DD298427A5

DD298427A5 - Verfahren zur herstellung von 3-methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-aza-anthrachinon-(9,10)

Info

Publication number: DD298427A5
Application number: DD33399389A
Authority: DD
Inventors: Udo Graefe; Ernst-Joachim Bormann; Wolfgang Ihn; Guenther Reinhardt; Brigitte Schlegel; Dieter Tresselt; Klausjuergen Dornberger; Wolf-Ruediger Rudat; Matthias Olbrich
Original assignee: Zentralinstitut F. Mikrobiologie Und Experimentelle Therapie,De; Arzneimittelwerk Dresden Gmbh,De
Priority date: 1989-10-30
Filing date: 1989-10-30
Publication date: 1992-02-20

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines neuen Aza-anthrachinons, welches im Detail die Struktur eines * aufweist. Die mit der Zielstellung, diesen als Tolypocladin bezeichneten neuen Metaboliten in effektiver Weise herzustellen, verbundene Aufgabe wird geloest, indem in der biologischen Prozeszstufe ein Cyclosporin A-bildender pilzlicher Mikroorganismus, vorzugsweise ein Stamm aus den Arten Tolypocladium inflatum bzw. Sesquicilliopsis rosariensis, unter sterilen Bedingungen in aerober Submersfermentation kultiviert wird. Der genannte Metabolit wird anschlieszend aus dem hierbei erhaltenen Myzel oder aus Myzelrueckstaenden mit heiszem Wasser oder mit polaren organischen Loesungsmitteln bei sauren p H-Werten extrahiert und nach Einengen des Loesungsmittels in nahezu reiner Form gewonnen. Zur Feinreinigung kann gegebenenfalls ein uebliches chromatographisches Verfahren angeschlossen werden. Fuer Tolypocladin wurde in ausgewaehlten In-vitro-Testsystemen eine inhibierende Wirkung auf Krebszellkulturen aufgefunden.{neues Aza-anthrachinon; * Bezeichnung Tolypocladin; pilzliche Produktionsorganismen Tolypocladium inflatum und Sesquicilliopsis rosariensis; Cyclosporin A-Bildner; aerobe Submersfermentation}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung eines neuen Metaboliten mit 2-Aza-anthrachinon-Grundstrukuir, die mit der anwesenden p-Chinongruppierung einen starken Chromophor enthält.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.

-2- 298 Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Diverse Pilze bilden unter bestimmten Kulturbedingungen und in Abhängigkeit von der Nährbodenzusammensetzung chinoide farbige Substanzen, die dem Strukturtyp der o- und p-Chinone, Naphthochinone, Anthrachinone und anderen Polyketido angehören (Turner, B., Fungal Metabolites, Vol.11, Academic Press, 1983). Neben carbozyklischen Strukturen wurden auch heterozyklische Chinone aufgefunden, die sich ebenso wie die carbozyklischen Vertreter durch chromogene Eigenschaften auszeichnen (Thomson, R.H., Naturally occurring quinones, Academic Press, New York, 1971). Eine Reihe von natürlich vorkommenden chinoiden Verbindungen besitzt vorteilhafte biologische Eigenschaften aufgrund ihrer Reduzierbarkeit durch Atmungskettenenzyme lebender Zellen oder DNA-Interkalation, die sie zur Anwendung als Antineoplastika als geeignet erscheinen lassen. p-Chinoide Verbindungen vom Typ der Anthracyclina sind so z. B. in der Therapie von Krebserkrankungen in Anwendung. Aufgrund vielfältiger Nebenwirkungen (Cardiotoxizitat, Alopezie, Nausea, Immunsuppression u.a.) ist weiterhin die Suche nach besser wirksamen Derivaten und neuen Kanzerostatika von Interesse. Durch chemosynthetische Abwandlung von natürlichen Grundstrukturen und durch Partialsynthesen, ausgehend von natürlichen Grundkörpern, können wirkungsoptimierte Heilmittel hergestellt werden.

