DD301724A9

DD301724A9 - Mutanten von menschlichem interleukin-3

Info

Publication number: DD301724A9
Application number: DD90343414A
Authority: DD
Inventors: Lambertus Ch J Dorssers; Robert W Van Leen
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1989-08-14
Filing date: 1990-08-13
Publication date: 1993-08-12
Also published as: IL95350A0; IE980055A1; DE69030937D1; DK0413383T3; NO301481B1; PT94992A; HUT54411A; EP0810285A2; ES2106017T3; ATE154638T1; FI105192B; NZ234869A; EP0413383A1; CA2023246C; AU6096090A; JP3192416B2; CA2023246A1; FI903996A0; JPH0420295A; NO903544D0

Abstract

Zur Verfügung gestellt wurden Mutanten von hIL-3 mit Deletionen, die faktisch die gesamte Codierungsregion von hIL-3 umfassen und gleichzeitig ihre biologische Aktivität bewahren. Bevorzugte Mutanten sind jene mit einer oder mehreren Deletionen am Aminoende (Aminosäuren 1-14) und/oder am Carboxylende (Aminosäuren 116-133, 120-130 und/oder 130-133). Eine weitere bevorzugte Gruppe von Mutanten sind Substitutionsmutanten. Einige dieser Mutanten weisen einen antagonistischen Effekt auf. Spezifische Beispiele dafür sind Cys * Ala-Mutantan , (Cys exp 16 * Ala exp 16, Cys exp 16 Cys exp 84 * Ala exp 16 Ala exp 84). Andere Mutanten mit einem antagonistischen Effekt sind Glu exp 50 * Lys exp 50 sowie Lys exp 79 * Glu exp 79. Schließlich werden Antikörper zur Verfügung gestellt, die auf zwischen den Aminosäuren 29 und 54 angesiedelte spezifische Epitope gerichtet sind.

Description

Gegenstand der Erfindung

Die Erfindung betrifft Mutanten von koloniestimulierenden Faktoren, die durch Verfahren auf der Grundlage von DNA-Rekombinationstechniken gewonnen werden. Ganz konkret betrifft die Erfindung Mutanten von lnterleukin-3. Und noch konkreter enthalten diese Mutanten eine oder mehrere Deletionen und/oder eine oder mehrere Substitutionen. Die pharmakologische Anwendbarkeit dieser Mutanten ist von ihrer spezifischen Rezeptorbindung und den Signaltransduktionseigenschaften abhängig.

Vorgeschichte der Erfindung

Historisch gesehen kam es zunächst zur Entdeckung von hämopoetischen Zellen betreffenden Faktoren im Rahmen einer Untersuchung, bei der die Proliferation bzw. Differenzierung von Knochenmarkzellen in weichen Agrarkulturen gemessen wurde. Die diese Aktivität ausweisenden Faktoren wurden insgesamt als koloniestimulierende Faktoren (CSF) bezeichnet. Später zeigte sich, daß es eine Vielfalt von CSF gibt, die teilweise durch die hämopoetischen Familien, die stimuliert werden, klassifiziert werden können.

Bei Menschen und Nagetieren schließen diese Proteine G-CSF und M-CSF ein. Diese Proteine stimulieren die In-vitro-Bildung von vorwiegend neutrophilen Granulozyten- bzw. Makrophagenkolonien. lnterleukin-2 (IL-2) stimuliert die Proliferation sowohl von aktivierten T-Zellen als auch von aktivierten B-Zellen, gilt jedoch nicht als CSF.

Gm-CSF und lnterleukin-3 (IL-3, auch bekannt als Multi-CSF) stimulieren die Bildung von Makrophagen-wie auch von neutrophilen und eosinophilen Granulozytenkolonien. Außerdem stimuliert IL-3 die Bildung von Mastzellen-, Megakaryozytensowie reinen und gemischten Erythroidenkolonien (D. Metcalf, „The hematopoietic colony-stimulating factors" [Die hämopoetischen CSF], 1984, Elsevier, Amsterdam, und D.Metcalf,Science 299 [1985], S. 16-22). Wachstumsfaktorinduzierte Zeilproliferation ist ein komplizierter Prozeß. Nach der hochspezifischen Bindung des Wachstumsfaktors an seinen Rezeptor an der Zelloberfläche wird der Komplex durch Endozytose internalisiert und induziert eine intrazelluläre Reaktion, der häufig eine Phosphorylierung des Rezeptors vorangegangen ist (Sibley u.a.. Cell 48 [1987], 913-922). Diese intrazellulären Signale resultieren in spezifischer Gentranskription und letztendlich in DNA-Synthese und Zellreplikation. Es besteht ein beträchtliches Interesse an den CSF, da sie über ein therapeutisches Potential verfugen, das darin besteht, daß Verluste an Zellen, die von Blutbildungs- und Lymphozytenstammzellen abstammen, wieder ausgeglichen werden können. Bei Human-IL-3 (hlL-3) handelt es sich um einen solchen CSF. Reifes hlL-3 setzt sich aus 133 Aminosäuren zusammen; das Protein enthält eine Disulfidbrücke und zwei potentielle Glykosylierungsorte (Yang u.a.. Cell 47 [1986], 3-10). Es weist u.a. folgende Aktivitäten auf:

1) Stimulierung der Koloniebildung durch hämopoetische Präkursorzellen des Menschen, wobei die gebildeten Kolonien Erythroide, Granulozyten, Megakaryozyten, Granulozytenmakrophage und Mischungen daraus einschließen;

2) Stimulierung der DNA-Synthese durch Stammzellen (Blasten) der akuten myologenen Leukämie beim Menschen (AML). Sobald Klarheit über die Struktur-Funktion-Beziehung des Moleküls besteht, können nützliche Agonisten und Antagonisten eines Proteins hervorgebracht werden. Im allgemeinen wird diese Beziehung durch Modifizierung, Ersetzung oder Deletion von Aminosäuren untersucht.

Auf diese Weise können Informationen über die Bedeutung jeder einzelnen Aminosäure für die Aktivität des Proteins erlangt werden. Wichtige Domänen der Proteine können das aktive Zentrum, Metall- und Cofaktorbindungsorte, Rezeptorbindungsorte, die an Untereinheitenwechselwirkungen beteiligten Aminosäuren und die antigenen Determinanten sein.

Nach erfolgter Bestimmung der Primärsequenz eines Proteins können zur Untersuchung der erwähnten Charakteristika unterschiedliche Verfahren angewendet werden. Stehen beispielsweise Primärstrukturen homologer Proteine anderer Arten zur Verfugung, dann können diese Sequenzen mit maximaler Übereinstimmung angeordnet werden. Konservierte Sequenzen sind häufig für die Bedeutung bestimmter Aminosäuren kennzeichnend.

Mit Hilfe bekannter Algorithmen sind Sekundärstrukturen vorhersagbar. Siehe dazu z. B. Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 78 (1981)3824-3828,Garnier u.a., J. Mol. biol. 120 (1978) 97-120, Biou u.a., Prot. Eng. 2 (1988) 185-191, Cärmenes u.a., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159 (1989) 687-693.

Ist die interspezifische Homologie zwischen homologen Proteinen hoch und die 3-D-Struktur von einem bekannt, können von dieser Struktur auch wichtige Aminosäuren abgeleitet werden.

Primär- und/oder Raumstrukturdaten können zur Anwendung kommen, um begründete Schätzungen für Mutageneseexperimente anstellen zu können. Die Expression von mutationserzeugten Proteinen sowie die Erprobung dieser Muteine in biologischen Untersuchungen liefern Informationen über die relative Bedeutung bestimmter Aminosäuren.

Ziel der Erfindung ist es, IL-3-Mutanten mit ähnlichen oder verbesserten pharmazeutischen Eigenschaften - verglichen mit den originären IL-3 - auszustatten, wobei vorzugsweise die erwähnten Verfahren zur Anwendung kommen sollen.

Fachliteratur

Human-lnterleukin-3

1984 wurden cDNA-Klone, die für murines IL-2 codieren, isoliert (Fung u.a.. Nature 307 [1984] 233-237 und Yokota u.a., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 81 [1984]1070-1074). Diese cDNA hybridisierte nicht mit menschlichen DNA- oder cDNΑ-Klonen. Daraus wurde geschlossen, daß es kein menschliches Gegenstück zum murinen IL-3 (mlL-3) gibt. Diese Annahme wurde durch das breite Spektrum der Aktivitäten zum Human-GM-CSF verstärkt. 1986 ergab eine cDNA-Expressionsbank beim Gibbon schließlich die Gibbon-IL-3-Sequenz. Nach Gegenüberstellung mit einer genomischen Bank beim Menschen erbrachte die Untersuchung den Beweis für das Vorhandensein von IL-3 im Menschen (Yang u.a.. Cell 47 (1986) 3-10).

Zwischenzeitlich fanden Dorssers u.a., Gene 55 (1987) 115-124, bei einer Human-cDNA-Bankein Klon, das überraschenderweise mit mlL-3 hybridisierte. Diese Hybridisierung war das Ergebnis des hohen Grades an Homologie zwischen den S'-nichtcodierenden Regionen von mlL-3 und hlL-3.

Modifizierte CSF (mit Ausnahme von IL-3)

Moonen u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 4428-4431, schildern die Herstellung von Human-GM-CSF mit Hilfe unterschiedlicher rekombinanter Quellen, darunter E.-coli-, Hefe- und Tierzeilen. Teilweise gereinigte Expressionsprodukte aus Hefe- und Tierzellen wurden im Hinblick auf den Deglykosylierungseffekt untersucht. Nach Beseitigung der N-verbundenen Oligosaccharide stieg die Immunoreaktivität um das 4- bis 8fache. Die spezifische biologische Aktivität lag bei den Untersuchungen sowohl zur chronischen Myelogenleukämie (CML) als auch zum menschlichen Knochenmark um einen Faktor von 20 höher.

Kaushansky u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 1213-1217, unternahmen den Versuch, die Region(en) des für die biologische Aktivität erforderlichen GM-CSF-Polypeptids zu bestimmen. Da menschliche und murine GM-CSF in ihren entsprechenden Koloniebildungsversuchen keine Kreuzreaktion vollziehen, stützte sich das Vorgehen auf die Verwendung von hybriden DNA-Molekülen mit unterschiedlichen Längen von Codierungsregionen für h- und mGM-CSF. Nach der Expression in COS-Zellen wurden die Hybridproteine sowohl in menschlichen als auch murinen Koloniebildungsversuchen getestet. Es zeigte sich, daß zwei GM-CSF-Regionen für die hämopoetische Funktion von ausschlaggebender Bedeutung sind. Diese Regionen sind strukturell durch eine amphiphilische Helix und durch eine disulfidgebundene Schleife gekennzeichnet.

Gough u.a., Eur. J. Biochem. 169 (1987) 353-358, beschreiben innere Deletionsmutanten der murinen GM-CSF. Von keinem der Mutanten wird biologische Aktivität berichtet.

Kuga u. a., Biochem. Biophys. Res. Com. 159 (1989) 103-111, geben eine Schilderung der humanen G-CSF. Aus den Ergebnissen wird deutlich, daß die Mehrheit der Expressionsprodukte mit Mutationen in den inneren oder C-terminalen Regionen hG-CSF-Aktivität ausschließt. Dagegen behielten N-terminale Deletionsmutanten, denen 4,5,7 oder 11 Aminosäuren - aus einer Gesamtheit von 174 Aminosäuren — fehlten, die Aktivität. Einige der N-terminalen Aminosäuremutanten wiesen eine verstärkte Aktivität auf.

Die Gewinnung von Deletionsmutanten des Human-lnterleukin-1 (IL-I) erfolgte unter Nutzung verfügbarer Endonuclease-Restriktionsorte und Expression in eukaryotischen Zellen. Das Carboxylende (63 Aminosäuren) des Polypeptids enthält das aktive Zentrum (Makino u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 [1987] 7841-7845). Aus einer kürzlich vorgenommenen Studie von IL-I α und IL-I β wird ersichtlich, daß für eine vollständige biologische Aktivität 140 bzw. 147 Aminosäuren (von insgesamt 153 Aminosäuren) erforderlich sind (Mosley u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA84 [1987] 4572-4576). Einfache Aminosäureveränderungen an beiden Enden führten zu einer deutlichen Verringerung der biologischen Aktivität. Diese Studien erbrachten jedoch keine ausführlichen Informationen über die rezeptorbildende Domäne von IL-I.

