JPH04500610A - 核酸の増幅技術の改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＃Ｉ）帽― 本発明１叡特に連鎖重合反応（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｃｈａｉｎ　ｒ ｅａｃｔｉｏｎ　：　ＰＣＲ）を利用する、核昂に違穿喝［有］叩１ｉｆｔｃｔ ｉ圓）技屑にメ友良に関する。

記述された最υに用帥否詠）一つとして、Ｒ，５ＡＩＫ１等（サイエンス　１９ ８５゜２３０．１３５０）によって開発された連鎖重合反応（ＰＣＲ）がある。

その手法によりぶ４怜ミ一本鎖若しく１に２本鎖のＤＮＡ配列を増幅することが 可能であり、そのＷｉｔ、ＤＮＡポリメラーゼの周期的作用を利用したものであ る。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡＭをテンプレートとして、オリゴヌクレオチド プライマの３°−ＯＨ自出端を基点とする伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）により 、その相補鎖をコピーする。

上記のＰＣＲ法でＩｔ、　ｎ回の連続増幅サイクルを行ない、その間（：、２つ のプライマの指示の下にそれらに内包された二本鎖ＤＮＡ配列の増幅が行なわれ る。

１回の増幅サイクルＩＬ　ＤＮＡの変性（９０〜９５°Ｃの温度における）と、 プライマのハイブリダイゼーション（例え１戴　３７〜７５°Ｃの温度における ）と、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡＭの伸長との３つのステップから成り、 これらのステップカ場縞的に行なわれる。

ＰＣＲｌｔ、以下の２つの点１ミその技術的基礎を置く。

−第＠叡一方がＤＮ八へ鎖に相補性であり、他方がＤＮＡ−鎖に相補性であり、 且１それぞれの３゛末端か相互に向き合った２つのオリゴヌクレオチドプライマ を使用することであり、 一第コ戴適当なりＮＡポリメラーゼの活性を反復して利用することである。

このよう＋１ｍ、ＰＣＲによｔｕ戴適当な条件下において、第ｎサイクルで新た に合成されたすべての配列を、次回の第（ｎ＋１）サイクルにおいて、ＤＮＡポ リメラーゼのテンプレートとして１り用することが可能である。その結果、標的 核酸配列の数（戴サイクル数の関数として指数関数的（コｍさね、指数関数の相 を含む増幅曲線に従う。その場合（ミ得られる桿的配列の量Ｑ＋Ｌ最初の傍り惑 ＪＩ＋の量Ｑ、と、埋嘴１１数ｘと、サイクル数ｎとに関係し、以下の式で表わ される：Ｑ＝Ｑ・　（１＋ｘ）” このよう（二ＰＣＲによれ（戴所謂標的核１９１を指数関数的に数千倍にも増幅 することができる。

上記の増幅手法の詳細な説明が、ＣＥＴｔｌＳのヨーロッパ特許出願第２０１１ ８４号に記載されている。それによると、ＰＣＲに使用される２つのオリゴヌク レオチドプライマ１戴−木組のものが好ましく、またＤＮＡポリメラーゼの存在 下で（１１部物の合成を誘導するため（ミ充分に長くなければならない。

これまで番二上記手法の改善、改良が数多く提案されてきｔ−その中でも、特ム サイクＭ＆ｍ靴濫加を避けるた）ｆＡ：、ＣＩｌ″ＩｔｌＳのヨーロッパ特許出 願第２５８０１７号でＬｌｏｏｏＣの温度に耐え得るＤＮＡポリメラーゼである タクボリメラーゼ（Ｔａｑ　ｐｏｌｙｎｅｒａｓｅ）を方法の開始時点で加私そ れによって増幅サイクルを多数回連続的に実施できるようにすること力＼提案さ れている。タクボリメラーゼ（叡−一方で増幅方法の自動化を実現し、他方で増 幅の特異性を高める。

このようｉ：、ＰＣＲによｔ’Ｌｌ＆クローニングによらないで、所謂標的核酸 配列を相当程度（コ曾曜することができ、その結果、大きな感度のゲインを得る ことができる。増幅された標的駈テｊ（訟　ドツトプロット（ｄａｔ−ｂｌｏｔ ）挑　電亥朝４酩丸塩基配列決定法等の種々のプロセスに直接使用することがで きる。２つの特許出願（ＣＦｒｔｌＳ　（Ｄ　ヨｏ　ツｔ　％ＩＭ許出願第２０ ０３６２号と第２２９７０１号）ニ（ヌ試料から問題の核酸を検出するため（ミ 増輻とハイブリダイゼーションとを組み合わせることが提案されている。

その他の変更例若しくは改良例も提案さね、ＰＣＲｆＬ現在のところ、分子生物 学と臨床医学４伝病の診断や病原性微生物の検出）の両分野で広範に実施されて いる。もっとも、広く使用されるようになった結果として、この手法に１戴その 極めて高い感度（コ■適する重大な問題点のあることが明らかとなった。偽陽性 の問題であり、その原因（瓢試験結果を注意深く分析したところ、試料のコンタ ミネーション（ｃｏｎｔａｍｉｍｔｉｏｎ）に関係することが判明した。

最近の２年間に出た数多くの論文において、そのようなコンタミネーションの例 が報告さね、またそれに対する対応手段が、提案されている。それらの論文は、 予期しなかった種類のコンタミネーションに注目している。即ち、問題となって いる配列と同一の飯テｊによるコンタミネーションである。