Isochinolinstrukturen sind bisher als Bestandteil pflanzlicher Sekundärmetabolite vom Typ der Alkaloide festgestellt worden (K.Motheset al. Biochemistry of Alkoloids, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin, 1986). 2-Aza-anthraciiinone (Benzo-Isochinolindione) aus Pilzen oder prokaryotischen Mikroorganismen wurden bisher jedoch noch nicht beschrieben.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, den neuen pilzlichen Metaboliten 3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-aza-anthrachinon-(9,10) in effektiver Weise herzustellen, um die Palette der potentiell als Kanzerostatika direkt oder nach chemischer Modifikation einsetzbaren Wirkstoffe um einen neuen Grundtyp zu bereichern.

Darleguno des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, das die

fermentative Herstellung eines neuen pilzlichen Metaboliten aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten

Ausbeuten ermöglicht. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug gelöst, indem ein pilzlicher Cyclosporin Α-bildender Mikroorganismus

aerob bei einer Temperatur zwischen 2O⁰C und 37 ⁰C kultiviert wird. Aus dem während dsr Kultivierung c rhaltenen My^oIund/oder aus nach der Cyclosporin A-Abcrennung vorliegenden Rückstands- bzw. Hilfsprodukten wird der neue Metabolit3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-aza-anthrachinon-(9,10), dem im weiteren die Bezeichnung Tolypocladin gegeben wird, dannunter sauren Bedingungen mit Wasser bzw. mit polaren organischen Lösungsmitteln extrahiert.

In seiner weiteren Ausgestaltung ist das Verfahren in der mikrobiologischen Prozeßstufe wie folgt gekennzeichnet: Die Kultivierung erfolgt in steriler submerser Fermentation, wobei zur Anzucht Myzel-Areale von Oberflächenkulturen von Cyclosporin Α-bildenden Pilzstämmen der Species Tolypocladlum Inflatum, vorzugsweise vom Stamm T. Inflatum Wb 6-5, oder

der Species Sesqulcllliopsls rosarlensls, vorzugsweise von Stamm S. rosarlensls F 605, eingesetzt werden. Biologisch reine

Proben der beiden voranstehend explizit genannten Pilzstämme sind im Zusammenhang mit früheren Patentanmeldungen der Ursprungsbetriebe in der Hinterlegungsstelle für Mikrooiganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und

experimentelle Therapie der AdW, Beutenbergstr.11, Jena, DDR - 6900 unter den Registrierzeichen

IMET43899 für Stamm Tolyprucladlum inflatum Wb 6-5 sowie

IMET 43887 für Stamm Sesnuicilliopis rosariensis F 605

deponierte rden.

Das Fermentationsmedium besteht aus Kohlenstoff- und aus Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Bevorzugt wird

zur Kultivierung ein flüssiges Näht medium eingesetzt, welches als einzige Stickstoffquelle Ammoniumsalze, vorzugsweise

Ammoniumsulfat und/oder Diammoniumhydrogenphosphat, enthält. Die Kultivierung der yerfahrensgemäß einzusetzenden Stämme erfolgt in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedener Volumina, in Glasfermentoren mit Rührwerk bzw. in V2A-Stahltanks. Die in den Anzuchtstufen erhaltene Biomasse von T.lnflatum-Stämmen wird in der Hauptkultur unter aeroben

und sterilen Bedingungen bei 25⁰C bis 32⁰C, vorzugsweise bis 27⁰C, in einem Ammoniumsalz-Nährmedium obiger

Kennzeichnung bei einer Azidität zwischen pH 4,0 und pH 7,0 für die Dauer von 3 Tagen bis 8 Tagen fermentiert. Die nach den Anzuchtstufen verfügbare Biomasse von S. rosarlensis-Stämmen wird in der Hauptkultur hingegen unter aeroben

und sterilen Bedingungen bei 25°C bis 35⁰C in einem Ammoniumsalz-Nährmedium obiger Kennzeichnung gleichfalls bei einer

Azidität zwischen pH 4,0 und pH 7,0 tür die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen fermentiert. Für die weitere Ausgestaltung des Gesamtverfahrens ist nun ferner kennzeichnend, daß in seiner Aufarbeitungsstufe die Gewinnung des Tolypocladins in mehreren, sich fallweise ergänzenden Varianten erfolgen kann, nämlich unter sauren Bedingungen entweder

a) durch Extraktion des frischen Myzels, vorzugsweise des frischen Feuchtmyzels,

b) durch Extraktion von Myzelrückständen, wie sie nach einer Abtrennung des Cyclosporir,-A vorliegen, bzw.

c) durch Extraktion von solchen chromatographischen Trägermaterialien, welche wie vorzugsweise Aluminiumoxid zur Reinigung von Roh-Cyclosporin A eingesetzt worden sind.

