PT94576A

PT94576A - Processo de deteccao e/ou de identificacao de acido nucleico

Info

Publication number: PT94576A
Application number: PT94576A
Authority: PT
Inventors: Remy Griffais
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1989-07-03
Filing date: 1990-07-03
Publication date: 1991-03-20
Also published as: FR2649122B1; IE902410A1; EP0407291A1; FR2649122A1; DD298430A5; WO1991000363A1; KR920701477A; JPH04500610A; ZA905181B; AU5957790A; CA2035471A1

Description

INSTITUT PASTEUR "PROCESSO DE DETECÇÃO E/OU DE IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDO NÚCLEICO" A presente invenção diz respeito a um aperfeiçoamento introduzido nas técnicas de amplificação de ácidos nucleicos, particularmente mediante reacção de polimerização em cadeia (PCR).

Um dos primeiros métodos de ampliação descritos foi a reacção de polimerização em cadeia (PCR), desenvolvida por SAIKI R. e Colab. ("Science", 1985, 230, 1350). Esta técnica permite amplificar particularmente, sequências de ADN de cadeia simples ou de cadeia (hélice) dupla e baseia-se no funcionamento cíclico de uma ADN polimerase, enzima esta que é capaz de copiar uma cadeia (hélice) de ADN, utilizada como matriz, em tuna cadeia complementar mediante alongamento a partir da extremidade 3'OH livre de um par de iniciação oligonucleotídico. A técnica PCR consiste em efectuar n ciclos sucessivos de amplificação, durante os quais dois iniciadores dirigem a amplificação da sequência de ADN de cadeia (hélice) dupla que eles enquadram. Um ciclo de amplificação ê constituído por três etapas que permitem realizar sucessivamente a desnaturação do ADN (a uma temperatura compreendida entre 90 e 95°C), a hibridação dos pares -2-

de iniciação (por exemplo a uma temperatura compreendida entre 37 e 75°C) e o alongamento das cadeias (hélices) do ADN pela ADR polimerase.

As bases tecnológicas da PCR acentam sobre dois pontos fundamentais : utilização de dois iniciadores oligonucleotídicos, um complementar da hélice ADN-r, o outro da hélice ADN - e em que as extremidades 3' são simétricas; utilização repetitiva da actividade de uma ADN polimerase apropriada. A PCR permite, por conseguinte, a utilização, em condições adequadas, de todas as sequências neo-sintelizadas no ciclo n como matriz, para a ADN polimerase no ciclo (n + 1). Resulta uma amplificação exponencial do numero de sequências de ácidos nucleicos alvos em função do número de ciclos de acordo com a curva de amplificação que compreende uma fase exponencial em que a quantidade Q de sequências alvo obtidas pode estar ligada â quantidade Qo de sequências alvo iniciais, ao factor de amplificação x e ao número de ciclos n de acordo com a seguinte fórmula : Q = Qo (1 + x)n. -3- L .- A PCR permite assim amplificar, de maneira exponencial, sequências de ácidos nucleicos, ditas alvos, milhares de vezes.

Esta técnica de amplificação está mais particularmente descrita no pedido de patente de invenção europeia CETUS 201 184, que especifica especialmente que os dois iniciadores oligonucleo-tídicos utilizados na PCR são, de preferência, de hélice simples e devem ser suficientemente longos para iniciar a síntese do produto de extensão na presença da ADN polimerase.

Propos-se um certo número de melhoramentos ou aperfeiçoamentos a esta técnica e particularmente, para evitar a adição de enzimas a cada ciclo, adicionou-se desde o início do processo uma ADN polimerase que pode resistir a 100°C, a Taq polimerase descrita no pedido de patente de invenção europeia CETUS 258 017, permitindo realizar um número importante de ciclos de amplificação consecutivos. A Taq polimerase permitiu, por um lado, automatizar o processo de amplificação e, por outro lado, aumentar a especificidade da amplificação. A PCR permite assim obter, sem clonagem, uma amplificação considerável de uma sequência nucleica, dita sequência alvo, e, por conseguinte, um enorme ganho de sensibilidade. A sequência alvo amplificada é em seguida, directamente acessível a diferentes processos de análise tais como o processo "dot-blot", a electrofo-rese ou a sequenciação. Dois pedidos de patente de invenção -4-

(pedidos de patente de invenção europeia CETUS N9. 200 362 e N9. 229 701) descrevem mais particularmente a associação amplifi-cação-hibridação para a detecção de uma sequência de ácido nucleico pretendido em uma amostra.

Foram, depois, propostos variantes e/ou aperfeiçoamentos e a PCR é actualmente largamente utilizada tanto em biologia molecular como em clínica (diagnóstico de doenças genéticas e detecção de microrganismos patogénicos). Contudo, a utilização em rotina desta técnica fez aparecer um inconveniente importante, ligado â sua extrema sensibilidade, a saber o aparecimento de falsos-positivos, que se revelaram estar ligados depois de uma análise cuidadosa dos resultados, a uma contaminação da amostra a analisar.