Ｙ、　ＩＬ　Ｄ、　ＬＯ１Ｆ＝ｌＬランセツト（Ｌａｎｃｅｔ）の論文において （１９８８，ｉｔ。

６７９）　、連鎖重合反応の感度についてその欠点を指摘し、この重大な問題を 解決するた鵡ミ増幅前のＤＮＡテンプレートの調製に特別の注意を払うようにめ ている。Ｗ等はＨＢＶ配列の診断におけるコンタミネーションの例について詳細 に記載し、陰性の試料から陽性の結果が出ることを報告している。その場合にお いて、ＨＢＶ配列は陰性の試料から増幅され、その試料中（Ｓ検出されるべき配 列が存在しないこと、つまり、試料が陰性であることの証明１戴サザーンブロツ テイング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって行なわれた。

ｎ戴この結果を分析り、、ＨＢＶインサートを含むプラスミド（プラスミドｐＨ ＢＶ＋　３０）に基づく、使用されるプライマのコンタミネーションであると結 論付（すた。その理由（叡それらのプライマをすべて除去したところ、試料は最 早陽性Ｍを示さず、陰性であったからである。

印等＋ＩＰＣＲ力を断用に４広範に使用されるようになっている事実から、検出 されるべき配列と同一の翫テｊによるコンタミネーションに基づいて偽Ｔｈ（生 ずる問題は看過することができないとｔ、、ＰＣＲ用の試薬のみから成る所謂負 のコントロールを体系的に実施することによって、それらの試薬のプラスミドに よるコンタミネーションを評価することを提案している。

印等（戴また、プラスミドによるコンタミネーションの存在を、該プラスミドの ヴエクターインサート結合の各側に位置する配列に対応するプライマの存在下で の増幅によって証明することを提案している。この手続き撤すザーン・プロッテ ィング去等の従来の方法によって矛盾する結果が出た場合に必要となろう。

尤も、標的フラグメントのプラスミドベクタの存在によるコンタミネーション薬 を自由に処分するようになっており、そのような場合に信頼性の高い診断を行な うために１戴プラスミド以外の物質（ＰＣＲＯ生ａ　自由ウィルス明によるテン プレートのコンタミネーションを抑制することが重要である。ところが、Ｗ等の 見解によねＪ戴そのようなコンタミネーションを防止することは現在のところ不 可能であるとされている。

＆んＧＩＢＢＳ　ＱＬ　ジーンズ＆デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ ｅｌｏＨｎｔ）　、］　９８９．３．１０９５−１０９８．の論文において、次 のような装置を提案している。それＬ　ＰＣＲ用に使用されるすべての試薬を、 得られた生成物を分析するための器具から分離するものであり、螺子込み式のキ ャップを使用し、そしてエアロゾルの生成を抑制するために最終反応を行なう前 に内容物の凍結点にもっていく、既に存在している少量のコンタミナントの増幅 の危険を低減するためと、反応生成物の全体量を低減するための両方の目的のた め、増幅サイクルの数を最ＩＮこ限定する、各作業ではそれぞれ異なるピペット を使用する、というものである。

また、Ｇ、　５ＡＲＫＡＲｖ＝＋ｔネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９０．　 ３４３．　２７．の論文において、コンタミネーションを避けるため（ミ稠すべ きＤＮＡテンプレートを加える前（ミ試料をＵＶ処理すること提案している。

更＋；　Ｓ、ＵｌＫ　朔戴ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８９．　３３９． 　２３７−２３８．０論文において、コンタミネーションを検出上また抑制する ための数多くの″有効な実験プラクティス”を提案している。ＰＣＲ用の調製物 及び生成物を物理的に分離するｍの部邑　ＵＶ放射等）、使用される緩衝液をオ ートクレーブで処理する、ピペッティングの繰り返し使用を避けるために試薬を 小分けすること、操作中は保護手袋を着用すること、飛沫がかかるのを防止する こと、ＤＮＡ試料を含むエアロゾルを生じさせないピペットを使用すること、コ ンタミネーションにつながる操作の数を低減するために可能な場合には試薬を事 前に混合すること、ＤＮＡは最後に加えること、正と負のコントロールを注意深 く選択すること、等である。

このようＣミ以上に述べた複数の研究者によって報告されたコンタミネーション （瓢検出されるべき配列と同一の配列によるコンタミネーションであり、該破約 フラグメントが蓄積して、称ミ医療分析機関における標的配列の偏在につながる 。しかしながら、コンタミネーションを避けるための上記研究者らの提案を総合 してみても、それらの提案は何れも極めて制限的であり、日常的（こ実施するこ と１１符１である。

更ｌ：、それらの提案で１戴予備噛唱によって得られる標的配列の存在に基づく コンタミネーションを体系的に除去することはできない。

このような理白によって、本畠願大の目的１転従来の方法よりも実際の諸要求を 膚たし、怜：、施設における予備操作によって明されて偽陽性の原因となり得る コンタミナント二本鎖核酸、即ち、被検出配列と同一の配列の指数関数的な増幅 を抑制する標創匹テ塔帥シ去を提供することである。

本発明において、コンタミナント配列と＋Ｌ検圧されるべきゲノムＤＮＡフラグ メント（ｅＩ！ＦＨＤに対応する短い核酸フラグメントであって、その５°末端 にそれと一体化されたプライマを含むものを意味するものとする。

まｆ、本発明において、標的配列とＩＬ増福プライマによって規定されてそれら の間に内包される配列であって、ゲノムＤＮＡ等の長い配列の核酸に含まれる配 列を意味するものとする。

抽出するために生物試料を適当に溶解させた後Ｃミ（１）前記試料を、３７°Ｃ 〜４２゛Ｃの間の温度で作用する適当な試薬と接触させることによって、該試料 中に存在する二本鎖核酸４ｊｌ＋の５°末端を破壊する工程と、 （２）（１）の工程で得た試料を、熱耐性のＤＮＡポリメラーゼの存在下におい て、検出されるべき単数若しくは複数種須９４ＶΔ７＋１の増幅に適した増幅プ ライマ等の適当ｌｉ試藁と接触させることによって、実際１ｍｊｍｌｌａｇさせ る工程と、 （３）増幅した特異的標ｒΔ７１を検出する工程と、を含む方法である。

