DE3308030C2 - Tierische Interferone - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft tierische Interferone, ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von DNA, die für tierisches Interferon kodiert, die auf diese Weise erhältliche DNA und deren Verwendung zur Herstellung von tierischem Interferon durch rekombinante DNA-Technik.

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Ermittlung der eine Reihe von Rinder-α-Interferonen kodierenden DNA-Sequenz und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz. Diese DNA-Sequenz schließt die entsprechenden 3′- und 5′-flankierenden Sequenzen ein, die die in vitro-Verknüpfung in Expressionsträgern erleichtert. Diese Befunde ermöglichen wiederum die Entwicklung von Mitteln zur Herstellung von ausreichenden Mengen an tierischen Interferonen mittels rekombinanter DNA-Technik, so daß die Bestimmung von deren biochemischen Eigenschaften und biologischen Aktivitäten möglich wird und diese Produkte großtechnisch und biologisch angewandt werden können.

In der WO 80/02375 werden tierische Interferone aus induzierten Leukocyten angereichert und soweit gereinigt, daß das Inter­ feronpräparat beim Menschen keine Antigenreaktion hervorruft. Die US-PS 4 262 090 offenbart die Gewinnung angereicherter mRNA für die Herstellung verschiedener Interferone von tierischer oder menschlicher Herkunft.

Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien, die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind am Ende der Beschreibung aufgelistet. In der Beschreibung selbst wird auf die Nummern dieser Druckschriftenliste verwiesen.

A. Tierische Interferone

Interferonkomponenten wurden aus Geweben verschiedener Spezies gewonnen, die stammesgeschichtlich niedriger als der Mensch ein­ zuordnen sind (1, 2, 3). Durch Aktivitätsuntersuchungen an diesen Interferonen ließen sich unterschiedliche Grade an antiviraler Wirksamkeit beim jeweiligen Wirtstiernachweisen (3, 4, 5, 6). Es wurde auch nachgewiesen, daß diese Interferone nicht immer speziesspezifisch sind. Beispielsweise weisen Präparate von aus Geweben isolierten Rinderinterferonen eine antivirale Wirkung beim Affen und bei menschlichen Zellen auf (7). In ähnlicher Weise haben sich Humaninterferone als aktiv in verschiedenen Zellen von stammesgeschichtlich niedrigeren Spezies erwiesen (7).

Diese Speziesinteraktivität ist zweifellos darauf zurückzufüh­ ren, daß unter den Interferonen sowohl in bezug auf Amino­ säurezusammensetzung als auch Aminosäuresequenz ein hohes Maß an homologer Konservierung besteht. Jedoch blieb diese Er­ klärung bisher rein theoretisch, da Mengen und Reinheitsgrade von zur Verfügung stehenden tierischen Interferonen nicht aus­ reichten, jeden Zweifel ausschließende Versuche in bezug auf die Charakterisierung und biologischen Eigenschaften der ge­ reinigten Komponenten im Vergleich zu verschiedenen mensch­ lichen Gegenstücken durchzuführen (8, 9, 10, 11, 12).

Trotz dieser geringen Mengen und Reinheitsgrade wurde ein kausaler Zusammenhang zwischen Interferon und der antiviralen Aktivität beim erforderlichen Wirtstier festgestellt. Somit besteht ein Bedarf an der Herstellung von tierischen Interfero­ nen in hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden, um biologische Tier­ versuche einzuleiten und erfolgreich durchzuführen, die das Ziel haben, die Behandlung von Tieren gegen virale Infektionen und gegen maligne oder durch eine Immunosuppression oder ein Immunodefizit geprägte Zustände zu ermöglichen. Ferner ist durch die Herstellung von isolierten tierischen Interferonen eine Charakterisierung der physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser Produkte möglich, was eine Grundlage zu ihrer Einordnung und anschließende vergleichende Untersuchungen mit den menschlichen Gegenstücken bietet (8 bis 20).

Die bisher mit tierischen Interferonen durchgeführten Unter­ suchungen waren aufgrund der zur Verfügung stehenden, sehr ge­ ringen Substanzmengen auf relativ unreine Präparate beschränkt. Jedoch lassen diese Untersuchungen Schlüsse auf wichtige bio­ logische Funktionen zu. Diese Klasse von tierischen Interferonen besitzt nicht nur eine starke therapeutische antivirale Wirkung, sondern wirkt vermutlich auch als prophylaktischer Hilfsstoff bei der Verab­ reichung von Vaccinen und/oder bei antibiotischer Behandlung, wodurch es zu einem vielversprechenden potentiellen Wirkstoff für klinische Zwecke wird.

Man nahm an, daß die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen größeren Mengen an tierischen Interferonen darstellt. Unabhängig davon, ob die auf diese Weise hergestellten Materialien die Glycosylierung, die als charakteristisch für natives Material gilt, umfaßt oder nicht, ist anzunehmen, daß diese Materi­ alien biologisch aktiv sind und klinisch bei der Behandlung verschiedenster viraler, neoplastischer und immunosuppressiver Zustände oder Krankheiten eingesetzt werden können.

B. Rekombinante DNA-Technik

Die rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine erhebliche Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ leicht zu rekombinieren und neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben fähig sind. Es stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Verknüpfung von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven Enden zur Verfügung, die zur Bildung von lei­ stungsfähigen Expressionsträgern führen, mit denen spezielle Organismen transformiert werden können, so daß deren Synthese­ leistung in wirksamer Weise auf das gewünschte exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieser Weg jedoch recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fort­ geschritten, daß regelmäßig Vorhersagen über die Erfolgsaus­ sichten gemacht werden können. Versucht man, Erfolge ohne ent­ sprechende experimentelle Basis vorherzusagen, so läuft man Gefahr zu scheitern.

Plasmide, d. h. außerchromosomale Schleifen von doppelsträngiger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, die häufig in mehreren Kopien pro Zelle vorkommen, stellen ein Grundelement der re­ kombinanten DNA-Technik dar. Die in die Plasmid-DNA einkodierte Information umfaßt die Information, die erforderlich ist, das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d. h. Ursprung der Replikation = origin) und im allgemeinen eine oder mehrere phenotypische Selektionseigenschaften, wie im Fall von Bak­ terienresistenz gegenüber Antibiotika, die die Erkennung und bevorzugte Züchtung in selektiven Medien von Klonen der das betreffende Plasmid enthaltenden Wirtszelle erlauben. Der Wert von Plasmiden liegt darin, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktionsendonuclease oder "Restriktions­ enzym", die jeweils unterschiedliche Stellen der Plasmid-DNA erkennen, gespalten werden können. Anschließend können heterolo­ ge Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingesetzt werden, indem man eine Endenverbindung an der Spaltungsstelle oder an rekon­ struierten Enden nahe der Spaltungsstelle durchführt. Somit werden sogenannte replizierbare Expressionsträger gebildet. Die DNA-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt, aber der entstandene "rekombinante" replizierbare Expressions­ träger oder Plasmid können in die Zellen nach einem als Trans­ formation bekannten Verfahren eingeführt werden und es lassen sich große Mengen des rekombinanten Trägers durch Züchtung des Transformanten erhalten. Wird ferner das Gen in geeigneter Weise in bezug auf die Bereiche des Plasmids eingesetzt, die die Trans­ kription oder Translation der einkodierten DNA-Botschaft steuern, so kann der erhaltene Expressionsträger zur tatsächlichen Bil­ dung der Polypeptidsequenz, die durch das eingesetzte Gen ko­ diert wird, verwendet werden; ein Vorgang, der als Expression bezeichnet wird.

Die Expression wird in einem als Promotor bekannten Bereich, der durch RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird, initiiert. In der Transkriptionsphase der Expression erfolgt eine Ent­ windung der DNA, wobei sie eine Schablone für die initiierte Synthese von messenger-RNA aus der DNA-Sequenz wird. Die messenger-RNA wird wiederum in ein Polypeptid mit der durch die mRNA kodierten Aminosäuresequenz übersetzt. Jede Amino­ säure wird durch ein Nucleotidtriplett oder "codon" kodiert, die zusammen das "Strukturgen" bilden, d. h. den Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Polypeptidprodukts kodiert. Die Translation wird durch ein Startsignal (im allgemeinen ATG, das in der erhaltenen messenger-RNA zu AUG wird) initi­ iert. Sogenannte Stop-Kodons definieren das Ende der Trans­ lation und daher der Bildung von weiteren Aminosäureeinheiten. Das erhaltene Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirtszelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Pro­ dukts durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen er­ halten werden.

In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypeptiden - sogenannte direkte Expression - oder zur Expression eines hete­ rologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der Aminosäure­ sequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen ist. In den letztgenannten Fällen wird das gewünschte bioaktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird (21, 22).

C. Zellkulturtechnik

Zell- oder Gewebekulturen sind für kinetische und zellphysio­ logische Untersuchungen gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von permanenten Zellinien, die durch successive Serienübertragungen von isolierten normalen Zellen hergestellt werden, stehen zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden der­ artige Zellinien auf einem festen Träger in einem flüssigen Me­ dium gehalten oder in Suspensionen mit einem Gehalt an unter­ stützenden Nährstoffen gezüchtet. Eine Vergrößerung des Her­ stellungsmaßstabs zur Herstellung von großen Präparatemengen scheint nur eine Frage der mechanischen Möglichkeiten zu sein (vgl. 23, 24).

Aufgabe der Erfindung ist es, Peptide mit der Aminosäuresequenz von tierischen Interferonen und dafür kodierende DNA zur Ver­ fügung zu stellen.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß die rekombinante DNA-Technik mit Erfolg zur Herstellung von tierischen Inter­ feronen verwendet werden kann, vorzugsweise in direkter Form und in Mengen, die ausreichen, klinische Untersuchungen, die Vorbedingungen für eine Marktzulassung sind, zu initiieren und durchzuführen. Das Produkt eignet sich für alle Formen der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Tieren, insbesondere bei viralen Infektionen und malignen Zuständen sowie Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit. Seine Formen umfassen verschiedene mögliche oligomere Formen, die assoziierte Glycosylierung einschließen können, sowie allele Variationen von individuellen Bestandteilen oder Familienein­ heiten. Die Produkte werden durch gentechnisch manipulierte Mikroorganismen oder Zellkultursysteme gebildet. Somit besteht nun die Möglichkeit, tierische Interferone wirkungsvoller als bisher herzustellen und zu isolieren. Ein wesentlicher Faktor der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besteht darin, daß es gelungen ist, einen Mikroorganismus oder eine Zell­ kultur genetisch so zu dirigieren, daß sie veranlaßt werden, tierisches Interferon, insbesondere Rinderinterferon, die von der Wirtszelle in reifer Form ausgeschieden werden, in iso­ lierbaren Mengen zu bilden.

