DD298266A5 - Verfahren zur immobilisierung von glucoamylase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Glucoamylase. Anwendungsgebiet ist die biotechnologische Staerkeverzuckerung. Erfindungsgemaesz wird Glucoamylase direkt oder ueber eine Ankersubstanz an ein schwerloesliches Traegermaterial gebunden, das mehrwertige Metallionen an der Oberflaeche enthaelt. Die Bindung erfolgt ueber heterobifunktionelle Verbindungen, in denen eine Gruppe direkt oder nach Aktivierung mit der Glucoamylase oder gegebenenfalls einer Ankersubstanz und eine zweite Gruppe unter Chelatbildung mit den Metallionen des Traegermaterials reagiert. Durch eventuelle Nachbehandlung des Immobilisates mit anderen bifunktionellen Verbindungen wird die Oberflaeche weiterhin modifiziert.{Immobilisierung; Glucoamylase; Traeger; Ankersubstanz; Metallionen; Chelatbildner; Reagenzien, bifunktionell; Nachbehandlung}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Glucoamylase an schwerlösliche Trägermaterialien. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Herstellung von Immobilisaten, die in der Biotechnologie (Stärkeverzuckerung und Enzymelektroden) eingesetzt werden.
Es ist bekannt, daß Glucoamylase an schwerlösliche Feststoffe durch Adsorption, Ionenaustausch oder kovalente Bindung immobilisiert werden kann. Die letztere Methode ist besonders gut zur Erzeugung stabiler Bindungen geeignet. Kovalente Bindung erfolgt nach einer chemischen Modifizierung (Aktivierung) des Feststoffes und/oder der zu immobilisierenden Glucoamylase. Als Feststoffe werden natürliche Stoffe (Mineralien, Chitin, Zellulose u.a.) und synthetische anorganische Stoffe (Glas, Silikate u.a.) oder organische Polymere eingesetzt. Für kontinuierliche technisch durchgeführte Prozesse werden anorganische Feststoffe als Trägermaterialien aufgrund ihrer guten mechanischen Eigenschaften bevorzugt. Sie erfordern jedoch als ersten Schritt der Immobilisierung in der Regel eine Funktionalisierung durch reaktionsfähige Überzüge. Es sind Verfahren zum Aufbringen organischer Beschichtungen auf organische oder anorganische Feststoffe lekannt, die unter Verwendung von bifunktionellen Silanen zu einer Funktionalisierung führen. Dabei wird ein Silan der allgeme nen Formel (RiO)3SiR2 (mit R, einem Alkyl-, R2 einem Vinyl-, γ-Aminopropyl-, Epoxi-, Alkyl-, SH- oder anderem Rest) in orj anischer oder wäßrig-organischer Lösung eingesetzt und das Primärprodukt unter Bildung von C-O-Si, Metall-O-Si- und/oder Si-O-Si-Bindungen bei erhöhter Temperatur kondensiert. Beides, die Verwendung organischer Lösungsmittel und Kondensation bei erhöhter Temperatur sind relativ kostenaufwendig ebenso wie die Herstellung der Silane (U. Deschler, P. Kleinschmitt und P.Panster Angew.Chem.98 [1986] 237-253).
bifunktionelle Verbindungen wie Dialdehyde, Carbodiimide, Chinone u.a.) oder nach Modifizierung der Glucoamylase (z. B.
durch Perjodatoxidation der Kohlehydratanteile des Enzyms, durch Einführung von polymerisierbaren Doppelbindungen u.a.).
heterobifunktioneller Verbindungen ersetzt wird (EP218506, EP273758, DDR-Patentanmeldungen: WPc 12 N/3045800 und-6786). Diese heterobifunktionellen Verbindungen enthalten im Molekül mindestens eine reaktive Gruppe, die direkt oder nach
metailionenhaltigen Trägermaterial wenig dissoziierende Verbindungen ergeben (Chelate). Mit diesem Verfahren sind gute
ausreichend.
von oxidischen Oberflächen zu erzielen, der die Auflösung von Trägermaterialien bei niedrigen und hohen pH-Wertenweitgehend unterdrückt.