本発明の方法の南１ｊな態様においてＬ工程（１）の前記試薬１戴コンタミナン ト配列と標的配列とを判別する指定試薬であって、弱アルカリ性媒体中で作用す る適当なｆｄ期勿貿と酵素を含む群から選択される。

上記態様の有利な構成例において（戴前記酵素が、適当な５°　−エクソヌクレ アーゼ、特にラムダ５′　−エクソヌクレアーゼである。

上記構成例の有利な実施例において１叡工程（２）の増幅のために使用されるプ ライマ（瓢その５°末端が燐酸化されている。

ラムダ５°−エクソヌクレアーゼ１瓢二本鎖核酸配列の５゛末端を、該末端が燐 酸化されている場合Ｉ：、破壊する性質を育する。

ラムダ５°　−エクソヌクレアーゼの作用についてｌ叡Ｊ、　Ｗ、　ＬＩＴｒＬ Ｅの論文（Ｊ上記工程（１）を行なうことが、被検出配列と同一の配列によるコ ンタミネーションを抑制するために極めて重要である。

実際、上記のようＣ：、コンタミナント配列１戴予備増婚で使用された増幅プラ イマを端部に含んだ比較的短い配列（プライマｉｆｔ＋ｂ戊物）に対応するのに 対して、増幅プライマ（コンタミナント配列と一体化されるプライマと同一のプ ライマ）によって規定されそれらの間に内包される被検出標的配列（瓢長い配列 の核酸（ゲノムＤＮＡ等）に含まれる。

本発明の方法の工程（１）において＋Ｌ二本鎖核酸のヌクレオチドのみを５′＝ ３°の方向へ徐々に破壊する性質を育する５°　−エクソヌクレアーゼ等の判別 試薬が、該判別試薬の作用時間に対応する長さ分だけ５゛端部が破壊された核酸 を生成させる二と（こなるが、他方、該判ｇｌｌＸｌｉ［は一本ｌＤＮＡ　（プ ライマ、変性ＤＮＡ等）の５°末端は破壊しな１〜 本発明の方法の工程（２）においてＩＬ短い核酸配列（コンタミナントｅＤと長 ｕ　％１　（被検出標的配列を含もｔｌＡＤとが、５゛　−エクソヌクレアーゼ 等＃Ｉ］５ｉ１１Ｕシシ乍用の結果、互いに異なった振舞いをする。

つまり、事実ｈｌＬ標的配列と該配列の端部と一体化されｆＭプライマのみから なるコンタミナント配列に関して（叡それらの５°末端が破壊されているので、 伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　）は単一の増幅プライマのみから生じ、その結果、 コンタミナント配列は一次関数的な増加しか示さない。前記の工程（２）でｎ回 の連続増幅サイクルが行なわれるとすると、コンタミナント配列の増幅率は２０ 倍に止まり、これ１戴　２ゝ個の増幅配列を生じさせる指数関数的な増幅と比較 して、無視し得るものと考えられる。

それとは対照的Ｃ二検出されるべき標的配列に関して１表５°末端の破壊１表該 配列を含む長い核酸配列の領域１；影響を及ぼさず、従って、伸長は両方の増幅 プライマから生じ、その結果、標的配列は指数関数的に増加しくｎ回の連続増幅 サイクルの間に２゛個の配列が生成し）、該配列を容易に検出することができる ようになる。

５°　−エクソヌクレアーゼ等の判別試薬の作用時間として１ｉ、２〜３分の場 合もあれＩ；４３０分を超える場合もある。

このよう１：、、本発明の方法において１戴試料中に存在する二本鎖核酸の５゛ 末端を破壊することによって、ゲノムＤＮＡ等に含まれる標的配列の指数関数的 増幅に影響を与えることなく、コンタミナント配列の指数関数的増幅を抑制する ことができる。

標的配列がゲノムＤＮＡの５゛末端近くにあるとき、これが最も好ましくない場 合であるが、そのような場合にも、ネガティブ鏡上の同一の標的配列は５°末端 からは遠く離れており、従って、指数関数庄ｅ々元となり得る。

本発明の方法の工程（＋）で（叡短い二本鎖核酸フラグメントは傷つき易いのに 対して、標的配列は長い核酸フラグメント内で保護されており、常に指数関数的 （コ劉猛することができる。

図１１Ｌ既に定義した所謂コンタミナント核酸、即ち、使用されたプライマＡ及 びＢの５°末端によって端部が規定された核酸の、ＰＣＨによる従来の指数関数 的増幅を説明する図である。

この稠においてＩ戴鎖の伸長は両方のプライマから生Ｕ従って、試料中に標的配 列が全く存在しなくても、コンタミナント配列は指数関数的ｉ’ＪｌｌｌＷする 。

つまり、ｎ回のサイクルで、２１個のコンタミナント配列が生成する。２０サイ クルでＩＬ原理的に１戴最初の数の百方倍に増幅される。

それとは対照的（ミ本発明の方法においてミコンタミナント配列１戴例えば５° 　−エクソヌクレアーゼの存在下において、図２に示されるように−Ｍ数的にの み増幅されるので、偽陽性か生じることはなし１図２で１１判シ入２つのプライ マからではなく、単一のプライマのみから生じることが示されている。

実際、上記のようｌ、、　ｎサイクルでの一次関数的増賜の結果として生成され る配列１表　２ｎ個のみである。

以下の表１１瓢所謂コンタミナント配列の増幅によるコピー数を、５゛　−エク ソヌクレアーゼによる予備処理を行なわなかった場合（Ａ欄と図１．従来の指数 関数ｍ帥のと、５°　−エクソヌクレアーゼによる予備処理を行なった場合（Ｂ 欄と図２．−吹関２帥ｐとを比較して示している。