In bestimmten Wirtssystemen können Vektoren zur Bildung des gewünschten tierischen Interferons, das aus der Wirtszelle in reifer Form sekretiert wird, gebildet werden. Interferon, das die vom 5′-flankierenden Bereich des entsprechenden Gens abge­ leitete Signalsequenz enthält, wird vermutlich zur Zellwand des Wirtsorganismus transportiert, wo zur Unterstützung dieses Transports das Signalprotein während des Sekretionsvorgangs des reifen Interferonprodukts abgespalten wird. Dies ermöglicht die Isolierung und Reinigung des gewünschten reifen Interferons, ohne daß man Verfahren zu Hilfe nehmen muß, die dazu bestimmt sind, Verunreinigungen an intrazellulärem Wirtsprotein oder Zellbruchstücken zu beseitigen.

Gegenstand der Erfindung sind:

• - das in Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren zur Identifi­ zierung und Isolierung von DNA, die für ein Interferon einer Tierspezies kodiert, oder Fragmenten davon;
• - die nach diesem Verfahren erhältliche DNA (Anspruch 3);
• - deren Verwendung zur Herstellung eines tierischen Inter­ ferons durch rekombinante DNA-Technik gemäß Anspruch 4;
• - die tierischen Interferone gemäß Anspruch 6.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Rinderinterferon, das für die Klasse der hier in Betracht kommen­ den tierischen Interferone repräsentativ ist. Vorzugsweise wird dieses Rinderinterferon durch direkte Expression in reifer Form gebildet.

Der hier verwendete Ausdruck "reifes tierisches Interferon" bezieht sich auf die durch Mikroorganismen oder Zellkulturen bewerkstelligte Herstellung von tierischen Interferonen, die nicht vom Signalpeptid oder Präsequenzpeptid, das unmittelbar für die Translation der tierischen Interferon-mRNA sorgt, be­ gleitet ist. Somit wird erfindungsgemäß reifes tierisches Interferon zur Verfügung gestellt, das Methionin als erste Aminosäure (vorhanden aufgrund der Insertion des ATG-Startsig­ nalkodons vor dem Strukturgen) oder, wenn das Methionin intra- oder extrazellulär abgespalten ist, seine üblicherweise erste Aminosäure aufweist. Demgemäß kann reifes tierisches Inter­ feron auch zusammen mit einem konjugierten Protein, das sich vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheidet, hergestellt werden, wobei das Konjugat spezifisch in einer intra- oder extrazellulären Umgebung abspaltbar ist (21). Schließlich kann das reife tierische Interferon durch direkte Expression ohne die Notwendigkeit einer Abspaltung von fremden, überflüssigen Polypeptiden hergestellt werden. Dies ist von besonderer Be­ deutung, wenn ein bestimmter Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam genug entfernen kann, sofern der Expressions­ träger so gebaut ist, daß er die Expression von reifem Human­ interferon zusammen mit dessen Signalpeptid bewirkt. Das auf diese Weise hergestellte reife Interferon wird gewonnen und so weit gereinigt, daß es als Wirkstoff bei der Behandlung von viralen und malignen Zuständen sowie bei Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit geeignet ist.

Abgesehen von der Tatsache, daß tierische Interferone endogene Produkte des tierischen Organismus sind, ist ihre Nomenklatur analog zu Humaninterferonen; man unterscheidet also tierisches α-Interferon (Leukozyteninterferon), β-Interferon (Fibroblasten­ interferon) und γ-Interferon (Immuninterferon). Alle diese 3 Interferonarten sind im Tierversuch identifiziert worden. Ferner weiß man ausgehend vom Beispiel des Rinds, daß die tierischen α-Interferone wie bei Humaninterferon aus einer Familie von Proteinen zusammengesetzt sind. Die bisher unter­ suchten Produkte weisen zu den entsprechenden Human-α-inter­ feronen einen niedrigeren Homologiegrad auf als diese tieri­ schen Interferone untereinander oder die Human-α-interferone untereinander. Ferner ist die Rinder-β-Reihe aus einer Pro­ teinfamilie zusammengesetzt, die sich vom menschlichen Produkt unterscheidet. Ferner werden erfindungsgemäß Interspezies- und Interfamilien-Hybridinterferone bereitgestellt, wobei man die gemeinsamen Restriktionsstellen innerhalb der Gene von ver­ schiedenen tierischen Interferonen ausnützt und die entspre­ chenden Bereiche nach bekannten Methoden rekombiniert (57).

Auf jeden Fall umfassen die tierischen Interferone der Erfin­ dung die Interferone, die normalerweise bei Tieren der Familien der Vögel, Rinder, Hunde, Pferde, Katzen, Ziegen, Schafe, Fische und Schweine endogen sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Interferone von Paarhufern, wie Rinder, Schafe und Ziegen. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Interferone finden Anwen­ dung als Antivirus- und Antitumormittel bei den entsprechenden Wirtstieren. Beispielsweise können Rinderinterferone prak­ tische Anwendung bei der Behandlung des Atmungskomplexes bei Rindern entweder zusammen mit an sich bekannten Antibiotika als therapeutische Komponente oder zusammen mit Vaccinen als prophylaktische Komponente finden. Die auf die vor­ stehende Weise demonstrierte Klassenverwertbarkeit erstreckt sich auch auf andere Rinder sowie Ziegen, Schafe, Schweine, Pfer­ de, Hunde, Katzen, Vögel und Fische. Bei Pferden, Hunden, Katzen und Vögeln läßt sich die Antitumorwirkung der ent­ sprechenden Interferone vermutlich besonders gut gewerblich ausnutzen.

Das folgende, anhand von Rinderinterferon als repräsentativer Klasse beschriebene Grundprinzip kann zur Herstellung der er­ findungsgemäßen tierischen Interferone angewandt werden:

• 1. Rindergewebe, beispielsweise Rinderpankreasgewebe, wird zu einem gefrorenem Pulver zerkleinert und zur Verdauung von RNA und Proteinmaterialien behandelt. Nach Fällung erhält man hochmolekulare Rinder-DNA.
• 2. Die hochmolekulare DNA wird teilweise verdaut, um sie in bezug auf die Genstelle willkürlich zu zerschneiden.
• 3. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden der Größenfraktionierung unter Bildung von Fragmenten mit 15 bis 20 Kilo­ basenpaaren (kbp) unterworfen.
• 4. Die in Stufe 3 erhaltenen Fragmente werden unter Verwen­ dung eines λ-Charon 30-Phagenvektors geklont.
• 5. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren werden in vitro auf infektiöse Phagenteilchen mit einem Gehalt an rDNA unter Bildung einer Phagenbibliothek gepackt. Diese wurde durch Vermehrung auf Bakterienzellen auf das etwa 10⁶-fache vergrößert. Die Phagen wurden bis zur praktischen Konfluenz auf einem Bakterienrasen ausgestrichen und zur Hybridisie­ rung mit einem radioaktiven Humaninterferon-Marker einem Screening unterworfen.
• 6. Aus den geeigneten Klonen wurde die entsprechende DNA iso­ liert. Von dieser wurde eine Restriktionskarte erstellt und eine Analyse durch Southern-Hybridisierung durchgeführt.
  Restriktionsfragmente mit einem Gehalt an Rinderinterferon­ genen wurden der Subklonierung in Plasmidträger unterworfen und sodann sequenziert.
• 7. Die sequenzierte DNA wurde dann in vitro zur Insertion in einen entsprechenden Expressionsträger zugeschnitten, der zur Transformierung einer entsprechenden Wirtszelle ver­ wendet wurde, die wiederum in einer Kultur gezüchtet wurde und die Expression des gewünschten Rinderinterferonprodukts durchführte.
• 8. Das auf diese Weise hergestellte Rinderinterferon weist in seiner reifen Form 166 Aminosäuren auf, wobei am Beginn Cystein steht und in der Präsequenz 23 Aminosäuren vorhan­ den sind. Es weist einen stark hydrophoben Charakter auf. Sein monomeres Molekulargewicht wurde mit etwa 21 409 be­ rechnet. Es weist ähnliche Eigenschaften wie Humanleuko­ zyteninterferone (8, 9, 10, 11) auf. Es wurde festgestellt, daß es zu etwa 60 Prozent homolog mit humanem Leukozyten­ interferon ist.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert A. Mikroorganismen/Zellkulturen 1. Bakterienstämme/Promotoren

Die hier wiedergegebenen Versuche bedienen sich unter anderem des Mikroorganismus E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi⁻, hsr⁻, _khsm⁺) (25). Dieser Stamm erhielt bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31446. Jedoch eignen sich auch verschiedene andere Mikroorganismenstämme, darunter bekannte E. coli-Stämme, wie E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31 537) E. coli W 3110 (F⁻, λ⁻, prototroph) (ATCC 27325), E. coli DP 50 SuPF (ATCC 39061, hinterlegt am 5. März 1982), E. coli JM83 (ATCC 39062, hinterlegt am 5. März 1982), sowie andere Mikroorganismenstämme, von denen viele bei anerkannten Hinterlegungsstellen hinterlegt und dort erhältlich sind, bei­ spielsweise bei der American Type Culture Collection (ATCC); vgl. den ATCC-Katalog und (26, 26a). Beispiele für andere Mikro­ organismen sind Bazillen, wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, von denen zum Beispiel Salmonella typhi­ murium und Serratia marcescens erwähnt seien, wobei Plasmide verwendet werden, die die darin enthaltenen heterologen Gen­ sequenzen replizieren und exprimieren können.

