DD299150A5 - Akarizides mittel und verfahren zur herstellung seiner wirkstoffe - Google Patents

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DD299150A5
DD299150A5 DD34209990A DD34209990A DD299150A5 DD 299150 A5 DD299150 A5 DD 299150A5 DD 34209990 A DD34209990 A DD 34209990A DD 34209990 A DD34209990 A DD 34209990A DD 299150 A5 DD299150 A5 DD 299150A5
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fermentation broth
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bees
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Tibor Nagy
Karoly Zalai
Denes Mathe
Bela Stefko
Gyula Csokas
Arpad Hadhazy
Istvan Gebhardt
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Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R.T.,Hu
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein akarizides Mittel, insbesondere zur Bekaempfung der auf der Honigbiene (Apis mellifera) schmarotzenden Milbe Varroa jacobsoni. Das Mittel enthaelt als Wirkstoff die gegebenenfalls von den Zellen befreite Fermentbruehe oder den Extrakt der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbruehe oder die festen (zum Beispiel getrockneten) Formen der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbruehe des Bacillusstammes NCAIM 001083 oder des Pseudomonasstammes NCAIM 001086 oder der gemischten Mikropopulation der beiden Staemme (NCAIM National Collection of Agricultural and Industrial Microorganism, Budapest, Ungarn). Das Mittel wird zum Bespruehen des Stockes beziehungsweise der Rahmen und Waben, insbesondere jedoch, vorzugsweise mit Zuckersaft oder Honig vermischt, zum Fuettern und Traenken der Bienen verwendet.{Akarizid; Bekaempfung; Milbe; Honigbienenmilbe; Varroa jacobsoni; Fermentbruehe; Fermentextrakt; Bacillusstamm NCAIM 001083; Pseudomonasstamm NCAIM 001086; Bespruehen; Futterzusatz}

Description

Die Erfindung betrifft ein akarizides Mittel sowie ein Verfahren zur Herstellung seiner Wirkstoffe. Das Mittel ist insbesondere zur Bekämpfung der Milbe Varroa jacobsoni auf Bienen (d.h. zur Bekämpfung der Varroatose) geeignet. Es ist bekannt, daß die Milbe Varroa jacobsoni ein Schmarotzer der Honigbiene (Apis mellifera) ist, der 3ich in der Brut und
insbesondere von der Haemolymphe der sich entwickelnden Bienen ernährt. Als Ergebnis der Verseuchung des Stockes und vonder Schwere der Verseuchung abhängend erscheinen mißgebildete Binnen, das Volk wird geschwächt und anfällig gegen
Krankheiten und geht schließlich zu Grunde. Die Milbe Varroa jacobsoni ist über alle honigproduzierenden Gebiete verbreitet, und die verursachten Schäden sind sehr
beträchtlich. Der Befall eines Volkes wird anfangs 3-4 Jahre, in späteren Jahren 2-3 Jahre nach dem Befall offenkundig; die
Verluste ebben ab und nehmen wieder zu. Der Stock sieht aus, als wäre er vergiftet. Gegen die Varroatose sind verschiedene Schutzmaßnahmen bekannt:
1) Die Stöcke werden mit unterschiedlichen ätherischen Ölen behandelt beziehungsweise ausgeräuchert;
2) Anwendung unterschiedlicher synthetischer organischer Wirkstoffe, zum Beispiel
- synergistische Kombination mit Pyrethrinpiperonylbutoxyd Chemical Abstracts World Index (im folgenden: WPI Acc No.) 86-212705/33;
- Tetradifon (The Pesticide Manual, 8th Ed. The British Crop Protection Council, Registry Number (im folgenden: Reg. No. 116-29-0]) und Dicofol (Reg. No. 115-32-2) als Kombination; WPI Acc No. 86-037330/06;
- Bienenwachs mit antiparasitären Wirkstoffen, zum Beispiel 4,4-Dibrombenzylsäureisopropylester, WPI Acc No. 85-290439/ 47;
- 1-Pyridylformimino-2-phenoxymethyl-2-imidazolin-Derivate WPI Acc No. 85-224091/37;
- die 2-Anilinomethyl-2-imidazolin-Derivate WPI Acc No. 85-217891 /36
- das 2-Dimethylphenylimino-3-methyl-thiazolin WPI Acc No. 84-284115/46;
- Azoxybenzol enthaltene^ Mittel WPI Acc No. 82-95526E/45
- die mit Aceton bereitete Lösung von Aryl-N-methyl-carbamaten WPI Acc No. 78-82396A/46
- Futtermittel und Trinkwasser mit einem Gehalt en synthetischen Pyrethroiden WPI Acc. No. 87-130020/19.
Die synthetische organische Wirkstoffe enthaltenden Mittel werden durch Zerstäuben oder Räuchern in den Stock (die Beuten) eingebracht. Derartige Mittel sind zum Beispiel Mitac EC (200g/l) und Mitac WP (250-500g/kg), die als Wirkstoff das nicht in allen Ländern zugelassenen Amitraze enthalten, ferner Ectodex EC (50g/l) (The Pesticide Manual 8th Ed.). Diese Präparate dürfen nur bei entsprechenden Außentemperaturen (über 100C) angewendet werden. Wird die Behandlung nicht zum richtigen Zeitpunkt vorgenommen oder zu oft wiederholt, so kann es, wie angenommen wird, zu einer Anhäufung schädlicher Nebenprodukte kommen, die für die Bienen, aber auch für die Imker schädlich sein können.
3) Lock-und Abschreckstoffe
- WPI Acc No. 87-129545/19 und
- WPI Acc No. 84-018266/04;
4) sonstige Bekämpfungsverfahren, zum Beispiel
- mechanische Bekämpfung WPI Acc No. 84-302720/49 und
- Sterilisation der Milben mittels Röntgenstrahlen WPI Acc No. 86-048672/08.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die gegebenenfalls von den Zellen befreite Fermentbrühe des Stammes NCAIM 001083 oder des Stammes NCAIN1' )1086 oder der gemischten Mikropopulation der beiden Stämme oder der Extrakt
ihrer gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrühe oder die aus der gegebenenfalls von den Zellen befreiten
Fermentbrühe hergestellten festen Formen (ihr getrocknetes Pulver) gegen die Varroatose wirksam sind. Die genannten Stämme sind bei der Nationalen Sammlung für landwirtschaftliche und industrielle Mikroorganismen in Ungarn
(National Collection of Agricultural and Industrial Microorganism, NCAIM) an der Budapester Universität für Gartenbau(Budapest, Ungarn) unter den Nummern 001083 und 001086 hinterlegt. Von den beiden Stämmen ist der Bacillusstamm 001083neu, der Pseudomonasstamm 001086 bekannt. Die gemischte Mikropopulation der beiden Stämme ist ebenfalls neu.