Um certo número de artigos, que têm vindo a aparecer desde há cerca de dois anos, descrevem tais casos de contaminações e propõem meios para os resolver. Estes artigos descrevem um tipo de contaminação inesperado, a saber a contaminação por sequências iguais âs pretendidas. Y.M.D. LO e colab., em um artigo descrito em Lancet (1988, ii, 679), fazem ressaltar este inconveniente da reacção de polimerização em cadeia, devido à sua sensibilidade e, para atenuar este inconveniente importante, preconizam um cuidado particular na preparação da matriz de ADN antes da amplificação. LO e colab. descrevem mais particularmente um exemplo de contami- nação em um diagnóstico de sequências HBV e demonstram um resultado positivo obtido a partir de amostras negativas : amplificaram-se sequências HBV a partir de amostras negativas, sendo realizada uma verificação da ausência de sequências a detectar, na amostra, mediante uma técnica Southern Blot. LO e colab. analisaram este resultado como sendo uma contaminação dos iniciadores utilizados, pelos plasmídeos contendo o encherto HBV (plasmídeo pHBV 130), na medida em que, logo que se livram dos iniciadores contaminados, não há mais amplificações falsamente positivas em amostras negativas. LO e colab. sugerem que, na medida em que a PCR é cada vez mais utilizada em diagnóstico, o problema dos falsos positivos, por contaminação por sequência iguais ãs a detectar, não pode ser descorado. LO e colab. propõem a realização sistemática de um testemunho dito negativo constituído unicamente por reagentes da PCR para determinar a eventual contaminação plasmídica destes reagentes. LO colab. propõem igualmente a verificação da existência de uma contaminação plasmídica por amplificação na presença de iniciadores correspondendo às sequências colocadas de um e de outro lado da junção vector-encherto do referido plasmídeo. Este procedimento i especialmente necessário se forem obtidos resultados comflituais por métodos convencionais tais como a Southern Blot. -6- /\ É contudo necessário notar que o problema da contaminação pela presença de um plasmídeo vector do fragmento alvo apenas se põe no quadro dos laboratórios de pesquisa enquanto os laboratórios de diagnóstico (laboratórios de análises clínicas por exemplo), efectuam identificações de rotina dispõem de reagentes prontos a utilizar e que neste caso, é importante evitar a contaminação da matriz por outros produtos para além dos plasmídeos (produtos da PCR, virus livres por exemplo) para a realização de um diagnóstico fiável, não podendo esta contaminação ser evitada, na opinião de LO e colab., actualmente. R.A.GIBBS e colab., em um artigo descrito em "Genes & Development", 1989, 3, 1095-1098, propõem os seguintes conselhos : isolar todos os reagentes utilizados para a realização da PCR dos equipamentos utilizados para analisar os produtos obtidos; utilizar tampas de rosca e chegar mesmo a congelar os conteúdos, antes de efectuar a reacção final, para evitar a formação de aerossóis; limitar o número de ciclos de amplificação ao mínimo, simultaneamente para reduzir o risco de amplificar pequenas quantidades de contaminantes já presentes e para reduzir a quantidade total de produtos de reacção e dispor de jogos de pipetas diferentes para cada trabalho. G. SARKAR e colab., em um artigo descrito em "Nature", 1990, 343, 27, propõem, para evitar esta contaminação, tratat a amostra com raios UV, antes de se adicionar a matriz do ADN a amplificar. S. KWOK e colab., em um artigo descrito em "Nature", 1989, 339, 237-238, propõem um certo número de "boas práticas de laboratório" para controlar e evitar a contaminação : isolar fisicamente as preparações e os produtos para PCR (peças separadas, radiações UV, etc.); autoclavar os tampões utilizados; fraccionar os reagentes em pequenas amostras a fim de evitar uma pipetagem repetida utilizar luvas de protecção quando das manipulações evitar projecções; utilizar pipetas que não provoquem o aparecimento de aerossóis contendo amostras de ADN; pré-misturar os reagentes que o possam ser para diminuir o número de manipulações contaminantes; adicionar o ADN em último lugar; escolher cuidadosamente os controlos positivos e negativos. A contaminação descrita por estes diferentes Autores é, por conseguinte, uma contaminação pelas sequências iguais âs a detectar, ditas consequências alvos resultantes, na maior parte dos casos, no laboratório de análises clínicas, de amplificações anteriores, e que produzem um grande número de cópias, levando a uma acumulação dos fragmentos alvos amplificados e determinando particularmente na presença ubiquitária das sequências alvo no laboratório de análises clínicas. Contudo, o conjunto das sugestões propostas pelos diferentes Autores citados anteriormente, para evitar esta contaminação, tem o inconveniente de ser particularmente incómodo e difícil de realizar na rotina. -8-

Além disso, estas diferentes sugestões não permitem eliminar sistematicamente a contaminação devida à presença de sequências alvo resultantes de amplificações anteriores.

Por este motivo, a Requerente tem por objectivo a realização de um processo de amplificação de sequências alvo, que responda melhor às necessidades da prática que os processos anteriores, particularmente pelo facto de permitir impedir a amplificação exponencial dos ácidos nucleicos de hélice dupla contaminantes, quer dizer das sequências iguais âs sequências a detectar, amplificadas quando de testes anteriores no laboratório e que podem conduzir a resultados falsamente positivos.

Entende-se, no sentido da presente invenção, por sequência contaminante, um fragmento de ácido nucleico curto que corresponde a um fragmento de ADN genómico a detectar (sequência alvo) e que possui na sua extremidade 5' um iniciador integrado.