表！ 本方法の他の有利な態様において１戴工程（１）、即ち、二本鎖核酸配列の５” 末端を破壊する工程は一回のみ行なわ托工程（２）は少なくとも一回繰り返され る。

実際にＩＬ本発明の方法において１表５′　−エクソヌクレアーゼ等の判ｇｌ［ ＩＬ　フンタミナント配列の指数関数的増幅を抑制するため（：、増幅工程の最 初のサイクルに先立って、１回のみ使用されるべきであり、更にそれ（戴自動化 された工程において容易に使用することができるよう（ミ温度感受性（ｔ＃ｅｒ ａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｆｔｉｖｅ）であることが望ましし〜本発明の他の有利な 態様において１表本方法の工程（２）力（更（：、感温性（ｔ＃ｅｒａｔｕｒｅ −ｓｅｎｓｉ　Ｈｖｅ）のＤＮＡポリメラーゼの存在下で行なわれる。

熱耐性（ｔｈｅｎＴＩ）ｓｔａｂｌｅ）のポリメラーゼと３７℃で活性を示す感 温性のポリメラーゼとを組み合わせることにより、ＰＣＲの実施＋：Ｗする少な くとも２つの゛問題を解決できる利Φ力くある。つまり、−ＰＣＲにおいてコン タミナント配列が修復されて、増幅サイクルが進行するにつれて収率が低下する こと（本発明の方法によっては破壊されない例えば−末鎖コンタミナントの生ｔ ｌ、 −ＰＣＲをＲＮＡに応用する場合において、熱耐性ポリメラーゼとＲＮＡｗＩＤ ＮＡポリメラーゼとを組み合わせることにより、ＰＣＲを１ステツプにおいてＲ ＮＡウィルス粒召こついて実施すること、である。

本発明の方法に１飄予備操作で増幅される標的フラグメント（コンタミナント） を反応の開始時点て変化させ、しかもそり際ζミ被検出標的配列が存在するプラ スミド苦しくはゲノムＤＮＡを実質的ｎ力変化させないという利点がある。この 処理により、既存の増幅標的フラグメントは最早指数関数的増幅のためのテンプ レートとして作用しなくなるのに対して、プラスミド苦しくはゲノムＤＮＡは依 然として開始テンプレートのままである。

本発明の主題１！、また、本発明の検出方法を実施するための酵素組成物であっ て、二本鎮咳ａｆＥＪＩ＋の５°末端を破壊する試薬と、コンタミナント配列と 標的配列とを判別する試薬と、熱耐性のＤＮＡポリメラーゼどを含むことを特徴 とする糾邦冴灯である。

前記組成物の有利な態様において１叡前記判別試薬が、感温性の５°　−エクソ ヌクレアーゼである。

前記組成物の有利な態様において１戴該組成物が、更＋：、３７°Ｃから４２° Ｃで作用する濠４性の）ＤＮＡポリメラーゼをｔｔｉ、。

更１：、本発明の主題１戴本発明の方法を実施するための直ちに使用可能な用具 一式キット苦しくζ＝即能済みアセンブリであって、適量の緩衝液と適当な試薬 の他、少なくとも一対の適当なプライマを含み、更にオプションとして、少なく とも１種類の適当なプローブ、本発明の酵重量を含むことを特徴とする用具一式 キット若しくは調整済みアセンブリである。

前記の構成ツガ４ミ本発明は他の構成をも含むのであり、それらの構成が、本発 明の主題である方法の実施例に関する以下°の記載によって明らかとなるであろ であうで、本発明を何等限定するものでないこと力狸解されるべきである。

一般（：、本発明の方法によｔ′ｕｌ＆検出されるべき配列と同一であって、研 究室における予備テストによって予備的に増幅される配列に基づくコンタミネー ションによる偽陽性を除去することができる。

の（ＰＣＲ）稠との比較 クラミジアのＤＮＡ試料を、このバクテリアの潜在（ｃｒｙｐｔｉｃ　）プラス ミドから得て、それを、全体積が５０μｌの反応媒体中で増幅させる。反応媒体 １表５“末端か燐酸化された適当なプライマを各々ｌμＭと、４種類のデオキシ リボヌクレオチドｆｆ１（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を各／ｒ 　２００　ＩｔＭと、トリスｐＨ８を１０ｍＭと、ＫＣＪ’を５０ｍＭと、Ｍｇ Ｃ１＊を５ｍＭと、熱耐性５°−３′　ポリメラーゼをＩＵと、感温性ラムダ５ ゛−エクソヌクレアーゼをＩＵ含な。

プロトコール１戴以下の通りである。

試料を３７°Ｃで１５分間加熱しくエクソヌクレアーゼ作用）、次いで、堆層を ２５サイクル行なう。各サイクル：戴　９２℃での１５分間の加熱と、５５°Ｃ て゛の１分間の冷却と、更１：、７２℃での１分間の加熱とから成る。その後、 試ＮＩＬ７２°’Ｃ７’ＩＯ分間保持される。

ＰＣＲ生成物を、予め臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｃｎｉｄｅ）で 着色されたアガロースゲル（１，４％）上での電気泳動によって分離する。

そしてＤＮＡを、ＵＶ線の照射によって検出する。

比較のためζミ従来のＰＣＲ（５’　−エクソヌクレアーゼを使用しない）を同 一のプロトコルに従って行なう。

この比較の目的（戴本発明の方法の利６党、つまり、ラムダエクソヌクレアーゼ （瓢ゲノムＤＮＡを使用して行なったＰＣＲの収率Ｉこ何等影響を及ぼさない戟 前記のように定義された５’　ｍ洟頴軒ヒされたコンタミナント配列を使用して 行ったＰＣＲでは収率を著しく低下させることを、示すことである。

