DD298430A5

DD298430A5 - Verfahren zum nachweis und/oder zur identifizierung einer nucleinsaeuresequenz

Info

Publication number: DD298430A5
Application number: DD90342703A
Authority: DD
Inventors: Remy Griffais
Original assignee: Institut Pasteur,Fr
Priority date: 1989-07-03
Filing date: 1990-07-03
Publication date: 1992-02-20
Also published as: PT94576A; AU5957790A; WO1991000363A1; EP0407291A1; CA2035471A1; JPH04500610A; FR2649122A1; KR920701477A; FR2649122B1; ZA905181B; IE902410A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Nucleinsaeuresequenz oder eines Gemisches von Nucleinsaeuresequenzen nach Herstellung einer geeigneten Loesung einer biologischen Probe zwecks Extraktion der * Es besteht aus folgenden Stufen: (1) Zerstoerung der 5-Enden der doppelstraengigen Nucleinsaeuresequenzen, die in der Probe enthalten sind, indem die biologische Probe mit einem geeigneten Reagens, das bei einer Temperatur von 37 bis 42C aktiv ist, in Kontakt gebracht wird; (2) eigentliche Amplifikation, indem die in (1) erhaltene Probe in Gegenwart einer waermebestaendigen DNA-Polymerase mit geeigneten Reagenzien, insbesondere mit fuer die Amplifikation der nachzuweisenden Zielsequenz(en) geeigneten Amplifikationsstartern in Kontakt gebracht wird; (3) Nachweis der amplifizierten spezifischen Zielsequenzen.{Amplifikation; Nucleinsaeureamplifikation; Kettenpolymerisationsreaktion; Nucleinsaeuresequenzidentifizierung; DNA-Polymerase; Nucleinsaeuresequenznachweis; Amplifikationszyklen; PCR-Verfahren}

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verbesserung von Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure, insbesondere durch Kettenpolymerisationsreaktion (PCR).

Bekannte technische Lösungen

Eines de, ersten beschriebenen Amplifikationsverfahren ist die von SAIKIR. et al. (Science, 1985,230,1350) entwickelte Kettenpolymerisationsreaktion (PCR). Dieses Verfahren erlaubt insbesondere die Amplifikation einzelständiger oder doppelsträngiger DNS-Sequenzen und beruht auf der zyklischen Funktion einer DNA-Polymerase, einem Enzym, welches in der Lage ist, einen als Matrize dienenden DNA-Strang in Form eines komplementären Stranges durch Elongation aus dem freien 3'-Hydroxylende eines Oligoucleotid-starters zu kopieren.

Das PCR-Verfahren besteht darin, daß man aufeinanderfolgende Amplifikationszyklen durchgeführt, während derer zwei Starter die Amplifikation der doppelsträngigen DNA-Sequenzen steuern, die von ihnen eingeschlossen werden. Ein Amplifikationszyklus umfaßt drei Phasen, die es gestatten, nacheinander die Denaturierung der DNA (bei einer Temperatur zwischen 90 und 95⁰C), die Hybridisierung der Starter (zum Beispiel bei einer Temperatur zwischen 37 und 75°C) und die Elongation der DNA-Stränge durch DNA-Polymerase durchzuführen.

Technologisch beruht das PCR-Verfahren auf zwei Prinzipien:

- Anwendung zweier Oligonucleotid-Starter, von denen einer komplementär zum DNA⁺-Strang und der andere komplementär zum DNA"-Strang ist und deren 3'-Enden einander gegenüberstehen;

- wiederholte Nutzung der Aktivität einer geeigneten DNA-Polymerase.

Das PCR-Verfahren gestattet somit, unter bestimmten Bedingungen alle während des Zyklus η neu synthetisierten Sequenzen im Zyklus (n + 1) als Matrize für die DNA-Polymerase zu verwenden. Daraus ergibt sich eine exponentiell Amplifikation der Anzahl

der Ziel-Nucleinsäuresequenzen in Abhängigkeit von der Anzahl der Zyklen, ausgedrückt durch die Amplifikationskurve, die eineexponentiell Phase umfaßt, in der eine Beziehung zwischen der Menge Q an erhaltenen Zielsequenzen und der Menge Qo anursprünglich vorhandenen Zielsequenzen, dem Amplifikationsfaktor χ und der Anzahl der Zyklen besteht, die in der folgenden

Formel zum Ausdruck kommt: Q = Qo (1 + x)ⁿ. Das PCR-Verfahren erlaubt es so, Sequenzen von Nucleinsäuren, die als Zielsequenzen bezeichnet werden, tausendfach

exponentiell zu amplifizieren.

Dieses Amplifikationsverfahren wird genauer in der europäischen Patentschrift CETUS 201184 beschrieben, in der vor allem

ausgesagt wird, daß die beiden beim PCR-Verfahren verwendeten Oligonucleotid-Starter vorzugsweise einzelsträngig sind undausreichend lang sein müssen, um in Gegenwart der DNA-Polymerase die Synthese des Extensionsproduktes zu induzieren.

Es wurde eine Reihe von Verbesserungen für dieses Verfahren vorgeschlagen, vor allem aber die Taq-Polymerase, welche eine Temperatur von 100⁰C vertrügt und in der Europäischen Patentschrift CETUS 258017 beschrieben wurde, eine DNA-Polymerase,

die mit Beginn des Verfahrens zugesetzt wird, um die Zugabe von Enzymen in jedem Zyklus zu vermeiden, und die es erlaubt,eine hohe Anzahl aufeinanderfolgender Amplifikationszyklen durchzuführen. Die Taq-Polymerase erlaubte es zum einen, das

Amplifikationsverfahren zu automatisieren, und zum anderen, die Spezifizität der Amplifikation zu erhöhen. So gestattet das PCR-Verfahren ohne Klonunc oirie beträchtliche Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz, Zielsequenz

genannt, und damit einen gewaltigen Zuwachs an Sensitivität. Die amplifiziene Zielsequenz ist dann direkt für verschiedene

Analyseverfahren wie den Punkt-Transfer, die Elektrophorese oder die Sequenzierung zugänglich. Zwei Patentschriften

(Europäische Patentschriften CETUS 200362 und v>29701) beschreiben insbesondere ein kombiniertes Amplifikations- und

Hybridisierungsverfahren zum Nachweis einer gesuchten Nucleinsäuresequenz in einer Probe. Se'ther wurden Varianten und/oder Verbesserungen vorgeschlagen, und das PCR-Verfahren findet gegenwärtig sowohl in der Molekularbiologie als auch in der Klinik (Diagnose genetischer Krankheiten und Nachweis von pathogenen Mikroorganismen)

ein weiteros Anwendungsfeld. Bei der routinemäßigen Durchführung dieses Verfahrens zeigte sich jedoch ein bedeutender

Nachteil, der mit seiner ungeheuren Sensitivität in Verbindung stand, nämlich das Vorkommen falscher Positivbefunde, die-wie

sich nach einer genauen Analyse der Ergebnisse zeigte - auf eine Verunreinigung der zu analysierenden Probe zurückzuführenwaren.

