DE19708774A1

DE19708774A1 - Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme die Fructosylpolymeraseaktivität besitzen

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Publication number: DE19708774A1
Application number: DE19708774A
Authority: DE
Inventors: Arnd G Heyer; Elke Hellwege; Dominique Gritscher
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 1998-09-17
Also published as: BRPI9808154B1; US7153674B2; ZA981762B; US20030138927A1; PL197151B1; AU6825498A; HUP0003600A2; BR9808154A; US6515203B1; DE69836267D1; CZ314099A3; EP0977876B1; PL335657A1; DE69836267T2; CN1249783A; CZ299374B6; WO1998039460A1; CA2283375C; HU225800B1; CA2283375A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die saccharose abhängige Saccharose-Fructosyltransferasen (SST) Enzyme codieren. Weiterhin betrifft diese Erfindung Vektoren und Wirte, die derartige Nucleinsäuremoleküle enthalten, sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen. Ferner werden Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen be schrieben, die aufgrund der Einführung von DNA-Molekülen, die eine SST aus Artischocke codieren, kurzkettige Fructosylpolymere synthetisieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung von SST zur Produktion von kurzkettigen Fructosylpolymeren in verschiedenen Wirtsorganismen sowie die SST, mit deren Hilfe kurzkettige Fructosylpolymere unter Nutzung verschiedener, beispielsweise auch fermentativer oder anderer biotechnologischer, Verfahren erzeugt werden können.

Wasserlösliche, lineare Polymere besitzen vielfältigen Anwendungen, beispielsweise zur Viskositätserhöhung von wäßrigen Systemen, als Detergenzien, als suspendierendes Agens oder zur Sedimentationsbeschleunigung und Komplexierung, aber auch zur Wasserbindung. Polymere auf der Basis von Sacchariden, beispielsweise Fructosylpolysaccharide, sind besonders interessante Rohstoffe, da sie biologisch abbaubar sind. Neben einem Einsatz als nachwachsende Rohstoffe für industrielle Fertigung und Verarbeitung sind Fructosylpolymere aber auch als Lebensmittelzusatzstoffe, beispielsweise als Süßstoffe interessant. Hierfür kommen insbesondere Polymere mit geringen Polymerisationsgraden in Frage.

Bisher sind lediglich Verfahren zur Produktion von langkettigen Fructanpolysacchariden in Pflanzen durch Expression von Enzymen bakteriellen Ursprungs sowie ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die Fructosyltransferasen aus Helianthus tuberosus exprimieren, beschrieben worden. Verfahren zur Herstellung von Enzymen für die Produktion von kurzkettigen Fructosylpolymeren sind nicht bekannt. In der PCT/USA89/02729 wird die Möglichkeit der Erzeugung von Kohlenhydratpolymeren, insbesondere Dextran oder Polyfructose, in transgenen Pflanzen, und zwar speziell den Früchten transgener Pflanzen, beschrieben. Zur Erzeugung solcherart veränderter Pflanzen wird die Verwendung von Levansucrasen aus Mikroorganismen, insbesondere aus Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius und Bacillus subtilis, oder von Dextransucrasen aus Leuconostoc mesenteroides vorgeschlagen. Weder die Bildung der aktiven Enzyme, noch die von Levan oder Dextran sowie die Herstellung transgener Pflanzen wird beschrieben. Die PCT/EP93/02110 offenbart ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die das Isc Gen der Levansucrase aus dem gram-negativen Bakterium Erwinia amylovora exprimieren. In der PCT/NL93/00279 wird die Transformation von Pflanzen mit chimären Genen beschrieben, die das sacB Gen aus Bacillus subtilis oder das ftf Gen aus Streptococcus mutans enthalten. Im Falle des sacB Gens wird zur Erhöhung des Expressionsniveaus in transgenen Pflanzen eine Modifikation im 5'-untranslatierten Bereich des Gens empfohlen. Die PCT/NL96/00012 offenbart DNA Sequenzen, die Kohlenhydratpolymer synthetisierende Enzyme codieren, und die Herstellung von transgenen Pflanzen mit Hilfe dieser DNA-Sequenzen. Die offenbarten Sequenzen stammen aus Helianthus tuberosus. Entsprechend PCT/NL96/00012 sollen die offenbarten Sequenzen geeignet sein, das Fruktanprofil von z. B. Petunie und Kartoffel, aber auch von Helianthus tuberosus selbst zu verändern. So werden in der PCT/NL96/00012 unter anderem transgene Kartoffelpflanzen beschrieben, die eine SST aus Helianthus tuberosus exprimieren. Obwohl die enzymatische Aktivität der in den transgenen Pflanzen exprimierten SST nachgewiesen werden konnte, wurde jedoch nur eine geringe Umsetzung des Substrats Saccharose zu kurzkettigen Fructosylpolymeren erreicht. Dies mag auf verschiedene Faktoren zurückzuführen sein, wie z. B. eine geringe Affinität des Enzyms zu dessen Substrat oder möglicher Hemmung des Enzyms durch das gebildete Produkt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Nucleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, die eine Saccharose abhängige Saccharose- Fructosyltransferase (SST codieren, mit deren Hilfe es möglich ist, gentechnisch veränderte Organismen herzustellen, die kurzkettige Fructosylpolymere bilden können.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsform gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die Proteine mit der biologischen Aktivität einer SST codieren, und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus

(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID No. 3 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz;
(d) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter (a) oder (b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und eine SST codieren, deren Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch zu der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz ist; und
(e) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nucleinsäuremoleküle abweicht.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Enzym mit Fructosylpolymeraseaktivität ein Protein verstanden, das in der Lage ist, die Knüpfung von β-2,1-glycosidischen oder β-2,6-glycosidischen Bindungen zwischen Fructoseeinheiten zu katalysieren. Dabei kann ein zu übertragender Fructosylrest aus Saccharose oder aus einem Fructanpolymer stammen. Unter einem kurzkettigen Fructosylpolymer wird ein Molekül verstanden, das zumindest zwei, aber nicht mehr als 100 Fructosylreste enthält, die entweder β-2,1- oder β-2,6 glycosidisch verknüpft sind. Das Fructosylpolymer kann endständig einen Glucoserest tragen, der über die C-1 OH-Gruppe der Glucose und die C-1 OH- Gruppe eines Fructosylrests verknüpft ist. In diesem Fall ist also ein Molekül Saccharose im Fructosylpolymer enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen abgeleitet von der Artischocke.

Überraschenderweise ergeben sich bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle große Mengen an Fructosylpolymeren gebildet. Entgegen in der PCT/NL96/0012 beschriebenen Kartoffeln werden bei der Verwendung erfindungsgemäßer Nucleinsäuremoleküle hohe Ausbeuten an Oligofructan erreicht, die den zellulären Gehalt des Substrats Saccharose noch übersteigen.

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch RNA-Moleküle handeln. Entsprechende DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische oder cDNA-Moleküle. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugsweise Artischocke, oder können nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5'-Ende der Nucleotidsequenz ist es beispielsweise möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die für die Translokation des Enzyms in die Plastiden verantwortlich sind (Transitpeptide). Dies erlaubt es, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Sequenzen nicht mehr in den Plastiden, sondern im Cytosol lokalisiert sind, oder aufgrund der Addition von anderen Signalsequenzen in anderen Kompartimenten lokalisiert sind. Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten K_m-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufweisen. Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die aus Artischocke hergestellt wurden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridi sierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu codieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Dabei weisen die durch diese Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz von mindestens 80%, vorzugsweise 85% und besonders bevorzugt über 90%, 95%, 97% und 99% auf. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.

Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten. Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität oder Konformation oder physikalische Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Optimum.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die spezifisch mit Transkripten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen oder Transkripten davon hybridisieren. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Oligonucleotide mit einer Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können beispielsweise als Primer für eine PCR- Reaktion verwendet werden. Ebenso können sie Bestandteile von antisense- Konstrukten sein oder von DNA-Molekülen, die geeignete Ribozyme codieren.

Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle enthalten. Vorzugsweise handelt es sich dabei Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik übliche Vektoren.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen operativ verbunden, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren gestatten die Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren in verschiedenen. Die codierten Enzyme können auch außerhalb der Wirtsorganismen zur Produktion von kurzkettigen Fructosylpolymeren eingesetzt werden. Damit können fermentative u. a. biotechnologische Verfahren zur Produktion von kurzkettigen Fructosylpolymeren genutzt werden. Beispielsweise ist es denkbar, Fructosylpolymere mit immobilisierten Enzymen herzustellen.

Erfindungsgemäß werden die regulatorischen Elemente des Patatin B33 Promotors bevorzugt. Andere bevorzugte Promotoren sind der 35S CaMV-Promotor und der Promotor des Alkoholdehydrogenasegens aus Saccharomyces cerevisiae.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des Vektors im Wirtsorganismus bewirken, wie einen bakteriellen Replikationsursprung oder die 2-Mikron-DNA zur Stabilisation in Saccharomyces cerevisiae. Ferner können "left border"- und "right border"-sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten sein wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird.

