DE2509782A1 - Antibiotikum 67-121 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

DR.-SNG. VON KREISLER DR.-iNG, SCKUNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

AvK/Ax

SCHERICO LTD., Töpferstraße 5, Luzern (Schweiz).

Antibiotikum 67-121 und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft neue antibiotisch wirksame Substanzen, ihre Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen, die diese Substanzen enthalten: Die Erfindung ist insbesondere auf einen neuen Polyen-Antibiotikum-Komplex und die als Komponenten darin enthaltenen Antibiotika gerichtet, die durch Kultivierung eines bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes aus der Familie Actinoplanceae hergestellt werden können.

Eine allgemeine Abhandlung über ■ Makrolid-Antibiotika findet sich in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 2.Auflage, Bd. 12, S. 6^2 ff. Wie dort festgestellt wird, werden Antibiotika, die das gemeinsame Merkmal eines makrocyclischen Lactonringes aufweisen, allgemein als gesonderte Gruppe von Antibiotika eingestuft, die allgemein als Makrolid-Antibiotika bezeichnet werden. Außer durch den Lactonring sind die Antibiotika der Makrolid-Gruppe dadurch gekennzeichnet, daß sie verschiedene Keto- und HydroxyIfunktionen und glykosidisch gebundene Desoxyzucker aufweisen. Eine Untergruppe bilden die als antibakteriell bezeichneten Antibiotika. Eine weitere Untergruppe, für die eine antimykotische oder fungizide Wirkung typisch ist, bilden-die sog. Polyen-Makrolid-Antibiotika oder, kürzer ausgedrückt, die Polyen-

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Antibiotika. Diese Untergruppe ist dadurch gekennzeichnet, daß sie ein System von konjugierten Doppelbindungen mit 3 bis 7 konjugierten Bindungen aufweist. Die Identifizierung eines Antibiotikums als Polyen-Antibiotikum wirddurch das charakteristische UV-Absorptionsspektrum erleichtert. Als repräsentative Polyen-Antibiotika sind Amphotericin A, Amphotericin B, Candicidin, Nystatin, Perimycin, Pimaricin und Trichomycin zu nennen. Eine allgemeine Beschreibung der Polyen-Antibiotika findet sich in Kirk-Othmer~, Encyclopedia of Chemical Technology. 2.Auflage, Bd. 16, S. 1^3 ff. , während Daten über die UV-Absorptionsmaxima für die vorstehend genannten und andere Polyen-Antibiotika von H. Umezawa u.Mitarb, in "Index of Antibiotics from Actinomycetes", University of Tokyo Press 196?, S. 879-885, gegeben werden.·

Gegenstand der Erfindung sind gemäß einem Aspekt ein als Antibiotlkum-67-121-Komplex bezeichneter neuer Polyen-Antibiotikum-Komplex und die als Komponenten in diesem Komplex enthaltenen Antibiotika, die hier als Antibiotikum 67-121A, 67-121B, 67-121C und 67-121D bezeichnet werden. Es wurde gefunden, daß diese Antibiotika eine wertvolle fungizide Wirkung und, wie spezielle Tests ergeben haben, gegen eine Vielzahl von Stämmen von Candida albicans eine gegenüber dem bekannten Polyen-Antibiotikum Candicidin gesteigerte Wirksamkeit aufweisen. Der neue Antibiotikum-67-121-Komplex und die als Komponenten darin enthaltenen Antibiotika sind durch Kultivierung eines bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes herstellbar.

Gemäß einem weiteren Merkmal ist die Erfindung auf die Herstellung eines als Antibiotikum-67-121-Komplex bezeichneten Antibiotkumkomplexes oder einer als Antibiotikum 67-121A, 67-121B, 67-121C und 67-121D bezeichneten Antibiotikumkomponente dieses Komplexes nach einem Verfahren gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

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einen den Antibiotikum-67-121-Komplex oder dessen Komponenten bildenden Mikroorganismus der Gattung Aetinoplanes in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis dem Medium eine hohe antibiotische Wirksamkeit verliehen worden ist. Von der Anmelderin wird speziell ein Mikroorganismus einer neuen Spezies verwendet, die hier als Aetinoplanes caeruleus bezeichnet wird. :

Der Mikroorganismus ;

Der erfindungsgemäß verwendete spezielle Mikroorganismus xtfurde von einer Bodenprobe aus einem Salbeibuschbereich im Bristol Cone Park, California, isoliert und als Mitglied der Familie Actinoplanaceae, Gattung Aetinoplanes und speziell als Mitglied einer als Aetinoplanes caeruleus bezeichneten neuen Spezies identifiziert. Eine repräsentative Kultur des als Aetinoplanes caeruleus bezeichneten Mikroorganismus wurde bei der Northern Utilisation \ Research and Development Division,United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A., hinterlegt, wo er die Hinterlegungs-Nr. NRRL 5325 erhielt. Diese Kultur ist nun Teil der ständigen Sammlung dieses Instituts. Subkulturen von Aetinoplanes caeruleus NRRL 5325 sind auf Anforderung vom genannten Institut erhältlich.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wurde auf Grund der Tatsache, daß er kein Luftmycel bildet und globose (kugelförmige) bis digitale (fingerförmige) Sporangien bildet, die bei Dehiszenz kugelförmige bewegliche Sporen mit einem Büschel von polaren Plagella freigeben, als zur Gattung Aetinoplanes eingestuft. Der Mikroorganismus zeigte Charakteristiken, die, wie nachstehend dargelegt werden wird, von bekannten Spezies von Actinoplanes genügend verschieden sind, um die Bezeichnung als neue Spezies zu rechtfertigen. Die Spezies wurde auf Grund der Bildung von tiefblauen bis blaugrünen Kolonien bei Züchtung auf verschiedenen Medien als Aetinoplanes

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caeruleus bezeichnet. Ein überraschendes, vorteilhaftes und unterscheidendes Merkmal von Actinoplanes caeruleus ist die Fähigkeit, den neuen Polyen-Antibiotikum-Komplex und die als Komponenten darin enthaltenen, nachstehend als 67-121 bezeichneten Antibiotika zu produzieren.

Actinop-lanes caeruleus ist aerob und wächst gut auf den verschiedensten Nährmedien bei 26° bis 37°C. Bei 45°C. und darüber ist praktisch kein Wachstum festzustellen. Zur Herstellung von Antibiotika wird die Kultivierung vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 durchgeführt. Actinoplanes caeruleus ist empfindlich gegen Natriumchlorid und wächst sehr schlecht in Medien, die 1,5$ Natriumchlorid enthalten. . Er reduziert Nitrat zu Nitrit, verflüssigt Gelatine teilweise, zersetzt Cellulose sehr langsam und hydrolysiert Stärke nur gering.

Andere taxonomische Daten für Actinoplanes caeruleus sind in den folgenden Tabellen I bis Vl genannt:

Tabelle I: Merkmale der Kolonie auf verschiedenen Medien

Tabelle II: Verwertung von Kohlenhydraten

Tabelle III: Verwertung von Stickstoff \

Tabelle IV: Vergleich der Wachstumseigenschaften von A. caeruleus mit anderen Spezies von Actinoplanes

Tabelle V: Vergleich der physiologischen Eigenschaften von A. caeruleus mit anderen Spezies von Actinoplanes

Tabelle VI: Vergleich der Kohlenhydratverwertung von A. caeruleus mit anderen Spezies von Actinoplanes.

Die in den Tabellen I und III genannten Farbbeschreibungen bestehen aus zwei Bezeichnungen. Die erste ist ein Farbname, entnommen aus dem Buch "Descriptive Color Name Dictionary" von Taylor, Knoche und Granville, herausgegeben von Container Corporation of America, 1950 (U.S.A.),

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mit einer dem Farbnamen entsprechenden Farbkennziffer, die dem "Color Harmony Manual", 4. Auflage 1958, herausgegeben von Container Corporation of America, entnommen worden ist. Die zweite Färb"bezeichnung ist ein Synonym oder annäherndes Synonym der ersten Bezeichnung und dem Circular 553 des National Bureau of Standards (USA) vom November 1955 entnommen.

Im Falle von Tabelle II bestand das verwendete Medium aus Yjo des angegebenen Kohlenhydrats, 0,5$ Hefeextrakt, 1»5$ Agar, Rest Wasser, während im Falle von Tabelle III das verwendete Medium aus der angegebenen Menge der Stickstoffquelle, 1$ Glucose, 1,5$ Agar, Rest Wasser, bestand.

Die in den Vergleichstabellen IY bis VI gemachten Angaben über andere Spezies von Actinoplanes als Actinoplanes caeruleus wurden den folgenden Quellen entnommen:

a) für A. philippinensis, A. brasiliensis, A. missouriensis, A. utahensis aus J.E. Thieman u.Mitarb., Journal of Antibiotics 22 (1969) 119-125; ;

b) für A. sp. NRRL 3884 aus DOS 2 252 937 und

c) für A. italacus aus G. Beretta, International Journal Systematic Bacteriology 23 (1973) 37-42.