Es zeigt sich, daß die Aktivität des Human-lnterleukin-2 durch die Entfernung sowohl von Cys⁵⁸ als auch Cys'⁰⁵ deutlich gehemmt wurde, während die Deletion des dritten Cys-Rests (125) ohne Auswirkung blieb (Wang u.a., Science 224 [1984] 1431-1433; Cohen u. a., Science 234 [1986] 349-352). Bei allen zu einer Störung der Helixfaltung dieses Proteins führenden Substitutionen wurde festgestellt, daß sie signifikante Reduzierungen der biologischen Aktivität zur Folge hatten. Der potentielle rezeptorbindende Ort von IL-2 wurde auf einem elf Aminosäure langen Peptid kartiert. Individuelle Aminosäuresubstitutionen in dieser Region zeitigten dramatische Auswirkungen (Cohen u.a. [ebenda] ;Zurawski und Zurawski, EMBO J. 7 [1988] 1061-1069). Die Mutationsanalyse zeigte weiterhin, daß unterschiedliche Domänen von IL-2 an der hohen und niedrigen Affinitätsbindung des IL-2-Rezeptorkomplexes beteiligt sind (Robb u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 [1988] 5654-5658; Collins u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 [1988] 7709-7713).

Es kann gefolgert werden, daß Modifizierungen von CSF im allgemeinen einschneidende Veränderungen in der biologischen Aktivität dieser Moleküle bewirken. Der Human-G-CSF verliert beispielsweise seine Aktivität, wenn innere oder C-terminale Mutationen eingeführt wurden. N-terminale Deletionen in Human-G-CSF von bis zu 11 Aminosäuren (von insgesamt 174 Aminosäuren) dagegen beeinflussen die Aktivität nicht nachteilig, gleiches gilt für IL-I, bei dem von 153 Aminosäuren mindestens 140 für eine uneingeschränkte Aktivität erforderlich sind. Bei diesen Molekülen sind ganz eindeutig weniger als 10% der Aminosäuren entbehrlich.

Modifiziertes IL-3

Clark-Lewis u.a., Science 231 (1986) 134-139, unternahmen eine funktionell Analyse der synthetischen murinen IL-3-Analoge.

Sie gelangten zu dem Schluß, daß für die vollständige Aktivität die stabile tertiäre Struktur des kompletten Moleküls erforderlich ist. Aus einer Studie über die Rolle der Disulfidbrücken wurde deutlich, daß die Ersetzung von zwei der vier Cys-Reste durch AIa (Cys⁷⁹, Cys¹⁴⁰ -> Ala⁷³, AIa¹⁴⁰) eine verstärkte Aktivität nach sich zog (Clark-Lewis u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (19881

Über vorgeschlagene Modifizierungen von hlL-3 gibt es nur wenig Literatur. Noch seltener allerdings ist Literatur übertatsächüch durchgeführte Modifizierungen von hlL-3. In der internationalen Patentanmeldung WO 88/00598 ist von einer „sich natürlich vollziehenden" Ser²⁷ -> Pro²⁷-Substitution die Rede. (Bemerkenswert ist, daß die Numerierung der Aminosäuren in WO 88/ 00598 das Signalpeptid aus 19 Aminosäuren einschließt.) Außerdem wird empfohlen, Cys durch Ser zu ersetzen, um so die

Disulfidbrücke zu durchbrechen und eine oder mehrere Aminosäuren an den Glykosylierungsorten ASn³⁴CyS³⁵SeI-³⁶ und ASn⁸³AIa⁹⁰SOr³¹ zu ersetzen.

Aus EP-A-0275598 (WO 88/04691) wird deutlich, daß AIa¹ deletiert und dabei die biologische Aktivität erhalten werden kann.

Einige mutante hlL-3-Sequenzen werden zur Verfügung gestellt, nämlich zwei Doppelmutanten, AIa¹ -> Asp¹, Trp¹³ -»· Arg¹³

(pGB/IL-302) und AIa¹ ->· Asp¹, Met³ -» Thr³ (pGB/IL-304) und ein Dreiermutant AIa¹ -► Asp¹, Leu³ -* Pro³, Trp¹³ ->· Arg¹³ (pGB/IL-

303) (die Numerierung beginnt mit der ersten Aminosäure des reifen Proteins).

In WO 88/05469 wird dargelegt, wie die oben erwähnten Deglykosylierungsmutanten erlangt werden können, ebenso wie Mutanten von Art⁵⁴Arg⁵⁵ und Arg¹⁰⁸Arg¹⁰⁹Lys¹¹⁰ (in die gleiche Numerierung gebracht wie in EP-A-0275598). Letztere werden empfohlen, um die Proteolyse nach Expression in Saccharomyces cerevisiae durch KEX2-Protease zu vermeiden. Es wurde von keinen mutierten Proteinen berichtet. Glykosylierung und die KEX2-Proteaseaktivität sind in diesem Zusammenhang nur nach Expression in Hefe wichtig.

Schließlich erwähnt EP-A-0282185 verschiedene Mutanten, die konformations- und antigenneutral sein können. Um das zu erreichen, wird eine Reihe synonymer Aminosäuresubstitutionen empfohlen. Die vorgeschlagenen Aminosäureveränderungen zielen darauf ab, die Struktur zu bewahren und die Ladungsverteilung des IL-3-Moleküls unverändert zu lassen. Die einzig wirklich vollzogenen Mutationen sind Met² -* Me² und Ue¹³¹ -* Leu¹³¹. Es wurde nicht erwähnt, ob die beabsichtigten Neutralitäten erreicht werden konnten.

Bis jetzt ist von keinen umfassenden Mutageneseexperimenten zu hlL-3 berichtet worden.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht zwei neue Klassen von pharmakologisch interessanten Verbindungen, nämlich Deletionsmutanten und Substitutionsmutanten von hlL-3, die biologische Aktivitäten aufweisen, die jenen von hlL-3 ähnlich sind und in einigen Fällen auch entgegenwirken.

Darlegung der Charakteristik der Erfindung

Ein Aspekt der Erfindung betrifft biologisch aktive Polypeptidanaloge von lnterleukin-3 (nachfolgend auch als „hlL-3-Mutanten" oder „Muteine" bezeichnet) mit einer Deletion von mindestens zwei Aminosäuren.

Bevorzugte Mutanten sind jene mit einer oder mehreren Deletionen am Aminoende (Aminosäuren 1-14) bzw. Carboxylende (Aminosäuren 120-130 bzw. 130-133).

Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Substitutionsmutanten von hlL-3 aufgezeigt, die mindestens eine der folgenden Substitutionen aufweisen:

ASp²¹GIu²²	-» Lys²¹Arg²²
Asp³⁶	-+ Arg³⁶
GIu⁴³ASp⁴⁴	-> LyS⁴³Ar₉ ⁴⁴
Arg^Arg⁵⁵	-* GIu⁵⁴ASp⁵⁵
Asp⁴⁶	-* Lys^4e oder Arg⁴⁶
GIu⁶⁰	-> Lys⁵⁰ oder Arg⁵⁰
GIu⁵⁹	-> Lys⁵⁹ oder Arg⁵⁹
GIu⁶⁹	-* GIy⁵⁹ oder Pro⁵⁹ (a-Helixbrecher)
Arg^Ala⁶⁴	-* PrO⁶³GIy⁶⁴
GIu⁷⁵	-♦ Arg⁷⁵ oder GIy⁷⁵
Lys⁷⁹	-·. GIu⁷⁹
Arg³⁴	-» Pro⁹⁴
His⁹⁸Lys¹⁰⁰Asp¹⁰¹	-» GIu⁸⁸ASp¹⁰⁰GIn¹⁰¹
GIu¹⁰⁶	-> Lys¹⁰⁶
Ar₉ ¹⁰⁸Ar₉ ¹⁰⁹LyS¹¹⁰	-* GIu¹⁰⁸AsP¹⁰⁹GIu¹¹⁰
Phe¹¹³Tyr¹¹⁴	-» AIa¹¹³TV¹⁴
Cys¹⁶	-* AIa¹⁶
Cys⁸⁴	-* AIa⁸⁴
Cys¹⁶Cys⁸⁴	-* AIa¹⁶AIa⁸⁴

Ein wiederum anderer Aspekt der Erfindung verweist auf Substitutionsmutanten von hlL-3, die bei der Rezeptorbindung wirksamer sind als bei der Stimulierung der DNA-Synthese, also auf Antagonisten. Genauer gesagt, handelt es sich dabei um

einfache oder doppelte Cys-Mutanten. Cys wird vorzugsweise durch AIa (Cys¹⁶ -* Ala¹⁶, CyS¹⁶CyS⁸⁴ -» AIa¹⁶AIa⁸⁴) ersetzt. Andere

Mutanten mit antagonistischem Effekt sind GIu⁶⁰ —► Lys⁵⁰ und Lys⁷⁹ -* GIu⁷⁹.

Die erwähnten Polypeptide erlangt man durch Expression von entsprechend modifizierten DNA-Sequenzen. Aus diesem Grunde bietet die Erfindung auch geeignete Expressionsvektoren und Wirtszellen, die damit kompatibel sind.

Im Hinblick auf weitere Aspekte umfaßt die Erfindung pharmazeutische Präparate, zu denen die oben erwähnten biologisch aktiven Peptidanaloge von hlL-3, in Verbindung mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger, gehören.

Die Erfindung verweist schließlich auf monoklonale Antikörper, die auf ein zwischen den Aminosäuren 29 und 54 angesiedeltes Epitop abzielen.

Diese und andere Aspekte werden in der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung weiter dargelegt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Nucleotid- und translatierte Aminosäurensequenz des Fusionsproteininserts von pGB/IL-336. Bei Aminosäuren, die in Kleinbuchstaben angegeben sind, handelt es sich um nicht-hlL-3-Aminosäuren, die IL-3-Proteinsequenz beginnt bei AIa 1.

Fig. 2 zeigt die 5'- und S'-Sequenzveränderungen, die eingeführt wurden, um pGB/IL-339 zu erhalten. Wie in Abb. 1 verweisen die Aminosäuren mit Kleinbuchstaben auf nicht-hlL-3-Aminosäuren, die reife IL-3-Proteinsequenz beginnt bei AIa 1.

Bei Fig. 3 handelt es sich um eine Auf nähme des Polyacrylamidgels der folgenden 19 IL-3-Mutanten (Bahnen 1 bis 19): pGB/IL-336, pGB/IL-339,932,810,934,812,935,813,936,820,937,821,938,822,939,9329,904,905,9045; und des Pharmacia-LMW-Markers (Bahn 20). Mit diesen Zahlen übereinstimmende Mutationen werden in Tab.4 aufgeführt.

Fig. 4 zeigt einen AML-Proliferationsversuch für IL-3 (*) und IL-3-Mutant 821 C).

Fig. 5 zeigt ein Experiment einer IL-3-Rezeptorbindung. Radioaktiv markierte IL-3-Bindung an AML-Patientenstammzellen wird mit unmarkiertem IL-3-Protein konkurrenzreagiert (Bezugspräparat). Aufgezeigt werden die Ebenen der nichtspezifischen (unterer Streifen) und der höchsten Gesamtbindung (oberer Streifen) in diesem Experiment (siehe Beispiel 5).

Fig. 6 zeigt einen Vergleich von ausgewählten mutanten IL-3-Proteinen unter dem Gesichtspunkt der relativen biologischen Aktivität (nichtschraffierte Säulen) und der relativen Bindungsaktivität (schraffierte Säulen). Verwiesen wird auf den Prozentsatz der Aktivität im Vergleich zum IL-3-Bezugspräparat (Tab.4).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Verwendung entspricht IL-3 der in Tab. 1 dargestellten Aminosäure (1-133). Inbegriffen sind auch natürlich auftretende Varianten. Im Begriff IL-3 enthalten sind weiterhin hlL-3-Moleküle, die nach der Translation (z. B. durch Glykosylierung) modifiziert wurden. Unter IL-3-Derivaten ist jedes IL-3-Molekül zu verstehen, das chemisch oder enzymatisch modifiziert wurde und damit mindestens einen Teil seiner biologischen Aktivität beibehält.

Analoge von Human-IL-3 beziehen sich gemäß der vorliegenden Verwendung auf Moleküle mit einer Sequenz, die durch eine oder mehrere Deletionen oder Substitutionen vom reifen IL-3 abweicht.

Human-IL-3 ist weiterhin durch seine biologische Aktivität zur Stimulierung der Koloniebildung durch menschliche hämopoetische Präkursorzellen gekennzeichnet. Die gebildeten Kolonien schließen Erythroide, Granulozyten, Megakaryozyten, Granulozytenmakrophage und Mischungen daraus ein. Die biologische Aktivität von hlL-3 kann (für den vorliegenden Zweck) weiter in zwei Teile untergliedert werden — Signaltransduktion und Rezeptorbindung.