In einigen Artikeln der letzten zwei Jahre werden solche Fälle von Verunreinigung beschrieben und Mittel zur Lösung des Problems vorgeschlagen. In diesen Artikeln ist von einer Art unerwarteter Verunreinigung die Rede, nämlich von der Verunreinigung durch Sequenzen, die mit den gesuchten identisch sind. In einem Artikel in Lancet (1988, ii, 679) weisen Y. M. D. LO et al. auf diesen Nachteil der Kettenpolymerisationsreaktion, der mit

ihrer Sensivität im Zusammenhang steht, hin und unterstreichen die Notwendigkeit, der Vorbereitung der DNA-Matrize vor der

Amplifikation (.ine ganz besondere Sorgfalt zuteil werden zu lassen, um diesen wichtigen Nachteil auszugleichen. LO et al.,

beschreiben insbesondere ein Beispiel einer Verunreinigung bei der Diagnose von HBV-Sequenzen und zeigen einen positiven

Befund, der bei negativen Proben erhalten wird: Es wurden aus negativen Proben HBV-Sequenzen amplifiziert, wobei mit Hilfe

eines Southern-Transfers nachgewiesen wurde, daß die in der Probe nachzuweisenden Sequenzen in derselben nicht vorhandenwaren.

LO et al. analysierten diesen Befund als eine Verunreinigung der verwendeten Starter durch Plasmide mit dem HBV-Insert

(Plasmid pHBV130) in dem Maße wie die falschpositiven Amplifikationen in den negativen Proben bei der Beseitigung derverunreinigten Starter verschwinden.

LO et al. unterstreichen, Jaß das Problem der falschen Positivbefunde aufgrund der Verunreinigung durch Sequenzen, die mit

dein nachzuweisenden identisch sind, nicht vernachlässigt werden darf, zumal das PCR-Verfahren bei der Diagnose immerhäufiger Anwendung findet. LO et al. schlagen vor, systematisch eine lediglich aus Reagenzien bestehende negative

Vergleichsprobe für die PCR herzustellen, um die eventuelle Verunreinigung dieser Reagenzien durch Plasmide bewerten zu

können.

LO et al. schlagen gleichfalls vor, das Vorliegen einer Plasmidverunreinigung durch Amplifikation in Gegenwart von Startern

nachzuprüfen, die Sequenzen entsprechen, die sich beiderseits der Übergangsstelle zwischen Vektor und Insert des besagten

Plasmids befinden. Diese Verfahrensweise ist besonders dann erforderlich, wenn durch herkömmliche Verfahren wie den Southern-Transfer strittige Ergebnisse gewonnen werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß sich das Problern der Verunreinigung durch die Anwesenheit eines Plasmids, in welches

das Zielfragment insertiert ist, lediglich in Forschungslabors stellt, während in den Diagnoselabors (zur Durchführungmedizinischer Analysen zum Beispiel), welche routinemäßig Nachweise durchführen, anwendungsbereite Reagenzien zur

Verfügung stehen, so daß es in diesem Falle von Bedeutung ist, die Verunreinigung der Matrize durch andere Substanzen als die Plasmide (wie etwa PCR-Produkte oder freie Viren) zu verhindern, um einen zuverlässigen Diagnosebefund zu erhalten, wobei

nach Meinung von LO et al. zum gegenwärtigen Zeitpunkt eine solche Verunreinigung nicht vermeidbar ist.

In einem in Genes & Development, 1989,3,1095-1098 erschienenen Artikel geben R. A. GIBBS et al. folgende Ratschläge: AIIo

zur Durchführung der PCR verwendeten Reagenzien sind von den Ausrüstungen zu isolieren, die für die Analyse der erhaltenen

Produkte verwendet werden; Cawindestopfen sind zu verwenden, und man soll sogar soweit gehen, vor der Durchführung der Endreaktion den Inhalt einzufrieren, damit sich keine Aerosole bilden können; die Anzahl der Amplifikationszyklen ist auf ein Minimum zu beschränken, um das Risiko zu vermindern, kleine Mengen bereits anwesender Verunreinigungen zu amplifizieren,

und dabei zugleich die Gesamtmenge an Reaktionsprodukten gering zu halten; für jeden Arbeitsgang sollen andere

Pipettensäue zur Verfügung stehen. In einem in Nature, 1990,343,27 erschienenen Artikel schlagen G. SARKAR et al. zur Verhinderung dieser Verunreinigung vor,

dio Probe mit ΙΛ'-Strahlen zu behandeln, bevor die zu amplifizierende DNA-Matrize hinzugegeben wird.

In einem in Nature, 1989,339,237-238 erschienenen Artikel unterbreiten S. KWOK et al. eine Art „Ratgeber für die Laborpraxis",

um die Verunreinigung zu vermeiden bzw. in Grenzen zu halten: Die Präparate und die Produkte, die bei der PCR zum Einsatzkommen, sind physikalisch zu isolieren (getrennte Räumlichkeiten, UV-Bestrahlung...); die eingesetzten Puffer sind im

Autoklaven zu behandeln, die Reagenzien sind in kleine Proben zu unterteilen, damit sie nicht mehrfach mit der Pipette

aufgenommen werden müssen; bei der Arbeit sind Schutzhandschuhe zu tragen; Spritzer sind zu vermeiden; es sind Pipetten zuverwenden, bei denen es nicht zur Entstehung von Aerosolen, in denen DNA-Proben enthalten sind, kommen kann; die

Reagenzien, die miteinander gemischt werden können, sind vorzumischen, damit möglichst wenig verunreinigende Arbeitsgänge vorgenommen werden müssen; die DNA ist zuletzt hinzuzufügen; die positiven und negativen Kontrollen sind

sorgsam auszuwählen.