der Komplexe unter Ausbildung von 5- und 6-Ringstrukturon verläuft. Dieser Effekt wird in der Färberei genutzt, wo durch
erzeugt werden. Zur Immobilisierung von Glucoamylase wurden derartige Verbindungen nicht eingesetzt.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung von Glucoamylase zu entwickeln, das zu wiederverwendbaren Biokatalysatoren mit hoher. Fixierungsausbeuten und Auswaschstabilitäten führt.
chelatbildender Gruppen im Kopplungsreagenz bei gleichzeitig hohen Immobilisierungsausbeuten zu verbessern.
über heterobifunktionelle Verbindungen an schwerlösliche Trägermaterialien gebunden, die an inneren oder äußeren
denen eine funktioneile Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung eines Aktivierungsreagenz, mit der zu immobilisierenden
modifiziert. Als Trägermaterialien werden anorganische Materialien, organische Materialien oder Composite aus beidenverwandt, bei denen sich an der äußeren Oberfläche und/oder an der Oberfläche von Poren im Innern des Materials,gegebenenfalls als nachträglich aufgebrachte Überzugsschicht, Ionen mehrwertiger Metalle befinden.
hexacyanoferrat-(ll)), einem Metallhalogenid (z. B. Titantetrachlorid), einem Oxy- oder Hydroxysalz (z. B. Zirkonoxychlorid)orzeugt.
oder Keramiken, die gegebenenfalls aus einem ferromagnetischen Material bestehen oder ferromagnetische Bereiche enthalten.
einer metailionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.
werden, wobei dieses organische Material einen metallionenhaltigen Überzug zur Immobilisierung von Glucoamylase besitztoder ein nicht reaktives Material ist, das lediglich als Füllstoff dient oder ein Material ist, in dem oder an dem nach bekannten
reagiert, eine Säureazid-, eine Säurehalogenid-, eine Säureanhydrid-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine aktivierte Ester-,eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe.
-anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitril-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-,
oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der
mit Strukturen nach Formel I—XXII der folgenden Abbildung:
Y XZ XX Z
/ III Il Il
R-C-X R-N-Y R-C-Y R-C-C-Y R-C-C1-C2=Z
Y Y
(I) (II) (III) (IV) (V)
X XY ZZ X X Y
R-C-C1-C2=Z(-) R-C-C1-C2- R2-C-C-C-R2 R-C-C1 C-C2 C2=
(VI) (VII) (VIII) (IX)
| X | I | R-N | \ | X | Y | I | R-N | \ | Y | R | X | I | X | Y | / | Y | / | Y Y |
| -N + -X | R-C-Y | R-C-C2 | / / | |||||||||||||||
| \ | \ | W \ | :c-c2- | |||||||||||||||
| \ \ | ||||||||||||||||||
(X) (XI) (XII) (XIII) (XIV)
ZX XX XXX Y Y
R-C-Ci-C-C2- R-C-Ci-C2- R-C-C-C- R-C-C2-Ci-R5-Ci-C2-
(XV) (XVI) (XVII) (XVIIl)
X YZZXY
/ / / Il 11 I I I
R C1=N- R-NH-N-C-R5-C1-C2- R-C-C-NH-C- R-C-C-C-N
Y (XIX) (XX) (XXI) (XXII)
wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierte oder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Enzymbindung notwendige funktioneile Gruppe befindet, und
-SO3H1-OH1-H,
Z: =O,=S,=NH,=NOH,=N-in einem heterocyclischen Ring, R1: -H.einAlkylrest,
R2: -H1-NH2, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest, R3: einaromatischeroderheterocyclischerMolekülrest, R4: ein Alkylen-, Arylen- oder Aralkylenrest, R6: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppe und C1 und C2 Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.