Zum Beispiel wurden β-Lactamase und Lactose-Promotorsysteme mit Erfolg zur Initiierung und Aufrechterhaltung der mikro­ biellen Bildung von heterologen Polypeptiden verwendet. Ein­ zelheiten zum Aufbau und zur Herstellung dieser Promotor­ systeme gehen aus (27) und (28) hervor. Kürzlich wurde ein System auf der Basis des Tryptophan-Operons entwickelt, das sogenannte trp-Promotorsystem. Einzelheiten bezüglich des Aufbaus und der Herstellung dieses Systems wurden von Goeddel et al., (12) und Kleid et al., (29) beschrieben. Es wurden zahlreiche andere mikrobielle Promotoren entdeckt und einge­ setzt. Einzelheiten über deren Nucleotidsequenzen, die es dem Fachmann ermöglichen, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen, wurden veröffentlicht (30).

2. Hefestämme/Hefepromotoren

Das Expressionssystem kann auch das Plasmid YRp7 (31, 32, 33) verwenden, welches zur Selektion und Replikation sowohl in E. coli als auch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae fähig ist. Für die Selektion in Hefe erhält das Plasmid das TRP1-Gen (31, 32, 33), das eine Komplementation (Ermöglichung des Wachs­ tums in Abwesenheit von Tryptophan) von Hefe ermöglicht, die Mutationen in diesem am Chromosom IV der Hefe gefundenen Gen enthält (34). Ein geeigneter Stamm ist der Stamm RH218 (35), der bei der American Type Culture Collection ohne Einschrän­ kungen hinterlegt ist (ATCC 44076). Es wird jedoch darauf ver­ wiesen, daß beliebige Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die eine Mutation aufweisen, durch die die Zelle die Eigen­ schaft trp1 erhält, eine wirksame Umgebung zur Expression des das Expressionssystem enthaltenden Plasmids ist. Ein Beispiel für einen weiteren verwendbaren Stamm ist pep4-1 (36). Dieser tryptophan-auxotrophe Stamm weist eine Punktmutation im Gen TRP1 auf.

Wird an der 5′-Stelle eines Nicht-Hefegens die 5′-flankierende DNA-Sequenz (Promotor) aus einem Hefegen (für Alkoholdehydro­ genase 1) angebracht, so kann sie die Expression eines fremden Gens in der Hefe, wenn sie in ein Plasmid zur Transformation von Hefe gebracht wird, fördern. Neben einem Promotor ist für die einwandfreie Expression eines Nicht-Hefegens in Hefe eine zweite Hefesequenz am 3′-Ende des Nicht-Hefegens am Plasmid erforderlich, so daß eine einwandfreie Termination der Trans­ kription und Polyadenylierung in der Hefe möglich ist. Dieser Promotor kann im Rahmen der Erfindung ebenso wie andere Pro­ motoren verwendet werden (vgl. unten). Bei bevorzugten Aus­ führungsformen wird die 5′-flankierende Sequenz des Hefe-3- Phosphoglycerat-kinase-Gens (37) aufwärts vom Strukturgen an­ geordnet, wiederum gefolgt von DNA mit einem Gehalt an Termina­ tions-Polyadenylierungs-Signalen, beispielsweise TRP1- (31, 32, 33) -Gen oder PGK- (37) -Gen.

Da Hefe-5′-Flankensequenz (in Konjunktion mit 3′-Hefe-Termi­ nations-DNA) (vgl. unten) die Expression von fremden Genen in Hefe fördern kann, scheint es wahrscheinlich, daß die 5′- flankierenden Sequenzen von beliebigen hochexprimierten Hefe­ genen zur Expression von wichtigen Genprodukten verwendet werden können. Da unter diesen Umständen Hefe bis zu 65 Prozent ihres löslichen Proteins als glykolytische Enzyme (38) expri­ mierte und da dieser hohe Anteil auf die Bildung von hohen Anteilen an individuellen mRNAs zurückzuführen zu sein scheint (39), sollte es möglich sein, die 5′-flankierenden Sequenzen von beliebigen anderen glykolytischen Genen für derartige Ex­ pressionszwecke zu verwenden, beispielsweise Enolase, Glycerin­ aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxy­ lase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3- Phosphoglycerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-iso­ merase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beliebige 3′-flankierende Sequenzen dieser Gene können auch für eine geeignete Termination und mRNA-Polyadenylierung in einem der­ artigen Expressionssystem verwendet werden; vgl. oben. Bei­ spiele für einige andere hochexprimierte Gene sind die für saure Phosphatasen (40) und diejenigen, die aufgrund von Muta­ tionen in den 5′-flankierenden Bereichen (expressionssteigernde Mutanten) - im allgemeinen aufgrund der Anwesenheit eines TY1- transponierbaren Elements (41) - hohe Produktionsmengen expri­ mieren.

Von sämtlichen vorerwähnten Genen wird angenommen, daß sie durch Hefe-RNA-Polymerase II transkribiert werden (41). Es ist möglich, daß die Promotoren für die RNA-Polymerase I und III, die Gene für ribosomale RNA, 5S RNA und tRNA transkri­ bieren (41, 42), auch für derartige Expressionskonstruktionen wertvoll sind.

Schließlich können viele Hefepromotoren auch eine transkriptio­ nale Steuerung enthalten, so daß sie bei einer Veränderung der Wachstumsbedingungen ab- oder angestellt werden können. Beispiele für derartige Hefepromotoren sind die Gene, die die folgenden Proteine bilden: Alkohol-dehydrogenase II, Isocyto­ chrom-c, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assoziierte abbauende Enzyme, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydro­ genase und für die Maltose-und Galactoseverwertung verantwort­ liche Enzyme (39). Ein derartiger Steuerungsbereich ist für die Steuerung der Expression von Proteinprodukten, insbesondere wenn ihre Bildung für die Hefe toxisch ist, sehr wertvoll. Es dürfte auch möglich sein, den Steuerungsbereich einer 5′-flan­ kierenden Sequenz mit einer 5′-flankierenden Sequenz, die einen Promotor von einem hochexprimierten Gen enthält, zusammenzu­ bringen. Dies würde zu einem Hybridpromotor führen und sollte möglich sein, da es sich beim Steuerungsbereich und dem Pro­ motor offensichtlich um physikalisch unterschiedliche DNA- Sequenzen handelt.

3. Zellkultursysteme/Zellkulturvektoren

Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kulturen (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren (43). Die COS-7-Linie von Affennierenfibroblasten kann als Wirt für die Herstellung von tierischen Interferonen verwendet werden (44). Jedoch können die hier geschilderten Experimente in be­ liebigen Zellinien durchgeführt werden, die zur Replikation und Expression eines kompatiblen Vektors fähig sind, zum Bei­ spiel WI38-, BHK-, 3T3-, CHO-, VERO- und HeLa-Zellinien. Fer­ ner sind für den Expressionsvektor ein Replikationsursprung und ein Promotor, angeordnet vor dem zu exprimierenden Gen, zusammen mit allen erforderlichen Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleisstellen, Polyadenylierungsstellen und transkrip­ tionalen Terminatorsequenzen erforderlich. Während im Rahmen dieser Beschreibung diese wesentlichen Elemente von SV40 ge­ nutzt werden, ist darauf hinzuweisen, daß es sich hierbei nur um bevorzugte Ausführungsformen handelt und die Erfindung keineswegs auf diese Sequenzen beschränkt ist. Beispielsweise können die Replikationsursprungsstellen von anderen viralen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen) Vektoren, sowie jede zelluläre Ursprungsstelle der DNA-Replikation, die in einem nicht-integrierten Zustand funktioniert, verwendet werden.

B. Vektorsysteme 1. Direkte Expression von reifem Rinderinterferon in E. coli

Bei dem Verfahren, das zur direkten Expression von Rinderinter­ feron in E. coli als reifem Interferon-Polypeptid (minus die Signalsequenz) verwendet wurde, handelte es sich um eine Kom­ bination eines Plasmids mit einem Gehalt an einem Promotor­ fragment und einem translationalen Startsignal mit einem Zuge­ schnittenen Fragment von tierischer Genom-DNA, die den kodie­ renden Bereich für das reife Interferon enthielt.

2. Expression in Hefe

Um ein heterologes Gen, wie die DNA für tierisches Interferon in Hefe zu exprimieren, war es notwendig, einen Plasmidvektor mit einem Gehalt an 4 Komponenten aufzubauen. Bei der ersten Komponente handelte es sich um den Teil, der die Transforma­ tion von E. coli und Hefe ermöglicht und der somit ein selek­ tierbares Gen von beiden Organismen enthalten muß, beispiels­ weise das Gen für Ampicillinresistenz aus E. coli und das Gen TRP1 aus Hefe. Diese Komponente benötigt auch eine Replikations­ ursprungsstelle von beiden Organismen, die als Plasmid-DNA in beiden Organismen aufrecht zu erhalten ist. In diesem Fall handelt es sich um die E. coli-Ursprungsstelle aus pBR322 und die ars1-Ursprungsstelle aus dem Chromosom III von Hefe.

Bei der zweiten Komponente des Plasmids handelt es sich um eine 5′-flankierende Sequenz eines hochexprimierten Hefegens, um die Transkription eines abwärts plazierten Strukturgens zu fördern. In diesem Fall wird als 5′-flankierende Sequenz die Sequenz aus dem Hefe-3-Phosphoglycerat-kinase (PGK)-Gen ver­ wendet.

Bei der dritten Komponente des Systems handelt es sich um ein Strukturgen, das so aufgebaut ist, daß es sowohl ATG-Trans­ lations-Start- als auch Translations-Stopsignale enthält. Die Isolierung und der Aufbau eines derartigen Gens ist weiter unten beschrieben.

Bei der vierten Komponente handelt es sich um eine Hefe-DNA- Sequenz, die die 3′-flankierende Sequenz eines Hefegens ent­ hält, welches die geeigneten Signale zur Beendigung der Trans­ kription und zur Polyadenylierung enthält.

3. Expression in Säugetier-Zellkulturen

Die Strategie zur Synthese von Immuninterferon in Säugetier- Zellkulturen beruht auf der Entwicklung eines Vektors der sowohl zur autonomen Replikation als auch Expression eines fremden Gens unter Steuerung einer heterologen Transkriptions­ einheit fähig ist. Die Replikation dieses Vektors in Gewebe­ kultur kann erreicht werden, indem man eine DNA-Replikations­ ursprungsstelle (abgeleitet vom SV40-Virus) sowie eine Hilfs­ funktion (T-Antigen) durch Einführung des Vektors in eine Zellinie, die dieses Antigen endogen exprimiert (46, 47), bereitstellt. Der späte Promotor von SV40-Virus geht dem Struk­ turgen von Interferon voran und gewährleistet die Transkrip­ tion des Gens.