Bei einem hlL-3-Analog bedeutet erfindungsgemäß der Verweis auf verbesserte Eigenschaften, daß der Analog über ein besseres Signaltransduktions/Rezeptorbindungsverhältnis verfügt. „Besser" hängt dabei von den gewünschten Eigenschaften ab, z.B. von einem höheren Bindungskoeffizienten für einen Antagonisten oder einer gleichen oder höheren biologischen Aktivität für einen Deletionsmutanten. „Besser" kann auch bedeuten, daß der Polypeptidanalog geringere Neigung zur Bildung von Aggregaten zeigt.

Für den vorliegenden Zweck wird die (biologische) Aktivität des Human-IL-3-Analogs durch DNA-Synthese vermittels akuter myelogener Stammzellen des Menschen bestimmt. Außerdem werden Rezeptorbindungsversuche mit Spenderleukozyten, AML-Patientenzellen oder MV4-11-Zellen durchgeführt.

IL-3 ist sowohl bei der Rezeptorbindung als auch bei der Signaltransduktion aktiv. Wäre es möglich, diese Aktivitäten auf spezifische Aminosäuresequenzen zurückzuführen, die entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich sein können, dann wäre es auch möglich, die Bindungs- und Signaltransduktionsaktivitäten abzukoppeln. Damit wäre die Produktion spezifischer IL-3-Rezeptorantagonisten möglich.

Zur Erreichung dieser Ziele sind - als erster Schritt- klare Kenntnisse über die Struktur-Funktion-Beziehung von hlL-3 erforderlich. Durch Einführung einer Vielfalt von Mutationen im Protein können die Eigenschaften des natürlich auftretenden oder natürlich mutierten IL-3 geändert werden. Derartige Veränderungen werden unter Nutzung der beschriebenen Mutageneseverfahren entsprechend eingeführt und die mutierten Moleküle (hlL-3-Muteine) unter Nutzung der beschriebenen Expressionsvektoren angemessen synthetisiert.

Zur Bestimmung der Struktur-Funktion-Beziehung kommen u.a. die folgenden Mutageneseverfahren in Betracht:

a) Ersetzung einer Aminosäure durch einen isosteren Rest unterschiedlicher Funktion, z. B. Asp durch Asn. Damit werden die Wasserstoffbindungseigenschaften bewahrt und gleichzeitig die Ladung beseitigt;

b) Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere mit identischer Funktion, jedoch unterschiedlicher Struktur, z. B. GIu durch Asp, wobei eine Carboxylgruppe durch etwa 1Ä verschoben würde;

c) Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere mit unterschiedlicher Funktion;

d) Einführung oder Beseitigung von Disulfidbrücken; »

e) Aufbau von Deletionsmutanten;

f) Einführung von Helixbrechern (z. B. Pro);

g) Aufbau von Insertionsmutanten;

h) Schaffung von Glukosylierungsmutanten. *

Ein Aspekt der Erfindung besteht in der Entwicklung eines spezifischen Antagonisten, der den Rezeptor blockiert, indem er sich spezifisch daran bindet, vorzugsweise mit einem hohen Bindungskoefizienten, womit die Signaltransduktion verhindert wird. Antagonist kann jedes chemische Molekül sein, das mit dem Rezeptor eine Bindung eingeht und damit die Bindung des Agonisten verhindert. Die Erfindung zielt besonders auf Proteine ab, die einen solchen Blockierungseffekt aufweisen. Ein Aspekt der Erfindung besteht darin, daß hlL-3-Muteine ermöglicht werden, die zumindest von teilweise antagonistischer Wirkung sind. Konkret handelt es sich dabei um einzelne oder doppelte Cys-Mutanten. Cys wird vorzugsweise durch AIa ersetzt (Cys¹⁶ -* AIa¹⁶, CyS¹⁶CyS⁸⁴ -* AIa¹⁶AIa⁸⁴). Andere Mutanten mit einem antagonistischen Effekt sind GIu⁵⁰ -* Lys⁵⁰ und Lys⁷⁹ -»· GIu⁷⁹. Es ist vorstellbar, daß die Verabreichung einer signifikanten Dosis der beschriebenen Mutanten die Bindung des physiologisch verfügbaren IL-3 verhindert und damit seine antagonistische Aktivität erkennen läßt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Proteine mit hlL-3- oder hlL-3-ähnlicher Aktivität, die vorzugsweise um ca. 3 bis ca. 25% kleiner als das natürliche hlL-3-Molekül sind. Wie aus den Beispielen weiter hervorgeht, läßt sich durch die Einführung spezifischer Deletionen bestimmen, weicher Teil des Moleküls für die Rezeptorbindung und die Signaltransduktion unerläßlich ist. In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung werden Aminosäuren ermöglicht, die für die Rezeptorbindung bzw. die Signaltransduktion wichtig sind.

Im einzelnen wurden zwei Arten von Mutanten hergestellt: a) Deletionsmutanten und b) Substitutionsmutanten. Es wird davon ausgegangen, daß mit Hilfe der erwähnten Methoden leicht Kombinationen dieser Mutanten erlangt werden können. Es wurden Deletionsmutanten hergestellt, die zusammen faktisch die gesamte Codierungsregion erfaßten. Bei den erfindungsgemäß verwendeten Deletionen kann es sich um jede Aminosäuredeletion von mindestens zwei aufeinanderfolgenden (oder separierten) Aminosäuren handeln. Vorzugsweise können vier oder mehr Aminosäuren deletiert werden. Besagte Deletionen können bei einer beliebigen Aminosäure im Molekül (nur nicht in unmittelbarer Nähe des Carboxylendes) beginnen. Möglich sind auch zwei separierte Deletionen im Molekül (z.B. zweimal eine Aminosäuredeletion, zweimal zwei usw.). In einer der am stärksten bevorzugten Ausführungsformen werden 32 Aminosäuren deletiert, 14 am Aminoende und 18 am Carboxy !ende des Proteins. Überraschenderweise zeigten alle Deletionsmutantenproteine nach der Expression eine spezifische IL-3-Bioaktivität, allerdings zumeist sehr stark vermindert. Daraus kann geschlossen werden, daß es auf dem Protein keine einzelne kontinuierliche Peptiddomäne gibt, die mit dem Rezeptor eine Bindung eingeht.

Vier der Mutanten, der N-terminale Deletionsmutant ohne die Aminosäuren 1 bis 14, der C-terminale Deletionsmutant ohne die Aminosäuren 120 bis 130, der Doppelmutant davon sowie der C-terminale Mutant 130-133, zeigten biologische und Bindungsaktivität, die mit der des natürlichen IL-3-Moleküls vergleichbar ist. Es überrascht, daß hlL-3, dem bis zu 25 Aminosäuren fehlen (etwa 20%deshlL-3 in voller Länge), noch immer seine uneingeschränkte Aktivität aufweist. Angesichts von Cys¹⁶, das an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt ist, ist zu erwarten, daß ein —15 N-terminaler Deletionsmutant seine volle Aktivität bewahrt. Die Doppel-Deletionsmutanten, denen die 14N-terminalen und bis zu 18C-terminalen Aminosäuren fehlen (Tab.4, X und Z), bewahren dennoch die volle Aktivität. Solche Mutanten, denen bis zu 32 Aminosäuren fehlen, büßen höchstens etwa 25 % des originären Moleküls ein. Da dieser Doppelmutant die volle Aktivität bewahrt, ist zu erwarten, daß auch der -18 C-terminale Mutant voll aktiv sein wird.

Es wurden auch Mutanten mit nur inneren Deletionen hergestellt. Erfindungsgemäß wird ein innerer Deletionsmutant mit völlig beibehaltener Aktivität beschrieben, dem die Aminosäuren 120 bis 130 (Tab.4,939) fehlen. Es besteht die Wahrscheinlichkeit, daß noch mehr solcher Mutanten hergestellt werden können. Aus Verfahrensgründen ist es vielleicht von Vorteil, die ersten Aminosäuren des reifen IL-3-Proteins zu bewahren. Da der -14 N-terminale Deletionsmutant die volle Aktivität beibehält, wird erwartet, daß auch ein innerer Deletionsmutant in der N-terminalen Region seine Aktivität bewahrt. Eine weitere Region, in der eine Deletion mit Erfolg eingeführt werden könnte, ist offensichtlich die Gln^-Leu^-Region. Die Deletion von 1 bis 7 Aminosäuren, möglicherweise in Verbindung mit einer Lys²⁸ —* Pro^M-Substitution, könnte eine weitere Reihe innerer Deletionsmutanten liefern.

Die Entdeckung, daß die Aktivität von hlL-3 in den dargestellten Doppelmutanten oder bei jedem anderen Mutanten, dem große Teile von Protein (z.B. etwa 25%) fehlen, anhält, weist einen weiteren potentiellen Vorteil auf. Ein pharmazeutisches Präparat, das hlL-3 enthält, kann parenteral, intravenös oder subkutan verabreicht werden. Die Anwendung eines aus biologisch abbaubarem Polymer zusammengesetzten Hydrogels, das das Polypeptid einschließt und besagtes Polypeptid kontinuierlich freisetzt, ist durch die Peptidmenge, die eingeschlossen werden kann, begrenzt. Die Verwendung eines Deletionsmutanten des Polypeptids mit höherer spezifischer Aktivität impliziert, daß auf molarer Basis im gleichen Volumen mehr aktive Substanz eingeschlossen werden kann, wodurch sich der Zeitabstand zwischen den Verabreichungen vergrößert oder möglicherweise eine mehrfache Verabreichung nicht erforderlich ist.

Substitutionsmutanten wurden durch die Einführung spezifischer Mutationen im DNA-Bereich geschaffen, wobei Aminosäuresubstitutionen in das codierte Protein gelangen. Diese Substitutionen können in Regionen eingeführt werden, die für die Konformation oder die Aktivität des Proteins von Bedeutung sind. Beispiel für eine solche Mutation ist eine Mutation, die die zwischen Cys¹⁶ und Cys⁸⁴ bestehende Disulfidbrücke stört. Durch Ersetzung eines (oder beider) Cysteinreste durch ein Alanin kann die Brücke nicht gebildet werden, woraus eine stark verringerte Aktivität resultiert. Alle drei der möglichen Mutanten wurden hergestellt, und sie zeigen in einer Rezeptorbindungsstudie eine relativ hohe Bindungsaktivität (verglichen mit der biologischen Aktivität). Da unterschiedliche Verhältnisse von relativer Bindungsaktivität zu relativer biologischer Aktivität (Tab.4) festgestellt werden, kann es vorteilhaft sein. Kombinationen der dargestellten IL-3-Analoge zu verwenden. Außerdem kann es auch von Vorteil sein, Polypeptidanaloge mit sowohl einer oder mehreren Deletionen und einer oder mehreren Substitutionen zu verwenden.

Das Brechen der Disulfidbrücke hat eine substantielle Veränderung der Raumstruktur des Subjektproteins zur Folge, auch andere Aminosäuresubstitutionen beeinflussen diese Struktur und damit die Aktivität.

Aus Sekundärstrukturmessungen (Zirkulardichroismus) geht hervor, daß das hlL-3-Molekül einen hohen Prozentsatz (70% bei 20°C) an α-Helices aufweist. Aus Sekundärstrukturvorhersageprogrammen (z. B. Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1981] 3824-3828, Garnier u.a., J. Mol. Biol. 120 [1978] 97-120, Biou u.a., Prot. Eng. 2 [1988] 185-191, Cärmenes u.a., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159 [1989] 687-693] geht hervor, daß diese α-Helices zwischen den folgenden Aminosäuren angesiedelt sind: Met¹⁹ - His²⁶, GIy" - Arg⁵⁵, Leu⁵⁸ - GIu⁶⁹, AIa⁷¹ - Leu⁸¹, Leu⁸⁷ - His⁹⁵, His⁹⁸ - Leu¹¹¹ und Leu¹¹⁵ - AIa¹²¹.