Wesentlich ist, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen derchelatbildenden Gruppierung im heterobifunktionellen Reagenz, gegebenenfalls chelatbildender Gruppen im Enzymmolekül und Metallionen des Trägers zu einer fünf- oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt. Bevorzugt werden als chelatbildende Gruppierungen eingesetzt: 1-Hydroxy- oder 1 -Amino-1,1 -bisphosphonsäuren, Malonsäurederivate (I)1 Sideramine (II), Alphaketocarbonsäuren, Dithiocarbamate (IiI), 2-Hydroxy-, 2-Sulfhydryl- oder 2-Aminosäuren nach Foimel (I), (IV), Diketone oder Bis-chinone, deren Mono- oder Dioxime (V), Alphahydroxyketone, -ketoxime, Heterocyclen mit zum Ringstickstoff benachbarten Hydroxylgruppen, z. B. 8-Hydroxychinolin (Vl)12-Nitrosonaphtol, Salicylate. Sulfosalicylate, Aluminon, Eriochromcyanin R (VII), Acetessigester-, Acetylaceton- oder Malonesterderivate (VIII),
!rr.inobisphosphonsäuren (Xl)1 quartäre Ammoniumverbindungen (XII), Tricarbon- oder Triphosphonsäurederivate,gegebenenfalls über Ether oder Thioetherbrücken gebunden (XIII), aromatische Dicarbonsäuren, z. B. 2-Nitro-4,3', 5'-diphenylethertricarbonsäure (XIV), Alizarin S, Gallocyanin (XV), Brenzkatechin, -violett, Pyrogallol oder -rot (XVI), BAL-(Britisch
o-Hydroxybenzyliminodiessigsäurederivate (XXII).
bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle binden. Als
benutzt, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen, an Festphasen gebunden, zur Isolierung oder Reinigung von
eingesetzt. Weiterhin werden als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere (z. B. Dextrane, Polyole) eingesetzt, diegegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten oder der Glucoamylase die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oderdurch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phaseflüssiger Mehrphasensysteme führen.
aktive Gruppen, Borverbindungen Kohlenwasserstoff- oder Kohlehydratreste.
10g einer makroporösen Zirkondioxid enthaltenden Keramik werden mit 50ml einer wäßrigen Lösung von 6-Amino-1 -hydroxy-1,1-bisphosphonsäure (5OmM, Formel I, Y: -PO3H2, X: -OH) 1 h in einem rotierenden Gefäß behandelt. Das Produkt wird solange mit Wasser gewaschen, bis die Leitfähigkeit in der Waschlösung konstant bleibt. Danach werden 20 ml einer 5%igen Glutaraldehydlösung in Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH = 7,5) zu dem abfiltrierten Träger gegeben und 48h bei Raumtemperatur (unter Rotation) gehalten. Der aktivierte Träger wird gründlich mit Wasser gewaschen und dann zu 30ml einer Lösung von Glucoamylase (100IE/ml = 100 internationale Einheiten/ml) in Karbonatpuffer (pH = 7,5) gegeben. Nach 24stündiger Rotation wird das Produkt gewaschen und zur kontinuierlichen Stärkehydrolyse eingesetzt. Die Fixierungsausbeute beträgt 30%.
Technische Einzelheiten, wie sorgfältige Entgasung der Träger unter Vakuum, nach Möglichkeit im Ultraschallfeld, sowie Behandlungsschritte unter „Überkopfrotation" und intensive Waschvorgänge, d. h. mindestens 10x 20min, gelten für alle Beispiele gemeinsam.
500 mg Glucoamylase werden in Acetatpuffer (50 mM, pH 4,5) mit Perjodat oxydiert (s. M. Marek et al., Biotech. Bioeng.261223 11984]) unddialysiert. Der Rückstand wird mit 20mg Desferrioxamin B (Formel II, X: -OH, Y: -CORi, R enthält eine primäre Aminogruppe) versetzt und über 48 h bei 4°C zur Reaktion gebracht. Gleichzeitig wird aus äquimolaren Mengen von Eisen-Il- und Eisen-lll-sulfat in einer 1%igen Dextranlösung mit Ammoniaküberschuß ein magnetisches Eisenoxid (Fe3O4) gefällt, das durch Dextran als Schutzkolloid stabilisiert ist. Dieses Eisenoxidsol wird mit der modifizierten Glucoamylase versetzt und 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Nach mehreren Waschungen mit magnetischer Abtrennung wird das Produkt in einem wäßrigen 2-Phasen-System (Stärke-Polyethylenglycol) zur Stärkehydrolyse eingesetzt, wobei sich der Katalysator in der Stärkelösung anreichert und die entstehende Glucose in beiden Phasen gleich verteilt ist und aus der PEG-Phase durch Ultrafiltration abgetrennt werden kann.