図３１瓢全体として、その比較の結果を示している。即ち、前記の異なる条件下 で生成したＰＣＲ生成物を、前記のように臭化エチジウムで着色されたアガロー スゲル（１，４％）上での電気泳動によって分離したところ、本発明の方法にお いては偽陽性は見られなかった。

図３において、 一コラム１（叡燐酸化されたブラフの存在下で、クラミジアの潜在プラスミドを 含む試料から、従来のＰＣＨによって得られた増隘生成物であり、−コラム２＋ Ｌ燐酸化されたブラフの存在下で、クラミジアの潜在プラスミドを含む試料から 、本発明の方法（ラムダ５′　−エクソヌクレアーゼの作用十ＰＣＲ）によって 得られた増幅生成物であり、−コラム３１戴燐酸化されたブラフの存在下で、５ ′末端が燐酸化されたコンタミナントを含む陰性試料から、従来のＰＣＲによっ て得られｆｊ＠ＷｂＲ吻であり、 一コラム４（戴燐酸化されたブラフの存在下で、５°末端が燐酸化されたコンタ ミナントを−ａｌｌｌ？郵式料から、本発明の方法（ラムダ５°　−エクソヌク レアーゼの作用十ＰＣＲ）によって得られた苅剛ｌ」動電であり、−コラム５ｔ Ｌ　５’　末端が燐酸化されていないコンタミナントを含む陰性試料から、従来 のＰＣＲによって得られた増幅生成物であり、−コラム６１Ｌ５°末端か燐酸化 されていないコンタミナントを含む陰性試料から、本発明の方法（ラムダ５゛　 −エクソヌクレアーゼの作用子ＰＣＲ）によって得られ４社ある。

図より、以下のことが明らかとなる。

−ラムダ５゛　−エクソヌクレアーゼの存在ｉｉ、増幅そのものに影響しない（ コラムｌとコラム２）、 一ラムダ５′　−エクソヌクレアーゼを使用しない場合にＩＬ陰性の試料が偽の 陽性反応を示すことがあり（フラム３）、この好ましくない結果（瓢ラムダ５′ −エクソヌクレアーゼの添加によって消失する（コラム４）。ここで、コラム３ 及び４に１戴それぞれ々的）なバンド力（察されるが、それらのバンドは非特異 的なフラグラメントに対応するものであり、ＤＮＡテンプレートのない状態で行 なわれる増幅においては普通に見られるものである、−ラムダ５゛　−エクソヌ クレアーゼを使用した場合、５゛末端が燐酸化されたコンタミナント１表この酵 素に極めてＨｇである（コラム５とコラム６）。

実施例２　本発明の方法によるトラコーマクラミジアの検出反て１飄以下のよう に実施される。

臨床試料から得られたクラミジアのＤＮＡ試料を、反応緩衝液中に加える。この 反応緩衝液（表トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，４）を１０ｍＭと、ＫＣｌを５０ｍ Ｍと、ＭｇＣＬを２ｍＭと、デオキシリボヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰ）を各 々２００μＭと、プライマを各々ＩｔｉＭと、ラムダＤＮＡエクソヌクレアーゼ を反応１μｌ当たり０．０３Ｕと、熱耐性ポリメラーゼを反応１μ！当たり０． ０２Ｕ含む。

試料を３７°σで２０分間加熱し、次いで、ｍを以下のようにして連続的に２５ サイクル行なう。即ち、９０゛σで１５分間加熱し、５５°’（？’？’１分間 冷却し、更（ミ　７２℃で１分間加熱する。その後、試料を７２℃で１０分間保 持する。

ポリヌクレオチドキナーゼを使用して従来の方法で燐酸化されｔ訂のようなプラ イマを用ることによって得られたＰＣＲ生成物Ｌ２０１個の塩基対を有し、臭化 エチジウムで着色されたアガロースゲル上で分離される：プライマ１　（十）： 　５’　−ＴＴＣＣＣＣＴＴＧＴＡＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−３”プライマ２　（− ’）：　５’　−ＴＡＧＴＡＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＡ−３’ＤＮＡＩ− Ｌその後、ＵＶ線の照射によって検出される。ＰＣＲ生成物１戴該生成物に特異 的であって、”Ｐ［Ｆ］４：コラム１．マーカ、フラム２：負のコントロール： コラム３：正のコントロール、フラム４：陰性の臨床試料：コラム５と６：陽性 の臨床試料）とディグ■ｉｇ）−ｄＵＴＰω５：コラムｌ：マーカ：コラム２： 正のコントロール：コラム３：負のコントロール；コラム４：陰性の臨床試料； フラム５と６−陽性の臨床試料）の何れかで標識された一末鎖ＲＮＡプローブを 使用して、ハイボンドＮフィルタ＠ｂｏｎｄ　Ｎ　Ｆｉｌｔｅｒ、Ａｍｅｒｓｈ ａ→上でサザーン・プロッティング法を行った後（：、オートラジオグラフ法に よっても視覚化することができる。トラコーマクラミジアのゲノムＤＮＡを含を 南１ＣＱ■よ、ラムダエクソヌクレアーゼの存在下で確実に検圧される■４．コ ラム３と４、図５：コラム５と６）。

実施例３・コンタミナント濃度の役割 サイトメガロウィルス（ｃｙ＋ｃｍ＝ｇａｌｏｖｉ〜ｓ：ｃＭＶ）の所渭コンタ ミナント配列を調製する。

それら（ｉ、予備Ｍによって得られる燐酸化プライマの伸長生成物である。そこ で、それらのコンタミナント配列ＩＬＬ末端に該燐酸化プライマを含も！！＋１ のみから成る。