Es wurde gefunden, daß die Wirkung gegen Varroatose am besten ist, wenn die Fermentbrühe beziehungsweise die aus ihr
gewonnenen Anwendungsformen unmittelbar nach dom Einwintern angewendet werden. Die Toxizität für Bienen beträgt etwa
Vm der Toxizität des im Handel erhältlichen Amitraze, die Wirkung ist die Verabreichung über Futter und Trinkwasser 100%ig. Letzteres ist deswegen von bes jndarer Bedeutung, weil die Fütterungsmethode wesentlich einfacher ausführbar ist und das
normale Leben der Völker weniger stört als Räuchermethoden, das partielle Zerlegen d6r Beuten usw., wie das aus dem Beispiel38 hervorgeht. Auch ist es nie gelungen, mit der sehr verbreiteten Amitraze-Behandlung eino 100%ige Wirkung zu erreichen. Die
Bedeutung der neuartigen Behandlung wird ferner dadurch unterstrichen, daß von den herkömmlichen Mitteln zur Erzielung
einer identischen Wirkung immer höhore Mengen eingesetzt werden müssen, d. h. daß die Entstehung einergewissen Resistenzzu beobachten ist.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein akarzides Mittel, das als Wirkstoff die gegebenenfalls von Zellen befreite Fermentbrühe oder den Extrakt dor gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrühe oder die festen, zum Beispiel
getrockneten Formen der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrühe des Bacillusstammes NCAIM 001083 oder des
Pseudomonasstammes NCAIM 001086 oder der gemischten Mikropopulation der beiden Stämme enthält. Die Erfindung betrifft ferner den Bacillusstamm NCAIM 001083 sowie seine mit dem Pseudomonasstamm gebildete gemische Mikropopulation. Die Erfindung betrifft auch die landwirtschaftliche Verwendung der beiden Stämme beziehungsweise ihrer gemischten Mikropopulation, insbesondere zur Bekämpfung von Milben, vorzugsweise der Milbe Varroa jacobsoni. In dem
erfindungsgemäßen Bekämpfungsverfahren werden die Honigbienen oder der Stock beziehungsweise dessen Rahmen mit demdie gegebenenfalls von den Zellen befreite Fermentbrühe oder den Extrakt der gegebenenfalls von den Zellen befreiten
Fermentbrühe oder die festen, zum Beispiel getrockneten Formen der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrühe
des Bacillusstammes NCAIM 001083 oder des Pseudomonasstammes NCAIM 001086 oder der gemischten Mikropopulation derbeiden Stämme enthaltenden Mittel behandelt oder die Bienen werden mit dem Mittel gefüttert oder getränkt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung und Aufrechterhaltung des Bacillusstammes NCAIM 001083. Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Stammes werden von der Oberflächenschicht des Bodens, aus etwa 2-5cm Tiefe Proben genommen. Für eine Probe werden wenigstens drelUodenentnahmen verwendet. Die Proben werden mit sterilen Geräten entnommen und in sterilen, luftdicht schließenden Behältern transportiert. Die Stämme werden mittels der Plattenmethode isoliert, indem einige Gramm Boden in annähernd der hundertfachen Menge physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert werden. Aus der Suspension wird unter ständigem Rühren mit physiologischer Kochsalzlösung eine
Verdünnungsreihe hergestellt. Vom klaren Überstand werden jeweils Mengen von z. B. 1 ml in sterile Petrischalen pipettiert und
mit etwa der zehnfachen Menge an verflüssigtem Nähragar der Temperatur von 40-45°C aufgefüllt. Nach gründlichem
Umrühren läßt man den Ag art erstarren. Der Nähragar kann zum Beispiel die folgende Zusammensetzung haben:
a) b)
Fleischextrakt 3,0 g 3,0 g
Pepton 10,0 g B1Og
Agar 20,0 g 15,0 g
destilliertesWasser 1000,0 ml 1000,0 ml
pH 7,2 7.0
Die Nährböden werden bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Die Petrischalen werden, vorzugweise nach unten umgewendet, einige (2-6) Tage bei 25-30X inkubiert. Im Laufe der Inkubation erscheinen auf dem Nährmedium Kolor/ ; im allgemeinen werden die etwa 10-20 Kolonien aufweisenden Petrischalen weiter verarbeitet. Die Kolonien werden in an sich bekannter Weise weiter vereinzelt. Auf diese Weise erhält man Kolonien, die morphologisch homogen sind oder spontan entstandene gemischte Mikropopulationen enthalten. Die spontan entstandenen reinen oder gemischten Mikropopulationen werden auf Schrägagar aufechterhalten, der zum Beispiel die folgende zweckmäßige Zusammensetzung haben kann:
Fleischextrakt 1,0g
Hefeextrakt 2,0 g
Pepton 5,0 g
NaCI 5,O0
Agar 15,0 g
destilliertesWasser 1000,0 ml
pH 7,4
Sterilisation bei 1210C15 Minuten lang. Die frisch beimpften Röhrchen werden bei 32°C 48 Stunden lang inkubiert und dann zweckmäßig im Kühlschrank bei 4°C
gelagert.
Von der Oberfläche der auf diese Weise gelagerten Schrägagar werden die Zellen mit physiologischer Kochsalzlösung abgewaschen und mit ihnen eine Nährlösung von vorzugsweise der folgendon Zusammensetzung beimpft;
Pepton 7,8 g
Triton 7,8 g
Hefeextrakt 7.8 g
NaCI 5,6 g
Glucose 1,0 g
destilliertes Wasser 1000,0 ml
pH 7,5
Sterilisation bei 120°C 20 Minuten. Die Kulturen werden 2-3 Tage lang bei 30-350C, vorzugsweise in einer Schüttelkultur, oder aber in einer stehenden Kultur (unter teilweise anaeroben Bedingungen) fermentiert.Die Formentbrühe kann gewünschtenfalls, vorzugsweise mit einem Membranfilter, von den Zellen befreit werden. Die biologische, insbesondere akarizide Wirkung der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrüho wird untersucht. Ist die biologisch wirksame Population eine gemischte Population, so wird sie auf folgende Weise in ihre Stämme zorlegt. Die Population wird unter Verwendung eines für differentialdiagnostische Zwecke geeigneten Nährmediums erneut vereinzelt. Dieses Nährmedium kann zum Beispiel folgende Zusammensetzung aufweisen.
a) 20,0 g
Pepton 5,0 g
NaCI 15,0 g
Agar 1000,0 ml
destilliertesWasser 20-5OmI
defibriertesBlut
Das Nährmedium wird ohne Einstellung des pH bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert, dann auf 480C gekühlt und unter sterilen Bedingungen mit dem defibrierten Blut verseht.
b) 0,3 g
Fleischextrakt 1,0g
Pepton 2,ög
Agar 1000,0 ml
destilliertes Wasser 10,0 m!
steriles, defibriertes Blut
Das Blut wird zu dem verflüssigten, auf 480C gekühlten Nährmedium gegeben. Das Medium wird für 5 Minuten auf ein 800C warmes Wasserbad gestellt und dann in sterilen Petrischalen zu Platten vergossen.
C) 5,0 g
Fleischextrakt 10,0 g
Pepton 5,0 g
Dextrose 4,0 g
Dinatriumhydrogenphosphat 0,3 g
EisendDsulfat 8,0 g
Wismutsulfit 0,025 g
Brillantgrün 20,0 g
Agar 1000,0 ml
destilliertesWasser
pH 7.7
Die sämtliche Komponenten enthaltende Lösung wird unter ständigem Rühren so lange erwärmt, bis sie bis zum Kolbenhals schäumt. Dann läßt man unter ständigem Rühren auf etwa 50-5G0C abkühlen und gießt das Nährmedium in Petrischalen.
d) 10,0 g
Proteasep ~oton 3,0 g
Hefeextrakt 10,0 g
Lactose 10,0 g
Saccharose 5,0 g
NaCI 0,08 g
Phenolrot 0,0125 g
Brillantgrün 12,0 g
Agar 1000,0 ml
destilliertesWasser
pH 6,9
Das Nährmedium wird bei 12O0C15 Minuten lang sterilisiert und dann in sterile Pauschalen gegossen.