500mg N-(4-Hydroxyphenyl)-dithiocarbamat (Formel III, X: -SH, Z: =S) werden in wäßriger Lösung mit 10g einer Eisen-lll-oxid enthaltenden Keramikgeschüttelt. Das Produkt wird gewaschen und sorgfältig getrocknet. Anschließend wird es mit 30ml einer 2%igen Lösung von Toluendiisocyanat in trockenem Toluen aktiviert und mit getrockneten Lösungsmitteln (Toluen, Aceton) reagenzienfrei gewaschen und getrocknet. Die abschließende Glucoamylasekopplung erfolgt durch Eintragen des aktivierten Trägers in eine wäßrige Lösung von Glucoamylase (3000IE/30ml).
400 mg 3,4-Epoxy-1,2-dihydroxybutan-i ,1-bisphosphonsäure werden an 10g Aluminiumsilikat adsorbiert und anschließend mit einer Lösung von Glucoamylase (300IE/50ml Karbonatpuffer, lOOmmol/l, pH: 8,5) umgesetzt. Nach 5h bei 40C wird die Immobilisierung abgebrochen und das Produkt gewaschen und für die Maltosobestimmung genutzt.
5ml Glucoamvlase in einer Glycerol-Acetatpuffermischung (20% Glycerol, 0,1 mol/l Acetatpuffer, pH: 4,5) werden mit 30ml einer wäßrigen Lösung von 5-Diazo-8-hydroxychinolin (IOmmol/1) umgesetzt und der Reagenzüberschuß in einer Epidexsäule abgetrennt. 10g makroporöses Aluminiumoxidpulver werden mit der aktivierten Glucoamylase 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt, abfiltriert und gewaschen. Dann werden 2g Bäckerhofe in 20ml 3%iger Natriumalginatlösung suspendiert, mit dem feuchten Trägermaterial versetzt und die Mischung tropfenweise in eine Calciumchloridlösung gepreßt. Die entstehenden Kugeln werden vorsichtig getrocknet und anschließend in einem Säulenreaktor zur kontinuierlichen Vergärung von Stärkevorhydrolysat eingesetzt.
10g Schaumbeton werden nacheinander mit Lösungen von Eisen-lll-hexacyanoferrat und Eisen-ll-ammoniumsulfat (jeweils 20mmol/l,pH: 6,5) behandelt. Das tiefblaue Produkt wird gewaschen und anschließend mit 30ml einer Lösung von 3-Hydroxy-4-carboxy-benzoesäureazid (10mg/ml,pH: 4,0, Formel VII, Y: -COOH, X: -OH) 10min bei O0C geschüttelt und anschließend sofort mit einer Lösung von Glucoamylase in Acetatpuffer (3000IE/50ml lonenstärke: 0,1 mol/l, pH: 4,5) versetzt. Nach 2h wird der Träger gewaschen und bis zur Verwendung in o.g. Puffer aufbewahrt.
10g Schaumglas werden mit einor 5%igen Lösung von Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Riboflavin (zur Gelherstellung) getränkt und durch UV-Bestrahlung mit einem Überzug von Polyacrylamid versehen. Das getrocknete Produkt wird mit einer Lösung von Titantetrachlorid in Tetrachlorkohlenstoff 2 h geschüttelt, mit Aceton und Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 50mg N-(2-Hydroxyethyl)aminomalonsäure (Formel VIII, Z: =0, R2: -OH) in 30 ml Wasser versetzt. Nach 2stündiger Rotation der Mischung wird der funktionalisierte Träger mit Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und mit Chlorameisensäurenorbornylester in bekannter Weise die endständige Hydroxylgruppe in den aktivierten Ester überführt. Abschließend wird die Kopplung von Glucoamylase (3000IE In Karbonatpuffer, 50mmol/l, pH: 7,0) durch Zugabe von 30ml Glucoamylaselösung zu dem getrockneten Träger vollzogen. Das Produkt wird in Durchflußanalysatoren eingesetzt.
