DD298280A5 - Hochleistungsverfahren zur herstellung von penicillinen unter fed-batch-bedingungen - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Hochleistungsverfahren zur Herstellung von Penicillinen nach dem Zufuetterungsprinzip. Erfindungsgemaesz wird eine Stammselektion durchgefuehrt, wozu Effektoren in der Form von B-Vitaminen und Coffein eingesetzt werden. Die Standardisierung der Anzuchten erfolgt durch Zustandskontrolle ueber physiologisch indizierte Reifekriterien auf der Grundlage von Anlagenmeszgroeszen. Die primaere Wachstumsphase des Produktbildungsfermentors wird in Form einer p H-Profilfermentation durchgefuehrt. Es erfolgt eine Naehrloesungspraeparation zur Eliminierung der Koernung bei den eingesetzten Erdnusz- oder Sojaschoten. Bei der Produktbildungstruktur wird die Verwertungsaktivitaet fuer die dimeren oder oligomeren Kohlenstoffsubstrate der Zudosierungen waehrend der Produktbildung stimuliert. Bei der Produktbildungskultur wird Saccharose als C-Zufuetterungssubstrat und als Substrat fuer die Steuerung des Beginns der Produktbildung eingesetzt. Bei der Produktbildung erfolgt die Fuehrung der Substratzufuetterung biosynthesekapazitaetsbezogen.{Herstellungsverfahren, mikrobiell; Penicilline; Zufuetterungsprinzip; fed-batch-Bedingungen; Kohlenstoffsubstrate; Naehrloesungspraeparation}
Description
-2- 298 280 Anwendungsgebiet der Erfindung
Bevorzugtes Anwendungsgebiet ist die pharmazeutische Erzeugnisproduktion von Antibiotika auf der Basis mikrobieller Herstellungsverfahren nach dem Zufütterungsprinzip.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die mikrobielle Herstellung von Benzylpenicillin (Penicillin G), ebenfalls von Phenoxymethylpenicillin (Penicillin V) durch Kultivierung von mycelbildenden Penicillien kann nach dem batch-, fed batch- und repeated fed batch-Prinzip erfolgen (G.I. M. Hersbach, C. P. van der Beek, P.W. M. Dijck, Biotechnology of Industrial Antibiotics: The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation. Marcel Decker, Inc., New York, Basel, 1984). Die genannten Verfahrensprinzipien unterscheiden sich wesentlich durch den erforderlichen technischen und technologischen Aufwand zur Realisierung der Biosyntheseleistungen im Produktbildungsprozeß. Maßgebliche Entwicklungen in der Biotechnologie sind durch die Anstrengungen der Verfahrensentwicklungen zur Herstellung von Penicillinen induziert worden (R. C. Righelato, A. P. J. Trinci, S. J. Pirt, The Influence of Maintenance Energy and Groth Rate on the Metabolie Activity, Morphology and Conidiation of Penicillium chrysogenum, J. Gen. Microbiol. 50,399-412,1968. JJ. Heijnen, J. A. Roels, A. H. Stouthamer, Application of Balancing Methods in Modelling the Penicillin Fermentation, Biotech. Bioengin. 21,2175-2201,1979. R.Wittler, K.Schügerl, Steuerung der Mycelmorphologie beider Penicillinfermentation, Dechema-Monographien, Biotechnologie, 1983, Bd.95,101-114. R. Guthke, Model aided design of repeated fed batch penicillin fermentation, Bioprocess Engineering 2,169-173,1987. Y. M. Doe, G. M. Gaucher, Semicontinuous and Continuous Production of Penicillin-G by Penicillium chrysogenum Cell Immobilized in «-Carrageenan Boa'ds, Biotech. Bioengin. XXVI, 285-295,1984). Die genotypische Entwicklung der Penicillinbildner hat eine eindrucksvolle Entwicklung hinter sich und gipfelt in Penicillintiter -ι von 85000-90000 (ΙΕ/ml) (Panlabs; W. u. A. Crüger, Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, Akademische Verlagsgesellschaft Wiesbaden, 1982). Allerdings werden diese maximalen Stammpotenzen in ihrer technologischen Verwertbarkeit durch die Höhe und Breite des Nebenproduktspektrums limitiert. Für die Stammauswahl in einem großtechnischen Penicillinbildungsprozeß sind neben der technologisch verwertbaren Biosynthesepotenz die Stammarker, die Resistenz gegenüber Scherkraftbelastung und Theologische Kriterien entscheidend. Im Rahmen eines biotechnologischen Verfahrens sind die