den Zellen oder Zellorganellen oder der Ankersubstanz direkt reagiert, eine Säureazid-, eine Säurehalogenid-, eine Säureanhydrid·, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine aktivierte Ester-, eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe.

Das heterobifunktionelle Reagenz enthält als funktionell Gruppe, die nach Reaktion mit einem Aktivierungsreagenz mit den Zellen oder Zellorganellen oder gogebenenfalls der Ankersubstanz reagiert, 6ine Amino-, Hydrazino-, Säureamid-, -hydrazid-, -halogenid-, -anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitrit-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Alken-, Alkin- oder eine CH-acide Gruppe.

Die nötige Auswaschstabilität bei gleichzeitiger Wiederverwendbarkeit des schwerlöslichen Trägermaterials wird dadurch erreicht, daß das heterobifunktionelle Reagens als zweite funktionell Gruppierung eine chelatbildende Gruppierung enthält, die aus einer oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der Fähigkeit zur Bildung von Nebenvalenzbindungen besteht. Derartige chelatbildende Gruppierungen enthalten Molekülbereiche mit Strukturen nach Forme! (—XXII der folgenden Abbildung:

Y Χ ζ X X

R-C-X R-NY RCY R-r-r-Y R-C P₁ Co=Z

Y Y

(I) (TI) (III) (TV) (V)

X X Y 7. 7. X X Y

R-C-C₁-C₂=Zi-) R C-C₁ Co- Ro-C C-C R₂ RC C₁-C-Co V₂-

(VI) (VII) (VIII) (IX)

χ γ >; γ γ γ

R-N R-N R-N¹ -X Π C-Y R-C Co r.r_o

X Y X Y

(X) (XI) (XII) (XI Π) 'ΧΠ')

Z X X X X X X Y Y

III I I III I I I

R-C-C₁-C-Co- R-C-P₁ Co Tt C C C P C Po ^, R- r, r\,

(XV) (XVI) (XVIT) (XVIlT)

X Y 7. 7. X Y

/ / / /I 11 I ι I

R C₁=N- R-NU N-C R_n-C₁ Co- RPC NH-C RCC C N

Y (XIX) (XX) (XXT) (XXII)

wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierteoder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Enzymbindung notwendige funktioneile Gruppebefindet, und

X: -ORL-SR₁₁-NR₁R^-NO₁-Nr₁OH₁-R₄OH, Y: -COORK-R₄-COORL-O-R₄-COOR₁₁-NH-R₄-COOR₁₁-S-R₄-COOR₁₁-CONr₁R^-CONHOH,-PO₃H₂,-R₄-PO₃H₂,

-NHOH₁-SO₃H,-OH,-H,

Z: =0, =S, =NH, =NOH, =N- in einem heterocyclischen Ring, R₁: -H,einAlkylrest,

R₂: -H,-NH₂, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest, R₃: ein aromatischer oder heterocyclischer Molekülrest, R₄: ein Alkylen-,Arylen- oder Aralkylenrest, R₆: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund C₁ und C₂ Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.

Wesentlich ist, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen der chelatbildenden Gruppierung im heterobifunktionellen Reagens, gegebenenfalls unter Einbeziehung von funktionelien Gruppen der Zeil- oder Organelloberfläche oder der Ankersubstanz und Metallionen des Trägers zu einer fünf- oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt.

Bevorzugt werden als chelatbildende Gruppierungen eingesetzt: 1-Hydroxy- oder 1-Amino-1,1-bisphosphonsäuren, Malonsäurederivate (I), Sideramine (II), Alphaketocarbonsäuren, Dithiocarbamate (III), 2-Hydroxy-, 2-Sulfhydryl- oder 2-Aminosäuren nach Formel (I) (IV), Dikotone oder Bis-chinone, deren Mono- oder Dioxime (V), Alphahydroxyketone, -ketoxime, Heterocyclen mit zum Ringstickstoff benachbarten Hydroxylgruppen, z. B. 8-Hydroxychinolin (Vl), 2-Nitrosonaphtol, Salicylate, Sulfosalicylate, Aluminon, Eriochromcyanin R (VII), Acetessigester-, Acetylaceton- oder Malonesterderivate (VIII), Chromotropsäure, Hydroxynaphtoesäure, Eriochromschwarz T (IX), Aminoalkohole (X: -R₄OH) (X), Iminoessigsäuren oder Iminobisphosphonsäuren (Xl), quartäre Ammoniumverbindungen (XII), Tricarbon- oder Triphosphonsäurederivate, gegebenenfalls über Ether- oder Thiotherbrücken gebunden (XIII), aromatische Dicarbonsäuren, z.B. 2-Nitro-4,3',5'-diphenylethertricarbonsäure (XIV), Alizarin S, Gallocyanin (XV), Brenzkatechin, -violett, Pyrogallol oder -rot (XVI), BAL- (Britisch Anti Lewisit) derivate (XVIII), Benztriazol, 2-(o-Hydroxyphenyl)benzoxazol, o-substituierte Diazoverbindungen oder Schiffsche Basen (XVIII), Mercaptobenzthiazol, Mercaptophenylthiodiazolon oder Cyanursäurederivate (XIX), Formazane, Dithizon- oder Cyanessigsäurederivate (XX), p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin (XXI) oder o-Hydroxybenzyliminodiessigsäurederivate, o-Hydroxybenzyliminodi-alkylphosphon- oder -sulfonsäuren (XXII).