300mg Glucoamylase und 50mg 1,8-Dihydroxynaphthalin-3,6-disulfonsäure werden bei pH7,5 in Karbonatpuffer mit 25mg Bis-diazobenzidinhydrochlorid versetzt und unter schwacher Rührung 1 h bei Raumtemperatur gehalten. Das entstehende Glucoamylasederivat (Formel IX, X: -OH, Y: -N=N-) wird mit 5 ml 10%iger Polyacrylsäure und 3g fein verteiltem Eisen-ll,ll!-oxid versetzt und in eine Lösung von 2g Chromammoniumalaun in 30 ml Wasser getropft. Das Produkt wird getrocknet und bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
10g Poly-vinylalkohol-divinylbenzen (98:2) werden mit einer wäßrigen Lösung von Zirkonoxychlorid (2g in 50ml, pH: 3,5) 1 h auf 6O0C erwärmt, anschließend gründlich gewaschen und mit einer Lösung von 200mg Triethanolamin in 50ml Wasser weitere 3 h auf 60cC erwärmt. Das Produkt (Formel X, R = X: -CHj-CH2-OH) wird mit Cyanurchlorid (50ml, 50mmol/l, Acetonlösung) 5h bei Siedetemperatur aktiviert, mit Aceton und Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 50mmol Glucose in Karbonatpuffer (50ml, 50mmol/l, pH: 8,0) 3h bei Zimmertemperatur behandelt.
Der Träger wird gewaschen und an die immobilisierte Ankersubstanz werden 3000IE Glucoamylase aus Acetatpuffer (50ml 0,1 mol/l, pH: 4,5) adsorptiv immobilisiert.
10g poröses Glas („Trisoperl") werden 5h unter Rückfluß in einer Ammoniummolybdatlösung (lOmmol/, pH = 5,0) gekocht. Danach wird abfiltriert und mit 100ml einer 1%igen Lösung von 2-(N,N-diethylphosphonsäure)-aminoacetaldehyd (R: -CH2-CHO, Y: -CH2-CH2-PO3H2, Formel Xl) in Karbonatpuffer (pH = 7,5) versetzt. Nach 1 h wird abfiltriert und gewaschen. Der Träger wird dann mit 30ml einer Lösung von Glucoamylase (100IE/ml) in Acetatpuffer (10mmol/l, pH = 5,6) 24h bei Raumtemperatur behandelt, anschließend gewaschen und in Acetatpuffer aufbewahrt.
10g poröses Titandioxid werden mit 20ml einer Lösung von 1OmM N,N',N"-Tris-(2-phosphonatoethylamino)-acetaldehyd (Formel XIII, Y: -N-CH2-CH2-PO3H2) in destilliertem Wasser 1 h rotiert, gewaschen und in die Lösung von3000IE Glucoamylase in 30ml Karbonatpuffer (0,1 mol/l, pH: 7,0) gebracht. Nach 2stündiger Rotation ist die Immobilisierung beendet. Das Produkt wird abfiltriert, gewaschen und in Acetatpuffer bei pH4,5 aufbewahrt.
10g poröse Perlcellulose werden 4h mit einer alkoholischen Lösung von Zirkontetraethylat (2g in 50ml) unter Rückfluß auf Siedetemperatur erhitzt, anschließend mit Ethanol und Wasser gewaschen. Zu dem feuchten Träger werden 200mg 2-Aminodiphenylether-4,3',5'-tricarbonsäure (Formel XIV, Y: -COOH) in neutraler wäßriger Lösung gegeben und unter Rotation im Verlauf einer Stunde adsorbiert. 50mg Linsen'ektin als Ankersubstanz werden wie in Beispiel 2 mit Perjodat oxidiert und anschließend bei pH 7,0 (neutralisiert mit Hydrogenkarbonat) an den funktionalisierten Träger gebunden. Abschließend werden 30mg Glucoamylase in 20ml Wasser gelöst und zu dem Lektinimmobilisat gegeben. Nach den üblichen Waschschritten ist das Produkt zum Einsatz in analytischen Reaktoren geeignet.