Der zur Erzielung der Expression geeignete Vektor besteht aus pBR322-Sequenzen, die einen selektierbaren Marker für die Selektion in E. coli (Ampicillinresistenz) und eine E. coli- Ursprungsstelle für die DNA-Replikation bereitstellen. Diese Sequenzen sind aus dem Plasmid pML-1 (46) abgeleitet und um­ fassen den Bereich von der EcoRI-Restriktionsstelle bis zur BamHI-Restriktionsstelle. Die SV40-Ursprungsstelle leitet sich von einem 342-Basenpaar-PvuII-HindIII-Fragment ab, das diesen Bereich umfaßte (48, 49) (beide Enden waren in EcoRI-Enden um­ gewandelt). Diese Sequenzen kodieren abgesehen davon, daß sie den viralen Ursprung der DNA-Replikation enthalten, den Promotor sowohl für die frühe als auch für die späte Transkriptions­ einheit. Die Orientierung des SV40-Ursprungsbereichs ist so beschaffen, daß sich der Promotor für die späte Transkriptions­ einheit proximal zu dem Interferon kodierenden Gen befindet.

Fig. 1 zeigt eine Southern-Hybridisierung von (a) Human-, (b) Rinder- und (c) Schweinegenom-DNAs, die mit EcoRI ver­ daut und bei unterschiedlichen Formamidkonzentrationen mit einem 32P-markierten 570-Basenpaar-EcoRI-Fragment, das den kodierenden Bereich des Humanleukozyteninterferon-A/D-Hybrids enthält, hybridisiert sind. Die Hybridisierung bei einer Form­ amidkonzentration von 20 Prozent ergibt das klarste Muster der multigenen Rinder- und Schweineleukozyteninterferon-Genfamilien.

Fig. 2 zeigt eine Southern-Hybridisierung von 4 unterschiedli­ chen Rindergenom-DNA-Phagenrekombinanten, die mit EcoRI, BamHI oder HindIII verdaut und mit einem ³²P-markierten Humanleuko­ zytengenmarker hybridisiert sind. Klon 83 ergibt mit jedem Restriktionsenzym 2 hybridisierende Fragmente.

Fig. 3A zeigt einen Teil der Nucleotidsequenz aus dem Plasmid Subklon p83BamHI 1,9 kb sowie die abgeleitete Aminosäure­ sequenz des darin kodierten Rinderleukozyteninterferons. Das Signalpeptid wird durch die Aminosäurereste S1 bis S23 wieder­ gegeben.

Fig. 3B zeigt die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäure­ sequenz für ein zweites Rinderleukozyteninterferon (α2) aus dem Plasmidsubklon p67EcoRI 3,2 kb.

Fig. 3C zeigt die vollständige reife Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für ein drittes Rinderleukozyten­ interferon (α3) aus dem Plasmidsubklon p35EcoRI-BamHI 3,5 kb.

Fig. 3D zeigt die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäure­ sequenz eines vierten Rinderleukozyteninterferons aus dem Plas­ midsubklon p83EcoRI-BamHI 2,9 kb. Das Signal wird durch die Aminosäurereste S1 bis S23 wiedergegeben. Das reife Protein umfaßt 172 Aminosäurereste. Es ist festzustellen, daß der letzte Bereich von 6 Aminosäureresten einer Nucleotidbasen­ änderung in Position 511 zuzuschreiben ist, die 6 zusätzliche translatierbare Kodons vor dem nächsten Stopsignal in Phase ermöglicht.

Fig. 4 vergleicht die Aminosäuresequenzen von BoIFN-α1,α2, α3 und α4 (Bo = Rind) mit den Sequenzen für 11 bekannte Human­ leukozyteninterferone. Ferner sind die Aminosäuren angegeben, die bei allen Human- und allen Rinderleukozyteninterferonen konserviert sind. Für Rinderleukozyteninterferon α1 und α4 sind die Posi­ tionen angegeben, bei denen Homologie mit dem Großteil der Humanleukozyteninterferone auftritt.

Fig. 5 ist ein schematisches Diagramm zum Aufbau des Rinder­ leukozyteninterferon-Expressionsplasmids pBoIFN-α1trp55. Bei den Ausgangsmaterialien handelt es sich um den trp-Expressions­ vektor pdeltaRIsrc und das BamHI-Fragment des Plasmidsubklons p83BamHI 1,9 kb.

Fig. 6 zeigt eine Southern-Hybridisierung von Rinder-DNA, die mit EcoRI, HindlII, BamHI, BgIII und PvuII verdaut ist, mit einem radioaktiven Marker, der aus BoIFN-α1- oder BoIFN-α4- Genfragmenten hergestellt ist. Jedes IFN-Gen hybridisiert bevorzugt mit einer bestimmten Unterfamilie von BoIFN-α-Genen.

Fig. 7 zeigt eine Restriktionskarte der Genomrinder-DNA-Inserts von 3 Phagenrekombinanten, die den Humanfibroblasten-Humaninter­ ferongen-Marker hybridisieren. Die Stellung und Orientierung von BoIFN-β ist jeweils durch ein geschwärztes Rechteck ange­ geben. Die mit einem Stern gekennzeichneten Restriktionsstellen geben eine partielle Restriktionskarteninformation wieder.

Fig. 8 zeigt eine feiner aufgelöste Restriktionskarte für die 3 in Fig. 7 angegebenen Gene. Der schraffierte Bereich stellt die Signalsequenz und der gepunktete Bereich die reife Se­ quenz dar.

Die Fig. 9a, 9b und 9c zeigen die Nucleotidsequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Gene BoIFN-β 1, 2 und 3.

Fig. 10 vergleicht die Aminosäuresequenzen für die 3 BoIFN-βs mit HuIFN-β (Hu = human).

Fig. 11 ist ein Southern-Blot von Fig. 6, rehybridisiert mit einem BoIFN-β1-Genmarker unter Bedingungen, bei denen im all­ gemeinen nur ein einziges Hybridisierungsfragment auftritt, wenn ein analoges Experiment mit Humangenom-DNA und dem HuIFN- β-Gen durchgeführt wird (9).

Fig. 12 zeigt schematisch die zur Expression aller 3 BuIFN-βs unter Kontrolle des trp-Operons von E. coli angewandte Strategie.

Fig. 13 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäurese­ quenzen von BoIFN-γ, HuIFN-γ und Mäuse-IFN-γ.

Nachstehend folgt eine ausführliche Beschreibung der Herstellung von verschiedenen tierischen Interferonen mittels rekombinanter DNA-Technik, wobei eine allgemein anwendbare Methodik insbe­ sondere zur Herstellung von Rinderleukozyteninterferonen be­ schrieben wird. Dieses Verfahren wird in bezug auf ein bak­ terielles System beschrieben.

A. Isolierung von Rinder-DNA

Zum Aufbau einer Tiergenbibliothek wurde hochmolekulare DNA aus tierischem Gewebe nach einem modifizierten Verfahren gemäß Blin und Stafford (50) isoliert, willkürlich in bezug auf den Genort fragmentiert und der Größenfraktionierung zur Bil­ dung von 15 bis 20 kb-Fragmenten für die Klonierung in einem λ Phagenvektor (51) unterworfen.

Gefrorenes Gewebe, beispielsweise Rinderpankreas, wurde in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen und in 0,25 m EDTA, 1 Prozent Sarkosyl, 0,1 mg/ml Proteinase K (25 ml/ g Gewebe) 3 Stunden bei 50°C in Lösung gebracht. Die erhaltene viskose Lösung wurde durch 3 Phenolextraktionen und eine Chlo­ roformextraktion entproteinisiert, gegen 50 millimolar Tris- HCl (pH-Wert 8), 10 millimolar EDTA, 10 millimolar NaCl dia­ lysiert und mit wärmebehandelter pankreatischer Ribonuclease (0,1 mg/ml) 2 Stunden bei 37°C verdaut. Nach Extraktion mit Phenol und Äther wurde die DNA mit 2 Volumina Äthanol ge­ fällt, in 95-prozentigem Äthanol gewaschen, lyophilisiert und in TE-Puffer (10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 milli­ molar EDTA) über Nacht bei 4°C wieder in Lösung gebracht, wo­ bei die endgültige Konzentration 1 bis 2 mg/ml betrug. Das fertige DNA-Präparat war länger als 100 kb, bestimmt durch Elektrophorese an einem 0,5-prozentigen neutralen Agarosegel.

B. Partielle Endonuclease-Verdauung und Größenfraktionierung von Rinder-DNA

Aliquotanteile (0,1 mg) von Rinder-DNA wurden mit 1,25, 2,5, 5 und 10 Einheiten an Sau3A 60 Minuten bei 37°C in 1 ml Reak­ tionsmedium mit 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 milli­ molar MgCl₂ und 2 millimolar Dithiothreit verdaut. Die Inku­ bationen wurden durch Zusatz von EDTA in einer Konzentration von 25 millimolar gestoppt. Sodann wurde mit Phenol und Äther extrahiert, mit Natriumacetat auf eine Konzentration von 0,3 m gebracht (pH-Wert 5,2) und mit 3 Volumina Äthanol gefällt. Die DNA wurde in TE-Puffer bei 68°C wieder in Lösung gebracht und in einem 10- bis 40-prozentigen linearen Saccharosegradien­ ten (51) in einem Beckman SW 27 Rotor 22 Stunden bei 27 000 U/min und 20°C sedimentiert. Die Fraktionen (0,5 ml) wurden an einem 0,5-prozentigen Gel unter Verwendung von EcoRI-ver­ dauter Charon 4A (51a)-DNA als Molekulargewichtsstandard analysiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an 15 bis 20 kb- DNA-Fragmenten wurden vereinigt, mit Äthanol gefällt und wie­ der in TE-Puffer in Lösung gebracht.