In Betracht der Ladungsverteilung in den α-Helices und aufgrund der Möglichkeit, daß diese Ladungen bei der Wechselwirkung mit dem Rezeptor eine wichtige Rolle spielen, werden erfindungsgemäß auch die folgenden „Ladungsumkehrungs"Substitutionen eingeschlossen:

ASp²¹GIu²² -*	Lys²¹ Arg²²
Asp³⁶ -»	Arg³⁶
GIu⁴³ASp⁴⁴ ->	Lys^Arg⁴⁴
Arg^Arg⁵⁵ -♦	GIu⁵⁴AsP⁵⁵
Asp⁴⁶ -♦	Lys⁴⁸ oder Arg⁴⁶
GIu⁶⁰ ->	Lys⁶⁰ oder Arg⁵⁰
GIu⁶³ -►	Lys⁵³ oder Arg⁵³
GIu⁶³ -	GIy⁶⁸ oder Pro⁵³ (a-Helixbrecher)
Arg^Ala⁶⁴ -*	PrO⁶³GIy⁶⁴
GIu⁷⁶ -+	Arg⁷⁵ oder GIy⁷⁵
Lys⁷⁹ -*	GIu⁷⁹
Arg⁹⁴ -	Pro⁹⁴
HiS⁹⁸LyS¹⁰⁰ASp¹⁰¹ -►	GIu⁹⁸ASp¹⁰⁰GIn¹⁰¹
GIu¹⁰⁶ -»	Lys¹⁰⁸
Arg^I08Arg¹⁰⁹Lys¹¹⁰ -►	GIu¹⁰⁸ASP¹⁰³GIu"⁰
Phe¹¹³Tyr¹¹⁴ -»	Ala"³Thr¹¹⁴

Zur Veränderung der Glykosylierungsorte können sowohl Deletions- als auch Substitutionsmutanten verwendet werden. Das ermöglicht je nach Wunsch die Herstellung von glykosylierten oder unglykosylierten Polypeptiden in eukaryotischen Wirtszellen. Die oben beschriebenen Mutanten wurden bei Epitopkartierungsexperimenten verwendet, um exponierte Segmente des Moleküls, die bei der Rezeptorbindung von Bedeutung sein können, zu lokalisieren. Zu diesem Zweck wurden monoklonal Antikörper gegen reifes hlL-3 präpariert. Nachfolgend wurden diese Antikörper bei Western-Blotting-Experimenten gegen Mutantenproteine eingesetzt. Zumindest ein antigenes Fragment konnte entdeckt werden.

Erfindungsgemäß werden die neuen hlL-3-Mutanten durch ortsspezifische Mutagenese angemessen präpariert, doch es können zur Gewinnung modifizierter Proteine auch zahlreiche andere, in der Fachweit bekannte Verfahren verwendet werden. Zu den geeigneten, zur Umwandlung von Mikroorganismen fähigen Vektoren, die die mutierten DNA-Sequenzen, welche die gewünschten hlL-3-Mutanten codieren, ausprägen können, gehören Expressionsvektoren mit besagten, von der reifen hlL-3-Codierungssequenz abgeleiteten mutierten Sequenzen, die mit Expressionsregulierungsregionen und Terminatorregionen verbunden sind. Diese Regionen werden abhängig von den prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die als Wirtszellen dienen, ausgewählt. Als Wirtsstämme werden vorzugsweise E. coli oder Bacillus verwendet. Eingesetzt werden können jedoch auch Pilz-, Hefe- und Gewebekulturzellen (siehe EP-A-0275598).

Zu den Expressionsvektoren für E. coli gehören pGB/IL-336 und pGB/IL-339, die jeweils den lacZ-Promotor enthalten, sowie für Bacillus pGB/IL-322, der den a-Amilasepromotor und das Signalpeptid enthält, und deren Derivate. Andere geeignete Vektoren zur Expression in Bacillus sind beispielsweise der Hpall-Promotor, der Vektoren und Derivate davon umfaßt. Diese und andere Vektoren werden alle in EP-A-0275598 und EPA 90200624.6 (eingereicht am 15. März 1990 auf der Grundlage der folgenden Prioritäten: EPA 89200660.2, eingereicht am 15. März 1989, und EPA 89201967.0, eingereicht am 25. Juli 1989) beschrieben. Aus Zweckmäßigkeitsgründen kann es nützlich sein, Expressionskonstruktionen zu verwenden, die in der Lage sind, das Protein aus der Wirtszelle abzusondern. Das geschieht beispielsweise in den verwendeten Bacillus-Konstruktionen. Möglich ist auch die Isolierung aus Einschlußkörpern, wie hier beim E. coli dargestellt.

Die Reinigung des nach der Expression erhaltenen Polypeptids hängt von der Wirtszeile und der verwendeten Expressionskonstruktion ab. Im allgemeinen kann die Reinigung von hlL-3-Muteinen in dergleichen Art und Weise wie die Reinigung von natürlichen hlL-3 erfolgen. Um hochreine hlL-3-Muteine zu erhalten, werden folgende Schritte unternommen: hydrophobe Wechselwirkungschromatografie mit anschließender Anionenaustauschchromatografie, wahlweise gefolgt von Gelfiltration. Es kann auch ausreichen, nur einen oder zwei dieser Reinigungsschritte vorzunehmen (eine ausführliche Beschreibung der Reinigung von hlL-3 erfolgt in EPA 90200624.6, eingereicht am 15. März 1990, auf der Grundlage der folgenden Prioritäten: EPA 89200660.2, eingereicht am 15. März 1989, und EPA 89201967.0, eingereicht am 25.JuIi 1989). Es wurden also nach Expression in E.coli als erstem Schritt die das Protein enthaltenden Einschlußkörper isoliert. Nach Beschallung in 8M-Harnstoff wurde das Protein mittels Anionenaustauschchromatografie weiter gereinigt. Nach der Entfernung des Harnstoffs erbrachte die Filtersterilisierung ein Protein, das dann zur biologischen und biochemischen Charakterisierung verwendet wurde. Die Verwendung von Bacillus als Wirtsstamm erbrachte in Verbindung mit der Absonderung der Polypeptide nach Kombination von hydrophober Wechselwirkungs- und Anionenaustauschchromatografie hochreine Polypeptide. Außerdem wird deutlich, daß Mutanten mit veränderten Ladungen unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweisen können, die spezielle Elutionsbedingungen oder andere Säulenstoffe als die in den Beispielen verwendeten erfordern. Die gereinigten Muteine können durch Beimischung eines pharmazeutisch zulässigen nichttoxischen Trägers als pharmazeutische Präparate hergestellt werden. Wie bereits erwähnt, können derartige Präparate zur parenteralen (subkutanen, intramuskulären oder intravenösen) Verabreichung, insbesondere in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen, angefertigt werden. Die Präparate können zweckmäßigerweise in Dosierungseinheiten verabreicht und mit Hilfe bekannter pharmazeutischer Verfahren, z. B. gemäß „Pharmaceutical Sciences" von Remington, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1970, hergestellt werden. Rezepturen zur parenteralen Verabreichung können als gemeinsame Trägerstoffe steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole wie Polyethylenglykol, Öle pflanzlicher Herkunft, hydrierte Naphtalane u. ä. enthalten. Die erfindungsgemäßen Stoffe können als einziger Wirkstoff in einem Pharmazeutikum oder in Verbindung mit anderen aktiven Bestandteilen verwendet werden. Weitere aktive Bestandteile können z. B. aus entsprechenden Hämatopoetinen, CSF und Interleukinen ausgewählt werden. Dazu gehören GM-CSF, CSF-1, G-CSF, M-CSF, Erythropoetin, IL-1 α, IL-1 ß, IL-2, IL-4 bis IL-8 und der Tumornekrosefaktor.

Zur Untersuchung der biologischen Aktivität und Wirksamkeit der erfindungsgemäßen hlL-3-Analoge steht eine Vielzahl von Tests zur Verfugung. Beispielsweise kann der Analog mit herkömmlichen Verfahren erprobt werden, um festzustellen, ob das

Protein die Koloniebildung durch hämopoetische Human-Präkursorzellen stimuliert. Zu den gebildeten Kolonien gehören

Erythroide, Granulozyten und Granulozytenmakrophage. Als Alternative dazu kann auch die Fähigkeit der Subjektanaloge zur

Stimulierung der DNA-Synthese durch AML-Stammzellen, wie beispielsweise durch markierte Thymidinaufnahme bewiesen, zum Nachweis der Aktivität herangezogen werden.

Die biologisch aktiven Polypeptidanaloge von Human-IL-3 gemäß der Erfindung können sowohl für therapeutische als auch

diagnostische Zwecke genutzt werden. Zu den therapeutischen Verwendungszwecken gehören die Behandlung und Verhinderung von malignen und nichtmalignen Erkrankungen. Aufgrund der besonderen Eigenschaften der dargelegten Mutanten läßt sich die Anwendung verbessern.

Zu den Anwendungsformen gehören die Behandlung von:

- Zytopenien und/oder Immunosuppression aufgrund von Infektionen,

- Zytopenien aufgrund von Chemotherapie und/oder Bestrahlung,

- Knochenerkrankungen wie Frakturen und Osteoporose und von

- Immundefekten aufgrund von Vollnarkoseverfahren sowie

- Rekonvaleszenz nach Knochenmarktransplantation und

- die Unterstützung von Impfbehandlungen und der Therapie bei Infektionen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen, sie aber in keiner Weise einschränken:

VERSUCHE

Beispiel 1 Aufbau von Expressionsvektoren Aufbau von pGB/lL-336

Zur Gewinnung eines Polypeptids, das dem reifen Human-IL-3 sehr nahekommt, wurde eine Konstruktion gewählt, der die 5'-nichttranslatierten und signalpeptidcodierenden Sequenzen fehlen. Das IL-3-cDNA-lnsert von pLH1 (siehe EP-A-0275598) wurde mit Hincll und Hindlll exzidiert, mit einem synthetischen Oligonukleotid (Sall-Überhang/stumpf, 419/420, Tab. 1) ligiert, das die Sequenz mit der Codierung der N-terminalen 14 Aminosäuren des reifen IL-3 umfaßt, und in Sall-Hindlll-digeriertes pTZ18R (Pharmacia) eingebaut. Nach Verifikation der Sequenz wurde das vollständige Insert zur Proteinherstellung auf pUC8 übertragen (wie zuvor in EP-A-0275598 beschrieben), was Plasmid pGB/IL-335 erbrachte. Um eine direkte Sequenzbestimmung und Mutagenesezu ermöglichen, wurde das Pvul-Fragment des Plasmids pTZ18R, das den f1-Replikationsstartpunkt trägt, zur Ersetzung des entsprechenden Pvul-Fragments von pUC8 verwendet. Das resultierende bakterielle Expressionsplasmid pGB/IL-336 ergibt ein Fusionsprotein von 145 Aminosäuren mit einer errechneten relativen Molekülmasse von 16384 Dalton (Fig. 1).

Aufbau von pGB/IL-339

Ein alternatives Expressionspiasmid wurde gebaut, um den wirksamen Transfer von potentiell interessanten Mutanten in Bacillus-Expressionsvektoren zu erleichtern (siehe unten). Zu diesem Zweck wurde pGB/IL-336 mit Hpal und Hindlll digeriert, um den größten Teil des 3'-Endes des IL-3-cDNA zu entfernen. Die hervorstehenden Enden wurden abgestumpft, und nachfolgend wurde ein stumpfes Fragment mit den entsprechenden IL-3-Sequenzen (nt 137—497) und dem B. licheniformis-Alpha-Amylase-Terminator vom Plasmid pGB/IL-337 hineinligiert, was Plasmid GB/IL-338 erbrachte. Der Aufbau von pGB/IL-337 erfolgte aus pGB/IL-324 (gemäß EPA 892019670, die durch Verweis hier enthalten ist) durch Herausschaltung der 3'-nichtcodierenden IL-3-cDNA und Alpha-Amylase-Struktursequenzen zwischen dem IL-3-Stopcodon in cDN A und dem Alpha-Amylase-Terminator, wobei ein synthetisches Oligonucleotid (Tab. 1,944) verwendet wurde. Dieses Oligonucleotid führte auch einen Xhol-Ort unmittelbar stromabwärts vom IL-3-Stopcodon ein. Das Plasmid pGB/IL-338 wurde mit BamHI und Hincll digeriert, und ein Teil der Polylinker- und 5'-terminalen IL-3-Sequenzen wurde durch die phosphorylierten synthetischen Oligonucleotide 1055/1056 (Tab. 1) ersetzt, was Plasmid pGB/IL-339 erbrachte. Auf diese Weise wurde das IL-3-Gen mit einer leicht modifizierten heterologen signalpeptidcodierenden Sequenz rekonstruiert. Danach wurde ein Fusionsprotein von 148aa mit einer errechneten relativen Molekülmasse von 16541 Dalton synthetisiert (Abb.2). Die DNA-Sequenz von pGB/IL-339 wurde verifiziert und für korrekt befunden. Die biologische Aktivität des ausgeprägten Fusionsproteins erwies sich als unverändert. Aufgebaut wurde ein weiterer E. coli-Expressionsvektor pGB/IL-340, in dem dem lacZ-Promotor unmittelbar Sequenzen folgen, die das exakt zu reifem IL-3 fusionierte Bacillus-Alpha-Amylase-Signalpeptid codieren, wobei sich der Amylaseterminator stromabwärts befindet. Dieses Plasmid, das auch als Zwischenprodukt für den Aufbau von Bacillus-Expressionsvektoren dient, wurde durch Einführung des Ndel-Kpnl-Fragments vom pGB/IL-337 aufgebaut und überträgt alle gerade erwähnten Sequenzen in den Ndel-Kpnl-aufgespaltenen E. coli-VektorpTZ18RN. pTZ18RN ist pTZ18R (Pharmacia), unmittelbar stromaufwärts vom lacZ-ATG-Startcodon modifiziert, um einen Ndel-Ort einzuführen, wobei Oligonucleotid 731 Verwendung findet (siehe Tab. 1). pGB/IL-340 bewirkt eine hohe Produktion von IL-3 in E. coli.