Die von den verschiedenen Verfassern beschriebene Verunreinigung ist also eine Verunreinigung durch Sequenzen, die mit den

nachzuweisenden sogenannten Zielsequenzen identisch sind, wobei letztere in den meisten Fällen durch frühere

Amplifikationen in den medizinischen Analyselabors entstanden sind, die zur Entwicklung einer hohen Zahl von Kopien, zu einer Ansammlung amplifizierter Zielfragmente und schließlich besonders dazu führen, daß die Zielsequenzen im medizinischen Analyselabor praktisch allgegenwärtig sind. All diese von den verschiedenen genannten Verfassern gemachten Vorschläge zur Verhinderung dieser Verunreinigung haben jedoch den Nachteil, daß sie Zwänge mit sich bringen und routinemäßig nur schwer

zu verwirklichen sind.

Außerdem erlauben es diese verschiedenen Vorschläge nicht, die durch die Anwesenheit von bei früheren Amplifikationen

entstandenen Zielsequenzen verursachte Verunreinigung systematisch zu unterbinden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, eine exponentiell Amplifikation verunreinigender doppelsträngiger Nukleinsäuren, d.h. von Sequenzen, die mit den nachzuweisenden Sequenzen identisch sind, bei früheren Laborversuchen amplifiziert wurden und falschpositive Befunde hervorrufen können, zu verhindern.

Wesen der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Amplifikation von Nulceinsäuren bereitzustellen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter einer verunreinigenden Sequenz ein kurzes Fragment einer Nukleinsäure

verstanden, das einem nachzuweisenden genomischen DNA-Fragment (einer Zielsequenz) entspricht und einen an seinem5'-Ende integrierten Starter besitzt.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter einer Zielsequenz eine Sequenz verstanden, die durch die sie einschließenden Starter definiert wird, wobei diese Sequenz in eine Nucleinsäure langer Sequenz, insbesondere eine genomische DAN,

eingeschlossen ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Nucleinsäuresequenz

oder eines Gemisches von Nucleinsäuresequenzen mit einer enzymetischen Amplifikation, das dadurch gekennzeichnet ist, daßes nach Herstellung einer geeigneter Lösung der biologischen Probe zwecks Extraktion der Nucleinsäure(n) folgende Stufenumfaßt:

(1) eine Stufe der Zerstörung der 5'-Enden der doppelsträngigen Nucleinsäuresequenzen, die in der Probe enthalten sind, durch den Kontakt der besagten biologischen Probe mit einem geeigneten Reagens, das bei einer Temperatur von 37 bis42°C aktiv ist;

(2) eine Stufe der eigentlichen Amplifikation durch den Kontakt der in (1) erhaltenen Probe mit geeigneten Reagenzien, insbesondere mit Amplifikationsstartern, die für die Amplifikation der nachzuweisenden Zielsequenz(en) in Anwesenheit einer wärmeresistenten DNA-Polymerase geeignet sind;

(3) eine Stufe des Nachweises der amplifizierten spezifischen Zielsequenzen.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Reagens für die Stufe (1), welches als Diskriminatorreagens bezeichnet wird und der Unterscheidung zwischen verunreinigenden Sequenzen und Zielsequenzen

dient, ein Vertreter einer Gruppe ausgewählt, zu der geeignete chemische Piäparate und Enzyme gehören, die in schwachalkalischem Milieu wirken.

Nach einer vorteilhaften Anordnung dieser Ausführungsart ist das Enzym eine geeignete 5'-Exonuclease, vorzugsweise die

5'-Lambda-Exonuclease.

Nach einer vorteilhaften Modalität dieser Anordnung sind die für die Amplifikation in der Stufe (2) angewandten Starter an ihren

5'-Enden phosphoryliert.

Die Lambda-Exonuclease hat die Eigenschaft, daß sie die 5'-Enden der doppelsträngigen Nucleinsäuren zerstört, wenn diese Enden phosphoryliert sind. Die Wirkung dieser 5'-Lambda-Exonuclease ist genauer in den Artikeln von J.W. LITTLE (J. Biol. Chem., 1967,242,4,672-686)

beschrieben.

Zur Verhinderung von Verunreinigungen durch Sequenzen, die mit den nachzuweisenden identisch sind, spielt die Durchführung der obengenannten Stufe 1 eine entscheidende Rolle. Wie oben bemerkt wurde, entsprechen nämlich die verunreinigenden Sequenzen relativ kurzen Sequenzen, die an ihren Enden

die bei früher durchgeführten Amplifikationen verwendeten Amplifikationsstarter haben (Starterextensionsprodukte), währenddie nachzuweisenden Zielsequenzen, die von den sie umgebenden Amplifikationsstartern definiert werden (dieselben Starter

wie die in die verunreinigenden Sequenzen eingebauten), in eine Nucleinsäure langer Sequenz (insbesondere eine genomische

DNA) eingebettet sind. Während der Stufe (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens führt das Diskriminatorreagens und insbesondere die 5' Exonuclease,

welche die Eigenschaft aufweist, die Nucleotide einer doppelsträngigen Nucleinsäure nach und nach in Richtung 5' —> 3' zuzerstören, dazu, daß man Nucleinsäuren erhält, deren 5'-Enden auf einer Länge, die von der Wirkzeit der 5'-Exonuclease abhängt,zerstört worden sind, während dieselbe keine 5'-Enden einer einzelsträngigen DNA (zum Beispiel die Starter oder einedenaturierte DNA) zerstört.

In der Stufe (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden sich die kurzen Nucleinsäuresequenzen (also die verunreinigenden Sequenzen) und die langen Nucleinsäuresequenzen (also die Sequenzen, in denen die nachzuweisende Zielsequenz enthalten

ist) aufgrund der Einwirkung des Diskriminatorreagens und insbesondere der 5'-Exonuclease unterschiedlich verhalten:

- Was die verunreinigenden Sequenzen anbelangt, die ja nur aus der Zielsequenz und den an den Enden eingebauten Amplifikationsstartorn bestehen, so kommt es nur von einem einzigen Amplifikationsstarter aus zu einer Extension, da die 5'-Enden zerstört werden; eine solche Extension wird nur ein lineares Wachstum diecer verunreinigenden Sequenzen bewirken; geht man davon aus, daß während der Stufe (2) η aufeinanderfolgende Amplifikationszyklen stattgefunden haben, so werden die verunreinigenden Sequenzen nur 2n-mal amplifiziert, was als vernachlässigbare Amplifikation angesehen werden kann, wenn man dagegen eine exponentiell Amplifikation setzt, die die Bildung von 2" amplifizierten Sequenzen bewirken würde;

- Was hingegen die nachzuweisenden Zielsequenzen angeht, so betrifft die Zerstörung der 5'-Enden nicht den Bereich der langen Nucleinsäuresequenz, in dem sich die Zielsequenzen befinden; es kommt somit zu einer Extension von den beiden Amplifikationsstartern aus; eine solche Extension bewirkt eine exponentiell Zunahme der besagten Zielsequenzen (Entstehung von 2" Sequenzen in η aufeinanderfol^ indon Amplifikationszyklen) und erlaubt einen unproblematischen Nachweis der besagten Sequenzen.