einzusetzenden Nährstoffe, der einzusetzende Produktbildner und die Prozeßtechnologie auf einander abgestimmte Komponenten. Es gibt deshalb eine Vielzahl von Penicillinve.n<.;>rensmodifikationen, die sich in den Besonderheiten des jeweiligen Komponentensystems unterscheiden. Für alle Penicillinverfahren erweist sich der Phosphormetabolismua als grundlegend (WPC 12 U 3133544, Verfahren zur dynamischen Quantifizierung und Steuerung der Phosphataufnahme bei produktbildenden Pilzen in der Fermentation) und die Kohlenstoffsubstratversorgung, mit der die Katabolitrepression von Glukose für Penicillin durch technologisch geeigneten Maßnahmen unterlaufen wird. Eine g> undsätzliche Trennlinie zwischen fed- und repeated fed-batch Prozessen bildet die Form der Sauerstoffversorgung der Produktbildungskul'ur. Bei fed-Prozesson muß die Biomasseentwicklung und die Kulturlösungskonsistenz so geführt werden, daß die Versorgbarkeit über Zeitspannen von 100-160 Stunden gewährleistet wird. Bei repeated fed-batch-Prozessen hingegen begegnet man versorgungskritischen Biomassekonzentrationen durch Zwischenernten und Mediennachschub. Mit dem Mediennachschub erfolgt gleichzeitig eine Auffrischung der Nährsubstrate und Spurenelementd&pots für den nachfolgenden Fermentationsabschnitt (WPC 12N/263102/2, Verfahren zur zyklischen Fermentation von Streptothricinen, insbesondere Nourseothricin). Eine weitere Trennlinie zwischen den Verfahrenstypen resultiert aus der Volumenauslastung der biotechnologischen Reaktoren. Während bei fed-batch-Prozessen generell nur eine Volumenauslastung unterhalb des Bruttovolumens des Reaktors erreicht wird, liefern repeated fed-batch-Prozesse bedingt durch die Zwischenernten mit Mediennachschub im Prozeßverlauf Auslastungen, die das Bruttovolumen übersteigen. Anforderungen an eine erhöhte Verfahrensstabilität, Arbeitsorganisation und zusätzliche Behälterkapazität begleiten repeated fed-batch-Prozesse, deren typische Produktbildungsleistung 50-55 (kg/m3 * Monat) beträgt (UdSSR, CSSR, VRP, Österreich, USA). Trotz offensichtlicher Vorteile für diese Verfahren mit ihren erweiterten Manipulationsmöglichkeiten ist damit noch kein Vorteil hinsichtlich der Prozeßökonomie zwangsläufig gegeben. Produktausbeute, dafür erforderliche Aufwendungen an Einsatzmaterialien, Energienjüid Betriebskosten müssen als Einheit gewertet werden. In diesem Lichte sind die Leistungsgrenzen und technologische Gestaltungsmöglichkeiten von fed-batch-Prozessen noch nicht erschöpft. Bei den in der Regel mehrstufig gestalteten Prozessen zur mikrowellen Produktbildung dienen die dem Produktbildungsabschnitt vorgelagerte·. Maßnahmen der Beraitstellung einer genügend großen Menge an mikrobiellem Produktbildner. Die Anzuchtstufen dienen gleichfalls der Ausprägung von Stoffwechseleigenschaften und vorteilhafter morphologischer Eigenschaften für die Prozeßführung. In diesem Maßnahmekomplex ist der ei ste durchgreifende Ansatz für verfahrensspezifische Gestaltungen zu suchen. Mit den spezifischen Maßnahmen zur Produktbildungsführung wird der Gestaltungsansatz fortgesetzt. Bisherige Prozeßauslegungen weisen bei der Produktbildungsführung folgende Mangel auf:
- Sie ermöglichen nur unzulänglich den Bezug auf den Entwicklungsstand der verfügbaren Biosynthesekapazität,
- Rückstände an verwertbaren Kohlenstoffquellen auo den Anzuchtphasen werden nicht definiert abgebaut,
- die Kontrolle des Substratverwertungsverhaltens fehlt,
- Verfahrensübertragungen in andere Reaktoren und in andere Reaktormaßstäbe werden nur unzureichend unterstützt,
- industrielle Fermentationen benutzen vorrangig komplexe Nährsubstratquellen mit Schwankungen in deren Zusammensetzung und daraus erwachsenden Anpassungsbedarf in der Prozeßführung - eine Seite, die bei Anwendung dor gegenwärtigen Führungsmaßnahmen nur mangelhafte Unterstützung erfährt,
- Prozeßanpassungen bei Nährstoffkomponenten- und/oder Zufütterungskomponentenaustausch sind unzureichend unterstützt.