Beispiel Z

Aufbau von Deletions- und Substitutionsmutanten

Durchgeführt wurde In-vitro-Mutagenese, wobei gemäß dem von Kunkel u. a.(1987), Meth.Enzymol. 154,367-382, entwickelten Verfahren synthetische Oligonucleotide (Tab.1 und 2) zur Anwendung kamen. Einzelsträngige Matrizen-DNA wurde durch Transformation von pGB/IL-336- oder pGB/IL-339-DNA in einen E. coli-Stamm CJ236 (BioRad) und Superinfektion mit einem M13K07 (Pharmacia)-Helferphagen präpariert. Die Phagen-DNA wurde nach Standardverfahren hergestellt und auf 0,6% bei niedrigerTemperatur schmelzender Agarose fraktioniert, um den Helferphagen ssDNA zu entfernen. Die exzidierte Bande wurde mit Phenol geschmolzen und extrahiert. pGB/IL-336 oder pGB/IL-339 ssDNA wurde durch Butanolkonzentration und Ethanolfällung gewonnen und für primerabhängige DNA-Synthese in einer Sequenzierungsreaktion getestet.

Gereinigtes pGB/IL-336 oder pGB/IL-339 ssDNA (± 100ng) wurde mit 20ng phosphoryliertem Primer bei 65°C geglüht und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Bei der Synthese des komplementären Strangs wurden 1-2μg des Gen-32-Proteins, 4 Einheiten der T4-DNA-Polymerase und 2,5 Einheiten der T4-DNA-Ligase verwendet. Die Reaktion erfolgte bei 0⁰C 5 Minuten, bei 20⁰C 10 Minuten und bei 37⁰C 90 Minuten lang. Nach Abschluß war ein Drittel des Reaktionsgemische mit aufgetauten kompetenten JM109-Zellen (D.Hanahan (1985) in »DNA Cloning" [D. M. Glover], Band 1, IRL Press, Washington) vermischt und beschichtet. Einzeln herausgegriffene Kolonien wurden genutzt, um Flüssigmittel zu impfen, und die Zellen wurden zur Gewinnung von ssDNA mit dem M13K07-Hilfsphagen superinfiziert. Die Sequenz der Klone wurde unter Verwendung des M13-Umkehrsequenzierungsprimers und von zwei IL-3-sequenzspezifischen Primern verifiziert (Tab. 1; 823: nt 118-137 und 824: nt 261-280).

Der Doppel-Cysteinmutant (9045) wurde durch Ligierung der entsprechenden BstBI-BamHI-Fragmente der die mutanten IL-3-Gene 904 und 905 tragenden Plasmide aufgebaut. Auf ähnliche Weise wurden die Kombinationsmutanten X und Z durch Ligierung der eine 5'-Deletion enthaltenden Fragmente und der 3'-Deletionen enthaltenden Fragmente aufgebaut. Die daraus resultierenden Klone wurden durch Restriktaseanalyse und Sequenzanalyse überprüft.

Der Mutant 9329 wurde nach Hpal- und BamHI-Aufschluß und ügation mit den Oligonucleotiden 1424/1425 von 939 abgeleitet. Die Klone wurden zuerst auf Verlust des Hpal-Orts und danach auf korrekte DNA-Sequenz verifiziert. Von allen Transformanten wurde Plasmid-DNA für eine zweite Runde der Transformation in JM109-Zellen isoliert, um die potentielle Kontamination mit der parentalen IL-3-Konstmktion auszuschließen. Nach der Sequenzverifikation wurden diese Klone zur Proteingewinnung verwendet

Einige der hier beschriebenen Mutanten (811,933 und 9329) wurden in pGB/IL-340 eingeführt. Dies erfolgte durch Ligierung des Pstl-Xhol-Fragments von einem pGB/IL-339-Mutantderivat in Pstl-Xhol-aufgespaltenem pGB/IL-340, was die Plasmide pGB/IL-340/811, pGB/IL-340/933 und pGB/IL-340/9329 erbrachte.

Der Aufbau von Bacilius-Expressionsvektoren für IL-3-Muteine erfolgte durch den Austausch des Pstl-Hindlll-Fragments von pGB/ IL-322 (das einen Teil des Alpha-Amylase-Signalpeptids, die vollständige reife IL-3-cDNA-Sequenz und den Amylaseterminator trägt) mit dem Pstl-Hindlll-Fragment eines pGB/IL-340-Mutantderivats (das einen Teil des Alpha-Amylase-Signalpeptids, die mutante IL-3-cDNA-Sequenz und den Alpha-Amylase-Terminatorträgt). Die Bacilius-Expressionsvektoren für die Muteine 811,933 und 9329 wurden pGB/IL-322/811, pGB/IL-322/933 bzw. pGB/IL-322/9329 genannt. Ein weiterer Mutant (1455, dem die Aminosäuren 130-133 fehlen) wurde direkt in pGB/IL-340 durch Ausschluß-Mutagenese unter Verwendung von Oligonucleotid 1455 (Tab. 1) aufgebaut, was Plasmid pGB/IL-340/1455 erbrachte. Darauf wurde die Mutantensequenz in ähnlicher Weise wie für die Mutanten 811,933 und 9329 auf den pGB/IL-322 übertragen, was Plasmid pGB/IL-341 erbrachte.

Tabelle 1 Mutagenese-Oligonucleotide

Code

Sequenz (5'-+3'J

beteiligte Aminosäuren

810	AACTGCTCTAACATGCCTTTGCCTTTGCTG	20-30
811	• * CACTTAAAGCAGCCAGAAAATAACCTTCGA	31-49
812	· ATGGAAAATAACCTTAACAGGGCTGTCAAG	54-61
813	TTCAACAGGGCTGTCCTCCTGCCATGTCTG	66-80
820	• · AATCTCCTGCCATGTGCACCCACGCGACAT	85-90
821	ACGGCCGCACCCACGGACTGGAATGAATTC	94-102
822	• · GGTGACTGGAATGAAAATGCGCAGGCTCAA	107-119
932	• · CGGGGATCCGTCGACAACTGCTCTAACATG	1-14
933	• · ATAACACACTTAAAGAACAACCTCAATGGG	29-37
934	• · GGGGAAGACCAAGACAGGCCAAACCTGGAG	47-54
935	• · AGGCCAAACCTGGAGGCATCAGCAATTGAG	60-70
936	GCATCAGCAATTGAGTGTCTGCCCCTGGCC	76-83
937	TGTCTGCCCCTGGCCCCAATCCATATCAAG	89-95
938	CATATCAAGGACGGTACGTTCTATCTGAAA	103-111
939	CTGAAAACCCTTGAGGCGATCTTTTGAGTC	120-130

Tabelle 1 (Fortsetzung) Code Sequenz(5'->-3')

beteiligte Aminosäuren

823 CCTTGAAGACAAGCTGGGTT

824 CCAAACCTGGAGGCATTCAA

419 TCGACGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTT

420 AACCCAGCTTGTCTTCAAGGGCGTTGTCTGGGTCATGGGAGCG

731 CAGGAAACACATATGACCATGATT 944 TGAGCCTCGCGATCTTTTGACTCGAGTAGAAGAGCAGAGAGGACGG GATCCTCTGCAGCAGCGGCGGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAG-

ACAAGCTGGGTT

AACCCAGCTTGTCTTCAAGGGCGTTGTCTGGGTCATGGGAGCCGCCGCTG-

CTGCAGAG

GATCCTCTGCAGCAGCGGCG CGCCGCTGCTGCAGAG CTCAACAGACGACTTTGAGCTGACTCGAGTAGAAGAGCAGAG

• Zeigt das Nucleotid an, das der Deletion im IL-3-Gen am nächsten ist.

Tabelle 2

Oligonucleotide zur Substitutionsmutagenese

Code Sequenz (5' -*3')

beteiligte Aminosäuren

904	GACAAGCTGGGTTAACGCTAGCAACATGATCGATGAA	16
905	CTTAAAAATCTCCTGCCGGCGCTGCCCCTGGCCACGG	84
1480	TTGCCTTTGCTGCGCTTCAACAACCTC	36
1481	AACCTCAATGGGAAACGCCAAGACATTCTG	43-44
1482	GGGGAAGACCAACGCATTCTGATGGAA	46
1483	GACATTCTGATGAAAAATAACCTTCGA	50
1484	GAAAATAACCTTGAAGATCCAAACCTGGAG	54-55
1485	AGGCCAAACCTGAAAGCATTCAACAGG	59
1486	GAGGCATTCAACCCGGGCGTCAAGAGTTTA	63-64
1487	GCATCAGCAATT[C/G]GTAGCATTCTTAAA	75
1488	GAGAGCATTCTTGAAAATCTCCTGCCA	79
1489	GCCGCACCCACGCCGCATCCAATCCAT	94
1490	CGACATCCAATCGAAATCGATCAGGGTGACTGGAAT	98-101
1491	GGTGACTGGAATAAATTCCGGAGGAAA	106
1492	TGGAATGAATTCGAAGATGAACTGACGTTCTAT	108-110
1493	AGGAAACTGACGGCGACCCTGAAAACCCTT	113-114

2 IC

Beispiel 3

Reinigung von IL-3-Muteinen aus E. coli oder Bacillus

E. coli-JM109-Kulturen (100ml) wurden mit 0,5ml einer frischen Übernacht-Kultur des (mutanten) IL-3-Klons geimpft und bei 37°Ckultiviert, bis ein OD von 0,4-0,6bei 550 nm erreicht war. Durch Zusatz von 1 mM IPTG (Pharmacia) wurde plasmidgenchte« Proteinsynthese induziert. Nach einer zusatzlichen Kultur über 3-16 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieriftig (10 Min., 4000 U/Min, bei 4°C) gesammelt und in gefrorenem Zustand gelagert.

Die Bakterien wurden in 10 ml TE (10 mM Tris-HCL, pH 8; 1 mM EDTA) suspendiert und mit Lysozym versehen (0,025 % = 9

ml). Nach 30 Min. lang bei Raumtemperatur erfolgter Inkubation wurden MgCI₂ und DNaseden Endkonzentrationen von 1OmM bzw. 20μ9/ηηΙ zugesetzt. Nach einer über 15 Min. andauernden Inkubation bei 37"C wurden Tween 20 (0,2%), DTT (2mM) und PMSF (0,1 mM) zugesetzt. Die Suspension wurde auf Eis abgekühlt und nachdrücklich beschallt (zweimal 35 Sek.). Das Homogenat wurde durch Zentrifugation (30 Min. 15000 x g, 1000011/Min. in einem Beckmann-JS13.1 -Rotor) bei 4°C geklärt, der Überstand wurde abgeschieden.

Das Pellet wurde in 4ml 55%iger Saccharose in Puffer-TPD (5OmM Tris-HCI, pH 8; 0,1 mM PMSF und 2mM DTT) durch Beschallung resuspendiert, zur direkten Untersuchung der biologischen Aktivität in Harnstoff entweder pelletiert oder löslich gemacht oder auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet (2-ml-Portionen von 75%iger und 60%iger Saccharose in TPD-Puffer), im wesentlichen wie in WO 88/00598 beschrieben. Nach der Zentrifugierung bei 200000 χ g (35000 U/Min, in einem Sorvall-TH641-Rotor) bei 25°C über zwei Stunden wurden die Einschlußkörper mit den IL-3-Proteinen aus der 75%-Saccharose-lnterphase gewonnen.