Auf diese Weise werden die Fermentbrühe beziehungsweise ihre unterschiedlichen Aufarbeitungsformen (s. Beispiel 3-11), die unmittelbar oder in formulierter Form (s. Beispiele 12-37) zur Bekämpfung der auf der Honigbiene Apis mellifera schmarotzenden Milbe Varroa jacobsoni verwendet werden können.
Erfindungsgemäß kann der Wirkstoff (im Sinne der Erfindung werden hier unter Wirkstoff die rohe Fermentbrühe oder deren extrakt, die von den Zellen befreite Fermentbrühe oder deren Extrakt, die beziehungsweise die festen, zum Beispiel getrockneten, gewünschtenfalls strahlensterilisierten Formen der Fermentbrühe verstanden) zu an sich bekannten Mitteln formuliert werden (Pesticid Formulations, Wade van Valkenburg; Marcel Dekker Inc. New York 1973), zum Beispiel zu Stäubemitteln, Spritzpulvern, Suspensionskonzentraten, wasserlöslichen Konzentraten, Aerosolpräparaten oder zu anderen, zum Beispiel zum Füttern und Tränken geeigneten Mitteln.
Diese Mittel enthalten neben dem Wirkstoff feste oderflüsnige Trägerstoffe, Lösungsmittel, Tenside und gegebenenfalls sonstige Hilfsstoffe, die den Wirkstoff für die Anwendung geeignet machen (s. zum Beispiel GB1552 277). An die Hilfsstoffe (Trägerstoffe, Lösungsmittel, Tenside, Schaumhemmer, Stabilisatoren usw.) besteht ferner die Anforderung, daß sie für die Bienen - beziehungsweise mittelbar für den Menschen - nicht toxisch sein dürfen.
Die festen Träger- und Streckmittel können natürlich oder synthetisch, anorganischer oder organischer Natur sein. Die natürlichen festen Träger- und Streckmittel sind zumeist aus unterschiedlichen Mineralien durch Mahlen gewonnene Gesteinsmehle (Kieselerde, Bentonit, Perlit, Kaolin, Dolomit usw.). Zu den festen Träger- und Streckmittel synthetischen Ursprungs zählen zum Beispiel die auf unterschiedliche Weise hergestellten, eine große spezifische Oberfläche aufweisenden Kieselsäuren (Aerosile) und Silikagele, ferner das durch Neutralisierung von Kalkmilch hergestellte feinverteilte Calciumcarbonat, das Aluminiumhydrat oder das durch dessen Wärmebehandlung und Vermahlung hergestellte Aluminiumoxyd. Als feste organische Träger natürlichen Ursprungs kommen Mehl, Zucker, Mahlgut aus Pflanzenabfällen (Holzmehl) in Frage.
Flüssige Träger und Lösungsmittel sind Wacser, organische Lösungsmittel oder deren Gemische, Alkananole, polyfunktionelle Alkenole, deren mit unterschiedlichen Säuren, zum Beispiel mit Fettsäuren, aromatischen Säuren, Hydroxy- und Aminosäuren gebildeten Ester, wie zum Beispiel Äthyl- oder Isobutylacetat, Amylacetat, Benzoesäuremethylester, Dioctylphthalat usw. Es können auch andere polare organische Lösungsmittel, zum Beispiel Säureamide wie Dimethylformamid, Lactone wie gamma· Butyrolacton, Lactame wie N-Methylpyrrolidon gewählt werden.
Zu den in den unterschiedlichen Mitteln eingesetzten oberflächenaktiven Stoffen werden hier die Emulgier-, Dispergier- und Netzmittel gezahlt, die zjr Formulierung von Pestiziden allgemein bekannt sind. Die Tenside können nichtionisch oder ionisch
Zu den nichtionischen Tensiden zählen die mit Alkoholen gebildeten Äther beziehungsweise die mit Fettsäuren gebildeten Ester des Äthylenoxyds, ferner saina mit Aralkylphsiiolan gebildeten Äther, seine mit Propylenoxyd gebildeten Copolymerisate, deren
Ester und Äther, dio mit den Hexitanhydriden von Fettsäuren gebildeten Derivate des Äthylenoxyds usw. Als Beispiele seien die
Nonylphonolpolyglycoläther, die Ölsäurepolyoxyäthylenester und das Polyoxyäthylensorbitanmonooleat erwähnt.
Die Ioni&chen Tenside können anionisch oder kationisch oder amphoter sein.
Zu den anionischen Tensiden gehören die unterschiedlichen'organischen Säuren, zum Beispiel Carbonsäuren, die Sulfonsäuren, die Alkoholsulfate und -sulfonate, die Phosphatester der Polyoxyäthylenäthor und -ester und ihre mit Alkali-, Erdalkali- oder organischen Anionen gebildeten Salze, zum Beispiel Schmierseife, Dodecylbenzolsulfonsäure-Ca-, -Na-, Ammonium- und Diisopropylammoniumsalz, Natriumdiisooctylsulfosuccinat und die mit den angegebenen Kationen gebildeten Salze der Polyacrylsäure.
Kationische Tenside sind zum Beispiel die Halogenide, Sulfonate der langkottigen Alkyiamine, das St^ar '.dimethyiammoniumchlorid, die langkettigen Äthanolamine oder deren Salze sowie auch die mit anionischen Tensiden gebildeten Salze.
Amphotere Tenside sind zum Beispiel die Betaine, die Lecithine, das Natrium-N-methylalkyltaurimid usw.
Als Hilfsstoffe kommen zum Beispiel haftungsvermittelnde natürliche oder synthetische Polymere in Betracht, zum Beispiel Stärke, Dextrin, Mono- ur.d Disaccharide, Carboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylsäure, Xanthangummi, Alginate. Als Antischaummittel können Polyoxyäthylen-polyoxypropylen-Copolymerisate, langkettige Alkenole oder spezielle Silikonöle verwendet werden. Weiterhin können als Hilfsstoffe Lockstoffe wie Honig, Mono- oder Disaccharide, Duftstoffe wie Isoamylacetat verwendet werden. Zu den Hilfsmitteln sind auch die Stabilisatoren zu rechnen, die die Stabilität des Mittels gewährleisten. Als Beispiele seie ι Benzoesäure, Natriumbenzoat, die Ester der p-Hydroxybenzoesäure genannt.
Die Wirkstoffe können als flüssige, feste oder Aerosolpräparate formuliert werden.
Zur Herstellung flüssiger Formulierungen wird der Wirkstoff in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise in Wasser, gelöst oder suspendiert, wobei die erwähnten Hilfsstoffe gleichzeitig oder nacheinander zugegeben werden.