C. Aufbau der Rindergenom-DNA-Bibliothek

Das 15 bis 20 kb-Rinder-DNA-nonlimit-Digestionsprodukt wurde in einem λ-Charon 30A-Vektor (52) mit G-A-T-C-kohäsiven Enden, erzeugt durch Entfernung der beiden internen BamHI-Fragmente der Phage, geklont. Charon 30A wurde in E. coli Stamm DP 50 SupF (ATCC 39061, hinterlegt am 5. März 1982) in NZYDT-Brühe gezüchtet, durch Fällung mit Polyäthylenglykol konzentriert und durch Zentrifugation im CsCl-Dichtegradienten (53) ge­ reinigt. Phagen-DNA wurde hergestellt durch 2-malige Extrak­ tion der Phage mit Phenol und 1-malige Extraktion mit Phenol und Äther und Konzentrieren der DNA durch Äthanolfällung.

Zur Herstellung der Endfragmente von Charon 30A wurden 50 µg der Phagen DNA 2-Stunden bei 42°C in 0,25 ml 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 8), 10 millimolar MgCl₂ und 0,15 m NaCl getempert, vollständig mit BamHI verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert und in einem 10- bis 40-prozentigen Saccharosegra­ dienten entsprechend den vorstehenden Angaben sedimentiert. Fraktionen mit einem Gehalt an 32 kb getemperten Armen der Phage wurden vereinigt und mit Äthanol gefällt.

Die gereinigten Charon 30A-Arme (6 µg) wurden wiederum 2 Stun­ den bei 42°C getempert, mit 0,3 µg 15 bis 20 kb-Rinder-DNA und 400 Einheiten Phagen-T4-Polynucleotid-ligase vereinigt und über Nacht bei 12°C in 0,075 ml Reaktionsmedium mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar MgCl₂, 20 millimolar Dithiothreit und 50 µg/ml Rinderserum­ albumin inkubiert. Das der Ligation unterworfene DNA-Gemisch wurde sodann in reife λ-Phagenteilchen unter Verwendung eines in vitro-λ-Packungssystems (54) gepackt.

Die Komponenten dieses Systems, d. h. Ultraschallextrakt (SE) Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Protein A und Puffer A und M1, wurden gemäß (54) hergestellt. 3 µl-Aliquotanteile des ver­ knüpften DNA-Gemisches wurden 45 Minuten bei 27°C mit 15 µl Puffer A, 2 µl Puffer M1, 10 µl SE und 1 µl Protein A inku­ biert. Das FTL wurde 45 Minuten auf Eis aufgetaut, mit 0,1 Volumina Puffer M1 vereinigt und 25 Minuten bei 35 000 U/min und 4°C zentrifugiert. 0,075 ml des Überstands wurden zum vorstehenden Reaktionsgemisch gegeben. Nach weiterer 2-stündi­ ger Inkubation bei 27° wurde ein kleiner Aliquotanteil der Packung am vorstehenden Stamm DP 50 SupF titriert. Dieses Verfahren ergab insgesamt etwa 1,1 × 10⁶ unbhängige Rinder-DNA-Rekombinanten. Der Rest des Packungsgemisches wurde gemäß einem Platten-Lysat-Verfahren (52) durch Ausstreichen der Rekombinanten auf DP 50 SupF in einer Dichte von 10 000 plaquebildenden Einheiten pro 15 cm NZYDT-Agarplatte ver­ stärkt.

D. Screening der Phagenbibliothek für Rinderinterferongene

Die zur Identifizierung der Phagenrekombinanten, die Rinder­ interferongene tragen, angewandte Strategie bestand darin, die Nucleotidhomologie mit radioaktiven Markern, die aus geklonten Humanleukozyten- (8, 9), Humanfibroblasten- (12) und Hu­ manimmuninterferongenen (55) hergestellt waren, nachzuweisen. Die Hybridisierungsbedingungen wurden mit Southern-Blots (56) von genomischer tierischer DNA festgestellt. Jeweils 5 µg hochmolekulare DNA (auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt aus Humanplazenta, Rinderpankreas und G. sub­ maxillaris vom Schwein wurden vollständig mit EcoRI verdaut, der Elektrophorese auf 0,5 Prozent Agarosegel unterworfen und auf Nitrocellulosepapier übertragen (56). Ein ³²P-markierter DNA-Marker wurde aus einem 570 bp-EcoRI-Fragment, das den proteinkodierenden Bereich für reifes Humanleukozyteninter­ feron A/D-Hybrid an der BGL II-Restriktionsstelle (57) ent­ hielt, nach üblichen Verfahren (58) hergestellt. Die Nitro­ cellulosefilter wurden jeweils über Nacht bei 42°C in 5xSSC (56), 50 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert 6,5), 0,1 mg/ml ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA, 5x-Denhardt-Lösung (5), 0,1 Prozent Natriumdodecylsulfat, 0,1 Prozent Natriumpyrophos­ phat mit einem Gehalt an entweder 10, 20 oder 30 Prozent Form­ amid prähybridisiert und sodann mit 100 × 10⁶ cpm der mar­ kierten Probe in der gleichen Lösung mit einem Gehalt an 10 Prozent Natriumdextransulfat (60) hybridisiert. Nach Inkuba­ tion bei 42°C über Nacht wurden die Filter 4mal in 2xSSC, 0,1 Prozent SDS bei Raumtemperatur und 1mal in 2xSSC ge­ waschen und sodann über Nacht Kodak-XR-5-Röntgenfilm mit Dupont Cronex-Verstärkungsfiltern ausgesetzt. Wie aus Fig. 1 hervorgeht, läßt sich eine Anzahl von hybridisierenden Ban­ den sehr leicht in den Rinder- und Schweine-DNA-Verdauungs­ produkten nachweisen, wenn bei der Hybridisierung 20 Prozent Formamid vorhanden sind. Dieses Ergebnis beweist eine multi­ gene Familie von Leukozyteninterferongenen bei Rindern und Schweinen analog dem früher geführten Nachweis beim Menschen (12, 61). Die gleichen Hybridisierungsbedingungen wurden daher für das Screening der Interferongene in der Rinder-DNA-Biblio­ thek angewandt.

500 000 Rekombinantenphagen wurden auf DP 50 SupF in einer Dichte von 10 000 plaquebildenden Einheiten (pfu)/15 cm-Platte ausgestrichen. Doppelte Nitrocellulosefilter-Replicas wurden von jeder Platte nach dem Verfahren von Benton und Davis (62) hergestellt. Die Filter wurden auf die vorstehend beschriebene Weise mit dem Human-LeIF-Genmarker hybridisiert. 96 Duplikat­ hybridisierungsplaques wurden erhalten, die bei wiederholtem Screening starke Signale ergaben.

Die Rinderbibliothek wurde ferner einem Screening auf Fibro­ blasten und Immuninterferongene unterzogen. Marker wurden aus 502 bp Xba I-Bgl III-Fragmenten mit einem Gehalt am gesamten reifen Humanfibroblasteninterferongen (12), einem 318 bp Alu I- Fragment (enthaltend die Aminosäuren 12 bis 116) und einem 190 bp Mbo II-Fragment (enthaltend die Aminosäuren 69 bis 162) aus dem reifen kodierenden Bereich von Humanimmuninterferon­ gen (55) hergestellt. Die Hybridisierung von 1,2 × 10⁶ re­ kombinanten Phagen ergab insgesamt 26 Rinderfibroblasten- und 10 Immuninterferonklone.

E. Charakterisierung der Rekombinantenphagen

Phagen-DNA wurde auf die vorstehend beschriebene Weise von 12 Rekombinanten, die mit dem Humanleukozyteninterferon­ marker hybridisierten, hergestellt. Die DNAs wurden einzeln und kombiniert mit EcoRI, BamHI und HindIII verdaut und der Elektrophorese an einem 0,5-prozentigen Agarosegel unter­ worfen. Die Position der hybridisierenden Sequenzen wurde nach dem Southern-Verfahren (56) ermittelt. Ein Vergleich von einzeln verdauter DNA der Klone 10, 35, 78 und 83 ist in Fig. 2 gegeben. Für jede Phage sind die Größen der Re­ striktionsfragmente und das entsprechende Hybridisierungs­ muster verschieden und nicht-überlappend, was darauf hinweist, daß diese 4 Phagen unterschiedliche Rinderinterferongene tragen. Zusätzlich ergibt eine Verdauung des Klons 83 mit jedem der 3 Enzyme in jedem Fall 2 diskrete hybridisierende Banden, was anzeigt, daß diese Rekombinante 2 eng verknüpfte Interferongene trägt.

F. Subklonierung der Rinderleukozyteninterferongene

Restriktionsfragmente von 3 der rekombinanten Phagen, die mit dem Humanleukozytengenmarker hybridisiert waren, wurden der Subklonierung in die Mehrfachrestriktrionsenzym-Klonierungs­ stelle des pBR322-Derivats pUC9 unterworfen. Das Plasmid pUC9 war von pBR322 abgeleitet, indem man zunächst das 2067 bp- EcoRI-PvuII-Fragment mit einem Gehalt am Tetracyclinresistenz­ gen entfernte und dann ein 425 bp-HaeII-Fragment aus dem Pha­ gen-M13-Derivat mP9 (62a) in die HaeII-Stelle des erhaltenen Plasmids in Stellung 2352 (relativ zur pBR322-Zählung) ein­ setzte. Das HaeII-Fragment von mP9 enthält den N-terminalen kodierenden Bereich des E. coli lacZ-Gens, in das eine Multi­ restriktionsenzym-Klonierungsstelle der Sequenz CCA AGC TTG GCT GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGG zwischen dem 4. und 5. Amino­ säurerest von β-Galactosidase eingesetzt war. Die Insertion eines fremden DNA-Fragments in diese klonierenden Stellen unterbricht die Kontinuität zwischen dem lac-Promotor und dem lacZ-Gen, wodurch der Phänotyp des mit dem Plasmid transfor­ mierten JM83 von lac⁺ zu lac⁻ geändert wird.