Nach einer mindestens 4fachen Dilution wurden die Einschlußkörper bei 25000 x g pelletiert (30 Min. bei 13000U/Min. im Beckman-JS13.1-Rotor) und in 5ml 8M-Harnstoff mit 50 mM Tri-HCI pH 8,9 und 2 mM DTT beschallt und über Nacht bei 4 ⁰C stehengelassen. Die geklärte Lösung wurde daraufhin in eine 3-ml-DEAE-Sepharose-Schnellfließkolonne (Pharmacia) eingebracht und mit 8M-Harnstoff, 5OmM Tris-HCI pH 8,9 und 1 mM DTT-Puffer äquilibriert. Das IL-3-Protein wurde an die Kolonne gebunden und mit 75 mM NaCI im gleichen Puffer stufenweise eluiert. Das eluierte Protein wurde gegen verschiedene Teile 1OmM Tris-HCI pH 8,0 und 1 mM DTT-Puffer dialysiert und durch Zusatz von 10fach konzentriertem RPMI-Zellkulturmittel (Sigma) mit 1%igem Rinderserumalbumin isotonisch gemacht. Die filtersterilisierte Lösung (0,22 pm Millex-GV, Ultrafilter) wurde zur biochemischen und biologischen Charakterisierung verwendet.

Die durch Bacillus gewonnenen Mutantproteine 811,933,1455,9329 X und Z wurden in das Kulturmittel ausgeschleust und erforderten keine so gründlichen Reinigungsverfahren zur Erprobung der biologischen Aktivität. Aus diesem Grunde wurde der geklärte Überstand (11) (angepaßt an 5mM EDTA, 1 mM PMSF und 1 M Ammoniumsulfat) über eine mit 1 M Ammoniumsulfat in 1OmM Tris-HCI pH 7,0 Puffer äquilibrierte, 15-2OmI umfassende Fractogel-TSK-Butyl-650-(C)-Kolonne (Merck) geführt. Das gebundene IL-3-Protein wurde mit einem 10-mM-Tris-HCI-Puffer eluiert und danach über eine mit einem 10-mM-Tris-HCI-pH-8,0-Puffer äquilibrierte, 1,5ml umfassende DEAE-Sepharose-Schnellfließkolonne geführt. Der Durchfluß wurde gesammelt und auf 70%iges Ammoniumsulfat eingestellt, um das IL-3-Protein zu konzentrieren. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 10000U/Min. (JS-13-Rotor) gesammelt, aufgelöst und gegen einen 10-mM-Tris-HCI-pH-8,0-1-mM-DTT-Puffer dialysiert. Proben, die 25-100μΙ der ursprünglichen Bakterienkultur entsprachen, wurden auf 0,75 x 75 χ 100mm (BioRad Miniprotean II) 13,5%igen SDS-Polyacrylamidgelen (Acryl/Bisacryl=29/1) analysiert. Proteine wurden entweder durch Coomassie-Brillantblau-G250-Färbung oder immunologische Methoden sichtbar gemacht. Abb.4 zeigt ein Beispiel von in E. coli ausgeprägten gereinigten Muteinen.

Die Expression in E. coli von mutanten pGB/IL-339-abgeleiteten IL-3-Proteinen lag allgemein höher als das gleiche Mutantenprotein aus dem pGB/IL-336-Expressionsvelctor. Das angewendete Reinigungsverfahren wurde nicht geschaffen, um völlig reine IL-3-Protein-Präparate hervorzubringen. Im allgemeinen wurden auf den SDS-Gelen Schmutzstoffe mit leicht höherer relativer Molekülmasse beobachtet. Durch densitometrisches Scanning der beschmutzten SDS-GeIe wurde die Menge des IL-3-Proteins bestimmt. Obwohl nach der Dialyse gelegentlich ernste Proteineinbußen eintraten, belief sich die gesamte Ausbeute im allgemeinen auf 0,1-1 mg „gereinigten" IL-3-Proteins. Einzige Ausnahmen waren die Mutanten 811 und 933, die in keinem der E. coli-Expressionsvektoren Fusionsproteingewinnung erbrachten. Die Northern-Technik ließ eine starke Reduzierung des IL-3-spezifischen RNA in den Bakterien erkennen, während im DNA-Plasmidgehalt kein signifikanter Unterschied festgestellt wurde. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß die mRNA-Stabilität wahrscheinlich durch die in der eukaryotischen IL-3-cDNA-Sequenz eingeführten Deletionen vermindert ist.

Die einzige angemessene Methode zur Synthese der Muteine 811 und 933 ist die Expression in Bacillus licheniformis. Obwohl die Menge an produziertem Protein verglichen mit der durch Bacillus-Stränge mittels Synthetisierung anderer Muteine wie 9329 und 1455 gewonnenen Proteinmenge sehr gering ist, genügt sie dennoch, um die Muteine 811 und 933 in ausreichenden Mengen zu reinigen und die hierin beschriebenen biologischen Untersuchungen durchzuführen.

Beispiel 4

Immunologische Charakterisierung der IL-3-Muteine

Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antiseren wurde in WO 88/04691 beschrieben.

Zum immunologischen Nachweis von IL-3-Muteinen wurden die gelfraktionierten Proteine (siehe Beispiel 3) auf Cellulosenitrat (0,2 μιη, Schleicher und SchuellBA83) übertragen, wobei das Halbtrocken-Blottingsystem (Novablot, Pharmacia/LKB) mit einem fortlaufenden Puffersystem (39mM Glycin, 48mM Tris, 0,0375 % SDS und 20% Methanol) bei 1,2mA/cm² über einen Zeitraum von 90 Min. verwendet wurde. Der Cellulosenitratfilter wurde danach luftgetrocknet, mit einer 3%igen Rinderserumalbumin(BSA, Sigma)-Lösung vorinkubiert (1OmM Tris-HCI,pH 7,6; 35OmM NaCI; 0,1 % PMSF und 0,1% Natriumazid) und 4-16 Stunden lang mit den polyklonalen (10~³ Dilution) oder monoklonalen (je nach Zielstellung der Experimente) Antikörpern inkubiert, und zwar gerichtet gegen Human-IL-3 (MCA A1, A4, A5, A8, A18 bei einer 10"⁴-Dilution) in einem RIA-Puffer (1OmM Tris/HCI, pH 7,6; 15OmM NaCI; 1 %TritonX-100; 0,1 % SDS; 0,5% Na-desoxycholaat; 0,1 mM PMSF und 0,3% BSA). Immunologische Komplexe wurden nach den vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokollen unter Verwendung biotinylierten Anti-Kaninchen- oder -Maus-Ig, streptavidinbiotinylierter Meerrettichperoxidase (Amersham International, Amersham, GB) und 4-Chlor-1-naphtol (Gibco-BRL) sichtbar gemacht. Als Alternative wurden Antiserum-Inkubationen in Tris-gepuffertem Salz plus 0,05% Tween 20 durchgeführt. Alkaliphosphataseverbundene Anti-Maus-IG-Komplexe wurden nach Standardprotokollen (Promega) sichtbar gemacht.

Die Daten, die zur Wechselwirkung spezifischer monoklonaier Antikörper mit hlL-3-Muteinen in Western-Technik-Experimenten gehören, sind aus Tab.3 ersichtlich.

Tabelle 3

Bewertung der IL-3/MCA-Daten

MUTANT	4810	933	811	934 812	935	4813	INSGESAMT
(AA)	20-30	29-37	31-49	47-54 54-61	60-70	66-80	SONSTIGE
MCA
A1	_{+ +}	__		+ + + +	+ +	+ +	+ +
A4	+ +	++	++	+ + +	+	+	+ +
A5	+ +	+ +	__	+	++	+ +	+ +
A8				++ + +	+ +	+ +	+ +
A18	+ +			++ + +	+ +	^{+ +}	+ +
2	_{+ +}	__	——	++ + +	+ +	+ +	+ +
3	+ +	+ +		+	+ +	+ +	+ +
6	+ +		__	+ + +	+ +	+ +	+ +
10	+ +	++	——	+ + +	++	++	+ +
12				++ + +	++	+ +	+ +
13	+		——	+ + + +	+	+	+ +
14	+ +	+ +		+	+ +	+ +	+ +
15	+ +		_ —	+ + + +	++	+ +	+ +
26	+ +	++		+ + +	++	+ +	+ +
27	+ +	+ +	+ +	4-+ +	+	+	+ +
32	+ +			+ + + +	++	+ +	+ +
33	+ +	—		+ + + +	++	+ +	+ +
		36D-* R		43ED-*KR	46D-* R
		1480		1481	1482
A1		+ +		+ +	+ +
A4				+ +	+ +
A5				+ +	—
A8		+ +			+
A18		+		++	+ +

A: Aszitesmonoklonale

+ + : vollständige Reaktion bei Western-Technik

+: mindestens 5fach reduzierte Reaktion

—: keine Reaktion festgestellt

Aus der Analyse der in Tab.3 aufgeführten Ergebnisse wird deutlich, daß die Mehrheit der gegen das gelgereinigte denaturierte Fusionsprotein erhobenen monoklonalen Antikörper gegen Epitope gerichtet ist, die zwischen den Resten 30 und 50 des reifen IL-3-Polypeptids angesiedelt sind. Diese Epitope widerspiegeln zumeist lineare Polypeptidketten; es wurde lediglich ein Beispiel (13) eines diskontinuierlichen Epitops festgestellt Die größte Gruppe ist in der Lage, den 933-Mutanten zu identifizieren, geht jedoch keine Reaktion mit dem 811 -Mutanten ein. Aus diesem Grund muß das Epitop zwischen den Resten 37 und 50 liegen. Diese Region erweist sich als höchst hydrophil mit postulierter ß-Schleife und α-Helix (DNASIS-Software) und wurde als Antigendeterminante unter Verwendung des Hopp-und-Wood-Algorithmus vorgeschlagen. Die zweite Antikörpergruppe ist durch das Ausbleiben einer Reaktion mit Mutant 933 (dem 9 Aminosäuren fehlen) gekennzeichnet. Diese hydrophobe prolinreiche Knäuelregion wird nicht als größerer antigener Ort prognostiziert.

Eine verfeinerte Lokalisierung dieser Epitope ergibt sich aus der Reaktion der Aszitesmonoklonale mit den folgenden Substitutionsmutanten: Asp³⁶-* Arg, GIy⁴³ASp -* Lys^Arg und Asp⁴⁶ -* Arg.

Eine weitere Charakterisierung der Aszitesmonoklonale durch Doppel-Sandwich-ELISA verwies auf fehlende Interferenz zwischen A1 und A5 oder A8 sowie zwischen A5 und A18. ELJSA in der Konkurrenzreaktion zeigte eine Querkonkurrenz zwischen A1 und A18, zwischen A5 und A8 sowie zwischen A8 und A18. Keine Querkonkurrenz gab es bei A4. Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit den Immunblottingexperimenten. Außerdem wurde festgestellt, daß Aszitesantikörper unabhängig vom Glykosylierungsstatus mit hlL-3-Präparaten von Sauger-, Bakterien- und Hefekulturen reagieren.

Auf der Grundlage der zusammengefaßten Informationen aus diesen immunologischen Versuchen können Epitope wie folgt lokalisiert werden:

- A1 und A18 zielen gegen ein Epitop, das zwischen den Aminosäuren 29 und 37 angesiedelt ist. Weiterhin kann aus dem 36D-* R-Mutanten geschlossen werden, daß der A18-Epitop etwas stärker in Richtung des Carboxylendes als das A1-Epitop liegt.

- A5 zielt gegen ein Epitop, das zwischen den Aminosäuren 45 und 54 liegt.

- A8 zielt gegen ein Epitop, das zwischen den Aminosäuren 36 und 47 liegt.

Beispiel 5

Biologische Charakterisierung der IL-3-Muteine

Die AML-DNA-Synthese wurde auf AML193-Humanzellen getestet. AML193-Humanzellen (ATCC: CRL-9589) wurden in serumfreiem Medium (SFM) („Modified Dulbecco's Medium" nach Iscove (Gibco BRL] mit einem Gehalt von 0,1 % BSA [Behringwerke AG, Marburg] 10pg/ml Insulin [Organon] und Transferrin, 0,1 mM ß-Mercaptoethanoi) und 10 bis 20 Einheiten Human-IL-3 gehalten. »

Dilutionen von (mutanten) IL-3-Präparaten wurden in SMF auf runden Platten mit 96 Vertiefungen (50 μΙ) hergestellt. Sechs Tage lang wurden gewaschene Zellen (1-2 x 10" in 50μΙ SFM) zugesetzt und kultiviert. In 20μΙ SFM wurde ³H-Thymidin (0,1 μθ\, 2 μΟϊ/ΓΠΓηοΙ) zugesetzt und die Zellen 16 Stunden später geerntet. Eine Einheit der IL-3-Aktivität wurde als die Menge bestimmt, die erforderlich ist, um bei dieser Untersuchung 50% der maximalen DNA-Synthese zu erbringen. Beim IL-3-Bezugspräparat schwankte die spezifische Aktivität zwischen 2 x 10⁶und2 x 10⁷ Einheiten pro mg Protein. Allgemein wurde die biologische Aktivität der Muteine mit diesem Bezugspräparat verglichen.

