PL153902B1 - Method of producing polypeptide containing sequences of amonoacids of animal interferon - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego sekwencje aminokwasów interferonu zwierzęcego.

W zakresie prac nad wynalazkiem wyodrębniono i zidentyfikowano sekwencje DNA kodujące interferony zwierzęce oraz dokonano konstrukcji rekombinantowych nośników ekspresyjnych DNA zawierających wspomniane sekwencje DNA operatywnie połączone .z promotorem wywołującym ekspresje sekwencji. W doświadczeniach korzystano z układów hodowli komórekgospodarzy, takich jak rozmaite drobnoustroje i komórki kręgowców, transformowane wspomnianymi nośnikami ekspresyjnymi i przez to ukierunkowane na ekspresje omówionych dalej sekwencji DNA.

Wynalazek wynika częściowo z odkrycia sekwencji DNA (oraz wyprowadzonej z niej sekwencji aminokwasów), kodującej serie interferonów bydlęcych, łącznie z jej 3'- i 5'-skrajnymi sekwencjami ułatwiającymi włączenie jej in vitro do nośników ekspresyjnych. To odkrycie . z kolei umożliwia rozwój środków i metod wytwarzania, rekombinantową technologię DNA, wystarczających ilości interferonów zwierzęcych, do dalszego określania ich właściwości biochemicznych i bioaktywności, umożliwiając efektywne ich wytwarzanie w celu wykorzystania przemysłowego i biologicznego.

Publikacje i inne materiały omówione w niniejszym opisie w celu objaśnienia tła wynalazku, a w poszczególnych przypadkach w celu dostarczenia dodatkowych szczegółów odnoszących się do jego praktycznego zastosowania, ponumerowano oraz zgrupowano na końcu opisu.

Komponenty interferonowe wyodrębniono z tkanek różnych gatunków filogenetycznie niższych od człowieka (1-3). Badania aktywności prowadzone z tymi interferonami wykazały rozmaity stopień aktywności przeciwwirusowej w organiźmie zwierzęcia-gospodarza (3-6). Wykazano także, że te interferony nie zawsze są gatunkowo swoiste. Np. preparaty bydlęcych interferonów wyodrębnione z tkanek wykazywały aktywność przeciwwirusową wobec komórek małpich i ludzkich (7). Podobnie, stwierdzono, że interferony ludzkie są czynne w różnych komórkach gatunków filogenetycznie niższych (7).

153 902

Można przypuszczać, że ta aktywność międzygatunkowa jest zależna od wysokiego stopnia zachowawczości homologicznej między interferonami, tak w składzie aminokwasowym, jak i w sekwencji. Tym niemniej, wyjśnienie to pozostawało dotychczas w sferze teoretycznej, ponieważ możliwe do otrzymania ilości interferonów zwierzęcych (i ich czystości), były niewystarczające do przeprowadzenia jednoznacznych badań dotyczących charakteryzacji i biologicznych właściwości oczyszczonych komponentów wobec kilku ich ludzkich ' odpowiedników (8—12).

W każdym przypadku mimo że uzyskiwano niewielkie ilości niedostatecznie oczyszczonych preparatów, ustalono zależność przyczynową między interferonem a aktywnością przeciwwiru— sową w organiźmie zwierzęcia—gospodarza. Zatem, wytwarzanie interferonów zwierzęcych z dużą wydajnością i czystością byłoby wielce pożądane dla zainicjowania i efektywnego prowadzenia eksperymentów dotyczących badań biologicznych na zwierzętach, prowadzących do wykorzystania przemysłowego z przeznaczeniem do leczenia u zwierząt zakażeń wirusowych i stanów chorobowych związanych z nowOtworami złośliwymi, immunosupresją i deficytem immunologicznym. Poza tym, wytwarzanie interferonu poszczególnych gatunków zwierzęcych ułatwi ich charakterystykę fizyczną oraz bioaktywność, co da podstawę do usystematyzowania i, w konsekwencji, do badań porównawczych z ludzkimi odpowiednikami interferonowymi (8—20).

Dotychczas przeprowadzone badania z interferonami zwierzęcymi, z uwagi na ich małą dostępność, ograniczały się raczej do stosowania preparatów surowych, a mimo to wykazały bardzo ważne funkcje fizjologiczne interferonu. Interferony zwierzęce nie tylko wykazują skuteczną aktywność przeciwwirusową, ale są także potencjalnym uzupełnieniem profilaktycznym działania szczepionek lub antybiotyków i kandydatami na leki wielce obiecujące pod względem klinicznym i przemysłowym.