Die Extraktion wird in jeder dieser Varianten uei pH 1,0 bis pH 4,0, vorzugsweise bei pH 1,0 bis pH 2,0,

mit oxalsaurem heißem Wasser, Aceton oder Methanol (Oxalsäure-Zusatz jeweils 2%) bzw. mit salzsäure™ Methanol bzw. Dimethylformamid

ausgeführt. Durch Reextraktion des wäßrigen Extraktes bzw. des eingeengten Rückstandes der Extraktion mit organischen

Lösungsmitteln wie CHCI₃ und/oder n-Butanol und anschließende Konzentration des Extraktes kann der o.g. neue Metabolit

zusammen mit geringen Anteilen ähnlicher Verbindungen (Kongenoren) gewonnen werden.

Mittels Chromatographie an oxalsaurem Silicagel sowie an organophilen Dextrangelen kann Tolypocladin in reiner Form

gewonnen werden, d. h. die erwähnten kleinen Mengen an Nebenprodukten mit geringerer Polarität, die in wechselnder

Quantität in Abhängigkeit von der gegebenen Fermentation gebildet werden und die nach ihren Elektronenspektren und ihrem

pH-Verhalten eine ähnliche Struktur wie 3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-aza-anthrachinon-(9,10) aufweisen, werden auf diese

Weise vollständig abgetrennt. Die chemische Identität des neuen Metaboliten wird durch in Tabelle 1 gezeigte physikochemische Parameter belegt. Die in Abb. 1 angegebene Struktur der neuen Verbindung 3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-aza-anthrachinon-(9,10) wird ferner durch die Ergebnisse der NMR-spektroskopischen Untersuchungen (Varian XL-400,400MHz bzw. 100MHz für ¹H bzw. ¹³C NMR-Spektren)

gesichert.

Das in Abb. 2 gezeigte 400-MHz-Protonenspektrum beweist die Anwesenheit von drei aromatischen nichtgekoppelten Protonen

(6,7647ppm; 7,8681 ppm; 9,2183ppm), einer N-CH₃-Gruppe (2,7227ppm) sowie den OH-Gruppen (13,27ppm; 12,0ppm;

Das 100-MHz-¹³C-Spektrum (Abb.3) zeigt die Anwesenheit von zwei Carbonylgruppen, 11 aromatischen sp²-Hybridisierten Kohlenstoffatomen und einer am heterologen aromatischen Ring gebundenen Methylgruppe. Mit den angegebenen physikochemisel· ~> Daten wird die Struktur der neuen Verbindung, wie in Abb. 1 dargestellt, hinreichend

determiniert. (Die exakte Lokalisation der OH-Gruppe und des Protons an den Positionen 6 und 7 zu beschreiben, ist mit deneingesetzten Hilfsmitteln der Strukturaufklärung noch nicht möglich).

Für Tolypocladin ist in ausgewählten In-vitro-Testsystemen eine inhibierende Wirkung auf Krebszellkulturen, z. B. auf L 1210-Zellen, aufgefunden worden. Ausführungsbeispiele Beispiel 1

1.1. 1 bis 2cm² große Agarstücke aus Einzelkolonien von Oberflächenkulturen des Stammes Tolypocladlum inflatum Wb 6/5 dienen zur Beimpfung eines Vorzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l) in 500-ml-Erlenmeyerkolben (80ml Inhalt, 25°C, Rotationsschüttler, 150UpM; 4 Tage Kultivierungszeit): (NH₄I₂SO₄ 7; (NH^)₈HPO₄ 2; MgSO₄ · 7H₂O 0,5; ZnSO₄ 0,008; Glucose 100; CaCO₃; pH 5,3 bis pH 5,7.