Die flüssigen Präparate können nicht nur homogen, sondern auch dispers sein. Letztere werden hergestellt, indem der feste Wirkstoff auf eine geeignete Teilchengröße zerkleinert, dann in einem die entsprechenden oberflächenaktiven Stoffe enthaltenden Dispersionsmedium dispergisrt und dann zum Beispiel in einer Perlmühle weiter vermählen wird. Zu den erhaltenen Suspension werden in einem Rührwerk mit niedriger Drohzahl das Antischaummittel und gewünschtenfalls ein viskusitätserhöhendeä Mittel gegeben.
Zur Herstellung pulverförmiger Mittel wird der Wirkstoff in einer geeigneten Vorrichtung gemahlen und dann mit dem Träger und den oberflächenaktiven Stoffen homogenisiert. Man kann auch Wirkstoff, Träger und oberflächenaktive Substanzen zuerst homogenisieren, dann mahlen und schließlich erneut homogenisieren. Zum Mahlen können Hammermühlen, Schlagleistenmühlen, Stiftmühlen oder Luftstrahlmühlen verwendet werden. Es ist auch möglich, den Träger und die oberflächenaktiven Stoffe in der den Wirkstoff enthaltenden Disp', sion oder Lösung zu dispergieren und die erhaltene FlüssigkeK dann auf eine bekannte Weise, zum Beispiel durch Zerstäubungstrocknung oder Lyophilisieren, zu trocknen.
Gewünschtenfalls kann das erhaltene Pulver gemahlen und homogenisiert werden.
Bei der Herstellung und Anwendung flüssiger Präparate ist zu bedenken, daß die zum Einsatz kommende Flüssigkeitsmenge nicht zu groß sein kann; die Bienen würden so naß werden, daß das ihre Bewegung verhindert. Von der gemäß Beispiel 8a hergestellten zellfreien Fermentbrühe können vorzugsweise 5-50OmI pro m2 Bienenrahmen verwendet werden. Da die Fermentbrühe bzw. deren Verarbeitungsformen jedoch für die Blenne nicht toxisch sind, können auch größere oder kleinere Dosen verwendet werden. Häufigkeit der Behandlung und Größe der Dosis hängen im allgemeinen vom Befallsgrad ab. Wegen des erwähnten Nachteils der flüssigen Präparats ist im allgemeinen der Einsatz der unterschiedlichen pulverförmiger! Präparate bevorzugt. Davon werden im allgemeinen Mengen eingesetzt, die 0,01-1 Og Wirkstoff/m2 Bienenrahmen entsprechen. Eine sehr vorteilhafte Anwendungsform sind die Fütter- und Tränkpräparate, weil bei ihrer Anwendung die Beute nicht auseinandergenommen werden muß, ferner eine gleichmäßige und andauernde Dosierung möglich ist, im Gegensatz zu den Sprüh- und Stäubemitteln. Im Falle der Fütter- und Tränkemittel wird statt der Dosis der Fütterungs- bzw. Tränkzeitraum angegeben, der zur Verringerung beziehungsweise Beseitigung erford jri' n ist.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele Weiter erläutert, :st jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die %-Angaben in den Beispielen sind Ma.-%.
Beispiel 1 Isolierung von Stammen Die Mikroorganismen wurden mittels der Plattenmethode aus Waldboden (Ungarn, Akazienwäldchen im Komitat lolna, Sept,
1986) isoliert. 1 g Bodenprobe wurde in 99 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Aus der Suspension wurde eine
Verdünnungsreihe hergestellt auf die Weise, daß in jedem Schritt zu je 3ml Suspension 27ml physiologische Kochsalzlösung
gegeben wurden. Aus jedem Kolben wurde 1 ml in eine sterile Petrischale von 4cm Durchmesser pipettiert und mit je 9mlverflüssigtem Nährboden einer Temperatur von 40-450C versetzt, der 0,02 mg/ml Actidion enthielt.
Der Nährboden wurde durch kreisförmiges Schwenken der Petrischale gründlich mit der Bodensuspension vermischt und dann
erstarren gelassen. Die nach unten gedrehten Petrischalen wurden bei 28°C 72 Stunden lang inkubiert. Für die weiteren
Untersuchungen wurden die Petrischal6n verwendet, in denen 10-20 Kolonien gewachsen waren. Diese Kolonien wurden
mehrmals nach an sich bekannten Methoden vereinzelt, wodurch neun sich voneinander unterscheidende, in sich homogene
Kolonien gewonnen wurden. Außerdem war eine spontan gebildete Mischpopulation entstanden. Die gemäß den Beispielen 3a
bzw. 8a und b hergestellten Fermentbrühen bzw. zellfreien Fermentbrühen der isolierten reinen beziehungsweise gemischtenκ "i wurden auf die in den Beispielen 38-40 beschriebene Weise auf ihre akarizide Wirkung untersucht.
Beispiel 2 Isolierung der Subkulturen spontan entstandener gemischter Mlkropopulatlonen Aus der spontan entstandenen gemischten Mikropopulation wurden auf für differentialdiagnostische Zwecke vorgesehenem Nährboden (Schokoladenagar, Blutagar, Brillantgrün-Agar, Wismutsulfit-Agar usw.) durch erneute Vereinzelung und Alterung
der Kulturen zwei Stämme (reine Subkulturen) isoliert und bei der NCAIM unter den Nummern 001083 und 001086 hinterlegt.
Einer der Stämme, ein Bacillus, ist neu; der andere ist bekannt und gehört in die Gattung Pseudomonas. Die Eigenschaften der Mikroorganismen sind folgende:
a) Der Pseudomonasstamm NCAIM 001086 bildet auf einfachem Nähragar glänzende graue Kolonien von 0,5-1 mm Durchmesser. Das Wachstum ist bei 370C schwach, bei 30°C besser.
b) Der Bacillusstamm NCAIM 001083 bildet auf einfachem Nähragar matte, schwachgraue Kolonien von 1-2 mm Durchmesser.
a) Gram: positiv
b) Sporenbildung oval
c) Bewegung positiv
d) Wachstum anaerob positiv
θ) Wachstum auf Wismutsulfit-Agar +/-
f) auf Eosin-Methylenblau-Agar +/-
g) in Gegenwart von 7% NaCI positiv
h) Katalaso positiv
i) No3-NO2-Umwandlung negativ
j) Voges-Proskauer negativ
k) Indol negativ
I) Urease (Kristensen) negativ
m) Arginindihydrolase negativ
n) Lysindecarboxylase negativ
o) Ornithindecarboxylase negativ
P) Eskulinhydrolyse positiv
q) Stärkehydrolyse negativ
r) Kaseinhydrolyse negativ
s) Lecithinhydrolyse negativ
t) Gelatinehydrolyse positiv
u) Ammoniumeitrat negativ
ü) Säurebildung auf Oxydations-Fer-
mentations-Nährboden nach Hungh-Leifson oxydativ
v) Gasbildung in Peptonwasser-Glucose negativ
Säurebildung (BBS) Glucose positiv
Fructose positiv
Lactose negativ
Maltose negativ
Mannit positiv
Ramnose negativ
Saccharose positiv
Xylose negativ
(Peptonwasser) Arabinose negativ
Adonit negativ
ONPG positiv
Beispiel 3 Fermentierung der Stamme NCAIM 001083 und 001086 beziehungsweise ihrer spontan entstandenen gemischten Mikropopulatlon
a) Die Zellen der auf Schrägnähragar aufrechterhaltenen gemischton Mikropopulation werden mit pro Röhrchen je 5ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je ein ml der Suspension wird in 100ml Nährmedium gegeben, das sich in Kolben von 500ml Volumen befindet und die folgende Zusammensetzung hat:
0,78%Pepton
0,78% Triton
0,78 % Hefeextrakt
0,56% NaCI
0,1 % Glucose
(pH 7,5, sterilisiert bei 12O0C 20 Minuten lang), die beeimpften Kolben werden bei 320C 72 Stunden lang mit einer Frequenz von 300min"1 geschüttelt.
b) Man arbeitet auf die unter a) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß der Pseudomonasstamm NCAIM 001086 fermentiert wird.