Ziel der Erfindung ist es, mit einem fed-batch-Verfahren zur mikrowellen Penicillinproduktion bei Gewährleistung der Verfahrensökonomie und ohne Erhöhung des Anlagenaufwandes zur Penicillinproduktion die für diesen Prozeßtyp typische Produktausbeute entscheiden J zu erhöhen und die vorhandene Biosynthesekapazität der Reaktoren auszuschöpfen. Darüber hinaus gilt es:
- leistungsstarke, robuste mikrobielle Produktbildungsprozesse zu schaffen,
- die Reproduzier barkeit der Fermentationen und damit deren Ökonomie zu sichern,
- alle Formen von Prozeßanpassungen und -Umstellungen zu beschleunigen und unproduktive Materialaufwendungen zu reduzieren,
- variierende Auswirkungen der Prozeßvorgeschichte störungsausgleichend für die Produktbildung zu kompensieren,
- Reaktorgegebenheiten, Kulturlösungsbechaffenhelten und Verwertungscharakteristika der Produktbildner so in den Prozeßverlauf einzubeziehen, daß das Verfahren selbstanpassenden Charakter erhält und geeignet ist die Biosynthesepotenz der Produktbildungskultur auszuschöpfen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für die mikrobielle Herstellung von Penicillinen, insbesondere von Benzylpenicillin (Penicillin G), ebenfalls von Phenoxymethylpenicillin (Penicillin V) durch Kultivierung von mycelbildenden Penicillien nach dem fed batch-Prinzip leistungsstarke, ökonomische Herstellungsverfahren bereitzustellen, die das übliche Ertragsniveau von fed-batch-Verfahren wesentlich übertreffen, ohne den für den Verfahrenstyp benötigten apparativen und steuerungstechnischen Aufwand zu erhöhen. Überraschenderweise gelingt es- auf der Basis spezifischer Maßnahmen zur Stammselektion, spezifischer Maßnahmen zur Anzucht der erforderlichen Mengen an mikrowellen Maßnahmen zur Anzucht der erforderlichen Mengen an mikrobiellem Produktbildner bei Ausprägung spezifischer Stoffwechselcharakteristika und morphologischer Eigenschaften im Verlaufe der Anzucht und auf der Grundlage der prozeßgerecht komponierten Nährlösungen für die Anzuchtstufen und für den Produktbildungsabschnitt- mit Mitteln prozeßangepaßter Maßnahmen zur Substratzufütterung in der Produktbildungsphase -insbesondere das Kohlenstoffsubstrat betreffend - das fed-batch-Lelstungsvermögen so zu steigern, daß der Anschluß an das repeated fed-batch-Leistungsniveau erreicht wird
Erfindungsgemäß wird dazu folgende Vorgehensweise absolviert:
- die Stammselektion wird mit dem Ziel der Sensibiiisierung der Kohlenstoffsubstratverwertung (Glukose, Disaccharide) betrieben, vorteilhafterweise werden dazu Effektoren in Form von B-Vitaminen eingesetzt (B1, B12), so daß stabile Ertragskoeffizienten Vx/, und yp/, und stabile Führbarkeitsgrundlagen zur Kohlenstoffsubstratführung im Produktbildungsablauf verfügbar sind,
- die selektierten Penicillinstämme erfüllen die Kriterien:
• Stammpotenz > 25000 (ΙΕ/ml) bei 168 (h) Kultivierungsdauer
• Kohlenstoffsubstratumsatz maximal 10 (kgSub,u,,/kgP,oduk,)
• Scherkraftverträglichkeit bis zu einem Leistungseintrag von 3,5 (kW/m3)
• Viskositätswerte unter 200 (mPa * s), als rheologische Anforderung an die Mycelmorphologie
• Sensibilität der Mycelmorphologie gegenüber Kohlenstoffsubstratdosierung, gegenüber allen darin enthaltenen Komponenten bei der submersen Kultivierung