Die Immobilisierung der Zellen, Zellorganellen oder gegebenenfalls einer Ankersubstanz erfolgt entweder in der Weise, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst mit dem Träger reagiert und dann mit den Zellen, Zellorganellen oder der Ankersubstanz zur Reaktion gebracht wird oder daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst an die Zelle, Zellorganelle oder die Ankersubstanz gebunden wird und anschließend durch Inberührung bringen des Trägers mit dem so modifizierten Material die Immobilisierung vollzogen wird.

die Trägeroberfläche gebunden und anschließend wird in bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle die Immobilisierung der Zellen oder Zellorganellen vollzogen. Diese Verfahrensvariante stellt eine Methode dar, auch Zellen oder Zellorganellen, die einer besonders milden Immobilisierungsmethode bedürfen, fest und reversibel zugleich an Oberflächen fester, schwer löslicher Träger zu fixieren. Gegenüber bisherigen Methoden der milden kovalenten Bindung mit wäßrigen Metalloxiden hat diese Verfahrensvariante vor allem den Vorteil, keine ernsthaften Probleme bezüglich der Stabilität des Trägermaterials zu besitzen. Als Ankermoleküle werden Moleküle von Substanzen benutzt, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen, an Festphasen gebunden, zur Isolierung oder Reinigung von Zellen oder Zellorganellen eingesetzt werden.

Zur Coimmobilisierung werden gegebenenfalls die Zellen oder Organellen vor oder nach der Bindung von heterobifunktionellem Reagens an die Zelle oder Organelle, gegebenenfalls vor oder nach der Immobilisierung über Ankermoleküle, mit anderen Biomaterialien verbunden.

Weiterhin werden als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt, die gegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten, der Zelle oder Organelle die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oder durch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phase flüssiger Mehrphasensysteme führen.

Gegebenenfalls erfolgt eine Nachbehandlung der Immobilisate mit bifunktionellen Verbindungen, die einerseits eine chelatbildende Gruppierung und zum anderen eine Gruppierung enthalten, die zur Verringerung der löslichkeit des Trägers im Reaktionsmedium, zur Beeinflussung des Verteilungsgleichgewichtes feinverteilter Trägerpartikel \u flüssigen Zweiphasensystemen und/oder durch Wechselwirkungen mit dem biologisch aktiven Material od'jr mit Substratmolekülen zur Veränderung der Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Selektivität des Biokatalysators führen. Solche Gruppierungen sind aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste, heterocyclische Reste, ionenaustauschende Gruppen, chelatbildende Gruppen, optisch aktive Gruppen, Gruppen, die Cofaktoren binden, reduzieren oder oxydieren können, Kohlehydratreste, Esteroder Amidgruppen sowie Cofaktoren oder analoge Strukturen. Eine durch Ankermoleküle oder entsprechende Nachbehandlung erzielte hydrophile Oberflächenschicht bietet Möglichkeiten zum Einsatz von Immobilisaten mit noch nicht abgetöteten Zellei ι in organischen Lösungsmitteln.

Die erfindungsgemäß hergestellten Immobilisate besitzen eine höhn Auswaschstabilität in gebräuchlichen Substratlösungen, in Abhängigkeit von der Komplexbildungskonstante des Komplexes aus chelatbildender Gruppierung und Metallion des Trägers, bei Erhalt der Reversibilität der Bindung. Die Fixierung der Zellen oder Organellen an Oberflächen stabiler, schwerlöslicher Trägermaterialien führt zu einer Reduzierung von Diffusionslimitierungen und läßt einen Einsatz in mehreren Reaktortypen, z. B. auch Festbettreaktoren, zu.