In Abhängigkeit vom konkreten Fall kann die Wirkdauer des Diskriminatorreagens und insbesondere der 5'-Exonuclease einige Minuten bis über eine halbe Stunde betragen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es also, durch Zerstörung der 5'-Enden der in der Probe enthaltenen doppelsträngigen Nucleinsäuren, auf eine unerwartete Art und Weise die exponentiell Amplifikation der verunreinigenden Sequenzen zu

verhindern, ohne die exponentiell Amplifikation der insbesondere in eine genomische DNA eingebetteten Zielsequenzen zubeeinträchtigen.

Es ist zu bemerken, daß selbst im ungünstigsten Falle, d. h. dann, wenn sich die Zielsequenz am 5'-Ende der genomischen DNA

befindet, dieselbe Zielsequenz auf dem Negativstrang weit vom 5'-Ende entfernt ist und damit dazu führt, daß eine exponentiell

Amplifikation eintritt. Die Stufe (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens macht somit die kurzen doppelsträngigen Nucleinsäurefragmente anfällig,

während die Zielsequenz in den langen Nucleinsäurefragmenten geschützt und stets exponentiell amplifiziert wird.

In Figur 1 wird das herkömmliche Verfahren zur exponentiellen Amplifikation mittels PCR, ausgehend von einer nach der obigen Definition als verunreinigend bezeichneten Nucleinsäure, d. h. einer solchen, deren Ende durch die 5'-Enden der verwendeten St liter A und B definiert sind, dargestellt. Bei einer solchen Amplifikation kommt es zu einer Extension der Stränge ausgehend von den beiden Startern, und die

verunreinigende Sequenz wird auch dann exponentiell amplifiziert, wenn in der zu analysierenden Probe keine Zielsequenzenenthalten sind: Nach η Zyklen erhält man 2" Exemplare der verunreinigenden Sequenz. Im Prinzip wird die Ausgangssequenzinnerhalb von 20 Zyklen eine Million mal amplifiziert.

Dagegen führen die verunreinigenden Sequenzen bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, zum Beispiel in Anwesenheit von 5'-Exonuclease, nicht zu falschpositiven Ergebnissen, denn sie werden, wie aus Figur 2 ersichtlich ist, in der

man erkennt, daß eine Extension lediglich von einem einzigon Starter, nicht aber von beiden aus zustandekommt, nur linearamplifiziert.

In der Tat führt-wie oben ausgeführt- eine lineare Amplifikation bei η Zyklen lediglich zur Bildung von 2n Sequenzen. Die folgende Tabelle I zeigt auf, wieviel Kopien nach einer Amplifikation einer als verunreinigend bezeichneten Sequenz ohne Vorbehandlung mit einer 5'-Exonuclease (Spalte A und Figur 1, herkömmliche exponentiell Amplifikation) und mit einer Vorbehandlung mit 5'-Exonuclease (Spalte Bund Figur 2, lineare Amplifikation) entstehen. Tabelle I

Zyklen	A	B
	Verunreinigende Sequenz	Verunreinigende Sequenz
	ohne Behandlung	mit verändernder Behandlung
1	2	2
2	4	3
3	8	4
4	16	5
5	32	6
6	64	7
7	128	8
8	256	9
9	512	10
10	1024	11
11	2048	12
12	4096	13
13	8192	14
14	16384	15
15	32768	16

Zyklen	A	B
	Verunreinigende Sequenz	Verunreinigende Sequenz
	ohne Behandlung	mit verändernder Behandlung
16	65536	17
17	131072	18
18	262144	19
19	524288	20
• 20	1048576	21
21	2037152	22
22	4194304	23
23	8388608	24
24	16777216	25
25	33554432	26
26	67108864	27
27	134217728	28
28	268435456	29
29	536870912	30
30	1073741824	31

Nach einer anderen Durchführungsart des besagten Verfahrens erfolgt die Stufe (1), das heißt die Stufe der Zerstörung der 5'-Enden der doppelsträngigen Nucleinsäuresequenzen, nur einmal, während die Stufe (2) mindestens einmal wiederholt wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren braucht η nämlich das Diskriminatorreagens und im besonderen die 5'-Exonuclease nur einmal vor dem ersten Zyklus der Amplifikationsstufe zu wirken, um eine exponentiell Amplifikation der verunreinigenden Sequenzen zu verhindern; um also ohne Probleme in einem automatisierten Verfahren einsetzbar zu sein, muß es demzufolge wärmeempfindlich sein.

Nach einer anderen vorteilhaften Durchführungsart der Erfindung erfolgt die Stufe (2) des besagten Verfahrens außerdem in Gegenwart einer wärmeempfindüchen DNA-Polymerase.

Die Kombination einer wärmeempfindlichen Polymerase, die bei 37⁰C aktiv ist, mit der wärmebeständigen Polymerase hat den Vorteil, daß dabei mindestens zwei Probleme gelöst werden können, die bei der Durchführung einer PCR auftreten:

- Reparatur der verunreinigenden Sequenzen, die bei einer PCR entstanden sind, deren letzte Amplifikationszyklen schlechte Ergebnisse erbrachten (zum Beispiel Entstehung von einzelsträngigen verunreinigenden Sequenzen, die demzufolge vom erfindungsgemäßen Verfahren nicht zerstört würden);

- Im Falle der Anwendung der PCR auf RNA erlaubt die Kombination einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase mit wärmebeständiger Polymerase, die PCR in einer einzigen Stufe an viralen Partikeln mit RNA durchzuführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, zu Beginn der Reaktion die (verunreinigenden) Zielfragmente zu modifizieren, die bei vorherigen Manipulationen amplifiziert wurden, ohne daß es dabei zu signifikanten Veränderungen der plasmidischen oder genomischen DNA kommt, in welcher sich die nachzuweisende Zielsequenz befindet. Nach dieser Behandlung kann das vorher vorhandene amplifizierte Zielfragment nicht mehr als Matrize für eine exponentiell Amplifizierung dienen, während die plasmidische oder genomische DNA weiterhin Ausgangsmatrize bleibt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine enzymatische Zusammensetzung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Reagens, das die 5'-Enden der doppelsträngigen Nucleinsäuresequenzen zerstört und als Diskriminatorreagenz zwischen den verunreinigenden und den Zielsequenzen wirkt, sowie aus einer wärmebeständigen DNA-Polymerase besteht.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsart besagter Zusammensetzung ist das besagte Diskriminatorreagens eine wärmeempfindliche 5'-Exonuclease.

Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsart besagter Zusammensetzung enthält diese außerdem eine bei 37-42⁰C aktive DNA-Polymerase (wärmeempfindlich).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Koffer, Kit oder Satz aufeinander abgestimmter anwendungsbereiter Bestandteile für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, daß er neben zweckmäßigen Mengen an geeigneten Puffern und Reagenzien, mindestens einem Paar geeigneter Starter sowie eventuell mindestens einer geeigneten Sonde auch geeignete Dosen einer erfindungsgemäßen enzymatischen Zusammensetzung enthält. Außer den obengenannten Anordnungen umfaßt die Erfindung auch andere Anordnungen, die aus der folgenden Beschreibung, welche sich auf Beispiele zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht, hervorgehen.

Selbstverständlich sind die Beispiele lediglich zur Veranschaulichung des Gegenstandes der Erfindung angeführt und stellen in keiner Weise eine Beschränkung desselben dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es ganz allgemein, die falschpositiven Ergebnisse auszuschließen, die durch die Verunreinigung mit Sequenzen Zustandekommen, die mit den nachzuweisenden Sequenzen identisch sind und bei früher im Labor durchgeführten Tests amplifiziert wurden.

Beispiel 1

Nachwels von Chlamydia trachomatis durch das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart einer wärmebeständigen DNA- Polymerase; Vergleich mit einer herkömmlichen Amplifikation (PCR).

Proben der DNA von Chlamydia, die aus dem kryptischen Plasmid dieser Bakterie gewonnen wurden, werden einer Amplifikation in einem Reaktionsmedium unterzogen, das bei einem Gesamtvolumen von 50μΙ je 1 μΜ der am 5'-Ende phosphorylierten geeigneten Starter; je 200μΜ der 4 Desoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10mM Tris, pH-Wert 8; 50 itiM KCI; 5mM MgCI₂; 1 Einheit wärmebeständiger 5'3'-Polymerase und eine Einheit wärmeempfindlicher 5'-Lambda-Exonuclease enthält.

Verfahrensweise: Die Proben werden 15 Minuten lang auf 37"C erwärmt (Wirkung der Exonuclease) und dann einer Amplifikation von 25 Zyklon

unterzogen, wobei jeder Zyklus eine Erhitzung auf 92⁰C in 15 Sekunden, eine Abkühlung auf 55⁰C in einer Minute undanschließend eine Erhitzung auf 72⁰C in einer Minute umfaßt. Dann werden die Proben 10 Minuten lang bei 72°C gehalten.

Die Produkte der PCR werden durch Elektrophorese auf Agarosegel (1,4%), das vorher mit Ethidiumbromid gefärbt wurde,

getrennt.

Dann wird die DNA durch UV-Strahlen-Exposition nachgewiesen. Zum Vergleich führt man nach der gleichen Verfahrensweise herkömmliche PCR (ohne Versetzen mit 5'-Exonuclease) durch. Dieser Vergleich dient dazu, die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens aufzuzeigen, d.h. nachzuweisen, daß die Lambda- Exonuclease keinerlei Auswirkung auf das Ergebnis der PCR aus genomischer DNA hat, während sie das Ergebnis der PCR, die

mit verunreinigenden Sequenzen wie den oben aufgeführten, die an ihrem 5'-Ende phosphoryliert sind, durchgeführt wird, inhohem Maße herabsetzt.

Die Figur 3 veranschaulicht insgesamt diesen Vergleich und zeigt, wie falschpositive Ergebnisse mit Hilfe des

erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeschlossen werden, wenn Produkte von PCR, die unter den verschiedenen obengenannten

Bedingungen erhalten werden, durch Elektrophorese auf Agarosegel (1,4%), das wie oben angegeben mit Ethidiumbromid

gefärbt wurde, getrennt werden.

Sie enthält:

- in Spalte 1: die Amplifikationsprodukte, die durch eine herkömmliche PCR in Gegenwart phosphorylierter Starter aus einer Probe gewonnen wurden, die ein kryptisches Piasmid von Chlamydia enthielt;

- in Spalte 2: die Amplifikationsprodukte, die durch das erfindungsgemäße Verfahren (Wirkung der 5'-Lambda-Exonuclease + PCR) in Gegenwart phosphorylierter Starter aus einer Probe gewonnen wurden, die ein kryptisches Piasmid von Chlamydia enthielt;

- In Spalte 3: die durch herkömmliche PCR in Gegenwart phosphorylierter Starter aus einer negativen Probe, die an ihrem 5'-Ende phosphorylierte verunreinigende Sequenzen enthielt, gewonnenen Amplifikationsprodukte;

- in Spalte 4: die durch das erfindungsgemäße Verfahren (Wirkung von 5'-Lambda-Exonuclease + PCR) in Gegenwart phosphorylierter Starter aus einer negativen Probe, die an ihrem 5'-Ende phosphorylierte verunreinigende Sequenzen enthielt, gewonnenen Amplifikationsprodukte;

- in Spalte 5: die durch herkömmliche PCR aus einer negativen Probe, die an ihrem 5'-Ende nichtphosphorylierte verunreinigende Sequenzen enthielt, gewonnenen Amplifikationsprodukte;

- in Spalte 6: die durch das erfindungsgemäße Verfahren (5'-Lambda-Exonuclease + PCR) aus einer negativen Probe, die an ihrem 5'-Ende nichtphosphorylierte verunreinigende Sequenzen enthielt, gewonnenen Amplifikationsprodukte.

Aus dieser Figur ist erkenntlich, daß:

- die Gegenwart von δ'-Lambda-Exonuclease auf die Amplifikation selbst keinen Einfluß hat (Spalte 1 und Spalte 2);

- eine negative Probe in Abwesenheit von 5'-Lambda-Exonuclease ein falschpositives Ergebnis liefert, während dieses falsche Ergebnis in Gegenwart von 5'-Lambda-Nuclease verschwindet (Spalte 4); e? ist zu bemerken, daß man in den Spalten 3 und 4 eine geringfügige Bande vorfindet, die unspezifischen Fragmenten entsprich; und die man gewöhnlich bei Amplifikationen antrifft, die in Abwesenheit einer DNA-Matrize durchgeführt werden;

- bei Anwendung von ö'-Lambda-Exonuclease die an ihrem 5'-Ende phosphorylierten verunreinigenden Sequenzen derselben gegenüber viel empfindlicher sind (Spalten 5 und 6).

