DE2042829A1 - Reagens zur Bestimmung der gamma-Glutamyltranspeptidase - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. "Weickmann,

Dipl.-Ing. H. Weιckmaνn, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

> 8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820 HCK ' . MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 4S 39 21/22

Boehringer Mannheim GmbH, 68 Mannheim

Reagens zur Bestimmung der γ-Glutamyltranspeptida.se

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase unter Verwendung von γ-Glutamyl-p-Nltranilin und Glycylglycin als Substrat in Gegenwart'eines geeigneten Puffers.

der

In zunehmendem Maße wird die Bestimmung/γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GT) im klinisch-chemischen Labor zur Erkennung von leberkrankheiten durchgeführt. Diese Bestimmung erfolgt nach einem bekannten Verfahren nach der Reaktion:

Y-Glutamyl-p-Hitranilin + Glycylglyein^====^p-I!itra~ nilin + GIutamylglycylglycin" ■

Diei Gefjchwindiglceit der Preisetaung des gelbgefärbten p-Eitranilins kajin optisch verfolgt v/erden und ist ein Maß für die vorhandene Aktivität an γ-GT.

Pur eine routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens ist die Instabilität und schlechte Löslichkeit des Substrates y-Glutamyl-

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p-Nitranilin ein schwerer Nachteil. Diese Verbindung läßt sich nur schwer in .Lösung bringen und lösungen sind nur sehr kurze Zeit haltbar. Es war daher erforderlich, Abfüllungen jeweils nur für relativ wenige innerhalb kurzer Zeit durchzuführende Bestimmungen herzustellen. Eine Aufbewahrung der Reagenslösungen war nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens zu schaffen, welches die obigen Nachteile nicht aufweist.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Auffindung der Tatsache, daß die kombinierte Anwendung von Polyvinylpyrrolidon zusammen mit einem oberflächenaktivem Mittel die Löslichkeitseigenschaften und. die Beständigkeit von γ-Glutamyl-p-Nitranilin entscheidend verbessert.

Das erfindungsgemäße Reagens zur Bestimmung der γ-Glutamyltranspeptidase unter Verwendung von γ-Glutamyl-p-Nitranilin, Glycylglycin und Puffer ist daher gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon in Kombination mit einem oberflächenaktivem Mittel. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Reagens zusätzlich ein Azid, insbesondere ein Alkaliazid wie z. B. Natriumazid.

Als oberflächenaktive Mittel können im erfindungsgemäßen Reagens solche verwendet werden, welche keinen hemmenden oder inaktivierenden Einfluß auf die γ-Glutamyltranspeptidase ausüben. Als besonders geeignet erwiesen sich die Oxypolyäthoxyalkane, insbesondere ein Oxypolyäthoxydodecan.

Das erfindungsgemäße Mittel enthält das γ-Glutamyl-p-Nitranilin in gefriergetrockneter Form. Dieses kann zusammen mit den übrigen Bestandteilen des Mittels in fester Form vorliegen. Vorzugsweise besteht das erfindungsgemäße Reagens jedoch aus zwei Mischungen, von denen die eine γ-Glutamyl-p-Nitranilin und

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Glycylglycin in gefriergetrockneter Form enthält und die andere aus einer wässrigen Lösung besteht, welche den Puffer, Polyvinylpyrrolidon, das oberflächenaktive Mittel und gegebenenfalls das Azid enthält. Die beiden Mischungen sind je für sich sehr lange haltbar und durch einfaches Mischen unter gelindem Erwärmen läßt sich rasch eine relativ stabile Lösung herstellen, die längere Zeit gebrauchsfähig bleibt.

In der bevorzugten Ausführungsform enthält die wässrige Lösung

0,05 bis 0,2 M Trispuffer, pH 7,8 bis 8,2, 20 bis 100 g/l Polyvinylpyrrolidon, 0,75 bis 5 g/l oberflächenaktives Mittel

und gegebenenfalls _t.

0,5 bis 4 g/l Azid.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die wässrige Lösung aus

0,1 M Irispuffer, pH 8,0,
30 g/l Polyvinylpyrrolidon,
1 g/l Oxypolyäthoxyalkan und 1 g/l Natriumazid.

Der zweite Bestandteil des erfindungsgemäßen Reagens, die feste Mischung von γ-Glutamyl-p-Nitranilin und G-lycylglycin, enthält

1,0 bis 1,25 g γ-Glutamyl-p-Nitranilin und 5,0 bis 6,2 g Glycylglycin ./....."J

je 1 der flüssigen Reagenskomponente.