Entende-se, no sentido da presente invenção, por sequência alvo, uma sequência definida pelos iniciadores de amplificação que a enquadram, estando aquela sequência incluída em um ácido nucleico de sequência longa, ADN genómico particularmente. A presente invenção tem por objectivo um processo para a detecção e/ou identificação de uma sequência de um ácido nucleico ou de uma mistura de sequências de ácidos nucleicos compreendendo -9r

uma amplificação enzimãtica, caracterizado pelo facto de apôs se realizar uma solução apropriada da amostra biológica, para extrair o/os ácidos nucleicos, compreender as seguintes etapas : (1) uma etapa de destruição das extremidades 5' das sequências de ácido nucleico de hélice dupla presentes na amostra, mediante contacto da referida amostra biológica com um reagente apropriado, activo a tuna temperatura compreendida entre 37° e 42°C; (2) uma etapa de amplificação propriamente dita mediante contacto da amostra obtida em (1) com reagentes apropriados, particularmente iniciadores de amplificação apropriados para a amplificação da/das sequências alvo a detectar, na presença de uma ADN polimerase termorresistente; (3) uma etapa de detecção das sequências alvo específicas amplificadas.

De acordo com um modo de realização vantajoso do processo segundo a presente invenção, o reagente da etapa (1), denominado reagente de descriminaçao entre sequências contaminantes e sequências alvo, é escolhido no grupo que compreende produtos químicos convenientes e enzimas que actuam em meio alcalino fraco. -ΙΟ Ν

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, a enzima é uma 5' exonuclease apropriada, de preferência a 5' lambda exonuclease.

De acordo com uma modalidade vantajosa desta disposição, os iniciadores usados para a amplificação da etapa (2) são fosfori-lados nas suas extremidades 5'. A lambda exonuclease tem a propriedade de destruir as extre midades 5' dos ácidos nucleicos de hélice dupla quando as referidas extremidades são fosforiladas. A acção desta 5' lambda exonuclease está mais particularmente descrita nos artigos de J. W. LITTLE (MJ. Biol. Chem.", 1967, 242, 4, 672-686). A realização da etapa 1 anteriormente referida é crucial para evitar as contaminações pelas sequências iguais à que se pretende detectar.

Com efeito, como se referiu antes, as sequências contami-nantes correspondem a sequências relativamente curtas comportando nas suas extremidades os iniciadores de amplificação utilizados quando de amplificações anteriores (produtos de extensão do iniciador), enquanto as sequências alvo a detectar, definidas pelos iniciadores de amplificação que os enquadram (mesmo os iniciadores incorporados nas sequências contaminantes), estão incluídas em um ácido nucleico de sequência longa (particularmente ADN genómico).

Durante a etapa (1) do processo de acordo com a presente invenção, o reagente de discriminação é mais particularmente a 5' exonuclease, que tem a propriedade de destruir os nucleotidos de um ácido nucleico de hélice dupla unicamente, gradualmente, no sentido levando á obtenção de ácidos nucleicos cujas extremidades 5' estão destruídas em uma extensão dependente do tempo de acção da 5' exonuclease, enquanto não destrói as extremidades 5' do ADN de hélice simples (iniciadores ou ADN desnaturado, por exemplo).

Quando da etapa (2) do processo de acordo com a presente invenção, as sequências de ácido nucleico curtas (sequências conta minantes) e as sequências de ácido nucleico grandes (sequências comportando a sequência alvo a detectar) vão em virtude da acção do reagente de discriminação e mais particularmente da 5' exonuclease, comportar-se diferentemente : no que respeita âs sequências contaminantes, que apenas compreendem, com efeito, a sequência alvo e os iniciadores de amplificação incorporados nas extremidades, apenas haverá extensão a partir de um único iniciador de amplificação, na medida em que as extremidades 5' estão destruídas; uma tal extensão apenas leva -12-

a um aumento linear destas sequências contaminantes; se se considerar que durante a etapa (2) se efectuaram n ciclos sucessivos de amplificação, as sequências contaminantes apenas serão amplifi cadas 2 n vezes, o que pode ser considerado como uma amplificação descorável, em relação a uma amplificação exponencial que leva à formação de 2n sequências amplificadas. no que diz respeito âs sequências alvo a detectar pelo contrário, a destruição das extremidades 5' não afecta a zona da sequência longa de ácido nucleico em que se encontram as sequências alvo; haverá, por conseguinte, extensão a partir dos dois iniciadores de amplificação; uma tal extenção leva a um aumento exponencial das referidas sequências alvo (produção de 2n sequências, quando de n ciclos sucessivos de amplificação) e permitirá uma detecção fácil das referidas sequências. A duração da acção do reagente de discriminação e mais parti, cularmente da 5' exonuclease pode variar entre alguns minutos e mais de 1/2 hora, de acordo com os casos. 0 processo de acordo com a presente invenção permite, por conseguinte, de maneira inesperada, pela destruição das extremidades 5' dos ácidos nucleicos de hélice dupla presentes na amostra, evitar a amplificação exponencial das sequências contaminantes, não afectando no entento a amplificação exponencial das sequências alvo incluídas particularmente em um ADN genómico. -13-

De salientar que, mesmo no caso menos favorável, quer dizer quando a sequência alvo se encontra na extremidade 5' do ADN genó-mico, esta mesma sequência alvo, sobre a cadeia negativa, está longe da extremidade 5' e estará por conseguinte, na origem de uma amplificação exponencial. A etapa (1) do processo de acordo com a presente invenção torna vulnerável os fragmentos de ácido nucleico de hélice dupla curtos, enquanto nos fragmentos de ácidos nucleicos longos, a sequência alvo será protegida e sempre amplificada exponencialmente . A figura 1 ilustra o processo de amplificação exponencial clássico, obtido mediante PCR, partindo de um ácido nucleico dito contaminante tal como definido antes, quer dizer cujas extremidades estão definidadas pelas extremidades 5' dos iniciadores A e B utilizados.