Uświadomiono sobie także, że zastosowanie rekombinantowej technologii DNA może stanowić najskuteczniejszą drogę do otrzymywania potrzebnych ilości interferonów zwierzęcych, niezbędnych -dla uzyskania możliwości wykorzystania ich klinicznego i przemysłowego. Niezależnie od tego czy w tak wytworzonych materiałach będzie występować glikozylacja, którą uważa się za charakterystyczną dla materiałów natywnych, będą one prawdopodobnie wykazywać bioaktywność umożliwiającą użycie ich w leczeniu, i to w szerokim zakresie, stanów chorobowych lub chorób wirusowych, nowotworowych lub związanych z immunosupresją u zwierząt.

Rekombinantowa technologia DNA osiągnęła stadium pewnego- nagromadzenia doświad— czeń. Fachowcy w dziedzinie biologii molekularnej są w stanie dość łatwo dokonać rekombinacji różnych sekwencji DNA, otrzymując nowe jednostki DNA zdolne do tworzenia w transformowanych drobnoustrojach egzogennego- produktu białkowego- i to w znacznej ilości. Istnieją ogólne środki i metody łączenia in vitro różnych wolnych lub „lepkich końców fragmentów DNA, z utworzeniem sprawnych nośników ekspresyjnych użytecznych przy transformowaniu poszczególnych organizmów i kierujących przez to skuteczną syntezą żądanego produktu egzogennego. Tym niemniej, z punktu widzenia uzyskiwania indywidualnego produktu, droga ta pozostaje skomplikowana a i wiedza niejest zaawansowana do takiego stopnia, który pozwoliłyby na przewidywanie powOdzenia.

Podstawowym czynnikiem wykorzystywanym w technologii rekombinantowego DNA jest plazmid, niechromosomalna pętla dwuniciowego DNA znajdowana w bakteriach i innych drobnoustrojach, często w wielu egzemplarzach na komórkę. W skład informacji, zakodowanej w plazmidowym DNA, wchodzi informacja wymagana do reprodukcji plazmidu w komórkach potomnych (to jest początek replikacji) i zwyklejedna, lub więcej, fenotypowych, selekcyjnych cech charakterystycznych, takichjak, wprzypadku bakterii, oporność na antybiotyki, które pozwala na rozpoznanie klonów komórek—gospodarzy zawierających plazmid, o którym mowa, przez wybiórczy wzrost na podłożach selekcyjnych. Użyteczność plazmidów polega na tym, że mogą być one specyficznie rozszczepiane przez tę lub inną endonukleazę restrykcyjną, czyli „enzym restrykcyjny, przy czym każda z nich rozpoznaje inne miejsce w plazmidowym DNA. Tak więc, można włączyć do plazmidu heterologiczne geny lub fragmenty genów przez łączenie końców w miejscu rozszczepienia łub zrekonstruowanych końców przylegających do miejsca rozszczepienia. W ten sposób powstają tak zwane zdolne do replikacji nośniki ekspresyjne. Rekombinację DNA przeprowadza się poza komórką, ale powstający w rezultacie „rekombinantowy, replikujący się

153 902 nośnik ekspresyjny lub plazmid można wprowadzić do komórek za pomocą procesu zwanego transformacją, otrzymując przy wzroście transformenta duże ilości rekombinantowego nośnika zawierającego gen heterologiczny.

Ponadto, jeżeli gen jest włączony prawidłowo w odniesieniu do części plazmidu, która kieruje transkrypcją i translacją zakodowanej w DNA informacji, otrzymanego nośnika ekspresyjnego można użyć dofaktycznego wytwarzania sekwencji polipeptydowej, którą włączony gen koduje, . nazwanego dalej ekspresją.