Beispiel 2 Nachweis von Chlamydia trachomatis durch das erfindungsgemäße Verfahren Die Reaktion wird wie folgt durchgeführt: DNA-Proben von Chlamydia, die aus klinischen Proben gewonnen wurden, werden einem Reaktionspuffer zugesetzt, der

enthält: 10mMTris-HCI (pH-Wert8,4); 5OmM KCI; 2mM MgCI₂; Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTP): jeweils 200μΜ,

Starter: jeweils 1 μΜ, 0,03 Einheiten DNA-Lambda-Exonuclease je μΙ Reaktion, 0,02 Einheiten wärmebeständiger DNA- Polymerase je μΙ Reaktion. Die Proben werden 20 Minuten lang auf 37°C erwärmt und den folgenden aufeinanderfolgenden 25 Zyklen unterworfen: Die Proben werden 15 Sekunden lang auf 9O⁰C erhitzt, in einer Minute auf 55⁰C abgekühlt und in einer Minute auf 72⁰C erhitzt. Dann

werden die Proben 10 Minuten lang bei 72⁰C gehalten.

Die mit den folgenden Startern

Starter 1 (+): 5'-TTCCCCTTGTAAnCGTTGC-S' Starter 2 (-): Ö'-TAGTAACTGCCACTTCATCA-S',

welche auf herkömmliche Weise durch eine Polynucleotid-Kinase phosphoryliert wurden, erhaltenen PCR-Produkte weisen 201 Basenpaare auf und werden auf mit Ethidiumbromid gefärbtem Agarosegel getrennt. Die DNA wird dann durch UV-Strahlen-Exposition nachgewiesen. Die PCR-Produkte können auch nach Durchführung eines Southern-Transfers auf Hybond-N-Filter (Amersham) mit einer einzelsträngigen RNA-Sonde, die für die besagten Produkte spezifisch ist und entweder mit ³²P markiert (Figur 4: Spalte 1: Marker; Spalte 2: negative Vergleichsprobe; Spalte 3: positive Vergleichsprobe; Spalte 4: negative klinische Probe; Spalten 5 und 6: positive klinische Proben) oder aber mit Dig-dUTP markiert ist (Figur 5: Spa'te 1: Marker; Spalte 2: positive Vergleichsprobe; Spalte ?: negative Vergleichsprobe; Spalte 4: negative klinische Probe; Spalten 5 und 6: positive klinische Proben), autoradiographisch nachgewiesen werden. Klinische Proben, die genomische DNA von Chlamydia trachomatis enthalten, lassen sich gut in Gegenwart von Lambda-Exonuclease nachweisen (Figur 4: Spalten 3 und 4; Figur 5: Spalten 5 und 6).

Beispiel 3 Einfluß der Konzentration der verunreinigenden Sequenzen Man bereitet sogenannte verunreinigende Cytoniegalovirussequenzen (CMV-Sequenzen) vor. Es handelt sich dabei um Extensionsprodukte phosphorylierter Starter, die bei früheren Amplifikationen erhalten wurden. Diese

verunreinigenden Sequenzen enthalten also nur Zielsequenzen, die an ihren Enden die besagten phosphorylierten Starterhaben.

Die besagten verunreinigenden Sequenzen werden durch Reinigung ausgehend von einer Elektrophorese auf Agarosegel,

gefolgt von einer Elektroelution, einer Fällung in Ethanol, einer Suspension in Wasser und einer Quantifizierung mit „DNA

DIPSTRICK from INVITROGEN1-800-544-4684" gewonnen. Die so erhaltenen verunreinigenden Sequenzen werden dann soweit verdünnt, daß man etwa 10⁶ Kopien in 1b μΙ Wasser erhält. Dann erfolgen Serienverdünnungen der Größe 5, um vor der Durchführung einer jeden PCR die Anzahl der in jeder Probe

enthaltenen Kopien einschätzen zu können.

Die verschiedenen Proben werden dann entweder einer herkömmlichen PCR (ohne ö'-Lambda-Exonuclease) oder einer PCR in Gegenwart von 5'-Lambda-Exonuclease (erfindungsgemäßes Verfahren) unterzogen. Die Rolle der 5'-Lambda-Exonuclease in Abhängigkeit von der Konzentration der verunreinigenden Sequenz ist in Figur 6

dargestellt.

Die PCR-Produkte werden durch Elektrophorese auf mit Ethidiumbromid gefärbtem Agarosegol getrennt, und die DNA wird

durch UV-Strahlen-Exposition nachgewiesen.

Figur 6 zeigt die folgenden Ergebnisse:

- in Spalte 1 handelt es sich um Molekulargewichtmarker (Marker Vl, Boehringer);

- in Spalte 2:10^s Kopien verunreinigender CMV-Sequenzen, amplifiziert ohne S'-Lambda-Exonuclease;

- in Spalte 3:10⁶ Kopien verunreinigender CMV-Sequenzen, die nach einem Kontakt von 20 Minuten mit Lambda-Exonuclease (0,03 F.inheiten/μΙ) amplifiziert wurden;

- in Spalte 4:2 · 10⁴ Kopien verunreinigender CMV-Sequenzen, die ohne Lambda-Exonuclease amplifiziert wurden;

- in Spalte 5:2 · 10⁴ Kopien verunreinigender CMV-Sequenzen, die nach einem Kontakt von 20 Minuten mit Lambda-Exonuclease (0,03 Einheiten/μΙ) amplifiziert wurden;

- in Spalte 6:4 10³ Kopien verunreinigender CMV-Sequenzen, die ohne Lambda-Exonuclease amplifiziert wurden;

- in Spalte 7:4 · 10³ Kopien verunreinigender CMV-Sequenzen, die in Gegenwart von Lambda-Exonuclease (0,03 Einheiten/μΙ, Kontaktzeu: 20 Minuten) amplifiziert wurden.

Aus dieser Figur geht hervor,

- daß man in Abwesenheit von Lambda-Exonuclease eine Bande erhält, die den CMV-Sequenzen entspricht (Spalten 2,4 und 6);

- während man in Gegenwart von Lambda-Exonuclease, gleich welche Konzentration die verunreinigenden Sequenzen haben, keine Bande erhält (Spalten 3,5 und 7).