Das erfindungsgeiaäße Reagens ermöglicht die Herstellung von gebrauchsfertigen Lösungen zur Bestimmung der γ-Glutamyltranspeptidase, die längere Zeit gebrauchsfähig bleiben, im Gegensatz zu den bisher bekannten Lösungen von γ-Glutamyl-p-lTitranilin, die einerseits sehr schwer herstellbar waren und aus

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- 4 denen diese Verbindung nach der Herstellung nach, kurzer Zeit

wieder auskristallisierte. Das erfindungsgemäße Reagens 'schafft damit erstmalig die Möglichkeit, die γ-G-lutamyl trans

Bestimmung . , , „.., . _ . . . peptidase- routinemäßig durchzuführen, beispielsweise m auto matischen Analysegeräten,

Das folgende Beispiel erläutert die. Erfindung weiter,

Beispiel

Herstellung des Reagens *

6,84 g y-G-lutamyl-p-Kitranilin und 33»8 g G-lycylglycin v/erden unter .Erwärmen auf 70 bis 80° C in 6 1 bidestilliertem Wasser gelöst. Die v/arme Lösung wird in Portionen zu je 3>0 ml in 200 kleine Flaschen abgefüllt, darin eingefroren und in üblicher Weise gefriergetrocknet. Die so erhaltenen Zubereitungen sind mindestens 12 Monate bei Raumtemperatur stabil.

193»5 g Tris (Hydr^iethyl)-Aminomethan, 240 g Polyvinylpyrro- ψ lidon, 8 g Polyäthoxydodecan (im Handel unter der Bezeichnung The sit erhältlich) und 8 g ITatriumazid werden in 8 1 bidest.illiertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 8,0 eingestellt: Die so'erhaltene Lösung.ist^bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar.

Das wie unter a) beschrieben hergestellte Lyophilisat wird in 3 ml der nach b) hergestellten Lösung suspendiert und durch kurzes Erwärmen auf ca. 30 bis 40° C vollständig in Lösung gebracht. Dann läßt man die Lösung auf Zimmertemperatur ab-

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kühlen. Dem so erhaltenen, gebrauchsfertigen Reagens v/erden 0,2 ml einer Probelösung (z. B. Serum) zugesetzt und durch, mehrmalige Messung der Extinktion die Freisetzung des gelb gefärbten p~Nitranilins verfolgt, deren Geschwindigkeit ein Maß für die γ-G-lutamyltranspeptidaseaktivität ist.

d) Einfluß von Polyvinylpyrolidon (PVP) und Oxypolyäthoxydedecan (OPD) auf die löslichkeit von y-G-lutamyl-p-lTitra-

11,4- g γ-G-lutamyl-p-Nitranilid und 56,4 g G-lycyl-G-lycin vmrden unter Erwärmen auf 70 bis 80.° C in 10 1 bidestilliertem Wasser gelöst. Die warme Lösung wurde in Portionen zu je 3,0 ml in kleine flaschen abgefüllt, eingefroren und gefriergetroclcnet.

Mit den so erhaltenen Zubereitungen (Lyophilisate) vmrden Lösungsversuche angestellt. Die Lyophilisate wurden bei 50 bis 70° C in 0,2 M Tris-Puffer der a) keinen Zusatz, b) PVP und OPD in einem bestimmten Konzentrationsverhältnis enthielt, gelöst, die Lösung auf 25° G abgekühlt und die Lösungsvermittelnden Eigenschaften von PVP und OPD durch Messung der Trübung (^-Lichtdurchlässigkeit) bzw. Beobachtung des Kristallisations— Zeitpunktes festgestellt.

% PVP	0	3
fo OPD	0	\
Anfang	85 f \	84 %
nach 3 Std*	60 $	85 fo
nach 6 Std.	50\ io	84- fo
nach 24 Std.	20 $	84 f>
nach 2 Tagen	Kristallis.	82 fo-
nach 6 Tagen	It	78 fo

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Claims (5)

•— 6 — P A T E IT T A IT S P R Ü C H E

1.) Reagens zur Bestimmung der γ-G-lutamyltranspeptidase unter Verwendung von γ-Glutamyl-p-ITitranilin, Glycylglycin und Puffer, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Polyvinylpyrrolidon in Kombination mit einem oberflächenaktivem Mittel.

2.) Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Azid enthält.

3,) Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktives Mittel ein Oxypolyäthoxyalkan enthält.

4.) Reagens nach Anspruch 2 oder 3, bestehend aus

A) 0,05 bis 0,2 M Trispuffer, pH 7,8 bis 8,2, 20 bis 100 g/l Polyvinylpyrrolidon,

0,75 bis 5 g/l oberflächenaktives Mittel, 0,5 bis 4 g/l Azid

: in Form einer wässrigen Lösung und

B) einer gefriergetrockneten Mischung von

" 1 bis 1,25 g/l γ-Glutainyl-p-Nitranilin und

5 bis 6,2 g/l Glycylglycin

in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.

5.) Reagens nach Anspruch 4, bestehend aus

A) 0,2 M Trispuffer, pH 8,0,
30 g/l Polyvinylpyrrolidon,
1 g/l Oxypolyäthoxyalkan,
1 g/i Natriumazid

in Porin einer wässrigen Lösung und

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B) 1,13g y-G-lutamyl-p-Mtranilin und 5,6 g Glycylglycin je 1 der Lösung A).

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