Ekspresja inicjowanajest w regionie zwanym promotorem, rozpoznawanym przez polimerazę DNA, która się do niego · przyłącza. W transkrypcyjnej fazie ekspresji DNA rozwija się, co· pozwala na jego ekspozycję jako matrycy w celu inicjacji syntezy informacyjnego RNA w oparciu o sekwencję DNA. Informacyjny RNA ulega z kolei translacji do polipeptydu o· sekwencji lipeptydowej, którą włączony gen koduje, aminokwasów zakodowanej w mRNA. Każdy aminokwas jest zakodowany przez tryplet nukleotydowy, czyli „kodon. Kodony wspólnie tworzą „gen nym promotorem, rozpoznawanym przez polimerazę strukturalny, to jest część kodującą sekwencaminokwasów polipeptydowego produktu ekspresji. Translacja zaczyna się od sygnału „start zwija się, co pozwala (zwykle ATG, który w powstającym informacyjnym RNA staje się AUG). celu inicjacji syntezy informacyjnego RNA w Tak zwane kodony stop określają koniec translacji i od tego punktu tworzenie nowej jednostki złożonej z aminokwasów. Produkt można otrzymać przez ewentualną lizę komórek-gospodarzy z wykorzystaniem metod mikrobiologicznych i wydzielenie produktu za pomocą odpowiedniego oczyszczenia od innych białek.

W praktyce, za pomocą technologii rekombinantowego· DNA można przeprowadzać ekspresje całkowicie heter ologicznychpolipeptydów w tak zwanej bezpośredniej ekspresji, albo alternatywnie, można przeprowadzać ekspresję heterologicznego polipeptydu połączonego z częścią sekwencji aminokwasów homologicznego polipeptydu. W tych ostatnich przypadkach żądanemu produktowi bioaktywnemu nadaje się czasem bionieaktywność w ramachpołączonego, homologicznie heterologicznego polipeptydu, aż do rozszczepienia w środowisku zewnątrzkomórkowym (21,22).

Technika hodowli komórek lub tkanek do badań genetycznych i fizjologii komórek jest dobrze ustalona. Dostępne są środki i metody utrzymywania stałych linii komórkowych przez kolejne seryjne pasaże wychodzące od wyodrębnionych, normalnych komórek. Wspomniane linie komórkowe utrzymuje się, w celu użycia do badań, na stałej powierzchni podtrzymującej w podłożu ciekłym, względnie prowadzi się ich wzrost w zawiesienie zawierającej podtrzymujące substancje odżywcze. Powiększenie skali wydaje się nasuwać tylko problemy mechaniczne (23,24).

Sposobem według wynalazku wytwarza się polipeptyd zawierający sekwencje aminokwasów interferonu zwierzęcego. Sposób polega na tym, że prowadzi się hodowlę drobnoustroju lub hodowlę komórkową transformowaną replikującym się nośnikiem ekspresyjnym prowadzącą, do polipeptydu, po czym wyodrębnia się otrzymany polipeptyd, przy czym peptyd ten ewentualnie zawiera aminokwas metioninę przyłączoną do N-końca aminokwasu będącego zwykle pierwszym aminokwasem wspomnianego interferonu lub ewentualnie zawiera odszczepialny koniugat lub białko sygnałowe przyłączone do N-końca aminokwasu powyższego interferonu.

Wynalazek opiera się na odkryciu, że można stosować technologię rekombinantowego DNA do wytworzenia z powodzeniem interferonów zwierzęcych, korzystnie każdego z nich w postaci bezpośredniej i w ilości wystarczającej do przeprowadzenia badań na zwierzętach oraz badań klinicznych, Produkt nadaje się do użycia, we wszystkich postaciach w celu stosowania profilaktycznego lub leczniczego u zwierząt w zakażeniach wirusowych oraz stanach nowotworowych, immunosupresyjnych i deficytu immunologicznego. Postacie interferonu obejmują różne możliwe postacie oligomeryczne, którym może towarzyszyć glikozylacja. Mogą także występować wariacje alleliczne poszczególnych członów tej rodziny. Produkt wytwarzany jest przez drobnoustroje poddane zabiegom z dziedziny inżynierii genetycznej lub przez układy hodowli komórkowych. Tak więc istnieje nowa możliwość wytwarzania i wyodrębniania interferonów zwierzęcych w sposób wydajniejszy aniżeli to było dotychczas możliwe. Znaczącym wynikiem w obecnym wynalazku, w jego najkorzystniejszych zastosowaniach, jest otrzymanie genetycznie kierowanego drobnoustroju lub hodowli komórkowej w celu wytwarzania reprezentatywnego interferonu zwierzęcego, interferonu bydlęcego, wytwarzanego przez komórkę-gospodarza w postaci dojrzałej w ilościach nadających się ' do wyodrębnienia.