• spezifische Stammarker mit Identifizierungsfunktion für die Biosynthesepotenzprüfung im Labormaßstab - Deponieresistenz gegenüber Stickstoff-, Kohlenstoff- und Phosphorsubstraten
• Dereprimierungskonzentration von Phosphatphosphor für die die Phosphatasen < 30 (rngpcMp/Ixuiturieiung)
- Standardisierung der Anzuchten durch Zustandskontrolle über physiologisch indizierte Reifekriterien auf der Grundlage von Anlagenmeßgrößen mit dem Kontrollziel, die erforderliche Reihenfolge von Substratlimitationen und die Aktivierung spezifischer Enzyme im Anzuchtverlauf zu garantieren (DD258623A1, Verfahren zur Herstellung von Impf kulturen bei Antibiotikafermentationen).Pfe primäre Wachstumsphase des Produktbildungsfermentors erfolgt in Form einer pH-Profilfermentation mit folgenden Prüfkriterien und Maßnahmen:
• Kontrolle der Nährlösung durch die pH-Abfallgeschwindigkeit
• Kontrolle der Dereprimierungskonzentration der Phosphatasen durch Beobachtung der POvP-Limitation und der Phosphataseinduktion mit Hilfe der Beobachtungsgröße pH (WPC 12Q /313354.4, Verfahren zur dynamischen Quantifizierung und Steuerung der Phosphataufnahme bei produktbildenden Pilzen) und wahlweise Einbindung von Phosphörzudosierung, die durch das pH-Profil geführt wird (WPC 12Q /313354.4)
• Beendigung der primären Wachstumsphasn nach vollständigem Eintritt in die Glukose- und Fruktoselimitation, als Beobachtungskriterium gilt dafür „beständig ansteigender pH-Verlauf"
- Nährlösungspräparation mit dem Ziel, bei den eingesetzten Erdnuß- oder Sojaschroten die Körnung zu eliminieren und den Fraktionierungsgrad der Stickstoffanteile prozeßgerecht einzurichten (... Verfahren zur Präparation von Penicillinnährlösungen) und separierte Phosphorbilanzierungen für die Anzuchtkulturen und die Produktbildungskultur infolge der Mediumspräparation mit Proteasen
- Behandlung der Produktbildungskultur mit Maßnahmen zur Stimulierung der Verwertungsaktivität für die dimeren oder oligomeren Kohlenstoffsubstrate der Zudosierungen während der Produktbildung (... Verfahren zur Stimulierung der Verwertungsaktivität für Zufütterungssubstrate bei mikrowellen Produktbildungen) im Anschluß an die primären Wachstumsphase zur Ausbildung der enzymatischen Verwortungsbestandteile in der Kultur
- Behandlung der Produktbildungskultur mit Maßnahmen zur Inbetriebnahme der kohlenstoffsubstratgeführten Produktbildung (... Verfahren zur Inbetriebnahme kohlenstoffsubstratgeführter mikrobieller Produktbildungen) im Anschluß an die Stimulierungsphaso zur Bereitstellung prozeßgarechter Anfangsbedingungen für verwertbare C-Substrate im
- Durchführung der mikrowellen Produktbildung mit biosynthesekapazitätsbezogener Führung der Substratzufütterungen und
und der prozeßspezifischen Erfordernisse für pH-Bereich und Substratkonzentrationen im Kulturmedium; dabei sind diefolgenden Anforderungen maßgebend:
• Primat hat die Produktbildungsführung, die auf die prozeßspezifisch angepaßte Ausschöpfung der verfügbaren Verwertungskapazität ausgerichtet ist (... Verfahren zur Nachführung von Kohlenstoffsubstratdosierungen bei mikrowellen Zufütterungsverfahren-angepeßt an die verfügbare Biosynthesekapazität im Prozeßverlauf/WP C12 Q/2781566, Verfahren zur Ermittlung des Prozeßzustandes bei Fermentationsprozessen nach dem fed-batch-Prinzip unter Substratlimitation), wobei die Verwertungsdauer von Substratimpulsen vorzugsweise aus als Beobachtorgrößen fungierenden Anlagenmeßstellen bestimmt wird, das Verhältnis von nachgeführter Dosierrate zum ermittelten oder zum prognostizierten Verwertungsvermögen stets einen Wert unter 1 einhält, konstant gewählt wird oder eine prozeßaltergerechte Anpassung dergestalt erfährt, daß wachsenden Substrataufwendungen zur Produkterzeugung durch Verhältnisverringerungen begegnet wird, und die Sauerstoffversorgungsführung auf der Grundlage der Rührgeschwindigkeits- und der Belüftungsnachführung bei gesicherter Limitationsfreiheit in der Versorgung energiegünstig ausgerichtet wird und außer der Zuführung der Reagenzien zur pH-Korrektur und Schaumbekämpfung, die nach aktuellen Einschätzungs- oder Meßresultaten erfolgen, erfolgen die Zufütterungen in festen Mengonproportionen Kohlenstoffzufütterung unter Einhaltung der für die Substrate zulässigen Konzentrt'ionsbereiche in der Kulturlösung
« in Prozeßphasen droherden Versorgungsversagens in der Sauerstoffzuführung wird die Kohlenstoffsubstra'tzufütterung mit Hilfe prozeßzustandsgercschter Maßnahmen zur Zufütterungsreduzierung geführt (... Verfahren zur Kohlenstoffsubstratnachführung bei mikrobiellen Zufütterungsverfahren), wobei die Sauerstoffversorgungseinschätzung mindestens die pO2-Anlagenmeßdaten einschließt und die Zufütterung der weiteren Substrate vorzugsweise durch Konzentrationsanalysen der Kulturlösung geführt wird.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Verfahren zur Durchführung einer fed batch-Hochleistungsfermentation für die Produktion von Penicillin G demonstriert. Ausgangspunkt ist das Sediment einer Lyophylkonserve mit einer Hochleistungsselektante von Penicillium chrysogenum, die folgenden Anforderungen genügt:
• Stammpotenz > 25000 (ΙΕ/ml) bei 168 (h) Kultivierungsdauer
• Kohlenstoffsubstratumsatz maximal 10(kgSut»uit/kgprodukt)
• Scherkraftver.räglichkeit bis zu einem Leistungseintrag von 3,5 (kW/m3)
• Viskositätswerte unter 200 (mPa * s), als Theologische Anforderung an die Mycelmorphologie
• Sensibilität der Mycelmorphologie gegenüber Kohlenstoffsubstratdosierung, gegenüber allen darin enthaltenen Komponenten bei der submersen Kultivierung
• spezifische Stammarker mit Identifizierungsfunktion für die Biosynthesepotenzprüfung im Labormaßstab - Deponieresistenz gegenüber Stickstoff-, Kohlenstoff- und Phosphorsubstraten
« Dereprimierungskonzentration von Phosphatphosphor für die die Phosphatasen <30 (mgpO4.p/lKuihiris»ung)
8 bis 10 Tage lang bei 250C inkubiert. Das Medium enthält pro Liter folgende Substanzen:
zusetzen), Sterilisation 20min bei 1200C, 6,4 S pHnaChstaiiiiuUon S 6,6, zusätzlich kann Coffein 0,5mg/ml enthalten sein.
250C inkubiert. Diese Kulturen werden in bekannter Form Laborleistungstests mit Streßmedien unterzogen, die hohe
s~30000IE/ml bei 192h Kultivierungsdauer) wird die nächste Eprouvettenkultur mit dem oben beschriebenen Medium eröffnet.