Quando de uma tal amplificação, haverá extensão das cadeias a partir dos dois iniciadores e a sequência contaminante será amplificada exponencialmente, mesmo na ausência de sequências alvo na amostra a analisar : ao fim de n ciclos, obtêm-se 2n exemplares da sequência contaminante. Em 20 ciclos, a sequência inicial está em princípio amplificada um milhão de vezes. -14-

Pelo contrário, quando da realização do processo de acordo com a presente invenção, as sequências contaminantes na presença da 5' exonuclease por exemplo, não levam â obtenção de falsos positivos, visto que apenas são amplificadas linearmente como o demostra a figura 2, onde se vi que apenas há extensão a partir de um único iniciador e não dos dois.

Com efeito, como referido anteriormente, uma amplificação linear para n ciclos leva somente à formação de 2n sequências. 0 Quadro I a seguir mostra o número de cópias após uma ampli ficação de uma sequência dita contaminante, sem tratamento prévio com uma 5' exonuclease (coluna A e figura 1, amplificação exponencial clássica), e com tratamento prévio com uma 5' exonuclease (coluna B e figura 2, amplificação linear).

QUADRO I

Ciclos A Contaminante não tratado B Contaminante modificado 1 2 2 2 4 3 3 8 4 4 16 5 5 32 6 6 64 7 7 128 8 8 256 9 9 512 10 10 1024 11 11 2048 12 12 4096 13 13 8192 14 14 16384 15 15 32768 16 16 65536 17 17 131072 18 18 262144 19 19 524288 20 20 1048576 21 21 2097152 22 22 4194304 23 23 8388608 24 24 16777216 25 25 33554432 26 26 67108864 27 27 134217728 28 28 268435456 29 29 536870912 30 30 1073741824 31 6-

De acordo com um outro modo de realização vantajoso do referido processo, a etapa (1), a saber a etapa de destruição das extremidades 5' das sequências de ácido nucleico de hélice dupla, realiza-se apenas uma vez enquanto a etapa (2) se repete pelo menos uma vez.

Com efeito, no processo de acordo com a presente invenção, o reagente de discriminação e mais particularmente a 5' exonu-claesa apenas deve actuar uma vez, antes do primeiro ciclo da etapa de amplificação, para evitar a amplificação exponencial das sequências contaminantes; deve ser termo-sensível, para poder ser facilmente utilizável em um processo automatizado.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso do processo segundo a presente invenção, a etapa (2) do referido processo realiza-se, além disso, na presença de uma ADN polimerase termo-sensível. A associação de uma polimerase termo-sensível, activa a 37°C com uma polimerase termorresistente tem a vantagem de permitir a resolução de pelo menos dois problemas ligados â realização de uma PCR : reparar as sequências contaminantes obtidas a partir de uma PCR, em que os últimos ciclos de amplificação têm maus rendimentos, (obtenção de contaminantes de hélice simples, por exemplo, que não serão portanto destruídos pelo processo de acordo com a presente invenção), no caso da aplicação da PCR ao ARN, a associação de uma ADN polimerase ARN dependente com uma polimerase termorresistente permite a realização da PCR sobre partículas virais com ARN, em uma só etapa. 0 processo de acordo com a presente invenção tem a vantagem de modificar, no início da reacção, os fragmentos alvo amplificados por ocasião de manipulações anteriores (contaminantes), sem modificações importantes do ADN plasmídico ou genomico em que se encontre a sequência alvo a detectar. Depois deste tratamento, o fragmento alvo amplificado já não pode servir de matriz para uma amplificação exponencial, enquanto o ADN plasmídico ou genomico mantêm sempre a matriz inicial. A presente invenção tem igualmente por objectivo uma composição enzimãtica para a realização de um processo de detecção de acordo com a presente invenção, caracterizada pelo facto de compre ender um reagente destruidor das extremidades 5' das sequências de ácido nucleico de hélice dupla, dito reagente de discriminação entre sequências contaminantes e sequências alvo e uma ADN polimerase termorresistente.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso da referida composição, o referido reagente de discriminação é uma 5' exonuclease termosensível.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso da composição referida, ela compreende, além disso, uma ADN polime-rase activa a 37°-42°C (termo-sensível). A presente invenção tem, além disso, por objectivo um estojo, Kit ou conjunto coordenado, pronto a utilizar, para a realização do processo de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo facto de compreender, além das quantidades úteis de tampões e reagentes convenientes, pelo menos um par de iniciadores apropriado e, eventualmente, pelo menos uma sonda apropriada, doses apropriadas de uma composição enzimática de acordo com a presente invenção.

Além das disposições anteriores, a presente invenção compreende ainda outras disposições, que sobressairão da descrição que se segue, que se refere a exemplos de realização do processo de acordo com a presente invenção.

Deve ficar claramente entendido, contudo, que estes exemplos são unicamente dados a título de ilustração do objectivo de acordo com a presente invenção, não constituindo, portanto, de nenhuma maneira uma limitação. -19-

De uma maneira geral, o processo de acordo com a presente invenção permite eliminar os falsos positivos devidos â contaminação por sequências iguais às sequências a detectar, previamente amplificadas quando de ensaios anteriores, no laboratório.