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Tabelle I Beobachtungen der Kolonien auf verschiedenen Medien

Medium	Beobachtungen
Glücose- Asparagin- Ag ar	Wachstum: gut, faltig, kein Luftmycel^ kein diffundierbares Pigment Farbe: g41c stumpf orange (dusty orange) mittel orange 53 (moderate orange)
NZ-Amin*- Glucose-Agar	Wachstum: gut, faltig, kein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment Farbe: g5pa hell orange (bright orange), leuchtend orange 48 (vivid orange)
Milch	Wachstum: gut, kein Luftmycel·, kein diffun dierbares Pigment, keine Hydro- l·yse (oder bei einigen Kulturen Hydrolyse nur unter den Kolonien) Farbe: g4na hell orange (bright orange), leuchtend orange 48 (vivid orange), faltig
Bennett's Agar	Wachstum: gut, faltig, kein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment Farbe: gj5ne Topas (topaz), stark gelb lich braun 74 (strong yellowish brown) und einige dunklere gesprenkelte Bereiche eines dunkelgrünlichen Schwarz
Emerson*s Agar	Wachstum: gut, faltig, kein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment Farbe: g3ne Topas, stark gelblich braun 74
Tomatenmark Hafermehl- agar	Wachstum: ziemlich gut bis gut, faltig, kein Luftmycel, kein diffundier bares Pigment Farbe: Gemisch von g3ea heil melonen gelb (light melon yellow), blaß orangegelb 73 (pale orange yellow] und gl3 1/2 Ie mittelblau, mäßig blau 182 (moderate blue)

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Medium

Tabelle I (Forts.)
I ' Beobachtungen

Glueose-Hefeextrakt-

Wachstum:, gut, faltig, kein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment

Farbe: g3nc bernsteinfarben, tief orangegelb 69 (deep orange yellow)

Kartoffelscbeibe

Wachstum: gut in Gegenwart von GaCO^, ziemlich gut in Abwesenheit von CaCO-z

Saccharose-Nitrat -Ag ar (Czapek¹s Agar)

Wachstum: ziemlich gut bis schlecht, körnig kein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment

Farbe: g41a orange, kräftig orange 50

Tyrosin-Agar

a) Tyrosin-Hefeextrakt

b) Tyrosin-Rindfleisch- extrakt

Beobachtungen nach 2, 7 und 14 Tagen (gemäß Gordon & Smith J. Bact.69, 147)

Wachstum: gut, Kristalle schlecht gelöst, kein diffundierbares Pigment

" : ziemlich gut, Kristalle

schlecht gelöst, Bildung von schwachbraunem diffundierbarem Pigment

Pepton-Eisen-Agar

Beobachtungen nach 2j 7 und 14 Tagen

Wachstum: ziemlich gut bis schlecht, ke i η e Re akt ion

Bromkresol-Purpurmilch

Milch nicht peptonisiert, pH-Wert unverändert

*NZ-Amin: Ein bei der enzymatischen Digestion von Kasein gebildetes und als Stickstoffquelle dienendes Pepton.

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Tabelle II Yerwertung von Kohlenhydraten

Kohlenhydrat

L-Arabinose Cellulose D-Glucöse D-Galactose ß-Lactose D-Lävulose D-Mannose D-Raffinose 1-Rhamnose Stärke Saccharose D-Xylose Inosit D-Mannit Sorbit Kontrolle

0,5$ "Hefeextrakt

Beobachtung

schlechtes Wachstum schlechtes Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum ziemlich gutes Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum schlechtes Wachstum gutes Wachstum ziemlich gutes Wachstum gutes Wachstum schlechtes Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum schlechtes Wachstum schlechtes Wachstum

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Tabelle III Stickstoffverwertung

Stickstoff- quelle	Beobachtung
0,5$ Hefeextrakt (Difco *)	Wachstum: gut, erhöht, gefurcht, kein Luftmycel, kein diffundier- bares Pigment Farbe: g31c "bernsteinfarben, tief orangegelb 69 (deep orange yellow)
1,0$ NZ-Amin ** Typ A	Wachstum: gut, kein Luftmycel, dunkel braunes diffundierbares Pigment zuweilen gebildet Farbe: g4pe orangerostfarben (orange rust), tieforange 51
1$ Asparagin	Wachstum: schlecht, flach, kein luft mycel, kein diffundierbares Pigment ; Farbe:- g18pn dark teal blue, dunkel grünlichblau 174 (dark greenish blue) ;
1$ Glutaminsäure	Wachstum: schlecht, flach, kein Luft mycel, kein diffundierbares Pigment Farbe: g18pn dark teal blue, dunkel grünlichblau 174
1$ Natrium nitrat	Wachstum: sehr schlecht, nicht nennenswert
15έ Ammonium nitrat	Wachstum: sehr schlecht, nicht nennens wert

* "Difco" ist ein eingetragenes Warenzeichen (Difco Laboratories Inc., Detroit, Michigan, U.S.A.).

** NZ-Amin: Ein bei der enzymatischen Digestion von

Kasein gebildetes und als Stickstoffquelle dienendes Pepton.

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Tabelle

IY

Medium A.caeruleus A.philippinensis NRRl· 5325 ATCC 12427

A.brasiliensis ATCC 25844

A.missouriensis
CBS 188.64

Bennett's
Agar W

gut
faltig

kräftig gelbbraun, Bezirke mit dunkel grünlichem Schwarz

gut

leicht runzlig

ockergelb

stark

dick und
runzlig

tief orange

stark
glatt

blaß orange

Glucose-Asparagin
Agar W

gut
faltig

mäßig orange

gut

glatt

orange

gut

dünn und glatt

blaß rosa

gut
glatt

tief orange

Czapek-Doz¹ ¥
Agar

zieml.gut gut bis schlecht

körnig

kräftig orange

leicht runzlig ockergelb

mäßig

dünn, runzlig tief orange

mäßig

glatt
strohfarben

A.utahensis
CBS 367.66

gut

runzlig und
glänzend

orange

gutglatt und
glänzend

tief orange

mäßig

glatt
strohfarben

	Medium	W	T a b e	Actinoplanes sp. NRRL 3884	lie IY (Forts.)
	Bennett's Agar	0	gut	A. italacus ATCC 27366
		P	nicht bestimmt	sehr stark
		¥	orange	runzlig
	Glucose- Asparagin-Agar	0	sehr stark	hellbernstein-braun
		F	nicht bestimmt	spärlich
		W	blaß orangefarben
)9838/	Czapek-Dox' Agar	0	sehr stark	hellkirschfarben
0862		nicht bestimmt mittel orange	nicht bestimmt

CJl O CD -4 OO NJ

	i	W 0 P	A. caer'uleus MRL 5325	Tabelle	IY (Ports.)	A.misaouriensis CBS 188.64	I
	Medium	W 0 P	ziemlich gut körnig tief orangegelb mit dunkelgrünlich- blau gesprenkelt	A.philippinensis ATCC 12427	A.brasiliensis ATCC 25844	gut dick und runzlig tief orange	ro I
	Nähragar	W 0 P	zieml. gut "bis mäßig flach, membranförmig tief orangegelb	mäßig glatt und dünn blaß orange	mäßig dünn und glatt blaß orange- rosa	mäßig dünn und runzlig blaß orange	2509782
S09838/	Kartoffel- agar		sehr schlecht nicht charakteri sierbar nicht charakteri sierbar	mäßig glatt gelbbraun	gut glatt rosa-orange	mäßig dünn und runzlig blaß-orange
0862	CaIcium- maleat			mäßig glatt gelbbraun	gut glatt rosa-orange
		•

Tabelle IV (Ports.)

Medium	W	A.utahensia	Actinoplanes	A.italacus
	O	CBS 367.66	sp. NRRL 3884	ATCC 27366
Nähragar	Έ	gut	gering	sehr stark
	glatt		glatt
	orange	blaß orange	tief bernsteinfarben

Kartoffel-Agar W

mäßig

glatt und dünn

blaß orangefarben

nicht bestimmt

Zeichenerklärung:

W = Wachstum

O = Oberflächenbeschaffenheit

Έ = Farbe der Kolonie

sehr stark glatt

hellkirschfarben mit bernsteinfarbenem Rand

Calciummaleat	W	mittelmäßig	sehr schwach	spärlich
	O	glatt und dünn
	P	blaß orangefarben		blaß orangefarben

Test

Hydrolyse von Stärke

Tabelle V Physiologische Eigenschaften

A.caeruleus A.philippinensis A.brasiliensis

• ATCC25844

NRRL 5325 ATCC 12427

A„missouriensis CBS 188.64

-Bildung

ο co co u> co

Melanin

Hydrolyse von Tyrosin

Hydrolyse von Xanthin

Hydrolyse von Kasein

n.ta.

Hydrolyse von Calciummaleat

Nitratreduktion

Lackmusmilch

Verflüssigung von Gelatine

k.K. k.P. k.K.

k.P.

k.K. k.P,

	K.	CJl
k.	P.	O
k.		CO
		-J
		OO
	K)

Tabelle V (Ports.)