4ml Konidiensuspension einer 10ml Eprouvettenabschwemmung, 30h bei 250C auf einer Rotationsschüttelmaschine kultiviert,angelegt. Das Vorkulturmedium enthält pro Liter folgende Substanzen:
6.3 S pHV0,Su pHnfchSL S 6,5. Nach 30h Kultivierung werden 6ml Kultur mit 8ml sterilem Aquadest gemischt und 7 ml der Mischung zur Beimpfung einer Gerste- oder Reiskultur (50g/500 ml Erlenmeyerkolben mit 7 ml, 150g/11 Erlenmeyerkoiben mit 12 ml zu beimpfen) verwendet.
Die Produktbildneranzucht wird mit einer Vorimpffermentation gestartet. Der 751(1 m3)-Vorimpftankwird mit 50l(0,6m3) Nährmedium gefüllt, das mit 0,3gv„r,portef Reiikuituf/lMedium beimpft wird. Es erfolgt eine pH-Profilfermentation mit streng korrelierter Reihenfolge der Substratlimitationen (NH4-N -» Glukose, PO4-P -> Fruktose in Gegenwart von nichtlimitierendem NO3-N) mit den Charakteristika:
6.4 S pHs,a(t S 6,8 (NH4-N-Limitation),
5.5 S pHMlr.imum S 6,0, mit einer pH-Abfallgeschwind'gkeit zwischen 0,08h"1 und 0,09h"', 6,8 S pHEnde S 7,0 (Glukose-, PO4-P-Limitation),
Fruktoselimitation bei pH = 7,4 (wird aber nicht durchlaufen) und nachfolgendem Anstieg der proteolytischen Aktivität, mit einem Wert größer als 0,05TE (μηιο!/[ιπΙ * min)).
bis 400min'1 eingestellt, ate Kultivierungsdauer sind 18 h bis 22 h erforderlich, bei pHEnd„ ist das Kultivierungsende erreicht undes erfolgt die Beimpfung des Produktbildungsfermentors.
werden 76kg partikuläres N-Substrat in 1 m3 Leitungswasser (A40g/lMi<J|um) nach einer pH-Wert-Einstellung von pH = 8,01 h bei1000C vorgekocht. Die Abkühlung auf 450C ist der pH-Wert pH = 7,5. Es erfolgt die Zugabe von 1kg Brauereienzym, das in 5I25"C-temperiertem Leitungswasser gelöst wurde. Die Enzymbehandlung hat eine Dauer von 4 h, erfordert eine Temperatur im
ammoniakalische Phenylessigsäure 0,5g.
7,3 S pHnichSL — 7,5.
pHsurt = 7,5,
12. bis 13. Fermentationsstunde: pH-Abfallgeschwindigkeit mit Werten zwischen 0,16h"1 und 0,19h"1,pHMinimum = 6,0 (Glukoselimitation, durchläuft zuvor die Dereprimierungskonzentration von Phosphatphosphor für die
nach der Glukose-, spätestens nach der Fruktoselimitation wird die primäre Wachstumsphase beendet.
stimuliert. Die Maßnahmen werden bei einem pH-Niveau von 6,8 bis 7,0 (etwa zur 24. Fermentationsstunde) beendet.
werden 4l-Saccharose(45%)-lmpulse verwendet. Der Verlauf der Verwertungsint^nsität bei der vollständigen Impulsverwertungwird mit den Sollvorgaben, 2 Verwertungsphasen mit gleichlangen Phasendauern bei ±10% Toleranz, verglichen. Solange die
beobachteten Sollverhalten in der Verwertung wird die Inbetriebnahme beendet.
prozeßspezifisch angepaßte Ausschöpfung der verfügbaren Verwertungskapazität ausgerichtet. Die Nachführung der
pO2 und Sauerstoffverbrauch, Kohlendioxydbildung. Zur Dosierungsnachführung wird zunächst die laufende
verwertbarem Kohlenstoff aus der Kulturlösung aufgebraucht. Die Anzeige des Verwertur.gsendes durch beständig fallende
ausreichende Genauigkeit und Sicherheit bei 15minüt!ger Kontrolle der Tendenzstabilität.