Ferner können die erfindungsgemäßen Vektoren funktionelle Terminatoren enthalten, wie den Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobakterien.

In einer anderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül in den erfindungsgemäßen Vektoren verknüpft mit einem Nucleinsäuremolekül das, eine funktionale Signalsequenz zur Weiterleitung des Enzyms an unterschiedliche Zellkompartimente codiert. Diese Modifikation kann beispielsweise in einer Addition einer N-terminalen Signalsequenz zur Sekretion in den Zellwandraum höherer Pflanzen bestehen, aber auch jede andere Modifikation, die zur Fusion einer Signalsequenz an die kodierte Fructosyltransferase führt, ist Gegenstand der Erfindung.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Plasmid pB33-cySST, dessen Konstruktion in den Ausführungsbeispielen beschrieben ist (Fig. 1).

Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, ist insofern interessant, als daß auf diese Weise eine genauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der Enzyme, die diese Moleküle codieren, ermöglicht wird.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren transienmt oder stabil enthalten. Unter einer Wirtszelle wird ein Organismus verstanden, der in der Lage ist, in vitro rekombinierte DNA aufzunehmen und gegebenenfalls die von der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierten Proteine zu synthetisieren. Vorzugsweise sind dies prokaryontische oder eukaryontische Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon enthalten. Diese sind vorzugsweise aufgrund der Aufnahme der erfindungsgemäßen Vektorsysteme, Derivate oder Teile der Vektorsysteme zu einer Synthese von Enzymen für die Produktion kurzkettiger Fructosylpolymere befähigt. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Zellen dadurch gekennzeichnet, daß das eingeführte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül entweder heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist, d. h. natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt, oder an einem anderen Ort im Genom lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, sowie Verfahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben, und anschließend das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird. Ferner betrifft die Erfindung die mit den erfindungsgemäßen Pflanzen herstellbaren SSTs.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist es nun möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden kurzkettige Fructosylpolymere in beliebigen Organismen herzustellen wie es bisher durch konventionelle, z. B. züchterische Maßnahmen bei Pflanzen nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese. Durch eine Erhöhung der Aktivität der er findungsgemäßen Proteine, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unterschiedliche Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivität besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der entsprechenden SST zu erhöhen, oder die Einführung in Zellen, die dieses Enzym normalerweise nicht exprimieren. Ferner ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um erfindungsgemäß SSTs zu erhalten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen, bzw. veränderte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Produktspezifitäten aufweisen. Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die die Lo kalisation in Plastiden gewährleistende Sequenz deletiert werden und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1(1991), 95-106). Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül(en) transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäße(s) Nucleinsäuremolekül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährlei sten, insbesondere mit einem Promotor. Derartige Zellen lassen sich von na türlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt, oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicher weise nicht vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung. Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisie rende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr oder Kartoffel. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der er findungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Expression mindestens eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls kurzkettige Fructosylpolymere. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen sowie dem Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte erhältliche kurzkettige Fructosylpolymer.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Gegenstand der Erfindung sind somit auch Pflanzen, die die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei diesen Pflanzen handelt es sich vorzugsweise um N utzpflanzen, insbesondere stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen. Besonders bevorzugt ist hierbei Kartoffel. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, insbesondere Knollen.

Zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei ausgewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, besonders bevorzugt der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23- 29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST- LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) oder für eine endosperm-spezifi sche Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. . Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden einge setzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid- DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden. Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Pro toplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte eine selektierbarer Marker vorhanden sein.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir- Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und beschrieben in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel- Cambridge). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mi kroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimenden Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273). Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33- 38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037- 1048). Drei der oben genannten Transformationssysteme konnten in der Vergangenheit für verschiedene Getreide etabliert werden: die Elektroporation von Gewebe, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikel-Beschuß in regenerierbare Gewebe und Zellen (zur Übersicht: Jähne et al., Euphytica 85 (1995), 35-44). Die Transformation von Weizen wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (zur Übersicht: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die mindestens eine, bevorzugt jedoch eine Vielzahl von Zellen enthalten, die die erfindungsgemäßen Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon enthalten, und die aufgrund der Aufnahme der erfindungsgemäßen Vektorsysteme, Derivate oder Teile der Vektorsysteme zu einer Synthese von Enzymen für die Produktion kurzkettiger Fructosylpolymere befähigt sind. Die Erfindung ermöglicht also die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die aufgrund der eingeführten Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon zu einer Synthese von Enzymen für die Produktion kurzkettiger Fructosylpolymere befähigt sind. Da die bekannten Pflanzen nicht in der Lage sind, lediglich kurzkettige Fructosylpolymere zu produzieren, ist eine erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens leicht zu überprüfen, beispielsweise durch chromatographische Analyse der fructosehaltigen Zucker. Gegenüber den wenigen Pflanzen, die Fructosylpolymere enthalten, ergibt sich der Vorteil, daß eine definierte Molekülgröße, nämlich die der kurzkettigen Fructosylpolymere, vorliegt. Zudem ist eine Lokalisation in unterschiedlichen Zellkompartimenten und unterschiedlichen Organen, sowie eine Steigerung der Expressionsrate und damit der Produktausbeute möglich.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren umfassend:

(a) Inkontaktbringen von Saccharose oder eines äquivalenten Substrats mit einer erfindungsgemäßen SST unter Bedingungen, die die Umsetzung zu kurzkettigen Fructosylpolymeren erlaubt; und
(b) Gewinnung der so hergestellten Fructosylpolymere.

Die Natur der gebildeten Fructosylpolymere hängt von der enzymatischen Spezifität der Fructosyltransferase ab. Bei Verwendung einer erfindungsgemäßen SST wird vorzugsweise Kestose, aber auch Nystose und Fructosylnystose gebildet.

Ferner betrifft die Erfindung die Fructosylpolymere die aus einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle, Pflanze oder dem Vermehrungsmaterial oder Ernteprodukt erfindungsgemäßer Pflanzen und Pflanzenzellen gebildet oder nach dem vorbeschrieben erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden. Diese Fructosylpolymere können vorzugsweise in der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Back- oder Teigwaren verwendet werden. Vorzugsweise können diese Fructosylpolymere zur Viskositätserhöhung von wäßrigen Systemen, als Detergenzien, als suspendierendes Agens oder zur Sedimentationsbeschleunigung und Komplexierung, aber auch zur Wasserbindung. Polymere auf der Basis von Sacchariden, beispielsweise Fructosylpolysaccharide benutzt werden.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 stellt die Konstruktion des Plasmids pB33-cySST dar.

Fig. 2 stellt die Analyse der löslichen Zucker in Knollen von transgenen Pflanzen dar, die unter Einsatz des Vektorsystems pB33-cySST gewonnen wurden. Die aufgrund der genetischen Veränderung gebildeten kurzkettigen Fructosylpolymere (insbesondere 1-Kestose) sind markiert.

Beispiel 1 Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung einer cDNA die ein saccharose abhängige Saccharose-Fructosyltransferase aus Artischocke (Cynare scolymus) codiert

Gesamt-RNA wurden aus Blütenstücken der Artischocke isoliert (Sambrook et al, siehe oben). Poly(A)⁻ mRNA wurde unter Verwendung des mRNA lsolierungssystems PolyATtract (Promega Corporation, Madison, WI, USA) isoliert. Komplementäre DNA (cDNA) wurde von 5 ug dieser RNA mit Hilfe des ZAP-cDNA Synthese Kit von Stratagene nach Herstellerangaben hergestellt und es wurden 2×10⁶ unabhängige rekombinate Phagen erhalten. Die amplifizierte cDNA-Bibliothek wurde mit einem 32P-markierten DNA-Fragments, das dem 3'-Ende der 6-SFT cDNA (Sprenger et al., 1995) von 392 bp Länge entspricht nach üblichen Standardverfahren durchgemustert. Dieses Fragment wurde durch RT-PCR (RT- PCR Kit, Stratagene, Heidelberg, Germany) von Gesamt-RNA als Matrize aus Licht induzierten (72 Stunden) Primärblättern der Gerste erhalten. Positive Clone wurden näher untersucht.

Beispiel 2 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pCy21

Aus dem Clon pCy21 wurde die Plasmid-DNA isoliert und die Sequenz der cDNA- Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt.

Die Insertion des Clons pCy21 ist eine DNA mit 2055 bp. Die Nucleotidsequenz ist in Seq ID No. 1 angegeben. Die korrespondierende Aminosäuresequenz ist unter Seq ID No. 2 dargestellt. Eine Sequenzanalyse und ein Vergleich mit bereits publizierten Sequenzen zeigte, daß die in Seq ID No. 1 dargestellte Sequenz neu ist und eine codierende Region umfaßt, die Homologien zu SSTs aus anderen Organismen aufweist.

Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pB33-cySST und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffel

Das Plasmid pB33-cySST enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12 : 8711, modifiziert nach Becker, 1990, Nucl Acids Res 18 : 203) (vgl. Fig. 1). Das Fragment A beinhaltet den B33-Promotor des Patatin Gens b der Kartoffel. Es enthält ein Dral Fragment (Position .-1512 bis Position +14) des Patatin Gens b33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J 8 : 23-29 das zwischen der EcoRI und der Sacl Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg inseriert ist. Das Fragment B enthält die codierende Region der in SEQ ID No.1 angegebenen Sequenz. Das Fragment B wurde als Notl-Fragment mit glatten Enden aus dem Vektor pBluescript SK erhalten, in dem es über eine EcoRI/Not I linker Sequenz in die EcoRI Schnittstelle inseriert ist. Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTi ACH 5 (Gielen et al (1984); EMBO J. 3, 835-846) Nukleotide 11749-11939, welches als Pvu II- Hind III Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al (1983) Nature 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II Schnittstelle zwischen die Sphl und die Hind III Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg kloniert worden ist. Das Plasmid pB33-cySST hat eine Größe von ca. 14 kb. Das Plasmid wurde in Agrobakterien eingeführt (Höfgen und Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988) 9877).

Das Plasmid pB33-cySST wurde über den Agrobacterium vermittelten Gentransfer nach oben beschrieben Standardverfahren in Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte Pflanzen regeneriert. Aus regenerierten Pflanzen wurden Enzymextrakte gewonnen und auf das Vorhandensein auf Fructosepolymere untersucht. Die Analyse wurde wie in Röber (Planta 199, 528-536) beschrieben durch geführt. Die Analyse der Knollen einer Reihe von mit diesem Vektor transformierten Pflanzen zeigte eindeutig das Vorkommen von kurzkettigen Fructosylpolymeren, insbesondere 1-Kestose, was auf die Expression des erfindungsgemäßen SST-Gens zurückzuführen ist (vgl. Abb. 2).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, codierend eine saccharose abhängige Saccharose Fructosyltransferase (SST) aus Artischocke, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID No. 3 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz;
(d) Nucleinsäuremolekülen, die mit einer der unter (a) bis (c) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und eine SST codieren, deren Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch zu der in SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 angegebenen Aminosäuresequenz ist; und
(e) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b), (c) oder (c) genannten Nucleinsäuremoleküle abweicht.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein DNA-Molekül ist.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, das ein cDNA-Molekül ist.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein RNA-Molekül ist.

5. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Vektor nach Anspruch 5, wobei das Nucleinsäuremolekül mit regulatorischen Elementen operativ verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

7. Vektor nach Anspruch 6, wobei die regulatorischen Elemente aus dem Papatin B33 Promotor stammen.

8. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 6 oder 7 transformiert ist oder von einer solchen Zelle abstammt.

9. Verfahren zur Herstellung einer SST bei dem eine Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese der SST erlauben und die SST aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.

10. SST, codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 9.

11. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 6 oder 7 transformiert wurde oder die von einer solchen Zelle abstammt, wobei das Nucleinsäuremolekül, das eine SST aus Artischocke codiert, unter der Kontrolle regulatorischer Elemente steht, die die Transkription einer translatierbaren mRNA in pflanzlichen Zellen erlauben.

12. Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.

13. Pflanze nach Anspruch 12, die eine Nutzpflanze ist.

14. Pflanze nach Anspruch 13, die eine stärkespeichernde Pflanze ist.

15. Pflanze nach Anspruch 14, die eine Kartoffelpflanze ist.

16. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 15, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.

17. Ernteprodukte einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 15, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.

18. Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren umfassend:

(a) Kultivierung einer Wirtszelle nach Anspruch 8 oder Pflanzenzelle nach Anspruch 11 unter Bedingungen, die die Produktion von SST und Umsetzung von gegebenenfalls von außen zugeführter Saccharose oder eines äquivalenten Substrats zu kurzkettigen Fructosylpolymeren erlaubt; und
(b) Gewinnung der so hergestellten Fructosylpolymere aus den kultivierten Zellen oder aus dem Medium.

19. Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren umfassend:

(a) Inkontaktbringen von Saccharose oder eines äquivalenten Substrats mit einer SST nach Anspruch 10 unter Bedingungen, die die Umsetzung zu kurzkettigen Fructosylpolymeren erlaubt; und
(b) Gewinnung der so hergestellten Fructosylpolymere.

20. Kurzkettige Fructosylpolymere erhältlich aus einer Pflanzenzelle nach Anspruch 11, einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 15, aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 16 oder aus dem Ernteprodukt nach Anspruch 17 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 18 oder 19.

21. Verwendung der Fructosylpolymere nach Anspruch 20 zur Herstellung von Nahrungsmitteln.

22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Nahrungsmittel Back- oder Teigwaren sind.

23. Oligonucleotid, das spezifisch mit einem der Nucleinsäuremoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.