	Test	A.caeruleus A.utahensis NRRL 5325 CBS 367.66	+	Actinoplanes sp.NRRL 3884	η	Reaktion k	A.italacus A.armeniacus ATCC 27366 ATCC 15676	NJ
	Hydrolyse von Stärke	++		n.'b.	Reaktion zweifelhaft k		+/- ++	OI O
	H2S-Bildung Melanin	+	+/-	n.'b·	schwache positive	starke positive Reaktion	+ +	CD 1
	Hydrolyse von Tyrosin	+ ·		n.'b.	positive Reaktion		+ ++	OO NJ
cn	Hydrolyse von Xanthin	n.b.	+	n.'b.		η .Td. n.'b.
098	Hydrolyse von Kasein	+	+	,n.'b.	+ +++
co CD	Hydrolyse von Calciummaleat		+	n.'b.	- +/-
O	Nitratreduktion	+	k.K. k.P.	+	+/- +
CD ro i	Lackmusmilch	k.K. k.P.	V-	k.K. k.P.	k.K. k.K. peptonisiert peptonisiert
i j	Verflüssigung von Gelatine	+	negative Reaktion	+	+
i	Zeichenerklärung	: - "-	.Td. = nicht bestimmt
		+/- -	.K. = keine Koagulierung
j		+ ' a	.P. β keine Peptonisierung
		++ ■·
		+++ =

Tabelle VI

Vergleich der Verwertung von Kohlenhydraten von A. caeruleus mit'

anderen Spezies von Actinoplanes

co co co

Kohlenhydrat

Inosit .

Fructose

Rhamnose

Mannit'

Xylose

Raffinose

Arabinose

Cellulose

Saccharose

Glucose

Kontrolle

A.caeruleus NRRL 5325

A.philippinensis ATCC 12427 A.brasiliensis
ATCC 25844

A .missouriensis
CBS 188.64

V-

-H-

Tabelle VI (Forts.)

cn ο co oo co oo *»>

Kohlenhydrat

Inosit

Fructose

Rhamnose

Mannit

Xylose Raffinose

Arabinose

Cellulose

Saccharose

Glucose

Kontrolle

A.caeruleus A.Utahensis, A.Actinoplanes, A.italacus NRRL 5325 CBS 367.66 sp.NRRL 3884 ATCC 27366

A.armeniacus
ATCC 15676

ν-

■H- -H-

-H-

V-

V-

V-

+4·

n.b.

-H-

n.b.

Zeichenerklärung;

- = keine Verwertung

+/- = etwas besser als Kontrolle

+ = ziemlich gute bis mäßige Verwertung

++ = starke Verwertung

n.b. = nicht bestimmt

CJl O CD

Die Fermentation des MikroOrganismus

Die Fermentation oder Kultivierung des Mikroorganismus wird gewöhnlich in zwei Stufen durchgeführt: Die erste Stufe ist eine Impfmaterial-Produktionsstufe und die zweite die Antibiotikum-Produktionsstufe.

Das Impfmaterial oder Inoculum wird im allgemeinen durch Kultivierung einer von einer Agar-Schrägkultur gewonnenen Kultur von Actinoplanes caeruleus in einem geeigneten Nährmedium hergestellt.

Die Erzeugung von Antibiotika erfolgt im allgemeinen durch Kultivierung einer Probe des Impfmaterials in einem wäßrigen Nährmedium unter submeraen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 23° bis 40⁰C, vorzugsweise "bei 28°C, und bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 8,0 unter Bewegung oder Rühren, bis dem Medium eine erhebliche antibiotische Wirksamkeit verliehen worden ist. Eine Ferment.ationsdauer von etwa 3 bis 7 Tagen kann zweckmäßig angewandt werden. Um festzustellen, wann Spitzenproduktion des Antibiotikums erreicht ist, können Proben des Mediums periodisch auf ihren Gehalt an Antibiotikum in der nachstehend beschriebenen Weise ausgetestet werden. In dieser Weise wurde von der Anmelderin in bestimmten Fällen gefunden, daß etwa 4 Tage eine bevorzugte Kultivierungsdauer sind.

Als Nährmedium können beliebige geeignete Medien verwendet werden, die eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, und eine Stickstoffquelle, z.B. ein assimilierbares stickstoffhaltiges oder proteinhaltiges Material enthalten.

Zu den bevorzugten Kohlenstoffquellen gehören beispielsweise Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin und Melassen, während als Stickstoffquelleη beispielsweise Maisquell-

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v/asser, autolysierte Bierhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Trockenmilch, pankreatisch digeriertes Kasein, Feststoffe von Brennereirüclcständen, tierisches Peptonwasser und Fleisch- und Knochenabfälle "bevorzugt werden. Vorteilhaft können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden, Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen u.dgl. "brauchen den Fermentationsmedien gewöhnlich nicht zugesetzt zu werden, weil Leitungswasser und die als Komponenten des Mediums verwendeten ungereinigten Bestandteile diese Metalle im allgemeinen enthalten.

Wenn nur geringe Mengen des Antibiotikums erforderlich sind, kann anstelle der Kultivierung in Submerskultur die Oberflächenkultivierung angewandt werden.

Bei einer im Rahmen der Erfindung angewandten Methode zur Bestimmung, wann Spitzenproduktion des Antibiotikums stattfindet, wird eine Probe des Fermentationsmediums mit einem bestimmten Volumen genommen und das Antibiotikum daraus extrahiert und dann nach einer Standard-Zylindermethode getestet. Die Extraktion des Antibiotikums aus der Probe kann unter Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, z.B. Chloroform, Toluol, Benzol, Diäthylenglykol und Mäthyläther, erfolgen. Es ist auch möglich, ein in Wasser schwer lösliches organisches Lösungsmittel, z.B. n-Butanol, zu verwenden. Eine Probe des Fermentationsmediums kann typischerweise auf Basis von Gewicht/Volumeη 175 bis 1000 Mikrogramm/ml rohes Antibiotikum enthalten, jedoch können bei Fermentationen, die mit hoher Ausbeute durchgeführt werden, Konzentrationen, die um ein Mehrfaches höher sind als die genannte obere Grenze, erhalten werden. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand gewogen und in Dimethylformamid gelöst, wobei eine Lösung erhalten wird, die eine geschätzte Konzentration an Antibiotikum

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67-121 von etwa 1000 Mg/ml hat. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wird dann entnommen und mit 0,1-molarem Phosphatpuffer von pH 8,0 so verdünnt, daß eine lösung mit einer geschätzten Konzentration an Antibiotikum 67-121 von etwa 3 Wg/ml erhalten wird. Die genaue Konzentration von Antibiotikum 67-121 in der letztgenannten Lösung wird dann mit Hilfe eines Standard-Zylindertests mit Saccharoinyces cervisiae ATCG 9763 als Testmikroorganismus und unter Verwendung einer reinen Probe von Antibiotikum-67-121-Komplex als Standard, der eine Wirksamkeit von 1000 «g/mg zugeschrieben wird, bestimmt.

Das als Standard verwendete Antibiotikum 67-121 hat eine Wirksamkeit von 4000 jag/mg, ausgedrückt als Candicidin, bei der in Title 21 von Code of Federal Regulation, Section 148v, beschriebenen Candicidin-Testung.

Isolierung und Reinigung des Antibiotikum-Produkts

Nach der Spitzenproduktion wird das gebildete Polyen Antibiotikum nach Methoden, die für Polyen-Antibiotika an sich bekannt sind, aus dem Kulturmedium isoliert. Beispielsweise kann nach einer Methode, die aus den nachstehenden aufeinanderfolgenden Stufen besteht, gearbeitet werden:

a) Das gesamte Kulturmedium wird auf pH 2,5 bis 4,0 angesäuert.

b) Das Mycel wird vom angesäuerten Kulturmedium abfiltriert.

c) Das Mycel wird einmal oder mehrmals mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht oder schlecht mischbar ist, extrahiert.

d) Die Extrakte im organischen Lösungsmittel werden vereinigt und auf einen Rückstand eingedampft.

e) Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, z.B. einem gesättigten oder

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ungesättigten Kohlenwasserstoff oder einem Alkyläther, vorzugsweise Diäthyläther, verrieben.

f) Die erhaltene Suspension, die den rohen Antibiotikum-67-121-Komplex enthält, wird filtriert.

Es ist auch möglich, nach einer Methode zu arbeiten, bei der man das Polyen-Antibiotikum durch Ansäuern des gesamten Kulturmediums auf pH 2,5 bis 4,0 isoliert, das angesäuerte Kulturmedium mit einem geeigneten, mit Wasser nicht oder schwer mischbaren organischen Lösungsmittel direkt extrahiert und die vereinigten Extrakte dann den vorstehend beschriebenen Stufen (d) bis (f) unterwirft.

In der Praxis wurde von der Anmelderin gefunden, daß nach den vorstehend genannten Methoden ein roher Antibiotikum-67-121-Komplex, dessen Testung nach dem vorstehend beschriebenen Zylindertest .eine Konzentration von 250 Mg/mg ergibt, erhalten werden kann.

Die Reinigung des rohen Polyen-Antibiotikum-Komplexes kann nach bekannten Verfahren, z.B. durch fraktionierte Kristallisation, Auflösung und anschließende erneute Ausfällung, Gegenstromextraktion u.dgl., erfolgen.