Die zweite Vorzucht wird auf dem gleichen Medium in 5-l-Flaschen mit 4 JO ml Inhalt durchgeführt (72 Stunden, 25°C, Rotationsschüttler, 150 UpM). Für die Maßstabvergrößerung auf 2Ol und die Hauptkultur in 500-l-Fermentoren wird ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet (g/l): Glucose 80; (NH₄I₂HPO₄ 2; (NH₄I₂SO₄ 5; MgSO₄ · 7H₂O 0,5; ZnSO₄ 7H₂O 0,008; CaCO₃ 5,1; Aqua dest. ad 1 i; pH 5,3 bis 5,9; Sterilisation 30 Minuten, 120°C. Die Hauptkultur wird in 500-I-V2A-Tankfermentoren für die Dauer von 7 Tagen bei einer Temperatur von 25⁰C bis 27⁰C

durchgeführt (Belüftungsrate: 0,25:1 [v/v]; Rührerdrehzahl; 300UpM). Die Schaumkontrolle wird mit sterilem Maiskeimölvorgenommen.

1.2. Das Myzel aus 450I Kulturlösung wird durch Drehzellenfiltration geerntet und in 400I Wasser (pH 2,0) res'jspendiert und 30 Minuten auf 9O⁰C erhitzt. Anschließend wird die extrahierte Biomasse durch Drehzellenfiltration abgetrennt und verworfen. Die saure, wäßrige, rote Lösung wird 2mal mit 0,1 Volumina Butylacetat extrahiert. Der eingeengte Extrakt mit organischen Lösungsmitteln wird in 2 Liter Chloroform aufgenommen und 2mal mit 1 Liter 0,1 M Na₂CO₃-Lösung in H₂O gewaschen. Dabei geht der Metabolit als violettes Natriumsalz in die wäßrige Lösung. Die wäßrige Phase wird filtriert und mit Oxalsäure auf pH 4 eingestellt. Dann wird die wäßrige Phase 3mal mit CHCI₃ im Verhältnis 1:1 (wäßrige Phase:CHCI₃) extrahiert. Der CHCI₃-Extrakt wird auf 100ml eingeengt. Dabei fällt der Metabolit als rotbraunes amorphes Pulver in mind. 90%iger Reinheit aus (Ausbeute 2g/4501 Fermentationslösung). Eine weitere Reinigung wird dadurch erreicht, daß das Pulver 2mal mit Wasser (100ml) und 2mal mit Petrolether (3O⁰C bis 5O⁰C, 100ml) gewaschen und getrocknet wird. Für eine gegebenenfalls wünschenswerte Feinreinigung des neuen Metaboliten 3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-azaanthrachinon-(9,10) wird abschließend eines der nachfolgenden chromatographischon Teilverfahren herangezogen:

- Chromatographie an Kieselgel (0,063 bis 0,2mm), suspendiert in Aceton/CHCI₃ (2:1, v/v) mit 1 % Oxalsäure. Dabei erscheinen zuerst farbige Kongenoren, anschließend 3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-azaanthrachinon-(9,10). Die den Metaboliten enthaltenden Fraktionen werden eingeengt und die Oxalsäure durch Verteilung zwischen CHCI₃- und Wasserphase entfernt.

- Chromatographie an organophilen Dextrangelen mit 0,05% Oxalsäure und Methanol. Dabei können höhermolekulare braune, Eisenkomplex-bildende Verbindungen gegebenenfalls als Vorlauf abgetrennt werden.

- Feinreinigung des Natriumsalzes curch Gelchromatographie sn hydrophilen Dextrangelen (Typ G-10, Molselekt, Sephadex u.a.). Dazu wird der Metabolit (25mg) in der minimalen Menge an Na₂CO₃-Lösung aufgenommen, auf eine Säule 40cm χ 1 cm aufgegeben und mit Wasser eluiert. Die violetten, den Metaboliten enthaltenden Fraktionen werden mit HCI auf ρ H 1,0 angesäuert und mehrfach mit CHCI₃ extrahiert. Nach dem Einengen des Lösungsmittels wird der Metabolit in reiner Form gewonnen.