Bei den vorstehend genannten Fragmenten handelte es sich um folgende: (a) ein 1,9 kb BamHi-Fragment und 3,7 kb EcoRI-Frag­ ment aus dem Klon 83 (entsprechend den nicht-überlappenden Segmenten der gleichen Rekombinante), (b) ein 3,5 kb BamHI- EcoRI-Fragment vom Klon 35 und (c) ein 3,2 kb EcoRI-Fragment vom Klon 67. In jedem Fall wurden 0,1 µg des entsprechend ver­ dauten Vektors mit einem 10-fachen molaren Überschuß des ge­ reinigten Fragments verknüpft, transformiert in E.coli JM83 (ATCC 39062, hinterlegt am 5. März 1982) und auf M9-Platten (63) mit einem Gehalt an 0,04 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β- D-galactosid und 0,2 mg/ml Ampicillin ausgestrichen. Weiße Kolonien, die vermutlich einen DNA-Insert an der Restriktions­ stelle unter Unterbrechung des kodierenden Bereichs des lacZ- Gens an pUC9 trugen, wurden in 5 ml LB-Brühe mit einem Gehalt an 0,02 mg/ml Ampicillin aufgenommen, mehrere Stunden bei 37 °C gezüchtet und dem Screening auf das eingesetzte Fragment nach einem Plasmid-DNA-Minipräparationsverfahren (64) unterworfen.

G. DNA-Sequenz von Rinderleukozyteninterferongen an Klon 83

Die sich von der BamHI-Stelle von p83BamHI 1,9 kb (der 1,9 kb Fragment-Subklon von Klon 83) erstreckende DNA-Sequenz wurde nach dem chemischen Verfahren von Maxam-Gilbert (65) bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Der längste offene Ableseraster kodiert ein Polypeptid mit 189 Aminosäuren mit signifikanter Homologie zu den Humanleukozyteninterferonen (Fig. 4). Analog mit den Humanproteinen besteht Rinderleuko­ zyteninterferon aus einem hydrophoben Signalpeptid mit 23 Aminosäuren, das einem reifen Protein mit 166 Aminosäuren bei identischer Sequenz, ser-leu-gly-cys, vorausgeht. 4 Cystein­ reste in den Stellen 1, 29, 99 und 139 waren zwischen den Spezies exakt erhalten. Ein paarweiser Homologievergleich zwischen den Rinder- und Humaninterferonen ist in Tabelle I angegeben. Wie zu erwarten, ist das Rinderprotein in bezug zu den Humanproteinen beträchtlich weniger homolog (etwa 60 Prozent) als die letztgenannten Proteine untereinander (mehr als 80 Prozent).

Für 3 weitere Rinderleukozyteninterferongene, die an den Plasmidsubklonen p67EcoRI 3,2 kb, p35EcoRI-BamHI 3,5 kb und p83EcoRI 3,7 kb auftreten, sind in den Fig. 3B, 3C und 3D die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz an­ gegeben.

Wie in Tabelle I zusammengestellt, kodieren die BoIFN-α2 und -3-Gene Peptide mit nur geringen Unterschieden zu BoIFN-α1, während das BoIFNα4-Protein sich von den anderen Rinderpeptiden so stark unterscheidet, wie ein beliebiges Paar von Rinder- und Humanleukozyteninterferonen.

Um festzustellen, ob das α4-Gen sich wie die anderen BoIFN-αs von einer breiten Klasse von zellulären Proteinen ableitet, wurde genomische Rinder-DNA mit verschiedenen Restriktions­ endonucleasen verdaut und mit radioaktiven DNA-Fragmenten, die die kodierenden Bereiche der α1- (612 bp AvaII-Fragment, Fig. 6) und α4- (EcoRI-XmnI-Fragment von pBoIFN-α4trp15)- Gene repräsentieren, unter drastischen Bedingungen (50 Prozent Formamid), die keine Kreuzhybridisierung der beiden Gene erlauben, hybridisiert. Wie aus Fig. 6 ersichtlich, hybridi­ siert jedes Gen vorwiegend mit einem bestimmten Satz von Rinder-DNA-Fragmenten. Diese Ergebnisse geben insgesamt einen klaren Hinweis auf die Existenz von 2 unterschiedlichen Fa­ milien an Rinderleukozyten-IFN-peptiden, von denen die α1- und α4-Proteine als repräsentative Mitglieder angesehen werden können.

Tabelle I

Paarweise Vergleiche von Unterschieden in den kodierenden Sequenzen von Rinder- und Human-IFN-αs

H. Direkte Expression von reifem BoIFN-α1 in E. coli

Der Aufbau des direkten Expressionsplasmids ist in Fig. 5 zusammengestellt. Der Plasmidsubklon p83BamHI 1,9 kb wurde vollständig mit Ava II verdaut. Das 612 bp-Fragment mit einem Gehalt an Rinderleukozyteninterferongen wurde elektrophore­ tisch an einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel isoliert und durch Elektroelution gewonnen. Etwa 1,5 µg dieses Fragments wurden mit Fnu4H verdaut, mit Phenol und Äther extrahiert und mit Äthanol gefällt. Die erhaltenen Fnu4H-kohäsiven Enden wurden 30 Minuten bei 12°C in 20 µl 20 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar MgCl₂, 4 millimolar Dithiothreit und jeweils 0,1 millimolar dATP, dGTP, dCTP und dTTP mit 6 Einheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zu stumpfen Enden erweitert. Nach Extraktion mit Phenol und Äther wurde die DNA mit Pst I verdaut und der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Gel unterworfen. Das erhaltene 92 bp stumpf­ endige Pst I-Fragment, das sich vom ersten Nucleotid des kodierenden Bereichs für reifes Rinderleukozyteninterferon erstreckt, wurde aus dem Gel durch Elektroelution gewonnen.

Der Rest des reifen kodierenden Bereichs wurde folgendermaßen isoliert. 3 µg des BamHI-Inserts von p83BamHI 1,9 kb wurde partiell 10 Minuten bei 37°C in 45 µl Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar MgCl₂ und 2 millimolar Dithiothreit mit 14 Ein­ heiten Pst I verdaut und mit Phenol und Äther extrahiert. Das gewünschte 144b bp partielle Pst I-BamHI-Fragment, das sich vom Nucleotid 93 des reifen kodierenden Bereichs er­ streckte, wurde von einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel isoliert.

Das Plasmid pdeltaRIsrc ist ein Derivat des Plasmids pSRCex16 (66), bei dem die EcoRI-Stellen proximal zum trp-Promotor und distal zum src-Gen durch Reparatur mit DNA-Polymerase I (67) entfernt sind. Das selbst-komplementäre Oligodesoxynucleotid AATTATGAATTCAT (synthetisiert nach dem Phosphotriesterver­ fahren (68) wurde in die restliche EcoRI-Stelle unmittelbar neben der Xba I-Stelle eingesetzt. 20 µg pdeltaRIsrc wurden vollständig mit EcoRI verdaut, mit Phenol und Äther extra­ hiert und mit Äthanol gefällt. Das Plasmid wurde sodann 30 Minuten bei 16°C in 25 millimolar Natriumacetat (pH-Wert 4,6), 1 millimolar ZnCl₂ und 0,3 m NaCl mit 100 Einheiten Nuclease S1 verdaut, um ein stumpfes Ende mit der Sequenz ATG zu schaf­ fen. Nach Extraktion mit Phenol und Äther und Äthanolfällung wurde die DNA mit BamHI verdaut und der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel unterworfen. Das große (4300 bp) Vektorfragment wurde durch Elektroelution gewonnen.

Das Expressionsplasmid wurde durch Verknüpfen von 0,2 µg Vektor, 0,02 µg des 92 bp stumpfendigen Pst I-Fragments und 0,25 µg des 1400 bp partiellen Pst I-BamHI-Fragments mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase zusammengebaut und zur Trans­ formation von E. coli Stamm 294 (ATCC 31446) zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet. Plasmid-DNA wurde aus 96 der Kolonien hergestellt und mit Xba I und Pst I verdaut. 19 dieser Plasmide enthielten die gewünschten 103 bp Xba I- Pst I und 1050 bp Pst I-Fragmente. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, daß mehrere dieser Plasmide ein korrekt am Start des Rinderinterferon kodierenden Bereichs befindliches ATG- Initiationskodon aufwiesen. Eines dieser Plasmide, pBoIFN-α1- trp55 wurde zur weiteren Untersuchung ausgewählt.

I. Direkte Expression einer zweiten Klasse von reifem Rinder­ leukozyteninterferon (α4) in E. coli

Ein ATG-Initiationskodon wurde durch enzymatische Erweiterung eines synthetischen DNA-Primers, CATGTGTGACTTGTCT, gesetzt. Das Heptadecamer wurde mit T4-Polynucleotid-kinase und γ-32P ATP phosphoryliert, wie vorstehend beschrieben (12). 250 pMol des Primers wurden mit etwa 1 µg 319 bp HindII-Fragment mit einem Gehalt an den Aminosäureresten S20 bis 102 in 30 µl H₂O vereinigt, 5 Minuten gekocht und 3 Stunden bei 37°C mit 25 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment erweitert. Das Produkt dieser Reaktion wurde mit HgiAI verdaut. Das er­ haltene 181 bp stumpfendige HgiAI-Fragment wurde aus einem 6-prozentigen Polyacrylamidgel isoliert.

Das gesamte Gen für das reife Peptid wurde hinter dem trp- Promotor durch enzymatische Verknüpfung des vorstehenden Fragments mit einem 508 bp HgiA-PstI-Fragment mit einem Ge­ halt am carboxy-terminalen Bereich des Peptids und dem HuIFN-γ- Expressionsplasmid, pIFN-γ trp48-13 (55), das mit EcoRI ver­ daut, auf glatte Enden mit Klenow-DNA-Polymerase erweitert, mit PstI verdaut und schließlich an einem 6-prozentigen Poly­ acrylamidgel isoliert war, aufgebaut. Nach Transformation des erhaltenen Gemisches in E. coli 294 wurden verschiedene Klone identifiziert, bei denen die EcoRI-Erkennungsstelle zwischen dem trp-Promotor-Ribosomenbindungsstellenbereich des ursprüng­ lichen Expressionsvektors und der gesamte kodierende Bereich des reifen Rinder-IFN (pBoIFN-α4trp15) wieder hergestellt war.