Beispielsweise kann ein rohes Antibiotikum-67-121-Produkt, dessen Testung 250 Mg/mg ergab, wie folgt gereinigt werden: Dieses Produkt wird in der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 2:2:1 gelöst. Die erhaltene Lösung wird zur Entfernung von unlöslichem Material filtriert. Das Filtrat wird zu Diäthyläther gegeben (10 Raumteile Diäthyläther zu 1 Raumteil Filtrat) und die gebildete gelbe Fällung abfiltriert. Die Fällung wird dann in einer ausreichenden Menge der oberen Phase des vorstehend genannten Chloroform-Methanol-Waaser-Gemisches gelöst. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck stehen gelassen, "bis soviel Lösungsmittel abgedampft ist, daß Ausfällung des gereinigten Antibiotikum-Komplexes die Folge ist. Der

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ausgefällte gereinigte -Antibiotikum-Komplex wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Die Testung des in dieser Weise erhaltenen gereinigten Antibiotikum-67-12l-Komplexes ergibt 1000 ug/mg als Antibiotikum-67-l2l-Komplex (oder 4000 ug/mg, gerechnet als Candicidin).

Trennung der Komponenten des Antibiotikums

Der Antibiotikum-67-12!-Komplex kann nach chromatographischen Methoden, z.B. durch Säulenchromatographie, in seine Komponenten zerlegt werden. Bei Anwendung der Säulenchromatographie kann speziell Kieselgel als Säulenmaterial und die untere Phase eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (Vol.-Verhältnis 2:2:1) als Elutionsmittel verwendet werden.

Falls gewünscht, kann vor der vorstehend genannten chroraatographischen Trennung eine teilweise Trennung vorgenommen werden, indem der 67-121-Komplex in der unteren Phase eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (Volumenverhältnis 2:2:1) gelöst und das gelöste Material dann durch Zusatz von Methanol teilweise ausgefällt wird.

Die chromatographische Trennung des Antibiotikum-67-121-Komplexes durch Säulenchromatographie hat ergeben, daß der Komplex vier Antibiotikum-Komponenten enthält, die hier als Antibiotika 67-121A, 67-121B, 67-121C und 67-I2ID bezeichnet werden. Diese Bezeichnung entspricht der Reihenfolge, in der die Antibiotika aus der Säule austreten. Bei Anwendung des vorstehend genannten Systems aus Kieselgelsäule und Lösungsmittel wurden die folgenden R^-Werte für die einzelnen Komponenten bestimmt: Antibiotikum 67-121A = 0,17,, 67-121B = 0,14, 67-I2IC = 0,11 und 67-I2ID = 0,07. Die Elution der Antibiotikum-Komponenten von der Säule läßt sich leicht auf Kieselgel-Dünnschichtplatten unter Verwendung des bei der Trennung durch Säulenchromatographie verwendeten Lösungsmittelgemisches überwachen. Die Anwesenheit von antibiotischem Material auf der Platte wird in belie-

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biger zweckmäßiger Weise, z.B. durch Bioautographie oder auch durch Besprühen der Platte mit einem Schwefelsäure-Methanol-Gemisch und anschließendes Erhitzen der Platte festgestellt» wobei vorhandenes antibiotisches Matei'ial sichtbar wird.

Das Mengenverhältnis der Antibiotikum-Komponenten kann von einer Fermentation zur. anderen sehr unterschiedlich sein, jedoch kann allgemein gesagt werden, daß das Antibiotikum 67-121C gewöhnlich die größere Komponente und 67-121D eine Spurenkomponente ist. Um dies zu veranschaulichen, sei bemerkt, daß bei einem speziellen Beispiel die Komponenten in den folgenden Mengen vorlagen: 67-121A 12 Gew.-$, 67-121B 12 Gew.-^, 67-121C 76^ iGew.-% und 67-121D in einer Spur&nmenge. ;

Die als Produkte erhaltenen Antibiotika '

Wie bereits erwähnt, enthält der Antibiotikum-67-121-Komplex als Komponenten die Antibiotika 67-121A, 67-121B, 67-121C und 67-121D. Diese Antibiotika wurden als Polyen-Makrolid-Antibiotika eingestuft. Ferner wurden die Antibiotika nach ihren charakteristischen UV- und IR-Absorbtionsspektren als Heptaen-Makrolid-Antibiotika eingestuft. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Antibiotikum-67-121-Komplexes und seiner Komponenten werden nachstehend angegeben.

Chemische und physikalische Eigenschaften des Antibiokum-67-121-Komplexes

In der folgenden Tabelle 1 sind die Daten des UV-Absorbtionsspektrums für eine Probe des Antibiotikum-67-121-Komplexes und für Vergleichszwecke die aus der Literatur entnommenen entsprechenden Daten für eine Anzahl anderer Heptaen-Antibiotika genannt. In Tabelle 2 sind entsprechend die Elementaranalysenwerte, die Werte der optischen Drehung, die Schmelzpunkte sowie die R^-Werte genannt. Diese R^-Werte wurden mit einem Lösungsmittel-

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system bestimmt, das aus einem Gemisch von n-Butanol (6 Teile), Essigsäure (2 Teile), Wasser (2 Teile) und Dioxan (1 Teil) bestand. Der Nachweis erfolgte entweder durch Bioautographie gegen Candida albicans oder durch Besprühen der chromatographischen Platte mit Schwefelsäure und Methanol.

In Tabelle 3 sind gewisse Stabilitätsdaten für den Antibiotikum-67-121-Komplex genannt. Zur Ermittlung dieser Werte wurde das Antibiotikum mit dem geeigneten 0,1-molaren Puffer während der angegebenen Zeit auf dem siedenden Wasserbad erhitzt. Speziell wurde für pH-Werte von 9,0 bis 10,0 ein Boratpuffer verwendet, während für den Bereich von 2,2 bis 8,0 Puffer der Handelsbezeichnung Mcllvaines-Puffer verwendet wurden. Die Stabilität wurde durch Bestimmung der fungiziden Wirkung nach Erhitzen während der genannten Zeit mit Hilfe einer Scheiben-Testmethode (6,25 mm-Scheiben) mit Candida albicans als Testmikroorganismus ermittelt. Die Ergebnisse sind als Durchmesser der Hemmhöfe in mm ausgedrückt. Die Werte in Tabelle 3 zeigen, daß der Antibiotikum-67-1 21 -Komplex bei 100⁰C im pH-Bereich von 7,0 bis 9,0 ziemlich stabil ist. Bei pH 10 ist er etwas weniger stabil, wobei die Aktivität nach 15 Minuten bei 10O⁰C schnell abnimmt. Unterhalb von pH 5,0 ist das Antibiotikum verhältηismäßig instabil.

Wie die Werte in Tabelle 2 zeigen, läßt sich der Antibiotikum-67-1 21-Komplex chromatographisch von den anderen genannten Antibiotika mit Ausnahme von Candidin unterscheiden. Das Antibiotikum 67-121 läßt sich jedoch auf der Grundlage seiner Elementaranalyse und optischen Drehung von Candidin unterscheiden (bezüglich der optischen Drehung wird auf die nachstehend für die Komponenten B, C und D genannten Werte verwiesen).

Zur weiteren Charakterisierung des Antibiotikums-67-121-Komplexes wurde eine Standardmethode der Klassifizierung

. 509838/0862

für Heptaen-Antibiotika angewandt (siehe Tetrahedron 25., Seite 2229-2232). Me saure Hydrolyse ergab eine Aminozuckerkomponente, und zusätzlich ergab die Behandlung mit Kaliumhydroxyd eine aromatische Ketonkomponente. Das Antibiotikum-Produkt wurde demgemäß in der Klassifizierung der Heptaen-Untergruppe II zugeordnet. Die Heptaen-Untergruppe II umfaßt bekannte Antibiotika wie Candicidin, Trichomycin B und Perimycin.

• Tabelle

10 UY-Absorptionsdaten

Maxima und in Klammern E^^^

Antibiotikum

Antibiotikum-67-121-Komplex Ascosin "A" Ascosin "B" Candicidin Candidin

Candimycin Fungimycin Hamycin

Trichomycin "A"

Trichomycin

Maxima in mn

in MeOH

in EtOPI

342(340)., 363(475), 344(385) 362(490), 382(667), 403(605) 382(690) 404(625)

• . 340, 358, 377, 399

363(1000), 382(1650)

406(1860)

362, 382,

, 358i 376, 398 360, 380, 403 · -

364(985), 385(1730), 407(1910)

358, 376, 399

230, 285, 345, 383(962), 406(918)

361.5(625), 382(863) 286, 3^6, 364, 384, 405 404(750) (Trichomycin-Komplex)

358, 377,

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Tabelle

Antibiotikum

Elementaranalyse Optische ScHrnelzp.
Drehung C

Antibiotikum-

67-121-Komplex 56.Ϊ4 7.53 1.79 Ascosin "A"

plus Ascosin "B" 175

Candicidin Candidin Candimycin Fungimycin Hamycin

Trichomycin ^MA"

o*

63.29 '7.16 2.33

60.06 9.65 1.65 +363

57.17 8.81 1.70 o**

180

230

59.5 8.3 2.2 +216

0.43 0.53

0.54 0.45 0.53 0.54 0.52

60.06 .7.62 2.28 160
(kein
scharfer
Schmelzpunkt )

- 320 0.55

ι i(Zers.)