eingestellt. Dazu wird die automatische pO2-Drehzahl-Regelung, die zur automatischen Sauerstoffversorgung der Kultur mitpO2-Sollwerten über 20% eingesetzt wird, ohne Drehzahlveränderung auf Konstantbetrieb gestellt. Dosierungsnachführungenwerden in Abständen von 6 bis 24Stunden vorge, ,ommen. Die dabei verwendeten Saccharoseimpulse (45%) enthalten
der Substratimpulse benötigten Dosierzeiten bleiben unter 3Minuten. Das Verwertungsende- in der beschriebenen Formbeobachtet-wird nach Verwertungszeiten von höchstens 2 Stunden erreicht. Für alle Ratennachführungen in der
„impulsdosierte Substratmenge" zur „Verwertungsdauer" charakterisiert ist. Nach abgeschlossenen
| Fermentations | bisherige | Saccharose | Verw.- | nachgeführte |
| alter | Rate | impuls | vermögen | Rate |
| (h) | (l/h) | (I) | (l/h) | (l/h) |
| 28 | 1 | 6 | 4 | 3,0 |
| 36 | 2 | 6 | 5 | 4,0 |
| 65 | 3,5 | 10 | 7 | 5,5 |
| 90 | 4,2 | 12 | S | 7,0 |
pH-Führung erfolgt mit dem Sollwert 6,0, automatisch ausgeregelt durch Dosierunger, von Ammoniak (25%),
zulässiger Konzentrationsbereich für Phenylessigsäure
0,5g/l bis 1,6g/l mit prozeßbegleitender analytischer Kontrolle, zulässiger Konzentrationsbereich für NH4-N
0,2 g/l bis 0,4g/l mit prozeßbegleitender analytischer Kontrolle, die Zudosierungen von Phenylessigsäure und (NH4IiSO4 werdenunter Beachtung der Konzentrationsrestriktionen in festen Mengenrelationen zur dosierten Saccharose vorgenommen,
vorrangig in Form von diskontinuierlichen Zugaben in den Proportionen
1s«cch/1pES = 5, 1Si«h/iAmmon»ullil =15,
spezifischen Ertrag über40kg/(m3 * Monat) entspricht.
erforderlich. Diese Herangehensweise erfolgte lediglich aus Überslchtlichkeitsgründen für die Fermentationsdemonstration undmacht dieses Führungswerkzeug nicht etwa überflüssig.
und N-Substraten ist der Wert 5g/l (ein derartiges Verfahren kommt hier nicht zum Einsatz),
vereinfachtes Precursordosierregime, im Produktbildungsmedium wird eine Phenoxyessigsäurestartkonzentration von 6g/l bis8g/l eingestellt, wobei die Phenoxyessigsäure als gelöstes Kaliumsalz zugeführt wird (1 Okg Phenoxyessigsäure und 3,02 kg KOHin 1501 Wasser gelöst),
zulässiger Konzentrationsbereich für Phenoxyessigsäure 2 g/l bis 11 g/l mit prozeßbagleitender analytischer Kontrolle, die
dosierten Saccharose vorgenommen, vorrangig in Form von diskontinuierlichen Zugaben.
Claims (3)
1. Hochleistungsverfahren zur Herstellung von Penicillinen unter fedbatch-Bedingungen, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Stammselektion durchgeführt wird, wozu Effektoren in der Form von B-Vitaminen und Coffein eingesetzt werden und die selektierten Penicillinstämme die Kriterien:
- Stammpotenz >25000 (ΙΕ/ml) bei 168 (h) Kultivierungsdauer im Laborleistungstest
- Kohlenstoffsubstratumsatz maximal 10(kgsub«trat/kgprOdukt)
- Scherkraftverträglichkeit bis zu einem Leistungseintrag von 3,5 (kW/m3)
- Viskositätswerte unter 200 (mPa * s), als Theologische Anforderung an die Mycelmorphologie
- Sensibilität der Mycelmorphologie gegenüber Kohlenstoffsubstratdosierung, gegenüber allen darin enthaltenen Komponenten bei der submersen Kultivierung
- spezifische Stammarker mit Identifizierungsfunktion für die Biosynthesepotenzprüfung im Labormaßstab-Deponieresistenz gegenüber Stickstoff-, Kohlenstoff-und Phosphorsubstraten
- Dereprimierungskonzentration von Phosphatphosphor für die die Phosphatasen <30(mgPO4.p/
* Kulturlösung/
erfüllen müssen,
daß die Standardisierung der Anzuchten durch Zustandskontrolle über physiologisch indizierte Reifekriterien auf der Grundlage von Anlagenmeßgrößen erfolgt, daß die primäre Wachstumsphase des Produktbildungsfermentors in Form einer pH-Profilfermentation mit folgenden Prüfkriterien und Maßnahmen:
- Kontrolle der Nährlösung durch die pH-Abfallgeschwindigkeit