上記のコンタミナント配列（ｉ、アガロースゲル電気泳動によって純化さね、更 ｌミ電気溶出（ｅｌｅｃｊｒｏｅｌｕ＋　１ｏｎ）　、エタノール沈澱、水によ る懸濁、“インヴイトロゲン（ｌｓ”ＶＩＴＲＯＧＥ’ｉ’）　ｌ　−８００− ５４４−４６８４のＤＮ八へィプストリック■Ｉ阿耐＋００１による定量仕力守 Ｊわれる。

こうして得られたコンタミナント配列：Ｌその後希釈さね、水１５μβ中に約１ ０″個のコピーを含んだものが調製される。更（；連続５倍希釈を行ない、ＰＣ Ｒを実施する前に各試料中に存在するコピーの数を推定可能とする。

異なる試料について、従来のＰＣＲ（ラムダ５°　−エクソヌクレアーゼを使用 しない）とラムダ５°　−エクソヌクレアーゼ（本発明の方力を使用したＰＣＲ の何ねカリお行なう。

コンタミナント生成物の濃度の関数としてのラムダ５°　−エクソヌクレアーゼ の役ｔｉ＜、図６に図示されている。

ＰＣＲ生成物１戴臭化エチジウムで着色されたアガロースゲル上での電気泳動に よって分離さね、また、ＤＮＡはＵＶ線の照射によって検出される。

図６１戴以下の結果を示している。

−コラムＩ１１分子量マーカ（Ｍａｒｋｅｒ　Ｖｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を 含む、−コラム２ニラムダ５°　−エクソヌクレアーゼを使用しないで増幅され たコンタミナントＣＭＶ配列の１０’個のコピー、−コラム３．ラムダエクソヌ クレアーゼ（０，０３０／μｌ）と２０分間接触した後に増幅されたコンタミナ ントＣＭＶ配列の１０％個のコピー、−コラム４、ラムダエクソヌクレアーゼを 使用しないで増幅されたコンタミナン）ＣＭＶ配列の２ｘ１０’個のコピー、一 つラム５ニラムダエクソヌクレアーゼ（０，０３Ｕ／μｌ）と２０分間接触した 後（コ曾隘されたコンタミナントＣＭＶ配列の２ｘｌＯ’個のコピー、−コラム ６・ラムダエクソヌクレアーゼを使用しないで増幅されたコンタミナントＣＭＶ 配列の４ｘｌＯ”個のコピー、−コラム７：ラムダエクソヌクレアーゼ（０，０ ３Ｕ／μ１１接触時間：２０分）を使用して増幅されたコンタミナントＣＭＶ配 列の４ｘｌＯ’個のコピー。

この図から、以下のことか明らかとなる。

−ラムダエクソヌクレアーゼを使用しない場合にＩＬ　ＣＭＶ配列に対応するバ ンドが現れ（コラム２．　４．　６）、 −他方、ラムダエクソヌクレアーゼを使用した場合に１戴コンタミナント配列の 濃度に関係なく、バンドは現れない（コラム３．　５．　７）。

実施例４：非検圧標的配列を含むゲノムＤＮＡに関するラムダエクソヌクレアー ゼの役割 種々のＤＮＡに関するラムダエクソヌクレアーゼの役割を評価するため１：、種 々のゲノムＤＮＡを使用した。

ｌ）ヘルペスウィルス： Ｈ３Ｖ２．ＣＭＶ、ＶＺ、ＥＢＶという種々のヒトのヘルペスウィルスを感染さ せた細胞系からＤＮＡを得る。

連続希釈を行なった後１：、、上記の各ウィルスｉ：ＪＬ、、２０〜３０個のヌ クレオチドを含み、且つ、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して従来の方法で燐 酸化されたプライマの存在下において、ＰＣＲを行なう。

ＰＣＲを実施するため（：、、上記の試料を緩衝液に加える。緩衝液１′ｉ、実 施される方法の種類（従来のＰＣＲと本発明の方力によって、トリス−ＨＣｊ７ 　（ｐＨ８，４）を１０ｍＭと、ＫＣｆを５０ｍＭと、ＭｇＣ１ｔを２ｍＭと、 ゼラチンを０．０１％と、ｄＮＴＰを各々２００μＭと、適当なプライマを各々 １μＭと、タフポリメラーゼ（Ｃ臼ｔｌｓ　、　ＰＥＲＢＩＮ−肌刈玉）を反応 のｌμｌ当たり０．０２Ｕと、ラムダエクソヌクレアーゼ（ＢＲＬ）をＯ若しく は反応の１μβ当たり０．０３０含む。

ＭＬ以下のような異なる熱サイクルを受ける。

−１回：３７°Ｃで２０分間：９２°Ｃで１分間０９シの種類による、ラムダエ クソヌクレアーゼ作用）、 一３０回：９２℃で１５秒間：５５℃で１分間；７２℃で１分間（可動ＰＣＲ） 、 一１回＝７２６ご１０分間。

増幅された生成物を、臭化エチジウムで着色された２％アガロースゲル上での電 気泳動にかけ、更ζ：、、ＵＶプレート上で写真に撮る。

使用された分子量マーカ（Ｍａｒｋｅｒ　Ｖ　１．　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　 ＋ｉ以下の大きさを持つ：２１７６．１７６６．１２３０，１０３３．６３５， ５１７，４５３，３９４．２９８，２３４，２２０，１５４゜検出されたウィル スに対応して、次のような結果が得られた。

１、ａ、水痘−帯状庖疹ウィルスαａｒｉｃｅｌｌａ　Ｚｏｓｔｅｒ　ｖｉｒｕ ｓ　：　ＶＺＶ）　：水痘−帯状庖疹ウィルスを感染さゼ吹膚朗沙ＤゲノムＤＮ Ａの連続２倍希釈を使用して、前記のようへラムダエクソヌクレアーゼを使用し た場合と使用しない場合について、適当に燐酸化されたｖＺｖプライマを用いて ＰＣＲを行なう。