Trichomycin

59.49 8.09 2.16

* in Dimethylformamid; Literatur gibt keine Konzentration an. ** 0.3 % in Dimethylformamid. * ** 0.1 % in Pyridin

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Tabelle 3

Wärme- und pH-Beständigkeit von Antrbiotikum-67-121-Komplex

(Ausgedrückt als fungizide Wirkung)

Einwirkungsdauer "bei 100 C

Die Ergebnisse sind als Durchmesser des Hemmhofes in mm ausgedrückt»

pH O Min. ■ 5 Min. 15 Min. 30 Min,

2.2	O	O	O	O
3.0	O	O	O	O
4.0	12	9	O	O
5.0	14	14 .	13	.11
6.0	15	15	15	11
7.0	15	14	14	14
8.0	17	16	15	13
9.0	17	16	. 13 *	12
10.0	16	15	11	O

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Chemische und physikalische Eigenschaften der Komponenten von Antibiotikum 67-121 „

Antibiotikum 67-121A

Farbe und Form: gelbe Nadeln Schmelzpunkt 185 bis 19O⁰C (Zers„) Elementaranalyse: C = 59,

H = 7,90$ N = 2,60$

Molekulargewicht: 1218 (Osmometrie) ^⁶= + 161,6° (0,396 in Dimethylformamid)

pka = 6,0 (COO")

9,0 (NH, ) (66$ige wässriges Dimethylformamid)

UV-Daten (in Tetrahydrofuran-Wasser, Verhältnis 4:1)

* max ⁴⁰⁸ *P <^Elcm = ^95O> 384 mu (ε]^% = 1100)

363 ΐημ (E?"^% = 680)

IR-Daten (in Nujol)

1) _max 3350, 1725 und 1665 cm"¹

S 2,73 ppm (3H, Singlett, aromatisches-N-CI^)

NMR-Daten (in Hexadeuterodimethylsulfoxyd) 2,73 ppm (3H, Singlett, aromatisi 6,55 ppm (2H, Dublett,. J=8,5 Hz,aromatisches H)

7,64 ppm (2 H,Dublett,J=8,5 Hz,aromatisches H)

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Antibiotikum 67-121B

Farbe und Form: Schmelzpunkt:

Elementaranalyse:

gelbe ladein

175 bis 182⁰C (Zers.)

G = 59>70$ H= 7,65/* N = 2,1796

Molekulargewicht 1218 (Osmometrie) /ä_7^⁶ - + 199,7° *(0,396 in Dimethylformamid)

pka = 6,3 (COO")

9,0 (NH₃ ⁺) (66$iges wässriges Dimethylformamid)

UV-Daten (in Tetrahydrofuran-Wasser, Verhältnis 4:1)

max

408 τψ 383 ταμ 362 mp

lcm

lcm

E -lent

= 620)

= 750)

= 490)

IR-Daten (in Nujol)

3350, 1725 und 1665 cm

""¹

NMR-Daten (in Hexadeuterodimethylsulfoxyd)

6 6,58 ppm (2H, Dublett, J=8,5 Hz,aromatisches H) 7,60 ppm (2H, Dublett, J=8,5 Hz,aromatisches H)

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-30- 2509732

Antibiotikum 67-121C

Parte und Form: gelbe.Nadeln Schmelzpunkt: 175-18O⁰C (Zers.)

Elementaranalysa: C = 57,06$

H= 7,30$ N = 2,07$

Molekulargewicht = 1266 (Osmometrie)

J^ ■ = +143,8° (0,3$ in Dimethylformamid)

pka =6,0 (COO")

9,0 (NH₃ ⁺) (66$iges wässriges Dimethyl formamid )

UV-Daten (in letrahydrofuran-Wasser, Verhältnis 4i1)

383 ψ (E^_m = 910) 362 H₉I (E^_m = 600)

IR-Daten (in Nujol)
V _mQV 3350, 1725 und 1665 cm"¹

NMR-Daten (in Hexadeuterodimethylsulfoxyd)

D 2,76 ppm (3H, Singlett, aromatisches N-CH₅)

6,57 ppm (2H, DulDlatt, J=8,5 Hz,aromatisches H) 7,65 ppm (2H, Dublett, J=8,5 Hz,aromatisches H)

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Ebenso wie der Antibiotikum-67-121-Komplex werden die einzelnen Antibiotikum-Komponenten nach ihren charakteristischen UV- und IR-Absorptionsspektren als Heptaen-Makrolid-Antibiotika, in denen zahlreiche Hydroxylgruppen an den Makrolidring gebunden sind, eingestuft. Ferner werden die einzelnen Komponenten als Antibiotika der Heptaen-Untergruppe II eingestuft (siehe die oben angegebene Klassifizierung). Untersuchungen über den Abbau sowie die Daten des kernmagnetischen Resonanzspektruras und Massenspektrums zeigen, daß die Einzelkomponenten die aromatische Ketonkomponente

RHNV '/IiCH

enthalten, in der R bei den Antibiotika 67-121A und G ein Methylrest und beim Antibiotikum 67-121B Wasserstoff ist.

Durch Acetolyse der Antibiotika 67-121A und 67-121B wird die Anwesenheit einer D-Mycosaminzuckereinheit festgestellt, die glykosidisch an eine allylisehe Hydroxylgruppe des Aglycons gebunden ist.

Die Acetolyse des Antibiotikums C ergibt die Anwesenheit einer neuen Disaccharideinheit, die an eine allylisehe Hydroxylgruppe des Aglycons gebunden ist, wobei das Disaccharid sich als /O-ß-D-Mannopyranosyl (1 —> 4)-D-mycosamin7 der Formel

CH₂OH

erweist. In dieser Formel bedeutet die Wellenlinie, daß 509838/0862

die Stereochemie der glykosidischen Bindung des Disaocharids zum Aglycon noch nicht aufgeklärt worden ist.

Die Antibiotikum-Komponenten enthalten eine Carbonsäuregruppe, die der Salz- und Esterbildung nach an sich bekannten Verfahren zugänglich ist. Beispielsweise wurden von der"Anmelderin entsprechende Ester über das Diazomethan hergestellt. Diese Ester haben ebenfalls antimykotische oder fungizide Wirkung. Das Antibiotikum und seine Ester bilden mit den geeigneten Säuren, z.B. Hinsralsäuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essigsäure, Citronensäure, Weinsäure u.dgl. Säureadditionssalze.

Biologische Aktivität der Antibiotikum-Produkte A) Fungizide Wirkung in vitro

Die Werte der fungiziden In-vitro-Aktivität des Antibiotikums-67-121-Komplexes sind in Tabellefgenannt. Zum Vergleich sind außerdem die Werte für Candicidin angegeben. Die genannten hemmenden Mindestkonzentrationen wurden mit Hilfe üblicher Röhrchen-Verdünnungstests unter Verwendung von Sabouraud¹ Dextrose-Agar ermittelt.;

Als repräsentativ für die Antibiotikum-Komponenten wurden das Antibiotikum 67-121A und das Antibiotikum 67-121C in der gleichen Weise wie der Komplex getestet. Für das Antibiotikum 67-121A betrugen die hemmenden Mindestkonzentrationen weniger als 0,01 bis 0,03yUg/ml gegen 18 Stämme von Candida albicans, während für das Antibiotikum 67-121C Werte von 0,08 bis 0,3 /Ug/ml gegen 9 Stämme von Candida albicans nach einer Bebrütungsdauer von 48 Stunden ermittelt wurden. Die weitere Testung von Antibiotikum 67-1210 unter den gleichen Bedingungen ergab eine hemmende Mindestkonzentration von 0,3 «g/ml gegen 2 Stämme von Torulopsis und einen einzelnen Stamm von Cryptococcus. Stämme von Aspergillus und Dermato- phytes waren im allgemeinen weniger empfindlich. Hier

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"betrugen die hemmenden Mindestkonzentrationen für das Antibiotikum 67-121C 3 bis 25 /Ug/ral.