- Kontrolle der Dereprimierungskonzentration der Phosphatasen durch Beobachtung der ΡΟΛ-Ρ-Limitation und der Phosphataseinduktion mit Hilfe der Beobachtungsgröße pH und wahlweise Einbindung von Phosphorzudosierung, die durch das pH-Profil geführt wird
- Beendigung der primären Wachstumsphase nach vollständigem Eintritt in die Glukose- und Fruktoselimitation
durchgeführt wird,
daß die Nährlösungspräparation durch Eliminierung der Körnung bei den eingesetzten Erdnußoder Sojaschroten und Einrichtung des Fraktionierungssgrades der Stickstoffanteile erfolgt, daß bei der Produktbildungskultur die Verwertungsaktivität für die dimeren oder oligomeren Kohlenitoffsubstrate der Zudosierungen während der Produktbildung stimuliert wird, daß bei der Produktbildungskultur Saccharose als C-Zufütterungssubstrat und als Substrat für die Impulszugaben bei der Steuerung des Beginns der Produktbildung eingesetzt wird, wobei das Sollverhalten der Impulsverwertung durch Anzahl und Dauer der Verwertungsphasen charakterisiert ist und
daß bei der Produktbildung die Führung der Substratzufütterungen biosynthesekapazitätsbezogen durchgeführt wird, in allen Prozeßphasen eine unlimitierte Sauerstoffversorgung erfolgt und die prozeßspezifischen Erfordernisse für Fermentationstemperatur, für pH-Bereich und Substratkonzentrationen im Kulturmedium erfüllt werden, wobei die Produktbildungsführung auf die Ausschöpfung deryerfügbaren Verwertungskapazität ausgerichtet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwertungsdauer der Substratimpulse aus Anlagenmeßstellen, die als Beobachtergrößen fungieren, bestimmt wird und daß das Verhältnis von nachgeführter Dosierrate zum ermittelten oder zum prognostizierten Verwertungsvermögen stets einen Wert unter 1 besitzt und konstant gewählt wird oder eine Anpassung erfährt, 'ndem wachsenden Substrataufwendungen 2ur Produkterzeugung mit Verhältnisverringerungen begegnet wird, und die Sauerstoffversorgungsführung auf der Grundlage der Rührgeschwindigkeits- und der Belüftungsnachführung bei gesicherter Limitationsfreiheit in der Versorgung ausgerichtet wird und außer der Zuführung der Reagenzien zur pH-Korrektur und Schaumbekämpfung, die nach aktuellen Einschätzungs- oder Meßresultaten erfolgen, die Zufütterungen in festen Mengenproportionen zur Kohlenstoffzufütterung unter Einhaltung der für die Substrate zulässigen Konzentrationsbereiche in der Kulturlösung durchgeführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Prozeßphasen drohenden Versorgungsversagens in der Sauerstoffzuführung die Kohlenstoffsubstratzufütterung mit Hilfe von Maßnahmen zur Zufütterungsreduzierung geführt wird, wobei die Sauerstoffversorgungseinschätzung mindestens die pO2-Anlagenmeßdaten einschließt und die Zufütterung der weiteren Substrate durch Konzentrationsanalysen der Kulturlösung geführt wird.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD32396488A DD298280A5 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Hochleistungsverfahren zur herstellung von penicillinen unter fed-batch-bedingungen |
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| DD32396488A DD298280A5 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Hochleistungsverfahren zur herstellung von penicillinen unter fed-batch-bedingungen |
Publications (1)
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ID=5605721
Family Applications (1)
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| DD32396488A DD298280A5 (de) | 1988-12-27 | 1988-12-27 | Hochleistungsverfahren zur herstellung von penicillinen unter fed-batch-bedingungen |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010115838A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Fermentation process |
-
1988
- 1988-12-27 DD DD32396488A patent/DD298280A5/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010115838A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Fermentation process |
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