Beispiel 4 Die Fermentierung der spontan entstandenen gemischten Mikropopulatlon von NCAIM 001083 und 001086 und die Zerstäubungstrocknung der Fermsntbruhe.
Ein Liter der gemäß Beispiel 3a erhaltenen Fermentbrühe (Trockensubstanzgehalt 2,4%) wird mit Luft einer Eintrittstemperatur von 12O0C und einer Austrittstemperatur von 65-750C zerstaubungsgetrocknet. Das erhaltene Trockenprodukt hat eine Masse von 25,5g, sein Feuchtegehalt beträgt 5,8%.
Belsplel5
Strahlensterilisation des getrockneten Fermentationsproduktes
Das gemäß Beispiel 4 erhaltene Produkt wird mit Gammastrahlen in einer Dosis von 5 kGr bestrahlt. Der Erfolg der Strahlensterilisation wird in an sich bekannter Weise mit der Plattenmethode kontrolliert.
Beispiel β
Lyophilisieren der Fermentbrühe
Je 100ml der gemäß Beispiel 3a erhaltenen Fermentbrühe werdan 24Stunden lang bei -250C gehalten und in einem Gerät des Typs Edwards Supermodulyo 12K innerhalb von 24 Stunden lyophilisiert. Die Trockenmasse eines Lyophilisates beträgt 2,3-2,5g.
Beispiel 7 Strahlensterlllsatlon des Lyophilisates
Das gomäß Bespiel 6 erhaltene Lyophilisat wird mit Gammastrahlen in einer Dosis von 5KGr bestrahlt. Der Erfolg der Strahlensterilisation wird in an sich bekannter Weise mit der Plattenmethode kontrolliert.
Beispiel 8 Entfernen der Zellen aus der Farnvantbruhe
a) Ein Liter der die gemischte Mikropopulation enthaltenden Fermentbrühe gemäß Beispiel 3a wird in einer kühlbaren Zentrifuge des Typs LU 418H mit einer Drehzahl von 4000 min'1 bei 4°C eine Stunde lang zentrifugiert. Der klare Überstand wird mehrfach durch Membranen einer Porenweite von 0,45, dann 0,2 Mikron (Hersteller: Sartorius) filtriert, wodurch die Zellen restlos entfernt werden. Die filtrierte Fermentbrühe hat einen Trockensubstanzgehalt von 1,02%. Der Erfolg der Zellenentfernung wird in an sich bekannter Weise mit der Plattenmethode kontrolliert.
b) Man arbeitet auf die im Punkt a) beschriebene Weise, geht jedoch von der Fermentbrühe des Pseudomonasstammes NCAIM 001086 aus.
Beispiel 9 Zerstäubungstrocknung zellfreier Fermentbrühe
Ein Liter der gemäß Beispiel 8 a erhalteien zellfreien Fermentbrühe (Trockengehaltsubstanz 1,02%) wird mit Luft einer Eingangstemperatur von 12O0C und einer Ausgangstemperatur von 65-750C zerstäubungsgetrocknot. Die Masse des erhaltenen Produktes beträgt 10,57g, sein Feuchtegehalt 3,7%.
Beispiel 10 Lyophlllsleren zellfreier Fermentbrühe
Ein Liter der gemäß Beispiel 8a erhaltenen zellfreien Fermentbrühe wird 48 Stunden lang bei -25°C gehalten und in einem Gerat des Typs Edwards Supermoduiyo 12 K innerhalb von 24 Stunden Iyophiiisiert. Die Masse des Lyophiiisates beträgt 10,2 g.
Beispiel 11 Eindampfen zollfreier Fermentbrthe
Ein Liter der gemäß Beispiel 8a erhaltenen zellfreien Fermentbrühe wird In einem Filmeindampfer bei 5O0C unter einem Druck von 380Hgmm auf ein Volumen von 0,33Liter eingedampft.
Beispiel 12 Lyophlllsleren zollfreier Fermentbrühe mit Saccharosezusatz
Zu einem Liter der gemäß Beicpiel 8 a erhaltenen zellfreien Fermentbrüi ie wird Saccharose in einer Menge von 1 /60 seiner Masse gegeben. Die Flüssigkeit wird 48 Stunden lang bei -250C gehalten und in einem Gerät des Typs Edwards Supermoduiyo 12 K innerhalb von 24 Stunden Iyophiiisiert.
Flüssige Präparate Sprühmittel
Beispiel 13
Wirkstoff gemäß Beispiel 3a oder 3b 99,8%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 0,1 %
Methylsilikinöl-Emulsion (10%ig) 0,1 %
Das Präparat wrid durch Vermischen (Homogenisieren) der Komponenten hergestellt.
Beispiel 14 97,8%
Wirkstoff gemäß Beispiel 8a 2,0%
Dextrin 0,1%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 0,1 %
Methylsilikonöl-Emulsion (10%ig)
Herstellung wie in Beispiel 13.
Beispiel 15 92,0 Vo
Wirkstoff gemäß Beispiel 11 7,2%
Saccharose 0,5%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 0,3%
Methylsilikonöl-Emulsion (10%ig)
Herstellung wie in Beispiel 13.
Beispiel 16 93,0%
Wirkstoff gemäß Beispiel 11 6,3%
Saccharose
Fettalkohol-polyoxyäthylenäther- 0,25%
phosphatester-Kaliumsalz 0,15%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 0,25%
Methylsilikonöl-Emulsion (10%ig) 0,05%
Isoamylacetat
Herstellung wie in Beispiel 13.
Beispiel 17 99,7%
Wirkstoff gemäß Beispie 3 a oder b 0,1 %
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 0,1 %
Methylsilikonöl-Emulsion (10%ig) 0,1 %
Xanthangummi
Herstellung wie in Beispiel 15.
Beispiel 18 30,0%
Wirkstoff gemäß Beispiel 4 1,0%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 10,0%
Saccharose 0,5%
Methylsilikonöl-Emulsion (10%ig) 58,0%
Wasser 0,5%
Isoamylacetat
Herstellung gernäß Beispie 13.
Beispiel 19
Wirkstoff gemäß Beispiel 5 30,0%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 10%
Saccharose 10,0%
Methylsilikonöl-Emulsion(10%ig) 0,5%
Wasser 58,0%
Isoamylacetat 0,5% Herstellung gemäß Beispiel 13.
Beispiel 20
Wirkstoff gemäß Beispiel 11 . 93,0%
Saccharose . 6,4%
Fettalkoholpolyoxyäthylenätherphosphatester 0,25%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 0,15%
Lecithin 0,15%
Isoamylacetat 0,05% Herstellung gemäß Beispiel 13.