153 902

Dla pewnych układów gospodarzy mogą być wynalezione nośniki, przeznaczone do wytwarzanaia konkretnego interferonu zwierzęcego, wydzielanego z komórki-gospodarza w postaci dojrzałej. Uważa się, że interferon zawierający sekwencję sygnałową otrzymaną z 5'-skrajnego regionu odpowiedniego· genu, jest transportowany do ściany komórkowej organizmu-gospodarza, gdzie, pomagając w tym transporcie, część sygnałowajest odszczepiana podczas procesu wydzielania dojrzałego produktu interferowanego. Zastosowanie to ułatwia wydzielanie i oczyszczanie dojrzałego interferonu bez uciekania się do odpowiednich -metod eliminowania zanieczyszczeń wśródkomórkowych białkiem gospodarza lub komórkowym debris.

Sposobem według wynalazku w szczególności wytwarza się interferon bydlęcy, reprezentatywny dla klasy interferonów zwierzęcych w bezpośredniej ekspresji w postaci dojrzałej.

Określenie dojrzały interferon zwierzęcy oznacza tworzony przez hodowlę drobnoustrojów lub komórek interferon zwierzęcy bez peptydu sygnałowego łub peptydu presekwencji bezpośrednio towarzyszącego translacji mRNA interferonu zwierzęcego. Dojrzały interferon zwierzęcy wytworzony sposobem według wynalazku posiada metioninęjako pierwszy aminokwas (obecny na zasadzie insercji kodonu startowego sygnału ATG przed genem strukturalnym), albo gdy metionina zostanę wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowo odszczepiona, posiada swój normalny, pierwszy aminokwas. Dojrzały interferon zwierzęcy można także wytwarzać sposobem według wynalazku razem z przyłączonym białkiem, innym niż zwykły peptyd sygnałowy, przy czym połączenie to może być specyficzne odszczepione w środowisku wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowym (21). Kończąc, dojrzały interferon zwierzęcy można wytwarzać za pomocą bezpośredniej ekspresji bez niezbędnego odszczepienia jakiegokolwiek ubocznego, niepotrzebnego polipeptydu. Jest to szczególnie ważne, gdy dany gospodarz nie może w ogóle, lub nie może wydajnie usuwać peptydu sygnałowego w przypadku, gdy nośnik ekspresyjny jest przeznaczony do ekspresji dojrzałego interferonu ludzkiego· wspólnie zjego peptydem sygnałowym. Tak wytworzony dojrzały interferon odzyskuje się i oczyszcza w zakresie umożliwiającym użycie go w leczeniu stanów chorobowych wirusowych, nowotworowych, immunosupresyjnych i deficytu immunologicznego.

Do interferonów zwierzęcych wytwarzanych sposobem według wynalazku, będących interferonami endogennymi w organizmach zwierząt, należą, w nomenklaturze analogicznej do nomenklatury dla ludzkich interferonów, interferony zwierzęce a (leukocytów), β (fibroblastowe) i γ (odpornościowe). Wszystkie te trzy serie zidentyfikowano- na modelu zwierzęcym. Dalej, w oparciu o przykład bydlęcy, zwierzęce serie a, takjak w przypadku człowieka, złożone są z rodziny białek. Badane interferony wykazują niższy stopień homologn z odpowiednimi ludzkimi interferonami a, aniżeli, albo, wspomniane interferony zwierzęce między sobą, albo ludzkie interferony a między sobą. Oprócz tego, zwierzęce serie β złożone są z rodziny białek różniącej się od ludzkiej. Dodatkowo, wynalazek dotyczy wytwarzania interferonów-hybryd międzygatunkowych i międzyrodzinnych, przy korzystnym użyciu wspólnych miejsc restrykcyjnych w genach różnych interferonów zwierzęcych i sposobu rekombinacji odpowiednich części znanymi metodami (57).

W każdym przypadku, do interferonów zwierzęcych wytwarzanych sposobem według wynalazku należą normalnie endogenne interferony zwierząt z takich rodzin jak ptasia, bydlęca, psia, końska, kocia, kozia, owcza, rybia i świńska. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania interferonów zwierząt parzystokopytnych, takich jak bydło, owce i kozy. Interferony otrzymywane sposobem według wynalazku znajdują zastosowaniejako czynniki przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe w organiźmie odpowiedniego zwierzęcia-gospodarza. Np. bydlęce interferony mogłyby znaleźć praktyczne zastosowanie w leczeniu chorób związanych z układem oddechowym u bydła, albo w połączeniu ze znanymi antybiotykami jako składnik leczniczy, albo ze szczepionkami jako składnik profilaktyczny. Użyteczność interferonów tej klasy może rozciągać się na inne bydło oraz kozy, owce, świnie, konie, psy, koty i ptaki oraz ryby, przy czym można oczekiwać, że działanie przeciwnowotworowe odpowiednich interferonów będzie szczególnie istotne.