Exemplo 1 : Detecção de "Chlamydia trachomatis" pelo processo de acordo com a presente invenção, na presença de ÀDN polimerase termorresistentes comparação com uma amplificação clássica (PCR).

Amostras de ADN de "Chlamydia" obtidas a partir do plasmldeo críptico desta bactéria são submetidas a uma amplificação em um

cada um dos iniciadores apropriados fosforilados em 5', 200ja,M de cada um dos quatro desoxiribonucleotidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Tris 10 mM pH 8; KC1 50 mM; MgC^ 5 mM, 1 unidade de 5' 3' polimerase termorresistente e uma unidade de 5' lambda exonuclease termo-sensível. O protocolo ê o seguinte : aquecem-se as amostras a 37°C durante 15 minutos (acção da exonuclease) e submetem-se, em seguida, a uma amplificação compreendendo 25 ciclos, comportando cada ciclo : aquecimento a 92°C durante 15 segundos, arrefecimento a 55°C durante um minuto seguido de aquecimento a 72°C durante um minuto. As amostras são então conservadas a 72°C durante 10 minutos.

Os produtos da PCR sao separados mediante electroforese em gel de agarose (1,4%), previamente corado com brometo de etídeo. 0 ADN ê então detectado mediante exposição aos raios U.V..

Em comparação, realizam-se PCR clássicas (sem adição de 5' exonuclease), de acordo com o mesmo protocolo.

Esta comparação, tem por objectivo demonstrar as vantagens do processo de acordo com a presente invenção, a saber que a lambda exonuclease não tem efeito sobre o rendimento das PCR feitas a partir do ADN genómico enquanto diminui fortemente o rendimento da PCR realizada a partir de sequências contaminantes tais como as definidas anteriormente, fosforiladas na sua extremidade 5'. A figura 3, no seu conjunto, ilustra esta comparação e mostra a eliminação dos falsos positivos, obtida pelo processo de acordo com a presente invenção, quando os produtos da PCR realizada em condições diferentes, referidas anteriormente, são separados mediante electroforese em gel de agarose (1,4%), corado com brometo de etídeo, como referido antes. -21- -21-

Comportando : na colona 1 : os produtos de amplificação obtidos por PCR clássica, na presença de iniciadores fosforilados, a partir de uma amostra contendo um plasmídeo criptico de "Chlamydia"; na coluna 2 : os produtos de amplificação obtidos pelo processo de acordo com a presente invenção (acção da 5 '. lambda exonu clease + PCR), na presença de iniciadores fosforilados, a partir de uma amostra contendo um plasmídeo criptico de "Chlamydia"; na coluna 3 : os produtos da amplificação obtidos mediante PCR clássica, na presença de iniciadores fosforilados, a partir de uma amostra negativa contendo contaminantes fosforilados na sua extremidade 5'; na coluna 4 ; os produtos de amplificação obtidos pelo processo de acordo com a presente invenção (acção da 5' lambda exonuclease + PCR), na presença de iniciadores fosforilados, a partir de uma amostra negativa contendo contaminantes fosforilados na sua extremidade 51; na coluna 5 : os produtos de amplificação obtidos mediante uma PCR clássica, a partir de uma amostra negativa contendo contaminantes não fosforilados na sua extremidade 5'; -22-

na coluna 6 : os produtos de amplificação obtidos pelo processo de acordo com a presente invenção (5* lambda exonuclease + PGR), a partir de uma amostra negativa contendo contaminantes não fosforilados na sua extremidade 5'.

Sobressai desta figura que : a presença da 5' lambda exonuclease não influi na ampli ficação propriamente dita (coluna 1 e coluna 2); na ausência de 5’ lambda exonuclease, uma amostra negativa dá um resultado falsamente positivo (coluna 3), enquanto este mau resultado desaparece, na presença de 5' lambda exonuclease (coluna 4); é preciso salientar que nas colunas 3 e 4 se observa uma ligeira banda que corresponde a fragmentos não específicos, banda habitualmente reencontada quando de amplificações conduzidas na ausência de uma matriz de ADN. - quando se utiliza a 5' lambda exonuclease, os contaminantes fosforilados na sua extremidade 5' são muito mais sensíveis a esta última (colunas 5 e 6).

Exemplo 2 : Detecção de "ChLamydia trachomatis" pelo processo de acordo com a presente invenção. -23-

A reacção efectua-se como segue :

Amostras de ADN de "Chlamydia resultantes de amostras clínicas são adicionadas a um tampão de reacção contendo : Tris--HC1 (pH 8,4) 10 mM; KC1 50 mM; MgC^ 2 mM; desoxiribonucleotido trifosfatos (dNTP) : 200 de cada iniciador : 1 jjM de cada, 0,03 unidade de ADN lambda exonuclease por jjX de reacção, 0,02 unidade de ADN polimerase termorresistente por juQ. de reacção.

Aquecem-se as amostras a 37°C durante 20 minutos e subme-tem-se aos 25 ciclos sucessivos seguintes : aquecem-se as amostras a 90°C durante 15 segundos, arrefecem-se a 55°C durante um minuto e aquecem-se a 72°C durante um minuto. As amostras são, então, conservadas a 72°C durante 10 minutos.