Die hergestellten Immobilisate werden bevorzugt zur Biotrensformation eingesetzt. Nachfolgend soll die beanspruchte Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

10g einer makroporösen Zirkondioxid enthaltenden Keramik werden mit 50ml einer wäßrigen Lösung von 3-Amino-i-hydroxy-1,1-bis-phosphonsäure (5OmM, Formel I, Y: -PO₃H₂, X: -OH) 1 h in einem rotierenden Gefäß behandelt. Das Produkt wird solange mit Wasser gewaschen, bis die Leitfähigkeit in der Waschlösung konstant bleibt. Danach werden 20ml einer 5%igen Glutaraldehydlösung in Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH - 7,5) zu dem abfiltrierten Träger gegeben und 48h bei Raumtemperatur (unter Rotation) gehalten. Dar aktivierte Träger wird gründlich mit Wasser gewaschen, dann zu 20ml einer Zellsuspension von A. simplex mit einer Konzentration von 5-50mg Zellen je ml Karbonatpuffer (pH = 7,5) gegeben und 24h mild gerührt. Danach wird das Produkt gewaschen und zur kontinuierlichen Transformation von Cortisol eingesetzt. Technische Einzelheiten, wie sorgfältige Entgasung der Träger unter Vakuum, nach Möglichkeit im Ultraschallfeld, sowie Behandlungsschritte unter „Überkopfrotation" und intensive Waschvorgänge gelten für alle Beispiele.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung von Zellen oder Zellorganellen an schwerlösliche Trägermaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Zellen oder Zellorganellen, gegebenenfalls über eine Ankersubstanz, an Trägermaterialien erfolgt, die an inneren oder äußeren Oberflächen Ionen mehrwertiger Metalle enthalten, wobei die Bindung der Zelle, der Zellorganelle oder gegebenenfalls der Ankersubstanz, mittels heterobifunktioneller Reagenzien erfolgt, in denen eine funktioneile Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung eines Aktivierungsreagens, mit den zu immobilisierenden Zellen, den Zellorganellen oder gegobenfalls der Ankersubstanz und die zwei to Gruppierung mit den Metallionen der Matrix reagiert und daß gegebenenfalls die Oberfläche des Trägers durch Nachbehandlung mit einer weiteren bifunktionellen Verbindung modifiziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Trägermaterialien anorganische Materialien, organische Materialien oder Composite aus beiden sind, bei denen sich an der äußeren Oberfläche und/oder an der Oberfläche von Poren im Innern des Materials, gegebenenfalls als nachträglich aufgebrachte Überzugsschicht, Ionen mehrwertiger Metalk befinden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die metallionenhaltige Überzugsschicht auf dem Trägermaterial durch dessen Umsetzung mit einer metallorganischen Verbindung, einem Metallsatz, einem Metallkomplex, einem Metallhalogenid, einem Oxy- oder Hydroxysalz erzeugt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die anorganischen Trägermaterialien schwer lösliche natürliche oder synthetisch hergestellte Oxide, Salze, Mineralien, Gläser oder Keramiken sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein ferromagnetisches Material ist oder ferromagnetische Bereiche enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Trägermaterialien Polymere eingesetzt werden, die mit Metallverbindungen nach Anspruch 3 unter Bildung einer metallionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien anorganisch-organische Composite sind, in denen die Eigenschaften der anorganischen Träger, wie Abriebfestigkeit oder Verformbarkeit durch das organische Material, insbesondere durch Polymere verbessert werden, wobei dieses organische Material ein Trägermaterial nach Anspruch 6 oder ein nicht reaktives Material oder ein Material ist, in dem oder an dem nach bekannten Verfahren Zellen oder andere Biomaterialien immobilisiert sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien anorganisch-organische Composite sind, in denen ein organisches Trägermaterial nach Anspruch 6 durch Zusätze von anorganischem Material in seinen Eigenschaften, wie zum Beispiel Druckfestigkeit verbessert wird, wobei das organische Material nach Anspruch 6 zur Immobilisierung von Zellen oder Zellorganellen genutzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mehrwertigen Metallionen an der Oberfläche der Träger Ionen von Elementen der zweiten bis fünften Haupt- oder der Nebengruppen des Periodensystems, einschließlich der Lanthanidon sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagens verwendet wird, das als eine funktioneile Gruppe, die mit der Zelle, der Zellorganelle oder der Ankersubstanz direkt reagiert, eine Säureazid-, eine Säurehalogenid-, eine Säureanhydrid-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine aktivierte Ester-, eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine heterobifunktionelles Reagens verwendet wird, das als eine funktioneile Gruppe, die nach Reaktion mit einem Aktivierungsreagens mit der Zelle, der Zellorganelle oder gegebenenfalls der Ankersubstanz reagiert, eine Amino-, Hydrazino-, Säureamid-, -hydrazid-, -halogenid-, -anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitril-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Alken-, Alkin- oder eine CH-acide Gruppe enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagens verwendet wird, das als zweite funktionell Gruppierung eine chelatbildende Gruppierung enthält,

die aus einer oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der Fähigkeit zur Bildung von Nebenvalenzbindungen besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die chelatbildonde Gruppierung Molekülbereiche mit Strukturen nach Formel I—XXII im heterobifunktionellen Reagens besitzt,