	Tabelle 4	- fungizide In-vitro-	67-121-Komplex	48 Std.	Candicidin	48 Std
Antibiotikum-67-1	21-Komplex		24 Std.	0.3		ο.οδ
Aktivität		Hemmende Mindestkonzentration inyUg/ml	O.O3	0.3	24 Std.	0.08
	Mikroorganismus	O.O3	3.O	O.O3	7.5
		3.0	3.O	O.O3	3.0
	Candida albicans 4o6	0.8	O.3	3.0	ο.οδ
402	0.03	0.8 .	0.8	3.0
420	0>.8	0.3	0.03
4o4	0.3	0.3	0.8
403	0-3 . -	0.3		-
401	0.3	0.8
1	0.3	0.3
12031	0.3	0.8		0.3
PIo	0.3	0.8		J 0.08
404a	0.3	0.8	0.03	0.08
402A	0.3	0.8	0.03
Torulopsis glabrata 1	0.8	0.8	0.03	0.3
2	0.3	0.3		0.08
3	0.3	0.8	0.03
12	0.8	3.0	0.03
. 16	0.8	0.3
- 17	0.3	0.3
24	0.3	0.3
27	0.3
34
76
46

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67-121-Komplex ' Candicidin

72 Std.

Aspergillus niger - 7.5 7.5

Trichophyton rnentagrophytes 17 7.5 25

Triehophyton rnentagrophytes IA 3.O ■ 17.5

Trichophyton Soudanese 2 7.5 · 25. Trichophyton - 16 Stämme

(12 Spezies) 5.O
Micrösporum - 6 Stämme

(6 Spezies) 5.O

Micrösporum distortum 5.0
Phialophora (2 Stämme)' .5.0

B) Fungizide In-vivo-Aktivität

Die In-vivo-Schutzwirkung der Antibiotikum-Produkte "bei Mäusen (Carworth farm CF 1-Mäuse, Gewicht je etwa 20 gj gegen Candida albicans wurde bestimmt. Das Antibiotikum wurde auf dem genannten Weg in einem wässrigen Träger, der 0,5$ Carboxymethylcellulose enthielt, in zwei Dosen verabreicht. Eine Dosis wurde kurz vor der intravenösen Infizierung mit einer letalen Dosis von Candida albicans und die andere Dosis 4 Stunden nach der Infizierung verabreicht. Die meisten ungeschützten Yergleichstiere starben innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der Infizierung. Die Überlebendrate wurde nach Ablauf von 24 und 48 Stunden bestimmt, und hieraus wurden nach Standardmethoden die SD₅₀-Werte (schützende Dosis 50) bestimmt.

Die für den Antibiotikum-67-121-Komplex ermittelten Werte sind in Tabelle 5 zusammen mit den Werten für Candicidin (für Vergleichszwecke) genannt. Die SD^Q-Werte wurden an den überlebenden Tiere 48 Stunden nach der Infizierung bestimmt.

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	1	Verab reichung	Tabelle 5	(mg/kg)	Kontrollen lebende) 24 Std.	(fo Über-
Test	2	subkutan oral	SD50	Candi- cidin	20	48 Std.
-	3	subkutan oral	Antibio- tikum- 67-121- Komplex	5 25.	50	20
4	subkutan	2,5 2,5	■l	0	16
	subkutan oral	5,0 2,5	25	20	0
15	2,5 40		20
1,5 1,5

Die SD_cn-Werte für die Antibiotika 67-121A, 67-121B und 67-121C unter Verwendung von Mäusen CF 1 -wurden im wesentlichen nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt, jedoch mit dem Unterschied, daß das Antibiotikum als Einzeldosis eine Stunde nach der Infizierung mit Candida albicans verabreicht wurde. λ

Die SDr-n-Werte wurden an den überlebenden Tieren 72 Stunden nach der Infizierung bestimmt. Von den unbehandelten infizierten Vergleichstieren starben 80$ innerhalb von 24 Stunden und 100$ innerhalb von 48 Stunden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt.

Tabelle 6

	Fungizide In-vivo-Aktivität	15,0 18,0	Antibiotikum 67-121C
Verab reichung			2,1 1,5
subkutan oral	SD50 (mg/kg)
Antibiotikum Antibiotikum 67-121A 67-121B
2,5 1,5

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C) Akute Toxizität

Die akute Toxizität des AntiMotikums-67-121 -Komplexes bei Mäusen wurde mit intraperitonealer (i.p,) und subkutaner (s.c.) Verabreichung bestimmt. Zum Vergleich wurden die Werte für Candicidin bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 7 genannt.

	Tabelle 7	Candicidin
	LD50 (mg/kg)	8-22 300
Verabreichung	Antibiotikum 67-121-Komplex
i.p. s.c.	5-15 300

In der gleichen Weise wurde in einer weiteren Versuchsreihe die akute Toxizität der Antibiotika 67-121A, 67-121B und 67-121C bei männlichen CF 1-Mäusen bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 8 genannt.

Tabelle 8 /

LD₅₀ (mg/kg)

Verabreichung	Antibiotikum	Antibiotikum	Antibiotikum
	67-121A	67-121B	67-121C
i.p.	2,4	6,0	6,0
s.c.	>50	>50	—
oral	>50	>50

Die neuen Antibiotika können im allgemeinen örtlich, oral oder parenteral in freier Form oder in Form eines geeigneten Derivats verabreicht werden. Vorzugsweise werden sie in Mischung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Hilfsstoff verabreicht.

Die bei jeder besonderen Dosierungsform zu verabreichende genaue Dosis hängt von Faktoren wie der Phase und Schwere der Infektion, der Empfindlichkeit des infizierenden Organismus gegenüber dem Antibiotikum und den

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individuellen Eigenschaften der zu "behandelnden Spezies ab. Ea kann jedoch gesagt werden, daß für die intravenöse Verabreichung der Antibiotika gemäß der Erfindung eine Menge von etwa 0,25 bis 1,5 mg/kg Körpergewicht pro Dosis angezeigt ist. Für die orale Verabreichung würde eine Dosis im Bereich von 5 bis 50 mg angezeigt sein. Bei diesen Behandlungen würde die Einzeldosis einmal bis viermal täglich verabreicht. Örtlich anzuwendende Zubereitungen würden gewöhnlich in Form von Cremes,' Salben, Pulvern oder Vaginalsuppositorien verabreicht. Als orale Zubereitungen kommen Elixiere, Tabletten, Kapseln u.dgl. in Frage.

Beispiele

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erläutert. Beispiel 1 beschreibt die Kultivierung von Actinoplanes caeruleus (speziell wurde der Stamm NRRL 5325 verwendet) und die Herstellung des Antibiotikums-67-121-Komplexes. Die Beispiele 2 bis 5 beschreiben die Isolierung und Reinigung des 67-121-Komplexes. Beispiel 6 beschreibt die Trennung des 67-121-Komplexes in die ihn bildenden Antibiotika, und die Beispiele 7 und 8 veranschaulichen die Herstellung bestimmter Derivate vom Antibiotikum 67-121C, und die restlichen Beispiele beschreiben Zubereitungen, die bestimmte antibiotiache Produkte enthalten.

Beispiel 1

Kultivierung von Actinoplanes caeruleus und Herstellung

des Antibiotikum-67-121-Komplexes

A) Gewinnung von Impfmaterial

Man gibt je eine Impfnadelmenge (z.B. etwa 0,5 ml) einer Kultur von Actinoplanes caeruleus aus einem Schrägagar-Röhrchen in eine Reihe von 300 ml-Erlenmeyerkolben, die 100 ml eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:

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	2509782	g
3,0	g
5,0	g
5,0	g
24,0	g
1,0	g
2,0	1000 ml

Rindfleischextrakt

Hefeextrakt

Tryptose

Lösliche Stärke

Dextrose

Calciumcarbonat

Leitungswasser

Man "bebrütet den Inhalt der Kolben unter Bewegung auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 250 bis 300 UpM etwa 48 Stunden bei etwa 35°C.

B) Kultivierung und Produktion des Antibiotikums

Man überführt unter aseptischen Bedingungen je 5 ml des in der Stufe (A) gewonnenen Impfmaterials in eine Reihe von 500 ml-Erlenmeyerkolben, die 100 ml eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Sojabohnenmehl 30 g

Dextrose 40 g

Calciumcarbonat 10 g

Leitungswasser 1000 ml

Man kultiviert aerob unter submersen Bedingungen durch Fermentation des Inhalts der Kolben für 3 bis 4 Tage bei etwa 28 C unter drehender Bewegung bei etwa 300 UpM.

Ungefähr nach den ersten 2 4 Stunden werden Proben periodisch von den fermentierten Medien genommen und auf ihre antibiotische Aktivität getestet, so daß die Spitzenprodukten, d.h. die Phase, bei der die antibiotische Aktivität der fermentierten Medien einen Spitzenwert erreicht, festgestellt werden kann. Wenn die Fermentation effektiv beendet ist, was durch die Spitzenproduktion angezeigt wird, kann der Inhalt für die anschliesaende Isolierung des antibiotisch aktiven Produkts zweckmäßig vereinigt werden.

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Die vorstehend beschriebene Fermentation kann auch unter Verwendung anderer geeigneter Medien, z.B. der folgenden Medien durchgeführt werden:

a) Hefeextrakt 5g . Caseinhydrl^lysat 5 g Dextrose 10 g Lösliche- Stärke 20 g Calciumcarbonat 4 g Leitungswasser 1000 ml

b) Sojabohnenmehl 30 g

Getrocknete Feststoffe

von Maisquellwasser 5 g

Stärke 20 g

Dextrose , 10 g

Calciumcarbonat 7 g

Leitungswasser 1000 ml

Beispiel 2 Isolierung des Antibiotikum-67-121-Komplexes

Man säuert das bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch erhaltene Kulturmedium mit einer Mineralsäure, z.B. Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von 2,5 bis 4,0 an. Man gibt ein geeignetes Filterhilfsmittel zu (von der Anmelderin wurde speziell das Produkt der Handelsbezeichnung "Hyflo-supercel", eine rieselfähige Diatomeenerde der Firma Johns Manville Co., USA, verwendet) und extrahiert den erhaltenen Filterkuchen wiederholt mit n-Butanol, bis der Filterkuchen im wesentlichen frei von antibiotischem Material ist. Man vereinigt die n-Butanolextrakte und dampft unter vermindertem Druck auf einen Rückstand ein. Man verreibt den Rückstand mit einem Gemisch aus gleichen Raumteilen Diäthyläther und Aceton, filtriert, verreibt den Rückstand erneut mit Diäthyläther, filtriert erneut und trocknet dann den erhaltenen Rückstand unter vermindertem Druck. Der erhaltene Antibiotikum-121-Kom-

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plex ist im allgemeinen ein grüngelbes Pulver, dessen Testung bei dem oben genannten Zylindertest 1000 ng/mg als Candicidin oder 200 lig/mg als Antibiotikum~67-121-Komplex ergibt.