Os produtos da PCR obtidos com os seguintes iniciadores : iniciador 1 (+) : 5' - TTCCCGTTGTAATTCGTTGC - 3' iniciador 2 (-) : 5' - TAGTAAC T GC CAC TT CAT CA - 3' fosforilados de maneira clássica por uma polinucleotido quinase, apresentam 201 pares de bases e são separados em gel de agarose corado com brometo de etídeo. 0 ADN detecta-se então mediante exposição aos raios U.V.. Os produtos da PCR podem igualmente ser revelados mediante auto-radiografia, após realização de uma

Soutbern Blot sobre filtro Hybond N (Amersham) com uma sonda de ARN de hélice simples, específica dos produtos referidos, marcada 32 quer com p (figura 4 : coluna 1 : marcadores; coluna 2 : -24-

testemunha negativo; coluna 3 : testemunha positivo; coluna 4 : amostra clínica negativa; colunas 5 e 6 : amostras clínicas positivas) quer com Dig-dUTP (figura 5 : coluna 1 : marcadores; coluna 2 : testemunha positiva; coluna 3 : testemunha negativa; coluna 4 : amostra clinica negativa; colunas 5 e 6 : amostras clinicas positivas). As amostras clínicas contendo ADN genõmico de "Chla-mydia trachomatis" detectam-se bem na presença de lambda exonu-clease (figura 4 : colunas 3 e 4; figura 5 : colunas 5 e 6).

Exemplo 3 ; Papel da concentracção em contaminantes.

Preparam-se sequências ditas contaminantes de citomegalo-virus (CMV).

Trata-se de produtos de extensões de iniciadores fosfori-ladas, obtidos quando de amplificações anteriores. Estas sequências contaminantes contêm, portanto, unicamente sequências alvo contendo nas suas extremidades os referidos iniciadores fosfori-lados.

As referidas sequências contaminantes são obtidas mediante purificação a partir de uma electroforese em gel de agarose, depois mediante electroeluição, precipitação com etanol, suspensão em água e quantificação com "DNA DIPSTRICK a partir de INVITROGEN 1 - 800 - 544 - 4684". -25-

Diluem-se, em seguida, as sequências contaminantes assim obtidas, de modo a obter-se cerca de 10^ cópias em 15 jjtX de água. Efectuam-se, em seguida, diluições em série, de ordem 5, para se poder determinar o número de cópias em cada amostra, antes de realizar cada PCR.

Submetem-se, em seguida, as diferentes amostras quer a uma PCR clássica (ausência de 5' lambda exonuclease), quer a uma PCR na presença de 5' lambda exonuclease (processo de acordo com a presente invenção). O papel da 5' lambda exonuclease, em função da concentração em produto contaminante, é demonstrado na figura 6.

Os produtos da PCR são separados mediante electroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio e o ADN é detectado mediante exposição aos raios U.V.. A figura 6 mostra os seguintes resultados : na coluna 1, tem-se marcadores de peso molecular (Marker VI, Boehringer); 5 na coluna 2 : 10 copias de sequências CMV contaminartes amplificadas na ausência de 5' lambda exonuclease; -26

C a na coluna 3 : lCr copias de sequências CMV contaminantes amplificadas, após 20 minutos de contacto com a lambda exonuclease (0,03 U/

na coluna 4 : 2.104 cópias de sequências CMV contaminantes amplificadas na ausência de lambda exonuclease; na coluna 5 : 2.10^ cópias de sequências CMV contaminantes amplificadas após 20 minutos de contacto com a lambda exonuclease (0,03 U/jJiX) ·, na coluna 6 : 4.10-3 cópias de sequências CMV contaminantes amplificadas na ausência de lambda exonuclease; O ^ na coluna 7 : 4.10 cópias de sequências CMV contaminantes amplificadas na presença de lambda exonuclease (0,03 U/ Λΐ/l, tempo de contacto : 20 minutos).

Desta figura sobressai : que na ausência de lambda exonuclease se obtêm uma banda correspondente às sequências CMV (colunas 2, 4 e 6); enquanto na presença de lambda exonuclease e qualquer que seja a concentração em sequências contaminantes, não se obtêm nenhuma banda (colunas 3, 5 e 7). -27-

Exemplo 4 : Papel da lambda exonuclease sobre o ADN genómico contendo uma sequência alvo a detectar.

Diferentes ADN genómicos foram utilizados para determinar o papel da lambda exonuclease sobre diferentes ADN. Diferentes herpes virais e o vírus do papiloma foram mais particularmente estudados. 1) Herpes virais :

Os ADN obtém-se a partir de linhas celulares infectadas com os seguintes herpes virais humanos : HSV2, CMV, VZ e EBV.

Realizam-se diluições em série antes de se efectuar as PCR na presença de iniciadores apropriados para os diferentes virus, apresentando 20 a 30 nucleotidos e fosforilados de maneira clássica por uma polinucleotido quinase.

Para realizar a PCR, juntam-se as referidas amostras a um tampão contendo : Trio-HCl (pH 8,4) 10 mM; KCL 50 mM; MgC^ 2 mM; gelatina 0,01%; dNTP : 200yUK de cada; iniciadores apropriados : lyt^M de cada; TAQ polimerase (CETUS PERBIN-ELMER) : 0,02 U/^l de reacção; lambda exonuclease (BRL) 0 ou 0,03 U/de reacçio de acordo com o processo utilizado (PCR clássica ou processo de acordo com a presente invenção, respectivamente).