Fig.4 zeigt ein Beispiel der AML-Proliferationsstudie, bei der Mutein 812 mit dem in Bacillus ausgeprägten IL-3-Bezugspräparat verglichen wird. Aus der Grafik ist ersichtlich, daß das Mutein 812 eine Aktivität aufweist, die um etwa 4 Größenordnungen- im Vergleich zum unmodifizierten IL-3-vermindert ist. Dennoch ist das Mutein aber noch immer in der Lage, die AML-Zellen zu maximaler Aktivität zu stimulieren; dazu ist lediglich mehr Protein nötig.

Mit gereinigtem, rekombinanten hlL-3 wurde eine IL-3-Rezeptorbindungsstudie vorgenommen (siehe EP-A-0275598 und EPA 90200624.6).

IL-3 wurde mit dem Bolton-Hunter-Reagens radioaktiv markiert (wie von Budel u. a., Blood, 74 (1989] 565-571, beschrieben). Die spezifische Aktivität wurde auf 80000cpm/ng des IL-3 geschätzt. Als Ziel wurden entweder Spenderleukozyten, AML-Patientenzellen oder MV4-11 (ATC: CRL-9591 )-Zellen verwendet. Die Zellen wurden in Kombinationssalzlösung nach Hanks gewaschen und in Alpha-MEM plus 1 % BSA suspendiert. In der Regel wurden 3-10 χ 10⁶ Zellen mit 200-30OpM radioaktiv markiertem IL-3 und verschiedenen Konzentrationen nichtmarkierten Mutantproteins in einem Gesamtumfang von 200μΙ eine Stunde lang bei 37"C inkubiert. Zellgebundenes, markiertes IL-3 wurde 10 Minuten lang zu 1000 x g bei 4°C durch ein 0,5-ml-Polster Kälberserum in einer Eppendorf-Röhre zentrifugiert (Budel u.a., 1989). Die Röhren wurden in Flüssigstickstoff gefroren, und die Enden wurden zurZählung in einem Packard-Gammazählerabgeschnitten. Es wurde die Konkurrenzbindung gegenüber dem Bezugspräparat bestimmt. Fig.5 zeigt ein Beispiel eines IL-3-Rezeptorbindungsexperiments. Radioaktiv markierte IL-3-Bindung an AML-Patientenstammzellen v/ird mit nichtmarkiertem IL-3-Protein (Bezugspräparat) konkurrenzreagiert. Aufgrund der geringen Anzahl von Rezeptoren (unter 200) auf den Zielzellen schwankten die Konkurrenzdaten zumeist um eine Größenordnung.

In Tab.4 werden die Ergebnisse aus obigen Untersuchungen zu spezifizierten Deletions- und Substitutionsmutanten dargelegt. Ein Teil der Ergebnisse ist auch in Fig.6 grafisch wiedergegeben.

Es zeigte sich, daß IL-3-Fusionsproteine, die sowohl von pGB/IL-336- als auch von pGB/IL-339-Expressionsplasmiden abstammen, in der biologischen Aktivität identisch waren und sich vom aus der Expression der ungekürzten IL-3-cDNA in pGB/IL-322 abgeleiteten B. licheniformis-Bezugspräparat nicht signifikant unterschieden (siehe EPA 89201967.0). Offensichtlich geht vom heterologen Leader-Peptid in den E. coli-Fusionsproteinen keine negative Wirkung auf die biologische Aktivität aus. Die meisten IL-3-Deletionsmutanten waren bei der biologischen Aktivität wesentlich vermindert. Deletionen zwischen den Aminosäuren 50 und 105 führten zu einer mehr als lOOOOfachen Reduzierung der spezifischen Aktivität. In allen Fällen wurde jedoch biologische Restaktivität festgestellt, was auf die Sensitivität des Biotests sowie das Fehlen toxischer Komponenten in den Proteinpräparaten hinweist. Eine vollständige Wiederherstellung der biologischen Aktivität wurde für die Deletionsmutanten 932 (1-14) und 939 (120-130) und den entsprechenden Doppelmutanten 9329 sowie den C-terminalen Mutanten 1455 verzeichnet. Die deletierten N- und C-terminalen Sequenzen sind offensichtlich nicht an der Bindung an den Rezeptor oder an der angemessenen Faltung des Moleküls beteiligt. Im Gegensatz dazu führten Einzelsubstitutionen der Cystein-Reste (Mutanten 904 und 905) zu einer 500Ofachen Verminderung der biologischen Aktivität. Ähnliche Wirkungen wurden bei einem Cystein-Doppelmutanten (9045) festgestellt, was darauf hinweist, daß die S-S-Brücke beim natürlichen IL-3-Molekül eine wichtige stabilisierende Rolle spielt.

Bei den in E. coli ausgeprägten Muteinen, die im vorstehenden Abschnitt beschrieben wurden, handelt es sich durchweg um Fusionsproteine. Um den Nachweis zu führen, daß die zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren als Kompensation für den Verlust von deletierten IL-3-Spezialaminosäuren nicht erforderlich sind, wurde der Aufbau pGB/IL-322/9329 vorgenommen und in B. licheniformis ausgeprägt. Dieser Aufbau resultiert in einem 1-14/120-130 IL-3-Mutein ohne zusätzliche Aminosäuren am Aminoende. Die Aktivität dieses Muteins ist mit dem Wildtyp-Molekül vergleichbar und beweist, daß nur die restlichen 108 Aminosäuren für die IL-3-Aktivität verantwortlich sind.

Bestimmt wurde die Rezeptorbindung der meisten mutanten IL-3-Proteine. Die Bindungsexperimente gestatten keinen ausführlichen Vergleich der Rezeptorbindungsaktivität aufgrund der niedrigen Rezeptorzahlen auf den Zielzellen. Insgesamt besteht aber eine gute Korrelation zwischen biologischer Aktivität und Rezeptorbindung (Tab. 4). Für die meisten mutanten IL-3-Proteine liegt das Verhältnis zwischen relativer Bindung und biologischer Aktivität annähernd bei 1. Die Muteine 1483,1488, 904 und 9045 weisen beträchtlich höhere Relationen auf (Tab. 4 und Fig. 6), was auf eine potentielle antagonistische Aktivität hindeutet. Das bedeutet, daß diese Moleküle als Teilantagonisten von IL-3 betrachtet werden können. Nach weiteren Experimenten können Muteine gefunden werden, die über die gleiche Bindungskapazität wie das natürliche IL-3, jedoch eine 10⁴fache geringere Aktivität verfügen. Diese Moleküle wären echte Antagonisten von IL-3. Das erfindungsgemäß beschriebene Herangehen bietet die Mittel und Methoden, um solche Moleküle zu erhalten.

Tabelle 4 Biologische Aktivitäten von IL-3-Mutanten

MUTANTENCODE

pGB/IL-339

pGB/IL-336

AMINOSAURE-

DELETIONODER -SUBSTITUTION¹

RELATIVESPEZ.

BIOLOGISCHE

AKTIVITÄT²

1-14 20-30 47-54 54-61 60-70 66-80 76-83 85-90 89-95 94-102 103-111 107-119 120-130 1-14/120-130 16C-* A 84C-* A 16/84C->A 36D-* R 43ED-*KR 46D-* R 50E-* K 54RR-*ED 59E-* K 63RA-*PG 75E-*G 75E-* R 79K-* E 94R-* P 98HIKD-^EIKQ 106E-*K 108RRK-*EDE 113FY-* AT

1-14/120-133 1-14/116-133 29-37 31-49

1.0

3.7 ΧΙΟ"¹ 7,9 x 10^-l 7,1 χ 10"'

2.1 χ 10~³ 7,3 x 10"⁵

5.3 x 1O^-5

1.2 x 10"⁵

2.4 x 10"⁵ 6,4 XIO"⁶ 1,1XiO"⁶ 1,0XIO-⁶ 1,8 x 10"⁵

6.6 x 10"⁵ 2,1 X 10"* 2,0 4,0X10"'

2.4 x 10"* 1,9x10"* 3,1 X 10"* 3,1 X 10"³

< 1,5 x 10"*

7.5 X 10"³

2.7 x10"³ 8,OX1O"^S

1.1 X 10"²

9.8 x 10""⁵

1.5 x 10'²

8.6 X 10"³

1.9 X 10~³ 1,7X1O"³$

2.2 X 10~³ 3,2X10"* 3,1 X 10"⁶

<1,2x10"⁶

2.3 X 10"¹ 1,1 X 10"'$ 5,7x10'³$ 4,8x10~³$

RELATIVES

ANTAGONIST.

POTENTIAL³

1,1(0,2-3,3)

2,8(0,6-4,9)

2,4

N.C.

1,2(0,9-1,4)

N.C.

1,9(0,6-3,9)

1,8(0,3-2,8)

2,0(1,8-2,1)

100(33-210)

11 (4,8-38)

88(13-170)

12

N.C.

0,6

37 (4-67)

3,5(2,3-4,7)

14(3,5-27)

65(54-77)

N.C.

2(1,2-3)

N.C.

8,9(3,6-14) 1,6(1-1,9) 1,1(0,2-2,9) 1,6(0,5-3,2)

1 Angegeben wird die Deletion zwischen den Aminosäurezahlen des reifen Human-IL-3. Substitutionen von Aminosäuren werden in einem Einzelbuchstaben-Code angegeben.

2 Die mittlere spezifische biologische Aktivität wird im Verhältnis zu den IL-3-Bezugspräparaten ausgedrückt.

3 Das antagonistische Potential wird als relative Rezeptorbindungsaktivität, geteilt durch die relative biologische Aktivität, angegeben. Die Variationsbreite wird in Klammern angegeben.

+ Einschlußkörper werden aus Saccharoselösungen pelletiert und in Harnstoff löslich gemacht. Muteine wurden in einem Medium verdünnt und auf biologische Aktivität getestet. Rezeptorbindungsexperimente wurden einmal vorgenommen.

# Mutantproteine wurden in Bacillus ausgeprägt und sind durch das Fehlen einer Leader-Polypeptidsequenz gekennzeichnet. $ DieMuteinproteinkonzentrationwarfürdasdensitometrischeScanningzuniedrigundwurdeauf der Grundlage von Gelen und

Western-Technik geschätzt

N.C. Für das spezielle Muteinpräparat wurde keine Konkurrenzreaktion festgestellt.