J. Subklonierung der Rinderfibroblasteninterferongene

6 der Phagenrekombinanten, die mit dem Human-IFN-β-DNA-Marker hybridisiert waren, wurden gereinigt. Ihre DNA wurde zur wei­ teren Analyse gemäß den vorstehenden Angaben isoliert. Die Restriktionskarte kombiniert mit Southern Hybridisierungs­ analyse zeigte, daß die 6 Isolate 3 gesonderte Bereiche des Rindergenoms umfaßten,was für eine multigene BoIFN-β-Familie spricht. Diese Ergebnisse sind anhand der in Fig. 7 gezeigten Restriktionskarten zusammengestellt. Zur Erstellung einer genaueren Restriktionskarte und einer Nucleotidsequenz für die einzelnen Klassen von Rekombinanten, wurden hybridisierende Fragmente der Subklonierung in Plasmidvektoren unterzogen. Insbesondere wurden das 5kb BglII-Fragment der Phage λβ1 und das 5 kb BamHI-Fragment der Phage λβ2 einzeln in pBR322 an der BamHI-Stelle geklont. Das überlappende 4,5 kb EcoRI-XhoI- und 1,4 kb PstI-HpaI-Fragment der Phage λβ3 wurden in pUC9 (befreit von EcoRI-SalI-Stellen) bzw. pLeIF87 (10) (befreit von HpaI-PstI) eingesetzt.

K. DNA-Sequenzen von 3 gesonderten Rinderfibroblasten-IFN-Genen

Fig. 8 zeigt Restriktionskarten für die 3 Typen von Rinder-IFN- β-Genen, die subkloniert wurden. Diese sind leicht unterscheid­ bar durch die Anwesenheit von jeweils charakteristischen Spal­ tungsstellen. Die peptidkodierenden Bereiche sowie die Se­ quenzen unmittelbar oberhalb und unterhalb der jeweiligen Gene wurden nach dem chemischen Verfahren gemäß Maxam-Gilbert bestimmt. Sie sind in den Fig. 9a, 9b und 9c wiedergegeben. Die Nucleotidhomologie mit der für das Humanfibroblasten­ interferongen bestimmten Sequenz (12) läßt den korrekten Ab­ leseraster und gesamte Aminosäuresequenz für jedes Rindergen­ produkt, das ein hydrophobes Signalpeptid mit 21 Aminosäuren, gefolgt von reifem Protein mit 185 Aminosäuren einschließt, vorhersagen. Die Rinderproteine sind untereinander recht unter­ schiedlich (Tabelle II, Fig. 10), zeigen aber noch größere Unterschiede (etwa 60 Prozent) zum humanen Peptid.

Die multigene Natur von Rinderfibroblasteninterferon wurde ferner durch Rehybridisierung des in Fig. 11 gezeigten Southern- Blots mit einem radioaktiver Marker, der aus einem von pBoIFN- β-trp (Beschreibung weiter unten) abgeleiteten 415 bp EcoRI- PvuI-Fragment hergestellt war, nachgewiesen. Wie aus Fig. 11 ersichtlich, liefert dieser Versuch den Beweis für die Existenz von weiteren, homologen IFN-β-Genen. Die weniger hybridisieren­ den Bereiche können tatsächlich weiter entfernte verwandte Gene repräsentieren, die wiederum stärker unterschiedliche β-IFNs kodieren.

Tabelle II

Paarweise Homologievergleiche der kodierenden Sequenzen von Rinder-IFN-βs und Human-IFN-β

Die Anzahl der identischen Aminosäuren in jedem Paar kodieren­ der Sequenzen sind angegeben. Der Vergleich des Signalpeptids mit 21 Aminosäuren findet sich in der linken unteren Hälfte und der Vergleich der reifen IFN-βs mit 166 Aminosäuren fin­ det sich in der rechten oberen Hälfte der Tabelle. Die Gesamt­ zahl der in jedem Paar identischen Aminosäuren ist zuerst angegeben. In Klammern ist der prozentuale Homologiegrad aufgeführt.

L. Direkte Expression von 3 Rinder-IFN-βs in E. coli

Da die 3 Rinder-IFN-β-Gene viele DNA-Sequenzen und Restrik­ tionsstellen gemeinsam haben (vgl. Fig. 8), ist ein allgemeines Schema für die Expression aller 3 Gene denkbar. Da die die ersten 5 Aminosäuren kodierende DNA-Sequenz, die 2 AluI-Stellen enthält, in allen Fällen identisch ist, wurden 2 komplementäre synthetische Oligonucleotide aufgebaut, die ein ATG-transla­ tionales Initiationskodon einverleiben, die Kodons für die ersten 4 Aminosäuren von reifem Rinder-IFN-β wieder herstellen und ein für die Insertion nach einer trp-Promotorsequenz ko­ häsives EcoRI schaffen. Der Aufbau der Expressionsplasmide ist schematisch in Fig. 12 dargestellt. Eine Ligation der synthetischen Oligomeren an das von den BoIFN-β-Subklonplas­ miden abgeleitete 85 bp AluI-XhoI-Fragment, gefolgt von einer Digestion mit EcoRI und XhoI erzeugt ein 104 bp-Fragment, flankiert durch EcoRI und XhoI-kohäsive Enden. Die gesamte Kodierung wurde sodann in den trp-Expressionsvektor eingebaut, indem man das 104 bp-Fragment zusammen mit dem etwa 700 bp XhoI-PstI- Fragment, das den Rest der einzelnen BoIFN-β-Proteine ko­ diert, und das Plasmid pIFN-γtr48-13 (55), von dem das interne EcoRI-PstI-Fragment entfernt war, verknüpfte. Die erhaltenen Plasmide, nämlich pBoIFN-β1trp, pBoIFN-β2trp und pBoIFN-β3trp, führen unter der Kontrolle des E. coli trp-Operons sämtlich die exakte Transkription und Translation der IFN-β-Gene durch.

M. Charakterisierung und Subklonierung von Rinderimmuninter­ feron (BoIFN-γ)-Gen

Die 10 mit dem Human-IFN- γ-Marker hybridisierten Phagenre­ kombinanten wurden gereinigt. DNA wurde auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt. Alle 10 DNA-Proben ergaben bei der Southern-Blotanalyse spezifische Hybridisierungsbanden. Die Klone λγ5 und λγ7 wurden für die weitere Analyse ausge­ wählt, da sie unterschiedliche Hybridisierungsbandenmuster aufweisen. Die Restriktionskarten dieser beiden Klone zeigen, daß sich ihre DNA-Sequenzen überlappen. Der überlappende Bereich enthält die Restriktionsstellen XbaI, EcoRV und NcoI. Die DNA-Sequenzanalyse dieser beiden Klone ergibt eine ins­ gesamt ähnliche Genstruktur mit dem Humanimmuninterferongen (70) und zeigt ferner, daß λγ7 die für das 4. Exon kodierende Sequenz und λγ4 die für die ersten 3 Exons von Rinder-IFN-γ- Gen kodierende Sequenz enthält, was auf der DNA-Sequenzhomo­ logie mit dem Human-IFN-γ-Gen beruht. Die für BoIFN-γ abge­ leitete Aminosäuresequenz wird in Fig. 13 mit der von HuIFN-γ- (55) und Mäuse-IFN-γ verglichen.

Um das gesamte Rinder-IFN-γ-Gen auf einem kontinuierlichen DNA-Segment zusammenzubauen, wurden das 3000 bp BamHI-NcoI- Fragment, das die ersten 3 Exons von Rinder-IFN-γ-Gen (abge­ leitet von λγ4) umspannt, und das 2500 bp NcoI-HindIII-Frag­ ment, das das letzte Exon (abgeleitet von λγ7) umfaßt, iso­ liert. Diese beiden DNA-Fragmente würden sodann in einen BamHI- HindIII-Vektor, abgeleitet von pBR322, über eine dreiteilige Ligation geklont.

N. Expression von Rinder-IFN-γ-Gen in Säugetiersystemen

Zum Zweck der Herstellung einer intronlosen Version von BiIFN-γ um dieses Gen in einem prokaryontischen System, wie E. coli, exprimierbar zu machen, wurde das Gen für einen hohen Expressionsgrad in einem tierischen Zellexpressions­ system geschnitten, um erhebliche Mengen an spezifischer mRNA zu erhalten. Das 5500 bp BamHI-HindIII-Fragment, das das ge­ samte Rinder-IFN-γ-Gen umspannt, wurde in einen SV40-Vektor zur Expression in COS-Zellen (44) eingesetzt. Speziell wurde das BamHI-HindIII-Rinder-IFN-γ-Genfragment in einen 2800 bp SV40-Plasmidvektor pDLΔR1 (abgeleitet vom HBV-Antigenex­ pressionsplasmid pHBs348-L durch enzymatische Beseitigung der EcoRI-Stelle oberhalb des SV40-Replikationsursprungs selektiv zur Richtung der späten Transkription). Das Ex­ pressionsplasmid pHBs348-L wurde aufgebaut, indem man das 1986 bp-Fragment, das durch EcoRI- und BglII-Verdauung von HBV (71) erhalten wurde (das das HBsAg kodierende Gen umspannt) in das Plasmid pML (72) an den EcoRI- und BamHI-Stellen klonte. pML ist ein Derivat von pBR322, bei dem Sequenzen, die die Plasmidreplikation in Affenzellen hemmen, beseitigt worden sind (72). Das erhaltene Plasmid (pRI-Bgl) wurde sodann mit EcoRI linearisiert. Das 348 bp-Fragment, das den SV40-Ursprungsbe­ reich repräsentiert, wurde in die EcoRI-Stelle von pRI-Bg1 eingeführt. Das Ursprungsfragment kann in beiden Orientie­ rungen eingesetzt werden. Da dieses Fragment sowohl den frühen als auch den späten SV40-Promotor zusätzlich zum Replikations­ ursprung kodiert, konnten HBV-Gene unter der Kontrolle beider Promotoren je nach dieser Orientierung (pHBs 348-L repräsentiert HBs exprimiert unter Kontrolle des späten Promotors) exprimiert werden zwischen der BamHI-und der Sal I-Stelle über eine dreiteilige Ver­ knüpfung in Gegenwart eines 600 bp HindIII-Sal I-Konverter­ fragments, das von pBR322 abgeleitet ist. Die Transfektion des erhaltenen Plasmids in COS-Zellen führt zur wirksamen Ex­ pression von Rinder-IFN-γ unter der Kontrolle des späten SV40-Promotors.