Beispiel 4 Wirkung der Lambda-Exonuclease auf genomische DNA, die eine nachzuweisende Zielsequenz enthalt Es wurden verschiedene genomische DNA verwendet, um die Wirkung der Lambda-Exonuclease auf verschiedene DNA

einschätzen zu können. Verschiedene Herpes-Viren und insbesondere das Papillomvirus wurden untersucht.

1) Herpes-Viren:

Die DNAs gewinnt man aus Zellkulturen, die durch die folgenden Viren des menschlichen Herpes infiziert waren: HSV2, CMV, VZ

und EBV.

Vor der Durchl uhrung der PCR in Gegenwart geeigneter Starter für die betreffenden Viren, die 20 bis 30 Nucleotide umfaßten

und auf herkömmliche Weise durch eine Polynucleotid-Kinase phosphoryliert worden waren, erfolgten Serienverdünnungen.

Zur Durchführung der PCR werden die besagten Proben einem Puffer zugesetzt, der aus 1OmM Tris-HCI (pH-Wert u,4); 5OmM KCI; 2m"· Ί MgCI₂; Gelatine 0,01 %; dNTP: jeweils 1 μΜ; geeigneten Startern: jeweils 1 μΜ; TAQ-Polymerase (CETUS PERBIN- ELMEfO: 0,02 Einheiten/μΙ Reaktion; Lambda-Exonuclease (BRL) 0 bzw. 0,03 Einheiten/μΙ Reaktion -je nach angewandtem Verfahren (ob herkömmliche PCR oder erfindungsgemäßes Verfahren) - besteht. Die Proben werden den folgenden verschiedenen Wärmebehandlungszyklen unterworfen:

- 1 mal: 37⁰C in 20 Minuten; 92°C in 1 Minute (gegebenenfalls Einwirkung der Lambda-Exonuclease);

- 30mal: 92⁰C in 15 Sekunden; 55°C in 1 Minute; 72⁰C in 1 Minute (eigentliche PCR);

- 1mal: 72⁰C in 10 Minuten.

Die Amplifikationsprodukte werden einer Elektrophorese auf mit Ethidiumbromid gefärbtem 2%igen Agarosegel unterzogen

und auf UV-Platten photographiert.

Die verwendeten Molekulargewichtmarker (Marker Vl, Boehringer) haben folgende Größen: 2176,1766,1230,1033,653,517,

453,394,298,234,220,154.

Je neon nachgewiesenem Virus wurden folgende Ergebnisse gewonnen:

1 a) Virus Varlcelle zona (VZV):

Serienverdünnungen der Größe 2 einer genomischen DNA von durch das Virus Varicelle zona infizierten Zellen werden, wie

oben dargelegt, in Gegenwart und in Abwesenheit von Lambda-Exonuclease einer PCR mit geeigneten phosphorylierten

VZV-Startern unterzogen. Die mit den folgenden Startern:

Starter 1 (+): 5'-ATGGGGTATGCATACGTCGAGGCGGTTGAg-S' Starter2 (-): 5'-ATATTGAAGCAAATCGCGACATCGTACTAc-S'

erhaltenen PCR-Produkte weisen 189 Basenpaare auf.

Nach einer wie oben dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 7 veranschaulichten Ergebnisse, in welcher die ungeradzahligen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuciease und die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuciease entsprechen.

Aus dieser Figur geht hervor, daß ein Nachweis, der ausgehend von einer langen genomischen DNA erfolgt, durch das Vorhandensein von Lambda-Exonuciease n\< ht beeinflußt wird.

Gleiche Resultate erhält man auch bei anderen Herpes-Viren, wie aus dem folgenden ersichtlich wird:

Ib)EBV:

Serienverdünnungen der Größe 10 einer genomischen DNA von durch das Epstein-Barr-Virus infizierten Zellen werden, wie oben dargelegt, in Gegenwart und in Abwesenheit von Lambda-Exonuciease einer PCR mit geeigneten phosphorylierten EBV-Starterr. unterzogen

Die mit den folgenden Startern:

Starter 1 (+): B'-AGAGGTTCAGGGACTTGTCCTCTATCGTCT-a' Starter2(-): B'-TTACCAACAACATGCTGATTCGCGACAACA-3'

erhaltenen PCR-Produkte weisen 282 Basenpaare auf.

Nach einer wie oben dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 8 veranschaulichten Ergebnisse, in welcher die ungeradzahligen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuciease und die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuciease entsprechen.

Serienverdünnungen der Größe 10 einer genomischen DNA von durch das Herpes-Simplex-2-Virus infizierten Zellen werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Lambda-Exonüclease einer PCR mit geeigneten phosphorylierten HSV-Startern unterzogen. Die mit den folgenden Startern:

StarterK+): 5'-TTCCCGGTCGCCGGGCACCACCACGCCGtA-3' Starter 2 {-»iö'-TTCGCTTCATCGCCACGAAGACCAACGACG-S¹

erhaltenen Produkte weisen 185 Basenpaare auf.

Nnch einer wie oben dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 9 veranschaulichten Ergebnisse, in welcher die ungeradzahligen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuciease und die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuciease entsprechen.

Zum Nachweis des Cytomegalovirus verfährt man wie oben dargelegt und in Gegenwart folgender Starter:

StarterK+): 5'-ACGGCGTTCCCCCATAAAGTCAGGTAACAc-S' Starter 2 (-): 5'-CGCCGAGAAACACGGCGGACGCATCGACGG-3'

und man erhält ein amplifiziertes Fragment mit 259 Basenpaaren.

2) Paplllomvlrus(HPV11):

Serienverdünnungen der Größe 2 einer genomischen DNA, die durch Entnahme am Analcondylom eines Patienten gewonnen wurde, werden entsprechend der oben unter 1) beschriebenen Verfahrensweise in Gegenwart und in Abwesenheit von Lambda- - Exonuclease einer PCR mit geeigneten HPV11-Startern unterzogen

Die mit den folgenden Startern:

StarterK+): S'-TGGTACTTTGCACGCAGACGCCGTA-a' Starter2{-): 5'-ATGATAAAATATGTTGGTGCGTTtA-S'

erhaltenen PCR-Produkte weisen 154 Basenpaare auf.

Nach einer wie oben dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 10 veranschaulichten Resultate, in welcher die ungeradzahligen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuciease und die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuciease entsprechen.

Die in den Figuren 7 bis 10 veranschaulichten Resultate zeigen, daß die Lambda-Exonuciease das Ergebnis einer Amplification, die ausgehend von einer langen genomischen DNA (langes Fragment) erfolgt, nicht verändert.