Submetem-se as amostras aos diferentes ciclos térmicos seguintes : 1 vez : 37°C durante 20 minutos; 92°C durante 1 minuto (acção da lambda exonuclease se tiver lugar); 30 vezes : 92°C durante 15 segundos; 55°C durante 1 minuto; 72°C durante 1 minuto (PCR propriamente dita); 1 vez : 72°C durante 10 minutos.

Submetem-se os produtos da amplificação a uma electroforese sobre gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e fotografam-se sobre placas U.V..

Os marcadores de peso molecular utilizados (Marker VI, Boehringer) têm os seguintes tamanhos : 2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394, 298, 234, 220, 154.

De acordo com o virus detectado, obtêm-se os seguintes resultados : l.a. Virus Varicela zona (VZV) :

Submetem-se diluições seriadas de ordem 2 de ADN genõmico de células infectadas pelo virus varicela zona, a uma PCR com iniciadores VZV fosforilados apropriados, na presença e na ausência de lambda exonuclease, como referido anteriormente.

Os produtos da PCR obtidos com os seguintes iniciadores : iniciador 1 (+) : 5' - ATGGGGTATGCATACGTCGAGGCGGTTGAC - 3’ iniciador 2 (-) : 5' - ATATTGAAGCAAATCGCGACATCGTACTAC - 3' apresentam 189 pares de bases.

Após electroforese sobre gel de agarose, como referido antes, obtêm-se os resultados ilustrados na figura 7, em que as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exonuclease e as colunas pares representam uma PCR realizada na presença de lambda exonuclease.

Sobressai desta figura, que uma detecção realizada a partir de um ADN genómico longo não i influenciada pela presença da lambda exonuclease.

Obtêm-se os mesmos resultados com outros herpes virais, como referido anteriormente : l.b. EBV :

Submetem-se diluições seriadas de ordem 10 de ADN genómico de células infectadas pelo virus de Epstein-Barr, a uma PCR com iniciadores EBV fosforilados apropriados, na presença e na ausência -30- de lambda exonuclease, como referido antes.

Os produtos da PCR obtidos com os seguintes iniciadores : iniciador 1 (+) : 5' - AGAGGTTCAGGGACTTGTCCTCTATCGTCT - 3' iniciador 2 (-) : 5' - TTACCAACAACATGCTGATTGGCGACAACA - 3' apresentam 282 pares de bases.

Após electroforese sobre gel de agarose, como referido anteriormente, obtem-se os resultados ilustrados na figura 8, na qual as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exunoclease e as colunas pares representam uma PCR realizada na presença de lambda exonuclease. l.c. HSV2 :

Submetem-se diluições seriadas de ordem 10 de ADN genómico de células infectadas pelo virus herpes simplex 2, a uma PCR com iniciadores HSV fosforilados apropriados, na presença e na ausência de lambda exonuclease.

Os produtos da PCR obtidos com os seguintes iniciadores : iniciador 1 (+) : 5' - TTCCCGGTCGCCGGGCACCACCACGCCGTA - 3' iniciador 2 (-) : 5' - TTCGCTTCATCGCCACGAAGACCAACGACG - 3' apresentam 185 pares de bases. -31-

Após electroforese sobre gel de agarose, como referido antes, obtem-se os resultados ilustrados na figura 9, na qual as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exonu-clease e as colunas pares representam uma PCR realizada na presença de lambda exonuclease.

Para a detecção do sitomegalovirus, procede-se como descrito antes, na presença dos seguintes iniciadores : iniciador 1 (+) : 5' - ACGGCGTTCCCCCATAAAGTCACGTAACAC - 3' iniciador 2 (-) : 5' - CGCCGAGAAACACGGCGGACGCATCGACGG - 3’ e obtem-se um fragmento amplificado de 259 pares de bases. 2) Vírus do papiloma (HPV 11) :

Submetem-se diluições seriadas de ordem 2 de ADN genõmico, obtido a partir de um condiloma anal colhido em um doente, a uma PCR de acordo com o protocolo descrito em 1), com iniciadores HPV 11 fosforilados apropriados, na presença e na ausência de lambda exonuclease.

Os produtos da PCR obtidos com os seguintes iniciadores : iniciador 1 (+) : 5’ - TGGTACTTTGCACGCAGACGCCGTA - 3’ iniciador 2 (-) : 5' - ATGATAAAATATGTTGGTGCGTTTA - 3’ apresentam 154 pares de bases. -32-

Cr

Após elecrtoforese sobre gel de agarose, como se descreveu antes obtem-se os resultados ilustrados na figura 10, na qual as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exonu-clease e as colunas pares representam uma PCR realizada na presença de lambda exonuclease.

Os resultados ilustrados nas figuras 7 a 10 demonstram que a lambda exonuclease não modifica o rendimento de uma amplificação realizada a partir de uma matriz de ADN genómico (fragmento longo).

Exemplo 5 : Papel da lambda exonuclease sobre as sequên cias ditas contaminantes.

Isolam-se os ADN contaminantes mediante electroforese sobre gel de agarose e submetem-se, em seguida, a uma difusão passiva a 4°C em água.

Os produtos contaminantes assim obtidos são diluídos como descrito antes no exemplo 4.1.) e o protocolo PCR ê igual ao descrito no exemplo 4.1.).