以下のプライマを用いて得たＰＣＲ生成物ＩＬ１８９個の塩基対を有する：プラ イマ１　（十）：　５’　−ＡＴＧＧＧＧＴＡＴＧＣＡＴＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣ ＧＧＴＴＧＡＣ−３’ プライマ２　（−）　：　５°　−ＡＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＡＡＴＣＧＣＧＡＣ ＡＴＣＧＴＡＣＴＡＣ−３゜ 前記のようなアガロースゲル電気泳動の後で、図７に示される結果か得られた。

図において、奇数番号のコラム１戴ラムダエクソヌクレアーゼを使用しないで行 なったＰＣＲを表し偶数番号のコラムＩＬ　ラムダエクソヌクレアーゼを使用し て行なったＰＣＲを表す。

図から、長いゲノムＤＮＡを使用して行った検出（戴ラムダエクソヌクレアーゼ の影響を受けないことが理解される。

同様の結果が、上記の他のヘルペスウィルスについても得られた。

１、ｂ、ＥＢＶ二 ニブシュタイン−バーウィルス（Ｅｐｓｊｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）を感 染させたｍのゲノムＤＮＡの連続１０倍希釈を使用して、前記のよう（ミラムダ エクソヌクレアーゼを使用した場合と使用しない場合につ、江、適当に燐酸化さ れたＥＢＶプライマを用いてＰＣＲを行なう。

以下のプライマを用いて得たＰＣＲ生成物ＬＬ　２８２個の塩基対を育する８プ ライマｌ　（＋）　５’　−ＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣ；ＡＣＴＴＧＴＣＣＴＣ ＴΔＴＣＧＴＣＴ−３゛ プライマ２　（−）：　５’　−ＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣ ＧＣＧＡＣＡＡＣＡ−３’ 前記のようなアガロースゲル電気泳動の後で、図８に示される結果９祷られた。

図において、奇数番号のコラム１戴ラムダエクソヌクレアーゼを使用しないで行 なったＰＣＲを表し、偶数番号のコラム１飄ラムダエクソヌクレアーゼを使用し て行なったＰＣＲを表す。

１、ｃ、　Ｈ３Ｖ２　： ２型単純ペルペスウイルスを感染さセブ」ゴ泡のゲノムＤＮＡの連続１０倍希釈 を使用して、ラムダニクツヌクレアーゼを使用した場合と使用しない場合につい て、適当に燐酸化されたＨ３Ｖプライマを用いてＰＣＲを行なう。

以下のプライマを用いて得たＰＣＲ生成物１１１８５個の塩基対を有する。

プライマＩ　（＋）：　５’　−ＴＴＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＣ ＣＡＣＧＣＣＧＴＡ−３゜ プライマ２　Ｃ−）：　５°　−ＴＴＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡ ＣＣＡＡＣＧＡＣＧ−３’ 前記のようなアガロースゲル電気泳動の後で、図９に示される結果か得られた。

図において、奇数番号のコラムはラムダエクソヌクレアーゼを使用しないで行っ たＰＣＲを表し、偶数番号のコラムはラムダエクソヌクレアーゼを使用して行っ デこＰＣＲ蔓ヨジンす。

サイトメガロウィルスを検出する場合も、手順は以上と同様であるが、以下のプ ライマを使用して行なう。その結果ｔＬ２５９の塩基対の増幅されたフラグメン トが得られる。

プライマｌ　（＋）：　５’　−ＡＣＧＣ；ＣＧＴＴＣＣＣＣＣＡＴＡＡＡＧＴ ＣＡＣＧＴＡＡＣＡＣ−３゜ プライマ２　（−）：　５’　−ＣＧＣＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＡＣＧ ＣＡＴＣＧＡＣＧＧ−３゜ ２）乳頭腫ウィルス（Ｐａｐｉｌｌｃｒｍｖｉｒｕｓ　：　ＨＰＶ　］　ｌ　） 　：患者から採取した肛門フンジローム（ａｎａｌ　ｃｏｎｄｙｌｃｍｈ）から 得たゲノムＤＮＡの連続２倍希釈を使用上上記の１）で使用しｔニブロトコル（ こ従って、ラムダエクソヌクレアーゼを使用した場合と使用しない場合について 、適当に燐酸化されたＨＰＶＩＩプライマを用いて、ＰＣＲを行なう。

以下のプライマを用いて得たＰＣＲ生成物１飄　１５４個の塩基対を有する。

プライマＩ　（＋）　：　５°　−ＴＧＧＴＡＣＴＴＴＣ；ＣＡＣＧＣＡＧＡＣ ＧＣＣＧＴＡ−３゜ プライマ２　（−）　：　５°　−ＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＧＴＧＣ ＧＴＴＴＡ−３’ 前記のようなアガロースゲル電気泳動の後で、図１０に示される結果が得られｆ う図において、奇数番号のコラムＩＬ　ラムダエクソヌクレアーゼを使用しない で行なったＰＣＲを表獣偶数番号のコラムＬラムダエクソヌクレアーゼを使用し て行なったＰＣＲを表す。

図７と図１０の結果１戴ラムダエクソヌクレアーゼ（戴ゲノムＤＮＡテンプレー ト（長いフラグメント）を使用して行なった場合の増賜率を変化させないことコ ンタミナントＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、次いで、４°Ｃ の水に受動拡散させる。

こうして得られたコンタミナント生成物を前記の実施例４．１）におけるように 希釈し、ＰＣＲのプロトコルも実施例４．１）と同一のものを使用し７′ムコン タミナント配列としてＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶを用いて得られた結果か、図１１ ．１２．１３に示されている。これらの図から、エクソヌクレアーゼの使用によ って、該コンタミナント配列の増幅率が非常に高められることが理解される。