Zum Füttern geeignete Präparate Beispiel 21
Wirkstoff gemäß Beispiel 8 a 79,95%
Saccharose 20,0%
Isoamylacetat 0,025%
Äthylacetat 0,025%
Das Präparat wird durch Vermischen der Komponenten hergestellt.
Beispiel 22
Wirkstoff gemäß Beispiel 8 b 50,0%
gemischter Blütenhonig 50,0%
Beispiel 23
Wirkstoff gemäß Beispiel 11 80,0%
Saccharose 20,0%
Herstellung gemäß Beispiel 21.
Zum Tränken geeignete Präparate Beispiel 24
Wirkstoff gemäß Beispiel 8 a 98,0% Saccharose 1,95%
Isoamylacetat 0,025%
Äthylacetat 0,025%
Herstellung gemäß Beispiel 21.
Pulvert örmige Präparate Beispiel 25
Wirkstoff gemäß Beispiel 4 90,0%
Silikagel mit großer Oberfläche 8,0%
Saccharose 2,0%
Das Präparat wird durch Vermischen der Komponenten und anschließendes Vermählen auf eine Teilchengröße von unter Mikron hergestellt.
Beispiel 26
Wirkstoff gemäß Beispiel 5 80,0%
Silikagel mit großer Oberfläche 8,0%
Saccharose 2,0%
Herstellung gemäß Beispiel 25.
Beispiel 27
Wirkstoff gemäß Beispiel 9 90,0%
Talkum 9,0%
Saccharose 1,0%
Herstellung gemäß Beispiel 25.
Beispiel 28
Wirkstoff gemäß Beispiel 6 50,0%
Silikagel mit großer Oberfläche 10,0%
,Talkum 35,0%
Saccharose 5,0% Herstellung gemäß Beispiel 25.
Beispiel 29
Wirkstoff gemäß Beispiel 7 60,0%
Silikagel mit großer Oberfläche 10,0 %
Talkum 35,0% Saccharose 5,0%
Herstellung gemäß Beispiel 25.
Beispiel 30
Man arbeitet auf die im Beispiel 29 beschriebenen Weise, verwendet aber den Wirkstoff von Beispiel Spritzpulver (WP-Präparate)
Beispiel 31
Wirkstoff gemäß Beispiel 4 35,0%
Silikagel großer Oberfläche 4,0%
Natrium-N-methyltaurimid 1,0%
Die Komponenten werden miteinander vermischt und dann auf eine Teilchengröße von unter 40 Mikron vermählen.
Beispiel 32
Man arbeitet auf die im Beispiel 31 beschriebene Weise, verwendet jedoch den Wirkstoff gemäß Beispiel
Beispiel 33
Wirkstoff gemäß Beispiel 6 95,0%
Kaolin 4,0%
Sulfitlaugenpulver 0,5%
Cg-Cg-Fettalkoholsulfat-Na auf einem
Silikagelträger mit großer Oberfläche 0,5 %
Herstellung gemäß Beispiel 31.
Beispiel 34
Man arbeitet wie im Beispiel 33 beschrieben, verwendet jedoch den Wirkstoff gemäß Beispiel
Beispiel 35 98,0%
Wirkstoff gemäß Beispiel 9 0,6 %
Saccharose 1,0%
Silikagel mit großer Oberfläche 0,5%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat
Herstellung wie in Beispiel 31.
Beispiel 36 99,5%
Wirkstoff gemäßBeispiel 12 0,5%
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat
Herstellung wie in Beispiel 31.
Beispiel 37
Aerosolpräparat 40,0%
Wirkstoff gemäß Beispiel 11 3,0%
Saccharose 0,1 %
NonylphenolpolyglycolätherEO = 10 1,0%
Lecithin 0,1 %
Isoamylacetat 0,1 %
Butylacetat 55,7%
Treibgas
Die Saccharose und die übrigen Zusätze werden unter Rühren in dem Wirkstoff gelöst, die Lösung wird in Aerosoldosen gefüllt. Diese werden mit einem Ventil verschlossen und dann mit Treibgap gefüllt. Als letztes wird der Sprühkopf aufgesetzt.
Biologische Wirkung
Beispiel 38
Untersuchung der akariziden Wirkung der zellfreien Fermentbrühe gemäß Beispiel 8a gegen die auf der Honigbiene (Apis mellifera) schmarotzende asiatische Bienenmilbe Varroa jacobsoni Drei starke Bienenvölker in neun Rahmen, die mittelstark mit Varroa infiziert wann, wurden dreimal, in Abständen von drei Tagen mit derzellfreien Fermentbrühe gemäß Beispiel 8a behandelt. Dabei wurden jeweiic 60ml derzeüfreien Fermentbrühe mit Hilfe eines Handzerstäubers gleichmäßig auf die Flächen der Waben und die sich dort aufhaltenden Bienen aufgesprüht. Drei Tage nach der letzten Behandlung wurde jedes der Völker noch mit einem 30 mg Amitraze enthaltenden Räucherstreifen (ANTIVAR ad us. vet.) behandelt. Zum Vergleich wurden drei Völker zu den gleichen Zeitpunkten nur mit ANTIVAR-Räucherstreifen behandelt (30 mg Amitraze). Die Anzahl der abgefallenen Milben und die toten Bienen in der Beute wurden gezählt. Außerdem wurden der allgemeine Zustand, das Verhalten der Völker und der Königinnen beobachtet.
Auf die Bodenplatte der Beute wurdeeine aus Aluminiumblech gefertigte, mit einem 6mm hohen Rand versehene Bodoneinlage gelegt, die durch einen in Bodenhöhe in der Wand der Beute befindlichen, verschließbaren Schlitz zu jeder Zeit herausgezogen beziehungsweise wieder eingeschoben werden konnte, ohne daß die Beute auseinandergenommen werden mußte. Diese Bodeneinlage diente zum Sammeln der abgefallenen Milben.
Die Anzahl der toten Bienen, Maden und Puppen wurde mittels einer Falle festgestellt. Diese Leichenfalle ist eine oben und hinten offene, am Boden mit einer herausziehbaren Einlage versehene Schachtel aus Aluminiumblech, die oben mit einem Drahtnetz der Maschenweite 8 mm bedeckt ist. Dieses Netz hat die Aufgabe, die Bienen daran zu hindern, ihre Toten aus dem Stock zu tragen. Die Bienen konnten zwar durch die Maschen kriechen, mit einer toten Biene belastet jedoch nicht; so gab die Vorrichtung die Möglichkeit, die Toten zu beliebigen Zeitpunkten zu zählen. Der hintere offene Teil der Falle wurde auf die Ausgangsöffnung des Stockes aufgesetzt.
Das Betragen der Bienen innerhalb des Stockes, die „Stimme", das Brausen des Volkes, die Bewegung der Bienon auf den Rahmen, das Betragen der einzelnen Bienen wurde durch das bei jeder Behandlung vorgenommene Herausnehmen und Betrachten der Rahmen beobachtet.