Beispiel 5 Wirkung der Lambda-Exonuciease auf sogenannte verunreinigende Sequenzen

Die verunreinigenden DNA werden durch Elektrophorese auf Agarosegel isoliert und dann einer passiven Diffusion in Wasser bei 4⁰C unterzogen.

Die so gewonnenen verunreinigenden Produkte werden wie in Beispiel 4.1) verdünnt. Die Verfahrensweise für die PCR ist identisch mit der in Beispiel 4.1) beschriebenen.

Die mit CMV, EBV und VZV als verunreinigenden Sequenzen erhaltenen Resultate sind in den Figuren 11,12 und 13 veranschaulicht und zeigen, daß das Amplifikationsergebnis dieser verunreinigenden Sequenzen durch die Anwesenheit von Exonuclease stark verringert wird.

a) CMV:

Serienverdünnungen der Größe 5 von durch PCR mit geeigneten phosphorylierten CMV-Startern gewonnenen Amplifikationsprodukten werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Lambda-b'xonuclease einer PCR mit denselben Startern unterzogen.

Nach einer wie oben in Beispiel 4 dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 11 veranschaulichten Ergebnisse, in welcher die ungeradzahliyen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuclease und die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuclease entsprechen.

b) EBV:

Serienverdünnungen der Größe 5 von durch PCR mit geeigneten phosphorylierten EBV-Startern gewonnenen Amplifikationsprodukten werden in Gegei ,wart und in Abwesenheit von Lambda-Exonuclease einer PCR mit denselben Startern unterzogen.

Nach einer wie oben dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 12 veranschaulichten Resultate, in welcher die ungeradzahligen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuclease 'ind die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuclease entsprechen.

c) VZV:

Serienverdünnungen det Größe 5 von durch PCR mit geeigneten phosphorylierten VZV-Startern gewonnenen Amplifikationsprodukten werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Lambda-Exonuclease einer PCR mit denselben Startern unterzogen.

Nach einer wie oben dargelegt durchgeführten Elektrophorese auf Agarosegel erhält man die in Figur 13 veranschaulichten Ergebnisse, in welcher die ungeradzahligen Spalten einer PCR ohne Lambda-Exonuclease und die geradzahligen Spalten einer PCR mit Lambda-Exonuclease entsprechen.

Beispiel 6

Einfluß zunehmender Konzentrationen der Lambda-Exonuclease auf das Amplif ikationsergebnls einer genomischen DNA Eine gleichbleibend große Menge uenomischer DNA, gewonnen aus VZV-infizierten Zellen, wird in Gegenwart zunehmender Mengen an Lambda-Exonuclease (0; 0,36; 0,18; 0,09; 0,045; 0,0225 Einheiten/μΙ) gemäß der oben dargelegten Verfahrensweise von Beispiel 4 einer PCR unterzogen. .

Veranschaulicht werden die Ergebnisse in Figur 14, in welcher die Spalten 1 bis 7 nacheinander den verschiedenen oben angegebenen Konzentrationen von Lambda-Exonuclease entsprechen. Diese Figur zeigt, daß eine Konzentration von 0,09 Einheiten/μΙ Lambda-Exonuclease das Ergebnis der PCR nicht verringert, und das bedeutet, daß eine Konzentration von 0,03 Einheiten/μΙ Reaktion durchaus annehmbar ist.

Wie aus oben Gesagtem hervorgeht, beschränkt sich die Erfindung keineswegs auf die hier detaillierter dargelegten Arten ihrer Durchführung; sie umfaßt im Gegenteil alle Varianten, die dem Fachmann auf dem Gebiet einfallen können, ohne daß dabei der Rahmen und die Reichweite der vorliegenden Erfindung gesprengt würden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Nucleinsäuresequenz oder eines Gemisches von Nucleinsäuresequenzen mit einer enzymatischen Amplifikation, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Verfahren nach Herstellung einer geeigneten Lösung der biologischen Probe zwecks Extraktion der Nucleinsäure(n) folgende Stufen umfaßt:

(1) eine Stufe der Zerstörung der 5'-Enden der doppelsträngigen Nulceinsäuresequenzen, die in der Probe enthalten sind, durch Kontakt der besagten biologischen Probe mit einem geeigneten Reagens, das bei einer Temperatur zwischen 37 und 42⁰C aktiv ist;

(2) eine Stufe der eigentlichen Amplifikation durch Kontakt der in (1) erhaltenen Probe mit geeigneten Reagenzien, insbesondere mit für die Amplifikation der nachzuweisenden Zielsequenz(en) geeigneten Amplifikationsstartern, in Gegenwart einer wärmebeständigen DNA-Polymerase;

(3) eine Stufe des Nachweises der amplifizierten spezifischen Zielsequenzen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz von Stufe (1), Diskriminatorreagens zur Unterscheidung zwischen verunreinigenden Sequenzen und Zielsequenzen genannt, innerhalb einer Gruppe gewählt wird, die geeignete chemische Präparate und Enzyme umfaßt, die in schwach alkalischem Medium wirken.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine 5'-Exonuclease ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die 5'-Exonuclease die 5'-Lambda-Exonuclease ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Amplifikation von Stufe (2) verwendeten Starter an ihren 5'-Enden phosphoryliert sind.

6. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (1), d. h. die Stufe der Zerstörung der 5'-Enden der doppelsträngigen Nucleinsäuresequenzen, nur einmal stattfindet, während die Stufe (2) mindestens einmal wiederholt wird.

7. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (2) des besagten Verfahrens außerdem in Gegenwart einer wärmeempfindlichen DNA-Polymerase stattfindet.

8. Enzymatische Zusammensetzung zur Durchführung eines Nachweisverfahrens gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Reagens, welches die 5'-Enden der doppelsträngigen Nucleinsäuresequenzen zerstört und Diskriminatorreagens zur Unterscheidung zwischen verunreinigenden Sequenzen und Zielsequenzen genannt wird, sowie eine wärmebeständige DNA-Polymerase enthält.

9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Diskriminatorreagens eine wärmeempfindliche 5'-Exonuclease ist.

10. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem eine DNA-Polymerase enthält, die bei 37 bis 42⁰C aktiv ist (wärmeempfindlich).

11. Aufeinander abgestimmter, anwendungsbereiter Koffer, Kit oder Satz für die Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er neben zweckmäßigen Mengen an geeigneten Puffern und Reagenzien, mindestens einem Paar geeigneter Starter und gegebenenfalls mindestens einer geeigneten Sonde auch geeignete Dosen einer enzymatischen Zusammensetzung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 10 enthält.