Poly A plus mRNA wurden aus transfektierten COS-Zellen herge­ stellt und wiederum zur Herstellung von cDNA nach üblichen Verfahren (55) verwendet. Mit Rinder-IFN-γ-Genmarker hybri­ disierende cDNA-Klone wurden isoliert. Der cDNA-Klon mit dem längsten PstI-Insert wurde zur weiteren Analyse ausgewählt. Die DNA-Sequenzanalyse dieses cDNA-Klons zeigt, daß sämtliche aus dem Rinder-IFN-γ-Genomklon vorhergesagten Intronsequenzen korrekt entfernt sind.

Die cDNA wurde zur Expression in E. coli gemäß dem vorstehend erläuterten Primerreparaturverfahren geschnitten.

O. Herstellung von bakteriellen Extrakten

Über Nacht in LB-Brühe mit einem Gehalt an entweder 0,02 mg/ml Ampicillin oder 0,005 mg/ml Tetracyclin gezüchtete Kulturen wurden in einer Verdünnung von 1 : 100 auf 50 ml M9-Medium (63) mit einem Gehalt an 0,2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Casamin­ säuren und dem entsprechenden Arzneistoff überimpft und unter Schütteln bei 37°C bis zu einem A₅₅₀-Wert von 1,0 gezüchtet. Proben von 10 ml wurden durch Zentrifugation geerntet und in einem Trockeneis/Äthanol-Bad schnell gefroren. Die gefrorenen Pellets wurden in 1 ml 7 m Guanidin resuspendiert, 5 Minuten auf Eis inkubiert und zur Bestimmung in PBS verdünnt. Alter­ nativ wurden die gefrorenen Pellets durch Zusatz von 0,2 ml 20% Saccharose, 100 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 20 mil­ limolar EDTA und 5 mg/ml Lysozym der Lysis unterworfen. Nach 20 Minuten auf Eis wurden 0,8 ml 0,3-prozentiges Triton X-100, 0,15 m Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 0,2 m EDTA und 0,1 millimolar PMSF zugesetzt. Das Lysat wurde durch 15-minütige Zentrifu­ gation bei 19 000 U/min geklärt. Im Überstand wurde nach Ver­ dünnung in PBS eine Bestimmung durchgeführt.

P. Interferonbestimmungen

Die Aktivität von Rinderinterferon wurde mittels eines Hemm­ tests auf der Basis des zytopathischen Effekts (CPE) in Mikro­ titerplatten mit 96 Vertiefungen folgendermaßen durchgeführt:

• 1. In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (8 Reihen mal 12 Spalten) wurden 100 µl einer Suspension von Zellen mit einem Gehalt an 10 Prozent fötalem Kälber­ serum gegeben. Die Konzentration wurde so eingestellt, daß sich am nächsten Tag eine konfluente Zellschicht (monolayer) ergab.
• 2. Die Platten wurden zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen 10 Minuten auf einer Rüttelplatte gerüttelt. Nächster Tag:
• 3. In jede Vertiefung der ersten Spalte wurden 80 µl zusätz­ liches Medium gegeben.
• 4. Eine Vertiefung in der ersten Spalte wurde mit 20 µl einer Probe, in der die Interferonaktivität bestimmt werden sollte, versetzt.
• 5. Probe und Medium in der Vertiefung wurden vermischt, indem man mit einer 100 µl-Pipette mehrmals 100 µl des Inhalts entfernte und wieder einspritzte.
• 6. 100 µl Inhalt einer Vertiefung in der ersten Spalte wurden (horizontal) in eine Vertiefung in der zweiten Spalte übertragen.
• 7. Es wurde wie in Stufe 3 gemischt.
• 8. Mit der Übertragung von 100 µl des Inhalts einer Vertiefung einer Spalte auf die folgende Spalte wurde fortgefahren, bis insgesamt 11 Übertragungen durchgeführt waren.
• 9. 100 µl des Inhalts der Vertiefung in der 12. Spalte wurden entfernt und verworfen. Durch dieses Verfahren erhält man Zweifach-Serienverdünnungen.
• 10. Die Bestimmungsplatten umfaßten entsprechende NIH-Standards.
• 11. Die Platten wurden 24 Stunden bei 37 °C unter CO₂ inkubiert.
• 12. Jede Bestimmungsplatte enthielt Vertiefungen, in die 100 µl Zellsuspension und 100 µl Medium als Kontrollen für das Zellwachstum gegeben wurden, sowie Vertiefungen, in die 100 µl Zellsuspension, 100 µl Medium und 50 µl Virussus­ pension als virus-induzierte zytopathogene Kontrollen ge­ geben wurden.
• 13. Die Vertiefungen mit Ausnahme der Zellkontrollen wurden mit jeweils 50 µl Virussuspension infiziert. Die verwendete Infektionsmultiplizität war die Virusmenge, die innerhalb von 24 Stunden bei der speziellen Zellinie 100 Prozent zytopathischen Effekt hervorrief.
• 14. Die Platten wurden 24 Stunden bei 37°C unter CO₂ reinkubiert.
• 15. Die Flüssigkeit wurde von den Platten entfernt. Die Zellen wurden mit 0,5 Prozent Kristallviolett gefärbt. Die Färbung wurde 2 bis 5 Minuten durchgeführt.
• 16. Die Platten wurden in Leitungswasser gespült und zum Trock­ nen aufgestellt.
• 17. Der Interferontiter der Probe ist reziprok zu der Ver­ dünnung, bei der 50 Prozent lebensfähige Zellen erhalten bleiben.
• 18. Die Aktivität sämtlicher Proben wurde mit Hilfe eines folgendermaßen berechneten Umrechnungsfaktors (Reference Units Conversion Factor) normalisiert.

Diesbezüglich wird auf (69) verwiesen. Extrakte aus E. coli Stamm 294 (ATCC 31446), die mit pBoIFN-α 1trp55 transformiert waren, zeigten eine signifikante Aktivität bei mit VS-Virus (Indiana-Stamm) infizierten Rindernieren-Zellinien (MDBK), jedoch nicht bei auf gleiche Weise infizierten Zellinien von Affennieren (VERO), Humanzervikalkarzinom (HeLa), Kaninchen­ nieren (Rk-13) oder Mäusen (L929). Kontrollextrakte, die aus dem mit pBR322 transformierten Stamm 294 hergestellt waren, zeigten keine Aktivität gegenüber MDBK-Zellen. In Tabelle III ist die in vitro-antivirale Aktivität von BoIFN-α 1 gegenüber ver­ schiedenen infizierten tierischen und menschlichen Zellinien zusammengestellt. BoIFN-α 1 läßt sich von Humanleukozyten IFNs leicht aufgrund eines offensichtlichen Mangels an anti­ viraler Aktivität gegenüber menschlichen Zellen relativ zu seiner Aktivität gegenüber Rinderzellen unter Verwendung von VS-Virus als infizierendem Agens unterscheiden. Tabelle IV zeigt den Grad der Interferonaktivität, die in Extrakten er­ halten wurde, die aus E. coli W3110, das mit den Expressions­ plasmiden pBoIFN-α 4trp15, pBoIFN-β1trp, pBoIFN-β2trp und pBoIFN-β3trp, hergestellt wurden. Von besonderer Bedeutung ist die Beobachtung, daß Rinderfibroblasteninterferone an Rindernieren-Zellinien etwa 30-fach aktiver sind als an Humanamnion-Zellinien, während sich für Humanfibroblasten IFN eine umgekehrte Beziehung ergab. (12)

Tabelle III

Tabelle IV

Interferonaktivität in Extrakten von E. coli

Bakterielle Extrakte wurden hergestellt und ihre Inter­ feronaktivität bestimmt, wobei man die Rindernieren-MDBK-Zell­ linie und die Humanamnion-WISH-Zellinie und VSV zur Infektion gemäß Weck et al., 1981, verwendete.

Arzneipräparate

Die Verbindungen der Erfindung können nach üblichen Verfahren zu Arzneipräparaten verarbeitet werden, wobei die tierischen Interferonprodukte mit einem oder mehreren verträglichen Trä­ gerstoffen kombiniert werden. Entsprechende Trägerstoffe und deren Formulierung sind bekannt. Diese Arzneipräparate ent­ halten eine wirksame Menge Interferonprotein zusammen mit ei­ ner geeigneten Menge an Träger, so daß pharmakologisch ver­ trägliche Arzneipräparate, die sich zur Verabreichung an den Wirt auf üblichen Verabreichungswegen, beispielsweise paren­ teral, eignen, erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen tierischen Interferone existieren in natürlichen allelen Variationen. Diese Variationen können sich durch Unterschiede in bezug auf eine oder mehrere Amino­ säuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitu­ tionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren in dieser Sequenz bemerkbar machen. Sämtliche derartigen allelen Variationen fallen unter den Gegenstand der Erfindung.

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Claims (6)

1. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von DNA, die für ein Interferon einer Tierspezies kodiert, oder Fragmenten davon, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) eine genomische DNA-Bibliothek der Tierspezies erstellt,
• b) die DNA-Bibliothek einem Hybridisierungs- Screening mit einer DNA-Sonde unterwirft, die Human-Interferon-DNA enthält, und
• c) diejenigen Klone, die ein positives Hybridi­ sierungssignal ergeben, isoliert und die DNA gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA der zu untersuchenden Tierspezies zuerst mittels Elektrophorese auftrennt und unter unter­ schiedlichen Hybridisierungsbedingungen gegen die Interferon-DNA der anderen Spezies hybridisiert, um geeignete Hybridisierungsbedingungen für das Screening der DNA-Bibliothek zu bestimmen.

3. Für ein Interferon einer Tierspezies kodierende DNA, erhältlich nach dem Verfahren von Anspruch 1 oder 2.

4. Verwendung der DNA nach Anspruch 3 zur Herstellung eines tierischen Interferons durch rekombinante DNA- Technik, wobei man in einem transformanten Mikroorganismus oder einer transformanten Zellkultur eine Expression der DNA durchführt und das entsprechende tierische Interferon gewinnt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein tierisches Interferon aus der Gruppe der Rinder-Leukozyten-, -Fibroblasten- und -Immun­ interferone herstellt.

6. Tierisches Interferon mit einer in den Fig. 3a-d, 9a-c oder 13 dargestellten Aminosäuresequenz und dessen Allelvariationen mit Interferon-Aktivität, wobei die Figuren Bestandteil dieses Anspruchs sind.