Der gesundheitliche Zustand der Königinnen und ihr Verhalten wurden ebenfalls durch Beobachtung kontrolliert. Die Beobachtung erstreckte sich auf das Verhalten der den Hofstaat der Königinnen bildenden Bienen, die Bewegung der Königin, die Unversehrtheit ihrer Flügel (Bißspuren) und die Art, in derzur Eiablage geeignete Zellen gesucht wurden. Die Kontinuität des Brutgeschehens, aus dem auf die Aktivität der Königin geschlossen werden kann, wurde kontrolliert. Die bewohnten Wabenstraßen wurden bestimmt. Als bewohnte Wabenstraße galt das zwischen zwei benachbarten Waben befindliche Gebiet, wenn die beiden einander zugewandten Wabenflächen zu wenigstens 70-80% mit Bienen bedeckt waren. Mit Hilfe eines von Hand betriebenen Luftzerstäubers wurden zu jeder Behandlung 60ml der unverdünnten, gemäß Beispiel 8 von den Zellen befreiten Fermentbrühe (Temperatur 23-240C) auf die gesamte Fläche der neun Rahmen der drei Völker (Wabengasamtfläche eines Volkes: 27216cm2) aufgesprüht, wobei die Bienen während der Behandlung die Wabenfläche gleichmäßig bedeckten. Die bei den Kontrollvölkern verwendeten, amitrazehaltigen Räucherstreifen (ANTIVAR) wurden keilförmig gefaltet, in die Behandlungsschale aus Aluminium gelegt, angezündet und in den Strock geschoben. Die Ausflugsöffnung wurde eine Stunde lang verschlossen gehalten.
Geprüfte Parameter
a) Anzahl der nach den Behandlungen abgefallenen Milben: Bestimmung nach 24,48 und 72 Stunden nach der Behandlung
b) Bienensterben: Bestimmung alle drei Tage, unmittelbar vor Beginn der Behandlung
c) Verhalten der Völker und der Königinnen, Anzahl der bewohnten Wabenstraßen: Kontrolle anläßlich der Behandlungen, unter Auseinandernehmen der Beute.
Anzahl der abgefallenen Milben
Behandlung Amitraze Zeit nach der insgesamt: 2. 24 insgesamt: 3. 24 insgesamt: 4. 24 insgesamt: Anzahl der abgefallenen Milben 2.VoIk 3.VoIk
(30 mg) Behandlung (h) 48 48 48 1.VoIk
mit Fermentbrühe 72 72 72 43 31
1. 24 74 12 10
48 5 2 0
72 1 57 41
80 52 34
47 1 3
6 1 1
0 54 38
53 77 47
62 9 7
12 0 1
2 86 55
76
134 94
225 4 11
24 1 0
0 139 105
2Ί9
-12- 299 150 Anzahl der abgefallenen Milben bei der Referenzbehandlung
Behandlung Zeit nach der insgesamt: Anzahl der abgefallenen Milben 2.VoIk 3.VoIk
Behandlung (h) 1.VoIk
Amitraze
(30 mg) 241 190
1. 24 insgesamt: 164 12 3
48 3 1 0
72 0 254 193
167 87 37
2. 24 insgesamt: 68 3 1
48 0 1 0
72 0 91 38
68 35 24
3. 24 insgesamt: 21 2 1
48 0 0 2
72 0 37 27
21 55 32
4. 24 57 0 4
48 4 0 1
72 1 55 37
62
Bienensterben: Die Anzahl der in den Fallen gefundenen toten Bienen entsprach der bei Völkern üblichen normalen Mortalität. Ein merklicher Anstieg der Mortalität wurde durch die Behandlungen nicht verursacht. Verhalten: Im allgemeinen Zustand und dem Verhauen der Völker und Königinnen war durch die Behandlungen keine krankhafte Veränderung zu beobachten. Die nach der Anzahl der bewohnten Wabengassen beurteilte Stärke der Völker verschlechterte sich
nicht.
Beispiel 39 Toxikologische Untersuchungen an Bienen Untersucht wurde die akute IrtaleToxizitä: p.o. der gemäß Beispiel 8a hergestellten zellfreien Fermentbrühe an der Honigbiene Apis mellifera. Aus der zellfreien Fermentbrühe gemäß Beispiel 8a wurde mit Grundlösung (s. später) eine Verdünnungsreihe hergestellt,
deren erstes Glied 1,00% Fermentbrühe und deren letztes GJied 0,25% Fermentbrühe enthielt.
Zusammensetzung der Grund ösung: Speisezucker (Kristallzucker) 20,0g
Aceton 5,0 ml
destilliertes Wasser ad 100,0ml
Je 0,2ml der Lösungen der Verdünnungsreihe enthielt die Dosis für 10 Bienen. Auf 10 Bienen entfielen demnach 500,1000
beziehungsweise 2000 Mg.
Die Versuchsbienen wurden zur Zeit intensiven Ausfluges von den Brutwaben dreier kräftiger Bienenvölker durch vorsichtiges Abkehren genommen und volkweise getrennt in mit einem perforierten Deckel versehenes Kunststoffgefäß plaziert. Jede Dosis
wurde an sechs Gruppen zu je 10 Bienen untersucht. Dabei stellte jedes dar drei Völker 2 Gruppen.
Die von den Brutwaben abgekehrten und sofort ins Laboratorium transportierten Bienen wurden mit Kohlendioxyd betäubt, in Gruppen zu je 10 Bienen eingeteilt und dann in aus verzinktem Drahtnetz gefertigte, 10cm hohe Zylinder von 5cm Durchmesser
gesetzt. Das Drahtnetz hat eine Maschenweite von 4 mm. Die Zylinder sind an der einen Seite mit Aluminiumfolie, an der anderenmit einem Korken verschlossen, der mit Aluminiumfolie überzogen ist. In der Mitte des Korken war als Fütterungsplatz eine
Vertiefung von etwa 1 cm Durchmesser, 0,4mm Tiefe und 0,5ml Volumen ausgehöhlt worden. Über der Vertiefung waren in
3-4 mm Entfernung voneinander dünne Drähte befestigt.
Eine Stunde nach der mit CO2 vorgenommenen Betäubung wurden 0,2 ml der die Fermentbrühe enthaltenden Verdünnungsreihe mittels einsr Injektionsspritze in die Fütterungsvertiefung gegeben (pro Dosis 6 Gruppen). Die Kontroligruppon bekamen je 0,2ml der verwendeten zuckerhaltigen Grundlösung. Vier Stunden nach der Fütterung hatten die Bienen die Flüssigkeit verzehrt. Danach wurden sie ad libitum mit Zuckersirup weitergefüttert. Für die gleichmäßige Verteilung
dor Untersuchungssubstanz war nicht nur durch das einstündige Aushungern der Bienen gesorgt, sondern auch durch die
Gewohnheit der Bienen, sich im sozialen Nahrungsaustausch gegenseitig zu füttern. Für die Zeit der Beobachtungen wurde das Labor verdunkelt, auch zu den Fütterungszeitpunkten wurde nur eben die zum Arbeiten notwendige Lichtstärke eingesetzt. Der Raum wurde nicht für andere Zwecke genutzt. Die Temperatur betrug 23-24°C,
die relative Luftfeuchtigkeit 55-701;'?. und diese Warte wurden alle 3 Stunden kontrolliert.