ａ、ＣＭＶ： 適当に燐酸化されたＣＭＶプライマを用いてＰＣＲを行なって得られた増幅生成 物の連続５倍希釈を使用して、ラムダエクソヌクレアーゼを使用した場合と使用 しない場合について、同一のＣＭＶプライマを使用して、ＰＣＲを実施する。

実施例４におけるようなアガロースゲル電気泳動の後で、図１１に示される結果 が得られ７５図において、奇数番号のコラム（瓢ラムダエクソヌクレアーゼを使 用しないで行なったＰＣＲを表し、偶数番号のコラム１戴ラムダエクソヌクレア ーゼを使用して行なったＰＣＲを表す。

ｂ、ＥＢＶ： 適当に燐酸化されたＥＢＶプライマを用いてＰＣＲを行なって得られた増幅生成 物の連続５倍希釈を使用して、ラムダエクソヌクレアーゼを使用した場合と使用 しない場合について、同一のＥＢＶプライマを使用して、ＰＣＲを実施する。

前記のようなアガロースゲル電気泳動の後で、図１２に示される結果か得られた 。図において、奇数番号のコラム１戴ラムダエクソヌクレアーゼを使用しないで 行なったＰＣＲを表獣偶数番号のコラム１戴ラムダエクソヌクレアーゼを使用し て行なったＰＣＲを表す。

ｃ、ＶＺＶ 適当に燐酸化された■Ｚ■プライマを用いてＰＣＲを行なって得られた増幅生成 物の連続５倍希釈を使用して、ラムダエクソヌクレアーゼを使用した場合と使用 しない場合について、同一のｖＺｖプライマを使用して、ＰＣＲを実施する。

前記のようなアガロースゲル電気泳動の後で、図１３に示される結果が得られた 。図において、奇数番号のコラム（叡ラムダエクソヌクレアーゼを使用しなし） で行なったＰＣＲを表し、偶数番号のコラム１叡ラムダエクソヌクレアーゼを使 用して行なったＰＣＲを表す。

加の作用 ＶＺＶを感染させた細見から得られたゲノムＤＮＡの一定量について、上記の実 施例４におけるプロトコルに従って、ラムダエクソヌクレアーゼの量を増加させ つつ（０；０．３６　；０．１８．０．０９　；０．０４５　：０．０２２５単 位／μｌ）、ＰＣＲを行なう。

その結果が図１４に示されている。図において、コラム１〜７１叡それぞれラム ダエクソヌクレアーゼの前記の各濃度に対応する。図から、０．０９　Ｕ／μ！ のラムダエクソヌクレアーゼはＰＣＲの収率を増加させず、また、反応の１μｌ 当たり０．０３０の濃度が最も適していることを示している。

以上の記載から明らかなよう（ミ本発明１′！、上記のような明示的に記載され た実ｕｊの内容若しくはそれらの実施及び適用の方法に何等限定されるものでは なく、本発明の精神若しくは範囲を逸脱しない限りにおいて、本分野の技術者に よって容易に推考されるあらゆる変更をも含むものである。

ニ＝戸−一一一一　□ □ ｎｘ３０酵号イ号、６２　コヒ゛−太【上−く １　２　３Ｌ４５　６ ］　１　３４　５　６ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵素的増幅を含む、核酸配列の若しくは核酸配列を含む混合物の検出及び／ 又は同定のための方法であって、単数若しくは複数種類の核酸を摘出するために 生物試料を適当に溶解させた後に、 （１）前記試料を、３７℃〜４２℃の間の温度で作用する適当な試薬と接触させ ることによって、該試料中に存在する二本鎖核酸配列の５′末端を破壊する工程 と、 （２）（１）の工程で得た試料を、熱耐性のＤＮＡポリメラーゼの存在下におい て、検出されるべき単数若しくは複数種類の標的配列の増幅に適した増幅プライ マ等の適当な試薬と接触させることによって、実際に増幅させる工程と、 （３）増幅した特異的標的配列を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。 ２．工程（１）の前記試薬は、コンタミナント配列と標的配列とを判別する指定 試薬であって、弱アルカリ性媒体中で作用する適当な化学物質及び酵素を含む群 から選択される請求の範囲１に従う方法。 ３．前記酵素が、５′−エクソヌクレアーゼである請求の範囲２に従う方法。 ４．前記５′−エクソヌクレアーゼが、ラムダ５′−エクソヌクレアーゼである 請求の範囲３に従う方法。 ５．工程（２）の増幅のために使用されるプライマはその５′末端が燐酸化され ている請求の範囲４に従う方法。 ６．工程（１）、即ち二本鎖核酸配列の５′末端を破壊する工程は一回のみ行な われ、工程（２）は少なくとも一回繰り返される請求の範囲１〜５の何れか一つ に従う方法。 ７．工程（２）が、更に、感温性のＤＮＡポリメラーゼの存在下で行なわれる請 求の範囲１〜６の何れか一つに従う方法。 ８．請求項１〜７の何れか一つに従う検出方法を実施するための酵素組成物であ って、二本鎖核酸配例の５′末端を破壊する試薬と、コンタミナント配列と標的 配列とを判別する試薬と、熱耐性のＤＮＡポリメラーゼとを含むことを特徴とす る組成物。 ９．前記判別試薬が、感温性の５′−エクソヌクレアーゼである請求の範囲８に 従う組成物。 １０．更に、３７′Ｃから４２℃で作用する（感温性の）ＤＮＡポリメラーゼを 含む請求の範囲８若しくは請求の範囲９に従う組成物。 １１．請求項１〜７の何れか一つの方法を実施するための直ちに使用可能な用具 一式、キット若しくは調整済みアセンブリであって、適量の緩衝液と適当な試薬 の他、少なくとも一対の適当なプライマを含み、更にオプションとして、少なく とも１種類の過当なプローブ、請求項８から１０の何れか一つの酵素組成物の適 量を含むことを特徴とする用具一式、キット若しくは調整済みアセンブリ。