Beispiel 2

Die biologische Prozeßstufe wird ausgeführt wie in Beispiel 1. Anschließend wird durch Separation das gewachsene Myzel geerntet und aus diesem Feuchtmyzel in an sich bekannter Weise der Wirkstoff Cyclosporin A isoliert. Aus den hierbei anfallenden Myzelrückständen wird durch Extraktion mit 2% Oxalsäurelösung in Aceton oder Methanol eine den Metaboliten enthaltende Rohlösung gewonnen. Nach dem Einengen zur Trockne wird der Metabolit mit 0,1 N Na₂CO₃ aufgenommen und Fettanteile durch Verteilung zwischen der CHCI₃- und Wasserphase entfernt. Die weitere Aufarbeitung des in der basischen wäßrigen Phase verbliebenen V aboliten erfolgt wie in Beispiel

Beispiel 3

Dio biologische Prozeßstufe und die Abtrennung des gewachsenen Myzels werden ausgeführt wie in Beispiel 1. Aus dem Myzel wird in ah sich bekannter Weise der Wirkstoff Cyclosporin A extrahiert sowie säulenchromatographisch abgetrennt (Trägermaterial Aluminiumoxid). Aus hierbei anfallenden stark gefärbten Teilen des Trägermaterials wird der Metabolit Tolypocladin entweder durch oxalsaures (2%) Aceton bzw. Methanol, durch salzsaures Methanol (1N HCI) oder durch Dimethylformamid (1 % HCI konz.) extrahiert; und aus dem Rückstand entsprechender eingeengter Extrakte wird die Zielsubstanz schließlich analog der in Beispielen 1 und 2 beschriebenen Methodik gewonnen.

Tabelle 1: Physikochemische und spektrale Eigenschaften von 3-Methyl-5,6(7),8-Trihydroxy-2-aza-anthrachirion-(9,10)

- Eigenschaften:

roter amorpher Feststoff

löslichin - 0,1 M Na₂CO₃ZH₂O; gut unter Farbumschlag nach violett - Aceton, Methanol, CHCI₃; mäßig

- unlöslich in Hexan oder Petrolether -Schmelzpunkt: ⁰C(unkorrigiert)

- Chromatographische Eigenschaften: Rf 0,25 (Silufol, Oxalsäure-imprägniert; AcBtOn-CHCI₃; 2:1; v/v)

- EI-Massensp6ktrum(Jeol JMS-D100):' Summenformel (MS):

C₁₄H₉NO₆(M⁺): m/z 271.0475gef.;271.0481 ber.fürC₁₄H₉NO₆ Charakteristische MS-Fragmentpeaks:

m/z 243(M⁺-CO); 228(M⁺-CO-CH₃); 215(M⁺-2CO); 201 (M⁺-C₃H₂O₂); 197(M⁺-2CO-H₂O); 169(M⁺-H₂O-3CO); 145(M⁺-C₃H₂O₄).

- IR-Spektrum:

\_m„ (in KBr; cm"¹): 630,645,690,705,740,755,760,790,805,810,850,925,950,1050,1120,1140,1170,1 210,1300,1360, 1405,1450,1455,1500,1 515,1535,1550,1575,1610, (chelatiaiertes Chinon), 2320,3000,3400, 3710,1810.

- UV/VIS-Spektrum:

a) freie Säure A_m,_x(inMeOH, nm):

535

500(ε = 3,5 · 10^ecm²/Mol)

460

330, < 250 starke Absorption

b) Natriumsalz X_n,,,,(in MeOH, nm):

550,525 (beide ε = 7,5cm²/Mol)

Λ20

290

c) Zn⁺⁺-Komplex >_mix(inMe0H,nm):

550,390,335,268, < 300 starke Absorption

d) Cu⁺⁺-Komplex A_mix(inMe0H,nm):

580,530, < 300 starke Absorption

e) Ni⁺⁺-Komplex A_m„(inMe0H,nm):

595,560,510,400,270, < 250 starke Absorption

f) Mn⁺⁺-Komplex A_mlx(inMe0H,nni):

550,390,330,268, < 245 starke Absorption

g) Ca⁺⁺-Komplex ^,„(inMeOH.nm):

605,575,530,380,280, < 245 starke Absorption

h) Mg⁺⁺-Komplex Ä_m,_x(inMe0H,nm):

590,550,510,380,280, < 245 starke Absorption

i) Fe⁺⁺-Komplex Ä_mex(inMe0H,nm):