Auswertung Die Mortalität wurde 4,24 und 48 Stunden nach Verabreichung des den Wirkstoff enthaltenden Zuckersaftes bestimmt. Da bei Bienen, die aus ihrer gewohnten Umgebung, aus der Gemeinschaft des Bienenvolkes herausgerissen wurden, eine erhöhte Mortalität (in erster Linie wegen der Stiche, die sie sich gegenseitig versetzen) natürlich ist, wurden die bei unterschiedlichen Dosen erhaltenen Mortalitätswerte durch die durchschnittlichen Mortaütätswerte der Kontrollgruppen korrigiert; in der
folgenden Wirkungstabelie sind die korrigierten Mortalitätsv.'erte angegeben.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß der p. o. LDM-Wert mehr als 200,0 Mikrogramm/Biene beträgt (das entspricht einem Wert von
mehr als 2,0g/kg Bienenlebendgewicht.) Der LDW-Wert des Wirkstoffes Amitraze beträgt 12 Mikrogramm/Biene.
Akute orale Toxizität der zellfreien Fermentbrühe gemäß Beispiel 8a für Apis mellifera
Dosis Konz.der Gruppe tote Bienen in den Tote pro 10 Tiere korrigierte
Mg/10 Fermentbrühe Nr. einzelnen Gruppen in 48 h Mortalität
Bienen im Zuckersaft 4 24 48 (Durchschnitt)
w/v% Stunden nach dem Füttern %
0,25
0,67
0,00
0,50
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
0,83
1,7!»
1,00
1 0 0 0 1 1
1,00
3,57
Kontrolle
0,00
1 0 0 0 0 0
1 0 0 0 1 0
0,67
Beispiel 40
Die Wirkung der Fermentbrühe gegen die Milbe Varroa jacobsonl wurde an von den Milben befallenen Bienen (Apis mellifera) untersucht. Zu diesem Zweck wurde aus der Fermentbrühe gemäß Beispiel 3 b mit 50%iger Zuckerlösung eine Lösung bereitet, die 2,5% Fermentbrühe enthielt. Die Bienen für den Versuch wurden zur Zeit intensiven Ausfluges von den Brutwaben starker Bienenvölker durch schonendes Abkehren in mit einem perforierten Deckel versehene Kunststoffgefäße gesammelt. Die Bienen wurden sofort ins Laboratorium gebracht und dort mit Kohlendioxyd betäubt. Die Bienen wufdon mit dem Vergrößerungsglas untersucht, die von der Milb9 befallenen Bienen wurden in aus verzinktem Drahtnetz einer Maschenweite von 4 mm gefertigte, an einem Ende mit Aluminiumfolie verschlossene Zylinder von 10cm Höhe und 8cm Durchmesser eingebracht. Am Boden des Zvlindors befand sich ein 3-5cm langer leerer Wabenstreifen. Auf diesen wurde mit einer Injektionsspritze die obenerwähnte Lesung in einer Menge von 5-1OmI aufgebracht. Die Bienen konnten ad libitum davon verzehren. Während der Dauer des Versuches wurde das Laboratorium verdunkelt und auch nicht für andere Zwecke genutzt. Die Temperatur betrug 23-240C, die relative Luftfeuchte 55-70%.
Auswertung
12 Stunden nach Verabreichung der wirkstoffhaltigen Zuckerlösung wurden die abgefallenen Milben gezählt und die Bienen nach Betäuben mit CO2 auf noch anhaftende Milben untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß alle Milben vernichtet worden und auf den Boden des Käfigs gefallen waren. Die die Fermentbrühe gemäß Beispiel 3 b enthaltende Zuckerlösung hatte, zur Fütterung verwendet, innerhalb von 12 Stunden die Milben 100%ig abgetötet.

Claims (9)

1. Akarizides Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff die gegebenenfalls von den Zellen befreite Fermentbrühe oder den Extrakt der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrühe oder die festen (zum Beispiel getrockneten) Formen der gegebenenfalls von den Zellen befreiten Fermentbrühe des Bacillusstammes NCAIM 001083 oder des Pseudomonasstammes NCAIM 001086 oder der gemischten Mikropopulation der beiden Stämme (NCAIM - National Collection of Agricultural and Industrial Microorganism, Budapest, Ungarn) enthält, gewünschtenfalls in sterilisierter Form, gegebenenfalls zusammen mit festen und/od^r flüssigen Streckmitteln und oberflächenaktiven Stoffen.
Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff den Bacillusstamm NCAIM001083 enthält.
Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff den Pseudomonasstamm NCAIM 001086 enthält.
4. Bacillusstamm, hinterlegt unter der Nummer001083 bei National Collection of Agricultural and Industrial Microorganism, Budapest, Ungarn, dadurch gekennzeichnet, daß er auf einfachem Nähragar matte, hellgraue Kolonien von 1-2 mm bildet und folgende Eigenschaften aufweist:
z) ONPG positiv.
5. Gemischte Mikropopulation, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Bacillusstamm NCAIM 001083 gemäß Anspruch 4 und den Pseudomonasstamm NCAIM 001086 enthält.
6. Verfahren zur K ^stellung eines akariziden Wirkstoffes durch in Gegenwart von Kohlehydraten, anorganischem Stickstoff und sonstigen an sich bekannten Zusätzen in einem flüssigen Nährmedium vorgenommene aerobe oder partiell anaerobe Fermentation, dadurch
gekennzeichnet, daß man die gemischte Mikropopulation der Stämme NCAIM 001083 und 001086 fermentiert.
7. Verfahren zur Herstellung eines akariziden Wirkstoffes durch in Gegenwart von Kohlehydraten, anorganischem Stickstoff und sonstigen an sich bekannten Zusätzen in einem flüssigen Nährmedium vorgenommene aerobe oder partiell anaeorobe Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man den Bacillusstamm NCAIM 001083 fermentiert.
8. Verfahren zur Herstellung und Aufrechterhaltung des Bacillusstammes NCAIM 001083 oder der mit dem Pseudomonasstarnm gebildeten gemischten Mikropopulation dieses Stammes, dadurch gekennzeichnet, daß man
- Bodenproben mit physiologischer Kochsalzlösung extrahiert,
- den Extrakt auf einen Kohlenstoff- und Stickstcffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls Zusatzstoffe enthaltenden Nährboden (Nähragar) überträgt,
- bei 25-300C 2-6 Tage inkubiert,
- die entstandenen Kolonien vereinzelt,
- die entstandene gemischte Mikropopulation gewünschtenfalls abtrennt oder
- die einzelnen Stämme (Subkulturen) aus der gemischten Mikropopulation auf differentialdiagnostischen Nährböden durch erneutes Vereinzeln isoliert und in an sich bekannter Weise aufrechterhält.
9. Verfahren zur Vernichtung von Milben, dadurch gekennzeichnet, daß man den Boden oder
, flanzen oder sonstige Lebewesen mit einem der Mittel gemäß den Ansprüchen 1-3 oder mit deren verdünnten Anwendungsformen behandelt.
10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Bekämpfung von Milben, insbesondere zur Bekämpfung von Varroa jacobsoni, dadurch gekennzeichnet, daß man die Honigbiene oder deren Stock oder die Rahmen des Stockes mit einem der Mittel gemäß den Ansprüchen 1-3 oder deren verdünnten Anwendungsformen behandelt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Honigbienen mit einem ein Mittel gemäß einem der Ansprüche 1-3 enthaltenden Tränk- oder Fütterungsmittel füttert oder tränkt, vorzugsweise gleichmäßig und über längere Zeit.
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