Y X Z X X Z / I'll- Il I/

R-C-X R-N-Y R-C-Y R-C-C-Y R-C-Ci-Co=Z

Y Y

(I) (ID (ill) (IV) (V)

X XY ZZ XXY

R-C-C₁-C₂=ZI-) R-C-C₁-C₂- R₂-C-C-C-R₂ R-C-C₁-C-Co-Co=

R (VI) (VII) (VIII) · (IX)

X YX YY Y

R-N R-N R-N'-X R-C-Y R-C-C₂-C-C₂-

X Y X Y ' '

(X) (XI) (XiI) (XIII) (XIV)

ZX XX XXX Y Y

R-C-C₁-C-C₁;- R-C-C₁-C₂- R-CC-C- · R-C-C₂-C₁ R₅-C₁-C₂-

(XV) (XVI) (XVII) . (XVIII)

X ' Y ZZXY

' / / / /II/ I I I

R C₁=N- R-NH-N-C-R₅-C₁-C₂- R-C-C-NH-C- R.-C-C-C-N

(XIX) (XX) (XXI) (XXII)

wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierte oder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Bindung der Zelle, Zellorganelle bzw. Ankersubstanz notwendige funktionell Gruppe befindet, und
X: -ORV-SRv-NR₁R₂₁-NO₁-NR₁O^-R₄OH,

Y: -COORV-R₄-COORV-O-R₄-COORV-NH-R₄-COORv-S-R₄-COORv -CONr₁R₂₁-CONHOH₁-PO₃H₂,-R₄-PO₃H^-NHOH,-SO₃H,-OH,-H, Z: =0, =S, =NH, =NOH, =N-in einem heterocyclischen Ring, R₁: -H, ein Alkylrest,

R₂: -H,-NH₂, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest,
R₃: ein aromatischer oder heteroryclischer Molekülrest, R₄: ein Alkylen-, Arylen- oder Aralkylenrest,
R₅: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund

C₁ Lnd C₂ Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.

14. Verfahren nach Anspruch 1,12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen der chelatbildenden Gruppierung, gegebenenfalls unter Einbeziehung von funktioneilen Gruppen der Zeil- oder Organelloberfläche oder der Ankersubstanz und Metallionen des Trägers zu einer fünf- oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterobifunktionelle Reagens zunächst über die Chelatbildung mit dem Träger reagiert und dann mit der Zelle oder Organelle zur Reaktion gebracht wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterobifunktionelle Reagens zunächst an die Zelle oder an die Zellorganelle gebunden wird und anschließend durch Inberührung bringen des Trag 3rs mit der so modifizierten Zelle oder Organelle die Immobilisierung vollzogen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Ankermoleküle an den Träger immobilisiert werden und daß die Zellen oder Zellorganellen anschließend in bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle gebunden werden.

18. Verfahren nach Anspruch 1,16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen oder Organellen vor oder nach der Bindung von heterobifunktionellem Reagens an die Zelle oder Organelle, gegebenenfalls vor ode, nach der Immobilisierung über Ankermoleküle, mit anderen Biomaterialien nach bekannten Verfahren verbunden werden.

19. Verfahren nach Anspruch 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Ankermoleküle Moleküle von Substanzen benutzt werden, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen an Festphasen gebunden zur Isolierung oder Reinigung von Zellen oder Zellorganellen eingesetzt werden.

20. Verfahren nach Anspruch 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden, an die in bekannter Weise die Zelle oder Organelle gebunden wird, die gegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten, der Zelle oder der Organelle die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oder durch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phase flüssiger Mehrphasensysteme führen.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelle Verbindung zur Nachbehandlung des Trägers eine chelatbildende Gruppierung nach Anspruch 12-14 und eine Gruppierung enthält, die die Löslichkeit des Trägers im Reaktionsmedium verringert, die das Verteilungsgleichgewicht feinverteilter Trägerpartikel in flüssigen Zweiphasensystemen beeinflußt und/oder durch Wechselwirkungen mit dem biochemisch aktiven Material oder mit Substratmolekülen die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Selektivität des Biokatalysators beeinflußt.

22. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelle Verbindung zur Nachbehandlung des Trägers neben derChelatgruppe nach Anspruch 12-14einen aliphatischen oder einen aromatischen Kohlenwasserstoffrest, einen heterocyclischen Rest, eine ionenaustauschende Gruppe, eine chelatbildende Gruppe, eine optisch aktive Gruppe, eine Gruppe, die Cofaktoren binden, reduzieren oder oxydieren kann, einen Kohlehydratrest, eine Ester- oder Amidgruppe enthält.