Alle Publikationen (inkl. Patente und Patentanmeldungen), die in der vorliegenden Spezifikation erwähnt werden, widerspiegeln den Grad der Sachkenntnis der Fachleute, für die diese Erfindung bestimmt ist. Alle Publikationen sind durch Verweis im gleichen Maße einbezogen, als wäre jede einzelne Publikation spezifisch und individuell durch Verweis einbezogen. Obwohl die vorstehende Erfindung in gewisser Ausführlichkeit durch Illustration und Beispiel zum Zwecke besseren Verständnisses dargelegt wurde, dürfte dem Fachmann klar sein, daß zahlreiche Veränderungen und Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne vom Grundgedanken oder Anwendungsgebiet der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

Figur 1

-12 met thr met ile thr asn ser

1 ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC

5 GIn Thr Thr Pro Leu Lys Thr

49 CAG ACA ACG CCC TTG AAG ACA

21 Asp GIu He He Thr His Leu

97 GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA

37 Phe Asn Asn Leu Asn Gly GIu

145 TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA

53 Leu Arg Arg Pro Asn Leu GIu

193 CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG

69 GIn Asn AIa Ser Ala He GIu

241 CAG AAC GCA TCA GCA ATT GAG

85 Leu Pro Leu AIa Thr Ala AIa

289 CTG CCC CTG GCC ACG GCC GCA

101 Asp Gly Asp Trp Asn GIu Phe

337 GAC GGT GAC TGG AAT GAA TTC

117 Thr Leu GIu Asn Ala Gin AIa

3 85 ACC CTT GAG AAT GCG CAG GCT

133 Phe ***

4 33 TTT TGA GTC CAA CGT CCA GCT

481 CCT CGG TCG AGT TTT AAA CTG

529 AGA CTC TGA ACA AAA AAA AAA

577 ATT CCC GGG GAT CTA AAC TT

arg gly ser val asp Ala Pro Met Thr 4 CGG GGA TCC GTC GAC GCT CCC ATG ACC 4 8

Ser Trp VaI Asn Cys Ser Asn Met He 20 AGC TGG GTT AAC TGC TCT AAC ATG ATC 96

Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp 36 AAG CAG CCA CCT TTG CCT TTG CTG GAC 144

Asp Gin Asp He Leu Met GIu Asn Asn 52 GAC CAA GAC ATT CTG ATG GAA AAT AAC 192

AIa Phe Asn Arg Ala VaI Lys Ser Leu 68 GCA TTC AAC AGG GCT GTC AAG AGT TTA 24 0

Ser He Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys 84 AGC ATT CTT AAA AAT CTC CTG CCA TGT 288

Pro Thr Arg His Pro He His He Lys 100 CCC ACG CGA CAT CCA ATC CAT ATC AAG 33 6

Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys 116 CGG AGG AAA CTG ACG TTC TAT CTG AAA 3 84

Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala He 132 CAA CAG ACG ACT TTG AGC CTC GCG ATC 4 32

CGT TCT CTG GGC CTT CTC ACC ACA GAG 480 GTT CCT AGG GAT GTG TGA GAA TAA ACT 528 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAC CGA 576

Figur 2

5 '

-15 met thr met ile thr asn ser arg gly ser ser ala ala ala ala Ala I 1 ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CGG GGA TCC TCT GCA GCA GCG GCG GCT 48

3«

130 Leu Ala He Phe ***

4 33 CTC GCG ATC TTT'TGA CTC GAG TAG AAG AGA AGA GAA TC

Tabelle 1 (Fortsetzung) Mutagenese Oligonucleotide

Code Sequenz beteiligte

Aminosäuren

93 6 GCATCAGCAATTGAGTGTCTGCCCCTGGCC 76-83

• *

937 TGTCTGCCCCTGGCCCCAATCCATATCAAG 89-95

• ·

938 CATATCAAGGACGGTACGTTCTATCTGAAA 103-111

939 CTGAAAACCCTTGAGGCGATCTTTTGAGTC 120-13

823 CCTTGAAGACAAGCTGGGTT

824 CCAAACCTGGAGGCATTCAA

419 TCGACGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTT

420 AACCCAGCTTGTCTTCAAGGGCGTTGTCTGGGTCATGGGAGCG 731 CAGGAAACACATATGACCATGATT

944 TGAGCCTCGCGATCTTTTGACTCGAGTAGAAGAGCAGAGAGGACGG

1055 GATCCTCTGCAGCAGCGGCGGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAG-ACAAGCTGGGTT

1056 AACCCAGCTTGTCTTCAAGGGCGTTGTCTGGGTCATGGGAGCCGCCGCTG-CTGCAGAG

1424 GATCCTCTGCAGCAGCGGCG

1425 CGCCGCTGCTGCAGAG

14 55 CTCAACAGACGACTTTGAGCTGACTCGAGTAGAAGAGCAGAG

• Zeigt Nucleotid an, das der Deletion im IL-3-Gen am nächsten liegt.

Tabelle 2 Oligonucleotide zur Sustitutionsmutagenese

Code

Sequenz

beteiligte Aminosäuren

904 GACAAGCTGGGTTAACGCTAGCAACATGATCGATGAA 16

905 CTTAAAAATCTCCTGCCGGCGCTGCCCCTGGCCACGG 84 14 80 TTGCCTTTGCTGCGCTTCAACAACCTC 36

1481 AACCTCAATGGGAAACGCCAAGACATTCTG 43-44

1482 GGGGAAGACCAACGCATTCTGATGGAA 46

1483 GACATTCTGATGAAAAATAACCTTCGA 50

1484 GAAAATAACCTTGAAGATCCAAACCTGGAG 54-55

1485 AGGCCAAACCTGAAAGCATTCAACAGG 59 14 8 6 GAGGCATTCAACCCGGGCGTCAAGAGTTTA 63-64

1487 GCATCAGCAATT[C/G]GTAGCATTCTTAAA 75

1488 GAGAGCATTCTTGAAAATCTCCTGCCA · 79

1489 GCCGCACCCACGCCGCATCCAATCCAT 94

1490 CGACATCCAATCGAAATCGATCAGGGTGACTGGAAT 98-101

1491 GGTGACTGGAATAAATTCCGGAGGAAA 106

1492 TGGAATGAATTCGAAGATGAACTGACGTTCTAT 108-110

1493 AGGAAACTGACGGCGACCCTGAAAACCCTT 113-114

Tabelle 3 Bewertung der iL-3/MCA-Daten

MUTANT	4810	933	811	934 812	935	4813	INSGESAMT
<AA>	20-30	29-37	31-49	47-54 54-61	60-70	66-80	SONSTIGE
MCA
A1	+ +			+ + + +	+ +	+ +	+ +
A4	+ +	+ +	++	++ +	+	+	+ +
A5	+ +	+ +		+	+ +	+ +	+ +
A8	+ +	+ +		+ + + +	+ +	+ +	+ +
A18	+ +			++ ++	+ +	+ +	+ +
2	+ +			++ ++	+ +	+ +	+ +
3	+ +	+ +		+	+ +	+ +	+ +
6	+ +	+ +		+ ++	+ +	+ +	+ +
10	+ +	+ +		+ ++	+ +	+ +	+ +
12	+ +			++ ++	+ +	+ +	+ +
13	+			+ + + +	+	+	+ +
14	+ +	+ +		+	+ +	+ +	+ +
15	+ +			+ + ++	+ +	+ +	+ +
26	+ +	+ +		+ + +	+ +		+ +
27	+ +	+ +	+ +	+ + +	+	+	+ +
32	+ +			+ + + +	+ +	+ +	+ +
33	+ +			+ + + +	+ +	+ +	+ +
		36D->R		43ED-»-KR	46D->R
		1480		1481	1482
A1		+ +		+ +	+ +
A4		+ +		+ +	+ +
A5		+ +		+ +	——
A8		+ +			+
A18		+		+ +	+ +

A: Aszitesmonoklonale

+ + : vollständige Reaktion bei Western-Technik

+: mindestens 5fach reduzierte Reaktion

—: keine Reaktion festgestellt

Tabelle 4

Biologische Aktivitäten von IL-3-Mutanten

MUTAN	AMINOSAURE-	RELATIVESPEZ.	RELATIVES
TENCODE	DELETION ODER	BIOLOGISCHE	ANTAGONIST.
	-SUBSTITUTION'	AKTIVITÄT²	POTENTIAL³
Ref.		1.0
pGB/IL-339		3,7 χ ΙΟ"¹
pGB/IL-336		7,9 χ ΙΟ"¹	1,1(0,2-3,3)
932	1-14	7,1X10"'	2,8(0,6-4,9)
810	20-30	2,1 X10"³	2,4
934	47-54	7,3X1O"^S	N.C.
812	54-61	5,3X1O"^S	1,2(0,9-1,4)
935	60-70	1,2X1O"^B	N.C.
813	66-80	2,4 x 10"⁶	N.C.
936	76-83	6,4 X 10"⁶	N.C.
820	85-90	1,1XIO"⁶	N.C.
937	89-95	1,0x10"⁶	N.C.
821	94-102	1,8 X 10"⁶	N.C.
938	103-111	6,6 x 10"⁶	N.C.
822	107-119	2,1 X 10"*	1,9(0,6-3,9)
939	120-130	2,0	1,8(0,3-2,8)
9329	1-14/120-130	4,0x10"'	2,0(1,8-2,1)
904	16C->A	2,4 x 10"⁴	100(33-210)
90S	84C->A	1,9 x 10""	11 (4,8-38)
9045	16/84C-+A	3,1 X10"⁴	88(13-170)
1480»	36D->R	3,1 x 10"³	12
1481	43ED->-KR	<1,5x10"⁴	N.C.
1482»	46D->R	7,5 X 10"³	0,6
1483	50E-* K	2,7 x 10"³	37 (4-67)
1484	54RR->ED	8,0 X 10"⁶	3,5(2,3-4,7)
1485»	59E-+K	1,1XIO"²	3
1486	63RA-»PG	9,8 X 10"⁶	14(3,5-27)
1487 A*	75E->-G	1,5 X 10"²	3
1487B»	75E-+R	8,6 X 10"³	3
1488	79K-VE	1,9 x 10"³	65(54-77)
1489	94R-»P	1,7X1O~³$	N.C.
1490»	98HIKD-S-EIKO.	2,2 X 10"³	5
1491*	106E-»K	3,2 X 10"⁴	6
1492	108RRK->EDE	3,1 X 10"⁶	2(1,2-3)
1493	113FY-»AT	<1,2x10"⁶	N.C.
X#	2-14/120-133	2,3x10"'	8,9(3,6-14)
z#	1-14/116-133	1,1 χ10"'έ	1,6(1-1,9)
933#	29-37	5,7x10"³$	1,1(0,2-2,9)
811#	31-49	4,8x10'³$	1,6(0,5-3,2)

Claims

1. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3, dadurch gekennzeichnet, daß
er eine Deletion von mindestens 2 Aminosäuren, verglichen mit dem reifen Human-lnterleukin-3-Molekül, umfaßt und verbesserte Eigenschaften aufweist.

2. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3 nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß er eine Deletion von mindestens 4 Aminosäuren umfaßt.

3. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3 nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß er eine N-terminale Deletion von 4 Aminosäuren umfaßt.

4. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3 nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß er eine N-terminale Deletion von bis zu 14 Aminosäuren und/oder
eine C-terminale Deletion von bis zu 18 Aminosäuren umfaßt.

5. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3 nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß er eine innere Deletion umfaßt.

6. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-IL-3, dadurch gekennzeichnet, daß er
mindestens eine derfolgenden Substitutionen aufweist:

7. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von hlL-3, dadurch gekennzeichnet, daß er antagonistische Aktivität aufweist.

8. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von hlL-3 nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er aus der Gruppe, die aus den Mutanten Cys¹⁶ -» AIa¹⁶, Cys¹⁶Cys⁸⁴ -» AIa¹⁶AIa⁸⁴, GIu⁵⁰ -♦ Lys⁵⁰ und Lys⁷⁹ -> GIu⁷⁹ besteht, ausgewählt wird.

9. Ein biologisch aktiver Polypeptid-Analog von Human-IL-3, dadurch gekennzeichnet, daß er sowohl eine Deletion als auch eine Substitution aufweist.

10. Ein pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil einen biologisch aktiven Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3 gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein Derivat davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger umfaßt.

11. Ein pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren eine pharmazeutisch effektive Menge einer Substanz enthält, die aus der Gruppe von GM-CSF, CSF-1, G-CSF, M-CSF, Erythropoetin, IL-I a, IL-I β, IL-2, IL-4 bis IL-8 und dem Tumomekrosefaktor besteht.

12. Ein DNA-Fragment, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz enthält, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert.

13. Ein Klonierungshilfsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz enthält, die eines der Polypeptide nach Anspruch 1 bis 9 in Verbindung mit Transkriptions- und Translationsregulierungssequenzen codiert, die die Expression besagter Polypeptide innerhalb geeigneter Wirtszellen ermöglichen.

14. Eine Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach Anspruch 13 mit einem Klonierungshilfsmittel transformiert wird.

15. Ein Prozeß zur Gewinnung einer DNA-Sequenz, die einen biologisch aktiven Polypeptid-Analog von Human-lnterleukin-3 nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

- die Isolierung einer DNA-Sequenz zur Codierung des reifen hlL-3-Proteins,

- die Ausführung der In-vitro-Mutagenese, um gewünschte Nukleotide zu deletieren oder zu substituieren.

16. Ein Prozeß zur Gewinnung eines biologisch aktiven Polypeptid-Analogs von Human-lnterleukin-3 nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

- die Einführung der DNA-Sequenz, die besagtes Polypeptid in einem Expressionsvektor codiert, so daß es sich unter Kontrolle geeigneter Expressionsreguiierungssequenzen befindet,

- die Einführung besagten Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle,

- die Kultivierung der Wirtszellen,

- die Gewinnung des von besagten Wirtszellen produzierten Proteins.

17. Ein monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein zwischen den Aminosäuren 29 und 54 des reifen Human-IL-3 angesiedeltes Epitop gerichtet ist.

18. Eine Methode zur Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein zwischen den Aminosäuren 29 und 54 des reifen Human-IL-3 angesiedeltes Epitop gerichtet ist.