Następujące postępowanie przedstawione w odniesieniu do interferonu bydlęcego jako reprezentatywnego dla klasy, można zastosować do wytwarzania interferonów zwierzęcych sposobem według wynalazku.

1. Tkanki b}^dll^<3^, np. tkankę bydlęcej sśę w possać z^i^iroi^c^r^^e^o proszku i traktuje w ten sposób, żeby RNA i materiał białkowy uległ strawieniu i aby po strąceniu uzyskać bydlęcy DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

153 902 5

2. Wspomniany DNA o wysokiej masie cząsteczkowej częściowo trwawi się za pomocą losowego, jeśli chodzi o· locus genu, nacinania.

3. Powstałe fragmenty DNA frakcjonuje się pod względem wielkości, otrzymuje fragmenty o 15-20 kilopar zasad.

4. Fragmenty otrzymane w stadium 3 klonuje się używając nośnika fagowego λ Charon 30.

5. Tak przygotowane nośniki przeprowadza się in yitro do zakaźnych cząstek fagowych zawierających DNA w celu uzyskania zbioru fagów. Namnaża się je - w komórkach bakteryjnych o^koło ^l0“x. ^Fa^gi wystewa s^ię na ^płyt^ki do rzecz^ywⁱste^go rozpymęcia s^ię wars^tw^y Ijalkteru ^{i p}o^ddaje screningowi pod względem hybrydyzacji z promieniotwórczą próbką sondującą interferon.

6. Odpowiadający DNA wyodrębnia się z odpowiednich klonów, sporządza mapy restrykcyjne i analizuje przez hybrydyzację metodą Southerna. Fragmenty restrukcyjne zawierające geny bydlęcego interferonu subklonuje się w nośnikach plazmidowych i tworzy się sekwencje.

7. Sekwencje DNA przygotowuje się in vitro do intersercji do odpowiedniego nośnika ekspresyjnego, który stosuje się do transformowania odpowiednich- komórek-gospodarzy i któremu z kolei pozwala się rosnąć w hodowli z ekspresją wytwarzanego produktu w postaci interferonu bydlęcego.

8. Tak wytworzony interferon bydlęcy zawiera w swojej dojrzałej postaci 166 aminokwasów, zaczynających się od cysteiny i 23 w presekwencji i wykazuje charakter w znacznym stopniu hydrofobowy. Masę cząsteczkową jego monomeru obliczono na około 21409. Jego charakterystyka była podobna do ludzkiego interferonu leukocytowego (8-11). Stwierdzono około 60% homologii z ludzkim interferonem· leukocytowym.

A. Drobnoustroje/hodowle komórkowe.

1. Szczepy bakteryjne/promotory.

Próby wykonano stosując, między innymi, drobnoustrój E.coli K-12 szczep 294 /end A, thi, ' hsr”, khsm⁺/ (25). Szczep ten zdeponowany jest w American Type Culture Collection, ATCC nr rejestracyjny 31446. Jednakowoż użyteczne są i inne szczepy bakteryjne w tym znane szczepy E.coli, takie jak E.coli Χ1776 /ATCC 31537/ i E.coli W 3110 /F, λ~, protrofowy/ /ATCC 27325/, E.coli DP50SuPF /ATCC 39061, zdeponowany 5 marca 1982/, E.coli JM 83 /ATCC 39062, zdeponowany 5 marca 1982/ oraz inne szczepy drobnoustrojów, z których wiele zdeponowano i są (potencjalnie) dostępne w znanych instytucjach kolekcjonujących drobnoustroje, takichjak American Type Culture Collection /ATCC/, patrz Katalog ATCC (oraz także 26 i 26a). Do tych innych drobnoustrojów należą np. Bacilli, takie jak Bacillus subtilis oraz inne Enterobacteriaceae, spośród których wspomnieć można przykładowo o Salmonella typhimurium, o Serratia marcescens, z· użyciem plazmidów, które mogą replikować się w nich i wywoływać ekspresję sekwencji genów heterologicznych.