10g Aluminiumsilikat werden mit einer Lösung von 2g Alizarin S in 30 ml Natronlauge (1 mmol/l) 2 h unter Rotation umgesetzt, der Träger gewaschen und getrocknet. Zu dem trockenen Träger wird eine Mischung von 20mmol Terephtaloylchlorid und 20mmol Pyridin In 30ml Toluen gegeben und innerhalb von 2h bei 6O0C die ß-OH-Gruppe des Alizarin S verestert. Der funktionalisierte Träger wird mit Toluen, Aceton und Wasser gewaschen und sofort danach mit 3 000IE Glucoamylase in Karbonatpuffor (IOmmol/1, pH: 7,0) versetzt. Nach 3h ist die Immobilisierung beendet.
Glucoamylase (3000IE) wird in Karbonatpuffer (s.o.) mit 20ml o-Chinon (3mmol/l) und nach 4h mit 10ml Hydrazinsulfat (10mmol/l, pH6,5) umgesetzt, wobei ein Brenzkatechinderivat (Formel XVI, X: -OH) entsteht. 10g poröses Aluminiumoxid werden 4h mit der Reaktionslösung behandelt, gewaschen und zur Spaltung von Kartoffelstärke eingesetzt.
lOOmmol o-Phenylenbisdiezoniumchlorid werden bei pH9,0 mit 200mmol p-Aminophenol gekuppelt und das Produkt (Formel XVIII, Y: -OH, Re: -N=N-CeH^N=N-) wird erneut diazotiert, danach an 10g poröses Aluminiumsilikat adsorbiert und sofort mit einer Lösung von 3000IE Glucoamylase in o.g. Karbonatpuffer umgesetzt. Das Produkt wird mit Wasser und Acetatpuffer gewaschen.
500mg Glucoamylase aus Asp.-niger werden mit einer Lösung von 20mmol Cyanursäurechlorid in 3ml Aceton umgesetzt, danach wird das Produkt getrocknet und in Wasser aufgenommen. Die restlichen Chloridatome werden in Karbonatpuffer abhydrolysiert und das Produkt (Formel XIX, X: -OH) wird an 10g eines porösen Titansilikates adsorbiert. Der entstandene Katalysator wird zur Stärkespaltung eingesetzt.
durch Behandlung mit einem Überschuß von Benzochinon in Karbonatpuffer (3 mmol/l) aktiviert. Die abschließende
e-Chlorchinolin-S-carbonsäuremethylester wird mit Glycin zu der N-substituierten Aminoessigsäure umgesetzt und anschließend mit Hydrazin und Nitrit in das Azid überführt. 0,1 g dieser Verbindung (Formel XXI, Z: =N- im Ring, =0) werden mit 1 g Glucoamylase bei pH7,0 in Karbonatpuffer umgesetzt und anschließend an 10g Zirkondioxid adsorbiert.
200mg N-(2-hydroxy-5-aminobenzyl)iminodiessigsäure (Formel XXII, X: -OH, Y: -CHt-COOH) werden diazotiert und nach Neutralisation zu einer Mischung aus Glucoamyiase und Glucoseoxidase (jeweils 3000IE) in 20ml Karbonatpuffer pH: 8,0 gegeben. Nach 4h bei O0C ist die Kopplung beendet, und das Produkt wird mit 10g Eisen-ll,lll-oxid versetzt. Unter Rotation werden die modifizierten ( izyme adsorbiert (12 h), das Produkt wird gewaschen und magnetisch abgetrennt. Der Katalysator wird mit 10ml einer 10%igenPolyvinylalkohollösung vermischt und auf einer Glasplatte zu einer Membran ausgestrichen. Nach Trocknung wird die Membran vor die Platinspitze einer amperometrischen Elektrode gespannt. Die entstehende Enzymelektrode ist zur Bestimmung von Glucose und Maltose einsetzbar.