Beispiel 3

Alternative Isolierungsmethode für den Antibiotikum-67-121-Komplex

Man behandelt das Kulturmedium auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise, bis ein Filterkuchen erhalten wird, und wäscht diesen Kuchen zur Entfernung des größten Teils des Wassers mit Aceton<, Man extrahiert den Filterkuchen mit einem Gemisch, das aus beiden Phasen eines Gemisches von Chloroform, Methanol und V/asser im VoIumenverhältnis von 18:16:1 besteht, bis der Filterkuchen im wesentlichen frei von Antibiotikum ist. Man vereinigt die Extrakte, trennt die flüssigen Phasen ab, verwirft die wässrige Phase und dampft dann die organische Phase auf einen Rückstand ein, der aus rohem Antibiotikum-67-121-Komplex besteht, dessen Testung etwa 250 /Ug/mg ergibt.

Beispiel 4

Weiteres Verfahren zur Isolierung des Antibiotikum-67-121-Komplexes

Man säuert 1 1 des bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch erhaltenen Kulturmediums mit einer Mineralsäure, z.B. Salzsäure, auf einen pH-Wert von etwa 3,5 an. Man extrahiert das angesäuerte Kulturmedium zweimal mit je 2 1 Butanol, das mit Wasser gesätf.t ist. Man dampft die vereinigten Extrakte auf einen Rückstand ein und löst dann den Rückstand in der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 2:2:1. Man trocknet die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert. Man gießt die getrocknete lösung in ein Gemisch von Diäthyläther und

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Hexan im Voluraenverhältnis von 6:4, während man das Gemisch kräftig rührt. Man filtriert und trocknet die erhaltene gelbbraune Fällung, die aus dem rohen Antibiotikum-67-121-komplex besteht (Ergebnis der Testung etwa 250 >ug/mg). Von der Anmelderin wurde eine Ausbeute von 940 mg Produkt erhalten.

Beispiel 5 Reinigung des Antibiotikum-Komplexes

Man löst 3,9 g des auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise erhaltenen Antibiotikum-Komplexes in der unteren Phase eines Cbloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (2:2:1). Man filtriert die unlöslichen Bestandteile ab und gibt das Filtrat zu wasserfreiem Diäthyläther. Man filtriert die gebildete gelbe Fällung ab, wäscht mehrmals mit Diäthyläther und löst erneut in der oberen Phase des gleichen Systems. Man filtriert die unlöslichen Bestandteile unter vermindertem Druck ab. Während der Filtration bildet sich im Filtrat eine Fällung, die abfiltriert, dreimal bis viermal mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet wird. Eine Ausbeute von 410 Dig wird erhalten. Die Testung des Materials ergibt eine Wirksamkeit von etwa 1000 /Ug/mg, gerechnet als Antibiotikum 67-121.

Beispiel 6 Trennung des Antibiotikum-Komplexes in seine Komponenten

In eine Säule von 5 cm Durchmesser gibt man 800 g chromatographisches Kieselgel, worauf man unter Verwendung der unteren Phase eines frisch hergestellten Gemisches von Chloroform, Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 2:2:1) als Elutionsmittel 4,6 g des beispielsweise nach dem Verfahren von Beispiel 3 erhaltenen Antibiotikum-67-121-Komplexes eluiert.

Man überwacht das Erscheinen der Komponenten des Antibiotikums, indem man Proben von den aufgefangenen Frak-

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tionen nimmt und die Proben der Dünnschichtchromatographie unterwirft oder nach einer anderen geeigneten Methode analysiert. Man vereinigt die Eluatfraktionen, die jede Antibiotikumfraktion enthält, und engt ein, wobei man die einzelnen Antibiotikumfraktionen erhält. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Antibiotikum- R_f . Gewicht Schmels- ßijjw (0,3* Komponente g punkt,0C ' _{Dimetnylforina}_

__ mid

67-121A 0,17 0,262 185-190* +161,6

67-121B 0,14 0,260 175-182* +199,7

67-1210 0,11 1,640 175-180* +143,8

67-121D 0,07 Spur

* = Zers.

Beispiel 7 Herstellung des Methylesters von Antibiotikum 67-1210

Man löst 5 g Antibiotikum 67-1210 in 150 ml Dimethylsulfoxyd und 15 ml Methanol. Man kühlt die Lösung auf etwa 5⁰C und gibt 0,5 g Diazomethan in 30 ml Tetrahydrofuran zu. Man läßt die Reaktion 10 Minuten vonstatten gehen und gießt die Lösung dann in 10 Raumteile Diäthyläther, der kräftig gerührt wird. Man isoliert das Produkt durch Filtration oder Zentrifugieren und wäscht mit frischem Diäthyläther. Man löst die Fällung in der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 2:2:1) und chromatographiert an 500 g Kieselgel· unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches, wobei man 1,1 g der gewünschten Verbindung mit foigenden Kennzahlen erhält:

Schmelzpunkt 180-183°C

Elementaranalyse: 0 = 56,30*, H = 7,21*, N = 1,84* ^•η,ο,τ (3-ⁿ Tetrahydrofuran-Wasser-Gemisch, Volumenver- · hältnis 4:1): 409 m-'u (%]f_cm = 650) 385

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S (Hexadeuterodimetbylsulfoxyd) 3,4 ppm (3H, Singlett, COOOiU ).

3'

Wenn bei dem im vorstehenden Beispiel beschriebenen Versuch eine äquivalente Menge von Antibiotikum 67-121A oder Antibiotikum 67-121B an Stelle von Antibiotikum 67-1210 verwendet und in der gleichen Weise gearbeitet wird, können die Methylester der jeweiligen Antibiotika hergestellt werden. Ebenso können andere Veresterungsmittel verwendet werden, um andere niedere Alkylester, z.B. den Äthylester, Propylester, Isopropylester oder Butylester, herzustellen.

Beispiel 8

Herstellung des Methylesterhydrochlorids von Antibiotikuffl 67-1210

Man löst 1,3 g Methylester von Antibiotikum 67-1210 (hergestellt auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise) in einem Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser (Volumenverhältnis 4:1) und kühlt auf etwa 10⁰C. Man gibt 10 ml 0,1n-Salzsäure zur Lösung, engt auf einen Rückstand ein, löst erneut in Wasser und unterwirft der Gefriertrocknung, wobei man 1,1 g Antibiotikum-67-1210-Methylesterhydrochlorid mit folgenden Kennzahlen erhält :

Schmelzpunkt 170-180⁰O (Zers.)
\no-v (ⁱⁿ Tetrahydrofuran-Wasser-Gemisch, Volumenver-

JilcäX λ _c-f

hältnis 4:1): 408 mu (E''° = 750), 384 mn

I I CuI /

(E^_cm = 970), 363 nm (~&]^_Gm = 580). Ein Chlorgehalt von 2,20 Gew.-^ wurde gefunden.

Wenn bei dem vorstehend beschriebenen Versuch die Salzsäure durch eine äquivalente Menge anderer Säuren, vorzugsweise Mineralsäuren, ersetzt wird, können die jeweiligen Säureadditionssalze hergestellt werden. Als Beispiele solcher Säuren sind Schwefelsäure, Phosphor-

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säure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Essigsäure, Propionsäure Isobuttersäu^re, Maleinsäure, Oxalsäure, Phenylessigsäure und Methansulfonsäure zu nennen.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige Dosierungsformen, in denen die antibiotischen Produkte gemäß der Erfindung und ihre Derivate verwendet werden können.

Beispiel 9 Tabletten

Antibiotikum-^-121-Komplex Lactose U.S.P.

Maisstärke

Polyvinylpyrrolidon Natriumlaurylsulfat Magnesiumstearat

Wasser nach Bedarf (verdampft)

250,00 250,00

Verfahren (Trockengranulierverfahren):

Man mischt den Antibiotikum-67-121-Komplex mit der gleichen Menge Lactose, rührt den Rest der Lactose und anschließend die übrigen Bestandteile ein und preßt dann zu Tabletten.