Os resultados obtidos com CMV, EBV e VZV como sequências contaminantes estão ilustrados nas figuras 11, 12 e 13 e demonstram que a presença da exonuclease diminui muito fortemente o rendimento de amplificação destas sequências contaminantes. -33-

a CMV :

Submetem-se as diluições seriadas de ordem 5 de produtos da amplificação obtidos mediante PCR com iniciadores CMV fosfori-lados apropriados, a uma PCR com os mesmos iniciadores com e sem lambda exonuclease.

Apõs electroforese sobre gel de agarose, como descrito no exemplo 4, obtêm-se os resultados ilustrados na figura 11, na qual as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exonuclease e as colunas pares representam uma PCR realizada na presença de lambda exonuclease. b. EBV :

Submetem-se diluições seriadas de ordem 5 de produtos da amplificação obtidos mediante PCR com iniciadores EBV fosforilados apropriados, a uma PCR com os mesmos iniciadores, com e sem lambda exonuclease.

Apõs electroforese sobre gel de agarose, como descrito antes, obtem-se os resultados ilustrados na figura 12, na qual as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exonuclease e as colunas pares representam uma PCR realisada na presença de lambda exonuclease. -34-

c. VZV :

Submetem-se diluições seriadas de ordem 5 de produtos de amplificação obtidos mediante PCR com iniciadores VZV fosforilados apropriados, a uma PCR com estes mesmos iniciadores, na presença e na ausência de lambda exonuclease.

Após electroforese sobre gel de agarose, como descrito antes, obtem-se os resultados ilustrados na figura 13, na qual as colunas impares representam uma PCR realizada sem lambda exonuclease e as colunas pares representam uma PCR realizada na presença de lambda exonuclease.

Exemplo 6 : Acção de concentrações crescentes de lambda exonuclease sobre o rendimento de amplificação de ADN genómico.

Uma quantidade constante de ADN genómico obtido a partir de células infectadas com VZV é submetida a uma PCR na presença de quantidades crescentes de lambda exonuclease (0; 0,36; 0,18; 0,09; 0,045; 0,0225 U/ ul) de acordo com o protocolo anteriormente descrito, no exemplo 4.

Os resultados estão ilustrados na figura 14, na qual as colunas 1 a 7 correspondem sucessivamente às diferentes concen-

trações de lambda exonuclease referidas anteriormente. Esta figura mostra que 0,09 U/ ιύ. de lambda exonuclease não diminui o rendimento da PCR; isto mostra que uma concentração de 0,03 U/ 1 de reacção é absolutamente conveniente.

Sobressai, assim, do anteriormente descrito, que a presente invenção não se limita de modo nenhum a estes modos de utilização, realização e de aplicação que acabam de ser descritos de forma mais explicita; pelo contrário engloba todas as variantes que possam vir ao espírito do técnico na matéria, sem se sair do quadro, nem do alcance, da presente invenção.

Claims

L -36- f REIVINDICAÇÕES 1,- Processo de detecção e/ou de identificação de uma sequência de ácido uucleico ou de uma mistura de sequências de ácidos nucleicos, compreendendo uma amplificação enzimática, caracte-rizado pelo facto de, após dissolução apropriada da amostra biológica, para extrair o/os ácido(s) nucleico(s), compreender as seguin tes etapas: (1) uma etapa de destruição das extremidades 5' das sequências de ácido nucleico de hélice dupla presentes na amostra, mediante contacto da referida amostra biológica com um reagente apropriado, activo a uma temperatura compreendida entre 37°C e 42°C; (2) uma etapa de amplificação propriamente dita mediante contacto da amostra obtida em (1) com reagentes apropriados,particularmente iniciadores de amplificação apropriados para a amplificação da/das sequenciais) alvo (s] e detectar, na presença de uma ADN-polimerase termo-resistente; (3) uma etapa de detecção das sequências alvos específicas -3 amplificadas.

1 a 6, caracterizado pelo facto de se realizar, etapa (2) do referido processo, além disso, na presença de uma ADN polimerase termo-sensível.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o reagente da etapa (1), denominado reagente de discriminação entre sequências contaminantes e sequências alvos, no grupo que compreende produtos químicos convenientes e enzimas que actuam em meio alcalino fraco.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a enzima ser uma 5'-exonuclease.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a 51-exonuclease ser a 51-lambda-exonuclease.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de os iniciadores utilizados para a amplificação da etapa (2) serem fosforilados nas suas extremidades 5'.

6,- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de a etapa (1), a saber a etapa de destruição das extremidades 5' das sequências de ácido nulceico de hélice dupla, se realizar apenas uma vez enquanto se repete a etapa (2) pelo menos uma vez.

7.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

8. - Processo para a preparação de uma composição enzimática utilizada em um processo de detecção de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se misturar um reagente de destruição das extremidades 5' das sequências de ácido nucleico de hélice dupla, um reagente de discriminação entre sequências contaminantes e sequências alvos e uma ADN polimerase termo-resistente.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido reagente de discriminação ser uma 5'-exo-nuclease termo-sensível.

10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 e 9, caracterizado pelo facto de se incluir ainda uma ADN polimerase activa a uma temperatura compreendida entre 37° e 42°C (termo-sensível).

11. - Estojo, caixa ou conjunto coordenado, pronto a utilizar para a realização do processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de compreender, para além das quantidades necessárias de tampões e reagentes convenien- -39-

V tes, pelo menos um par de Iniciadores apropriado e eventualmente, pelo menos uma sonda apropriada, e doses apropriadas de uma composição enzimática preparada pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 10, Lisboa, 03 de Julho de 1990 O Agsite Oficial da Prcprscfcde Indusírial