Claims (21)
1. Verfahren zur Immobilisierung von Glucoamylase an schwerlösliche Träg6rmaterialien, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Glucoamylase, gegebenenfalls über eine Ankersubstanz, an Trägermaterialien erfolgt, die an inneren oder äußeren Oberflächen Ionen mehrwertiger Metalle enthalten, wobei die Bindung der Glucoamylase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz, mittels heterobifunktioneller Reagenzien erfolgt, in denen eine funktioneile Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung eines Aktivierungsreagenz, mit der zu immobilisierenden Glucoamylase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz und die zweite Gruppierung mit den Metallionen der Matrix reagiert und daß gegebenenfalls die Oberfläche des Trägers durch Nachbehandlung mit einer weiteren bifunktionellen Verbindung modifiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Trägermaterialien anorganische Materialien, organische Materialien oder Composite aus beiden sind, bei denen sich an der äußeren Oberfläche und/oder an der Oberfläche von Poren im Innern des Materials, gegebenenfalls als nachträglich aufgebrachte Überzugsschicht, Ionen mehrwertiger Metalle befinden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die metallionenhaltige Überzugsschicht auf dem Trägermaterial durch dessen Umsetzung mit einer metallorganischen Verbindung, einem Metallsalz, einem Metallkomplex, einem Metallhalogenid, einem Oxy- oder Hydroxysalz erzeugt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die anorganischen Trägermaterialien schwer lösliche natürliche oder synthetisch hergestellte Oxide, Salze, Mineralien, Gläser oder Keramiken sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein ferromagnetisches Materiel ist oder ferromagnetische Bereiche enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Trägermaterialien Polymere eingesetzt werden, die mit Metallverbindungen nach Anspruch 3 unter Bildung einer metallionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.
7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien anorganisch-organische Composite sind, in denen die Eigenschaften der anorganischen Träger, wie Abriebfestigkeit oder Verformbarkeit durch das organische Material, insbesondere durch Polymere verbessert werden, wobei dieses organische Material ein Trägermaterial nach Anspruch 6 oder ein nicht reaktives Material oder ein Material ist, in dem oder an dem nach bekannten Verfahren Enzyme oder andere Biomaterialien immobilisiert sind.
8. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien anorganisch-organische Composite sind, in denen ein org." Fisches Trägermaterial nach Anspruch 6 durch Zusätze von anorganischem Material in s, -inen Eigenschaften, wie zum Beispiel Druckfestigkeit verbessert wird, wobei das organische Material nach Anspruch 6 zur Immobilisierung von Enzymen genutzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mehrwertigen Metallionen an der Oberfläche der Träger Ionen von Elementen der zweiten bis fünften Haupt- oder der Nebengruppen des Periodensystems, einschließlich der Lanthaniden sind.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagenz verwendet wird, das als eine funktioneile Gruppe, die mit der Glucoamylase oder der. Ankersubstanz direkt reagiert, eine Säureazid-, eine Säurehaiogenid-, eine Säureanhydrid-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanat-, eine aktivierte Ester-, eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagenz verwendet wird, das als eine funktioneile Gruppe, die nach Reaktion mit einem Aktivierungsreagenz mit der Glucoamylase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz reagiert, eine Amino-, Hydrazino-, Säureamid-, -hydrazid-, -halogenid-, -anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitril-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Alken-, Alkin- oder eine CH-acide Gruppe enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein heterobifunktionelles Reagenz verwendet wird, das als zweite funktioneile Gruppierung eine chelatbildende Gruppierung enthält, die aus einer oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der Fähigkeit zur Bildung von Nebenvalenzbindungen besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekonnzeichnet, daß die chelatbildende Gruppierung Molekülbereiche mit Strukturen nach Formel I—XXlI im heterobifunktionellen Reagenz besitzt.