Beispiel 10 Kapseln ( 5 mg-Kapseln)

mg/Kapsel

Antibiotikum-67-121-Komplex 5,00

Lactose U.S.P. Ι8θ,75

Magnesiumstearat 1,25

Maisstärke 46,00

Natriumlaurylsulfat 12,00

Wasser nach Bedarf (verdampft) 5,00

250,00

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mg/Tablette	mg/Tablette
5,00	25,00
164,25	144,25
50,00	50,00
12,50	12,50
12,00	12,00
1,25	1,25
5,00	5,00

Verfahren (Trockengranulierverfahren):

Man mischt das Antibiotikum 67-121 mit der gleichen Menge Lactose, rührt den Rest der Lactose und anschließend die übrigen Bestandteile ein und füllt dann in Kapseln.

Beispiel 11

Lösung für intravenöse Injektion (als steriles gefriergetrocknetes Pulver geliefert)

mg/Ampulle

Antibiotikum-67-121-Komplex ²K),0 - 60,0

Natriumdesoxycholat 70,0

Zweibasisches Na.triumphosphat 16,0

(wasserfrei)

Einbasisches Natriumphosphat 9,0

(wasserfrei)

Verfahren ' . -

Man stellt ein steriles gefriergetrocknetes Pulver unter Verwendung der vorstehend genannten Bestandteile her.

Zur Verwendung als Injektionslösung wird mit sterilem Wasser gelöst und zur Verwendung für Infusionen mit einer 5#igen Dextrose-Injektionslösung (U.S.P.) mit einem pH-Wert von mehr als 4-,5 weiter verdünnt.

Beispiel 12 Salbe für örtliche Anwendung

Antibiotikum-67-l21-Komplex 30 g

Petrolatum 970 g

1000 g

Verfahren

1) Man schmilzt das Petrolatum.

2) Man schlämmt den Antibiotikum-67-121-Komplex mit etwa 10^ des Petrolatums auf und gibt durch eine Kolloidmühle.

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Man mischt die gemahlene Aufschlämmung'mit dem Rest des geschmolzenen Petrolatums und läßt abkühlen.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Als Antibiotikum-67-121 -Komplex "bezeichneter Polyen-Äntibiotikum-Komplex in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Derivats.

   2. Als Antibiotikuni-67-121-Komplex bezeichneter, in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Derivats vorliegender Polyen-Antibiotikum-Komplex, der in freier Form im wesentlichen die folgenden Kennzeichen hat: UV-Absorptionsmaxima in Methanol "bei 342, 363, 382 und 403 mu mit entsprechenden έΛ-

   / , I CIu

   Werten von 340, 475, 667 und 605, IR-Absorptionsmaxima in Mineralöl bei 3350, 1725 und 1665 cm und kernmagnetischen Resonanzspektren in Ilexadeuterodimethyl— sulfoxyd mit Maxima bei 2,75, 6,56 und 7,64 ppm.

   3. Polyen-Antibiotikum, das eine Komponente des Komplexes

   ist

   nach Anspruch 1 oder 2 /und aus der aus Polyen-Antibiotika mit der Bezeichnung Antibiotikum 67-121A, 67-121B, 67-121C und 67-121D bestehenden Gruppe ausgewählt ist, in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Derivats. :

   4. Polyen-Antibiotikum, das die Bezeichnung 67-121A und in freier Form im wesentlichen die folgenden Kennzeichen hat: UV-Absorptionsmaxima in einem 4i1-Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser bei 408, 384 und 363 mu mit entsprechenden E./ -Werten von 950, 1100 und 680,

   I GHl

   IR-Absorptionsmaxima in Mineralöl bei 3350, 1725 und 1665 cm~ und ein kernmagnetisches Resonanzspektrum in Hexadeuteroäimethylsulfoxyd mit Maxima bei 2,73, 6,55 und 7,64 ppm, wobei das Antibiotikum 67-121A in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch unbedenlichen Derivats vorliegt.

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   5. Polyen-Antibiotikum mit der Bezeichnung 67-12133 und im wesentlichen den folgenden Kennzeichen in freier Form: UV-Absorptionsmaxima in einem 4:1-Gemiseh von Tetrahydrofuran und Wasser bei 4o8, 383 und 362 mu mit entsprechen-

   1 oi /

   den Ej£_m-Werten von 620, 750 und 490, IR-Absorptions-

   maxima in Mineralöl bei 3350, 1725 und I665 cm" und ein kernmagnetisches Resonanzspektrum in Hexadeuterodimethylsulfoxyd mit Maxima bei 6,58 und 7*60 ppm, wobei das Antibiotikum 67-121B in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Derivats vorliegt.

   6. Polyen-Antibiotikum mit der Bezeichnung 67-121C und

   im wesentlichen den folgenden Kennzeichen in freier Form: UV-Absorptionsmaxima in einem 4:1-Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser bei 4o8, 383 und 362 mu mit entsprechen-

   den E^ -Werten von 800, 910 und 600, IR-Absorptions-

   maxima in Mineralöl bei 3350, I725 und I665 cm" und ein kernmagnetisches Resonanzspektrum in Hexadeuter-odimethylsulfoxyd mit Maxima bei 2,76, 6,57 und 7*65 ppm, wobei das Antibiotikum 67-121C in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Derivats vorliegt.

   7· Polyen-Antibiotika nach Anspruch 4 bis 6, weiter gekennzeichnet als Antibiotikum der Heptaen-Untergruppe II gemäß der hier gegebenen Definition und durch eine aromatische Komponente der Formel

   RHN-^V \\ C-CH₂- CH

   in der R bei den Antibiotika 67-121A und C ein Methylrest und beim Antibiotikum 67-121B Wasserstoff ist.

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   8. Polyen-Antibiotikum nach Anspruch 7, weiter dadurch gekennzeichnet, daß in den Antibiotika 67-121A und 67-121B eine D-Mycosaminzuckereinheit, die glykosidisch an eine allylische Hydroxylgruppe der Aglyconstruktur gebunden ist, und im Antibiotikum 67-12IC die Disaccharideinheit _i/Ö-ß-D-Mannopyranosyl(l,4)-D-mycosami_>n7_i die glykosidisch an eine allylische Hydroxylgruppe der Aglyconstruktur gebunden ist, vorhanden ist.

   9. Polyen-Antibiotika nach Anspruch 1 bis 8 in Form von pharmazeutisch unbedenklichen Derivaten.

   10. Polyen-Antibiotika nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch unbedenkliche Derivat ein Ester ist.

   11. Polyen-Antibiotika nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester ein niederer Alkylester ist.

   12. Polyen-Antibiotika nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester ein Methylester ist.

   IJ. Polyen-Antibiotika nach Anspruch 9 bis 12 in Form von Säureadditionssalzen.

   14. Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes für die Produktion eines als Antibiotikum-67-121-Komplex bezeichneten Polyen-Antibiotikum-Komplexes oder der als Komponenten darin enthaltenen Antibiotika.

   15· .Verfahren' zur Herstellung eines als Antibiotikum-67-121-Komplex bezeichneten Polyen-Antibiotikum-Komplexes oder der als Komponenten darin enthaltenen Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, daß man einen den Antibiotikum-67-121-Komplex oder dessen Komponenten bildenden Mikroorganismus der Gattung Actinoplanes in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis dem Medium eine hohe antibiotische Aktivität verliehen worden ist.

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   16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Spezies Actinoplanes caeruleus gehörenden Mikroorganismus verwendet.

   17. Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den als NRRL 5325 bezeichneten Stamm verwendet.

   18. Verfahren nach Anspruch 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung unter submersen aeroben

   Bedingungen durchführt.

   19. Verfahren nach Anspruch 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einer über 25°C, aber unter 45 C liegenden Temperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur von 26° bis J57^PC durchführt ■.

   20. Verfahren nach Anspruch 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 durchführt.

   21. Verfahren nach Anspruch 15 bis 20, weiter dadurch gekennzeichnet, daß/aus dem Kulturmedium den gebildeten Antibiotikum-67-121-Komplex oder eine Komponente dieses Komplexes in freier Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Derivats isoliert.

   22. Verfahren nach Anspruch 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung durch Einstellung des pH-Werts des Kulturmediums auf 2,5 bis 4,0 und anschließende Extraktion des antibiotisch aktiven Produkts aus dem Mycel mit Hilfe von Lösungsmittelextraktionsverfahren vornimmt.

   25. Verfahren nach Anspruch 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit einem mit Wasser nicht oder schlecht mischbaren organischen Lösungsmittel durchführt.

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   24. Verfahren nach Anspruch 15 bis 23> dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel n-Butanol verwendet.

   25· Verfahren nach Anspruch 21 bis 24, gekennzeichnet durch die weitere Maßnahme der Trennung des gebildeten Anribiotikum-67-121-Komplexes in die als Komponenten darin enthaltenen Antibiotika.

   26. Verfahren nach Anspruch 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung auf chromatographischem Wege durchführt.

   27· Verfahren nach Anspruch 21 bis 2.6, dadurch gekennzeichnet, daß man das antibiotisch aktive Produkt in freier Form isoliert.

   28. Verfahren nach Anspruch 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man das antibiotisch aktive Produkt vor oder nach der Isolierung in ein pharmazeutisch unbedenkliches Derivat umwandelt.

   29. Arzneimittelzubereitungen, enthaltend als aktives Ingrediens eine antibiotische Substanz nach Anspruch 1 bis 13 in Verbindung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger.

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