630,480, < 370 starke Absorption

j) Fe⁺⁺⁺-Komplex X_m„(inMe0H,nm):

650, < 440 starke Absorption

Triacetate Herstellung durch Umsatz von 142 mg Methyl-trihydroxy-isochinolin-dion in 3ml Pyridin und 3 ml Acetanhydrid 4h bei 60^CC. Reinigung durch Säulenchromatographie (Kiesel 0,063 bis 0,2mm; CHCI₃-Aceton 10:1) Ausbeute 122 mg; Schmelzpunkt 212 bis 215⁰C (gelbe Kristalle) Massenspektrometer

M⁺: m/z 397

M⁺-CH₂CO: m/z 355.0692

M⁺-2CH₂CO: m/z 313.0570

M⁺-3CH₂CO: m/z 271.0501

Charakteristische Fragmentpeaks: m/z 243.0542; m/z 165.1620; m/z 125.1319; m/z 111.1140; m/z 97.1000; m/z 71.0856;

m/z 57.0598; m/z 41.9829; m/z 41.0103 UVX_mlx(nm): 240,335

IR K_n,* (cm"¹): 630,860,880,895,930,995,1020,1090,1115,1160.1180,1270,1315,1350,1400.. 1420,

1575,1655,1665,1755,1760.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-5,6(7),8-trihydroxy-2-aza-anthrachinon-(9,10) (Tolypocladin) auf mikrobiellem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß man

- einen pilzlichen Cyclosporin Α-bildenden Mikroorganismus aerob bei einer Temperatur zwischen 20⁰C und 37⁰C kultiviert und

- den Metaboliten Tolypocladin aus dem erhaltenen Myzel und/oder aus nach der Cyclosporin Α-Abtrennung vorliegenden Rückstands- bzw. Hilfsprotiukten unter sauren Bedingungen mit Wasser bzw. mit polaren organischen Lösungsmitteln extrahiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Kultivierung einen pilzlichen Mikroorganismus der Species Tolypocladium inflatum einsetzt,

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Kultivierung den pilzlichen Mikroorganismus Tolvpocladium Inflatum Wb 6-5 einsetzt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man den jeweils gewählten Tolypocladium inflatum-Stamm unter sterilen Bedingungen bei 25°C bis 27⁰C in einem flüssigen Ammoniumsalz-Nährmedium für die Dauer von 3 Tagen bis 8 Tagen kultiviert.

5. Verfahren gemäß Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß man zur Kultivierung einen pilzlichen Mikroorganismus der Species Sesquicilliopsis rosariensis einsetzt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Kultivierung den pilzlichen Mikroorganismus Sesquicilliopsis rosariensis F 605 einsetzt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1,5 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß man den jeweils gewählten Sesquicilliopsis rcsariensis-Stamm unter sterilen Bedingungen bei 25⁰C bis 35⁰C in einem flüssigen Ammoniumsalz-Nährmedium für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen kultiviert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man den Metaboliten Tolypocladin aus dem erhaltenen Feuchtmyzel

mit oxalsaurem heißem Wasser,
mit oxalsaurem Aceton,
mit oxal- oder salzsaurem Methanol bzw.
mitsalzsaurem Dimethylformamid
extrahiert sowie anschließend gegebenenfalls auf chromatographir.chom Wege feinreinigt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man den Metaboliten Tolypocladin aus nach der Cyclosporin A-Abtrennurig vorliegenden Myzelrückständen

mit oxalsaurem heißem Wasser,
mit oxalsaurem Aceton,
mit oxal- oder salzsaurem Methanol bzw.
mitsalzsaurem Dimethylformamid
extrahiert sowie anschließend gegebenenfalls auf chromatographischem Wege feinreinigt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man den Metaboliten Tolypocladin aus zur Cyclosporin Α-Reinigung benutztem Aluminiumoxid

mit oxalsaurem heißem Wasser,
mit oxalsaurem Aceton,
mit oxal- oder salzsaurem Methanol bzw.
mit salzsaurem Dimethylformamid
extrahiert sowie anschließend gegebenenfalls auf chromatographischem Wege feinreinigt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 8 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß man die Extraktion jeweils bei pH 1,0 bis pH 4,0 ausführt.