R-C-C1-C2 = Z W \
(I) (H) (III) (IV) (V)
X XY ZZ XXY
II/- III Il III Il Il
R-C-C1-C2=Zi-) R-C-C1-C2 R2-C-C-C-R2 R-C-C1-C-C2-C2=
R (VI) (VII) (VIII) (IX)
X) (XI) (XII) (XIII) ' (XIV)
ZX XX XXX Y Y
III Il I I I I I I
R-C-C1 C-C2- R-C-C1-C2- R-C-P-C- R-C-C2-C1-R5-'C1-C2-
(XV) (XVI) (XVII) (XVIII) ·
X Y ZZXY
I Il Uff III
R C1=N R-NH-NC-R5-C1-C2- R-C-C-NH-C- R-C-C-C-N
Y (XIX) (XX) (XXI) (XXII)
wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierte oder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Enzymbindung notwendige funktionell Gruppe befindet, und
X: -ORv-SR11-NR1R2,-NO^NR1OH,-R4OH,
Y: -COORV-R4-COOR17-O-R4-COORV-NH-R4-COORu-S-R4-COOR11-CONR1R2,
-CONHOH^PO3H2,-R4-PO3H2,-NHOH,-SO3H,-OH,-H, Z: =0, =S, =NH, =NOH, =N-in einem heterocyclischen Ring, R1: -H, einAlkylrest,
R2: -H, -NH2, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest,
R3: ein aromatischer oder heterocyclischer Molekülrest, R4: ein Alkylen-, Arylen- oderAralkylenrest,
R5: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund
C1 und C2 Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.
R3: ein aromatischer oder heterocyclischer Molekülrest, R4: ein Alkylen-, Arylen- oderAralkylenrest,
R5: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund
C1 und C2 Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.
14. Verfahren nach Anspruch 1 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen der chelatbildenden Gruppierung und Metallionen des Trägers zu einer fünf- oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst über die Chelatbildung mit dem Träger reagiert und dann mit der Glucoamylase zur Reaktion gebracht wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst an die Glucoamylase gebunden wird und anschließend durch In-Berührung-Bringen des Trägers mit der so modifizierten Glucoamylase die Immobilisierung vollzogen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Ankermoleküle an den Träger immobilisiert werden und daß die Glucoamylase anschließend in bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle gebunden wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Ankermoleküle Moleküle von Substanzen benutzt werden, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen an Festphasen gebunden zur Isolierung oder Reinigung von Glucoamylase eingesetzt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 1 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden, an die in bekannter Weise das Enzym gebunden wird, die gegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten oder dem Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oder durch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phase flüssiger Mehrphasensysteme führen.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelie Verbindung zur Nachbehandlung des Trägers eine chelatbildende Gruppierung nach Anspruch 12-14 und eine Gruppierung enthält, die die Löslichkeit des Trägers im Reaktionsmedium verringert, die das Verte'lungsgleichgewicht feinverteilter Trägerpartikel in flüssigen Zweiphasensystemen beeinflußt und/oder durch Wechselwirkungen mit dem Enzym oder mit Substratmolekülen die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Selektivität des Biokatalysators beeinflußt.
21. Verfahren nach Anspruch 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die bifunktionelle Verbindung zur Nachbehandlung des Trägers neben derChelatgruppe nach Anspruch 12-14 einen aliphatischen oder einen aromatischen Kohlenwasserstoffrest, einen heterocyclischen Rest, eine ionenaustauschende Gruppe, eine chelatbildende Gruppe, eine optisch aktive Gruppe, eine Gruppe, die Cofaktoren binden, reduzieren oder oxydieren kann, einen Kohlehydratrest, eine Ester- oder Amidgruppe enthält.
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|---|---|---|---|
| DD32527889A DD298266A5 (de) | 1989-01-27 | 1989-01-27 | Verfahren zur immobilisierung von glucoamylase |
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| DD298266A5 true DD298266A5 (de) | 1992-02-13 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115491362A (zh) * | 2022-09-01 | 2022-12-20 | 可孚医疗科技股份有限公司 | 一种氧化酶的固定方法 |
-
1989
- 1989-01-27 DD DD32527889A patent/DD298266A5/de unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115491362A (zh) * | 2022-09-01 | 2022-12-20 | 可孚医疗科技股份有限公司 | 一种氧化酶的固定方法 |
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