Dla przykładu, do inicjacji i utrzymywania wytwarzania polipeptydów heterocyklicznych przez drobnoustroje korzystnie stosuje się układ promotora J-laktamazy i laktozy. Ze szczegółami odnoszącymi się do przygotowania i konstrukcji tych układów promotorowych można zapoznać się w odnośnikach 27 i 28. Niedawno odkryto układ bazujący na operonie tryptofanowym,· tak zwany układ promotora trp. Szczegóły odnoszące się do przygotowywania i konstrukcji tego układu opublikowali Goeddel i wsp. /12/ i Kleid i wsp. /29/. Odkryto też i wprowadzono do użycia inne promotory drobnoustrojowe, a także opublikowano szczegóły odnoszące się do ich sekwencji nukleotydowych, ułatwiające fachowcom funkcjonalne włączenie tych układów do nośników plazmidowych (patrz 30).

2. Szczepy drożdży/promotory.

W opisanym układzie ekspresyjnym można także zastosować plazmid YRp7 (31-53), nadający się do selekcji i replikacji zarówno w E.coli jak i w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Selekcje w drożdżach umożliwia posiadanie przez plazmid genu TRP1, który uzupełnia (pozwala na wzrost w nieobecności tryptofanu) drożdże z mutacją w tym genie, znajdowanym w chromosomie IV drożdży (34). Użytecznym szczepem jest szczep RH (35) zdeponowany w American Type Culture Collection bez ograniczeń /ATCC 44076/. Jednakże należy rozumieć, że dowolny szczep Saccharomyces cerevisiae z mutacją czyniącą komórkę trpl powinien być dobrym podłożem do ekspresji plazmidu zawierającego układ ekspresyjny. Przykładem innego szczepu, który może być użyty, jest pep4-l (36). Ten szczep auksotroficzny pod względem tryptofanu wykazuje także mutację w genie TRPl.

153 902

5'-skrąjna sekwencja DNA promotora z genu drożdżowego (dehydrogenazy alkoholowej I), gdy zostanie umieszczona po· stronie 5' genu nie pochodzącego z drożdży, może powodować ekspresje obcego genu w drożdżach, jeśli wchodzi w skład plazmidu użytego do transformowania drożdży. Opróczpromotora, prawidłowa ekspresja w drożdżach genu nie pochodzącego z drożdży wymaga drugiej sekwencji drożdżowej umieszczonej na końcu 3' genu nie pochodzącego z drożdży w plazmidzie tak, aby pozwolić na prawidłowe zakończenie transkrypacji i poliadenylacji w drożdżach. Promotor ten może być odpowiednio zastosowany w sposobie według wynalazku, jak również i inne promotory (patrz niżej). W korzystnych zastosowaniach 5'-skrajna sekwencja drożdżowego genu kinazy 3-fosfoglicerynianowej (37) umieszczona jest przed genem strukturalnym, po którym następuje DNA zawierający sygnały zakończenia - poliadonylacji, np. gen TRP1 (31-33),. albo· gen PGK (37).

Ponieważ drożdżowa 5'-skrajna sekwencja (w połączeniu z drożdżowym DNA 3'-zakończenia) (patrz niżej) może działać w kierunku wywołania ekspresji obcych genów w drożdżach, wydaje się prawdopodobne,że5'-skrajnesekwencjejakiegokolwiekgenu drożdżowego zwysoką ekspresją mogą zostać użyte w celu ekspresji produktów genowych. Ponieważ w pewnych okolicznościach występuje w drożdżach ekspresja enzymów glikolitycznych do 65% ich białek rozpuszczalnych (38) i ponieważ ten wysoki poziom okazuje się wynikiem wytwarzania na wysokim poziomie indywidualnych mRNA (39), powinno być możliwe, w celu ekspresji, użycie 5-skrajnych sekwencji jakichkolwiek innych genów glikolitycznych, takich jak genenolazy, dyhydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej, heksokinazy, dekarboksylazy pirogronianowej, fosfofruktokinazy, izomerazy gIukozo-6-fosforanowej, mutazy 3-fosfoglicerynianowej, kinazy pirogronianowej, izomerazy· triozofosforanowej, izomerazy fosfoglukozowej i glukokinazy. Można także użyć jakiegokolwiek z S-skrajnych sekwencji tych genów we wspomnianych układach ekspresyjnych w celu prawidłowego zakończenia ipohadenylacji mRNA (patrzjak wyżej). Niektórymi innymi genami z wysoką ekspresją, są geny fosfataz kwaśnych (40) i geny wykazujące wysoki poziom eksprsji zależny od mutacji w 5ⁱ-skrajnym regionie (mutanty z podwyższoną ekspresją), co jest zazwyczaj zależne od przemieszczanego elementu TY1 (41).

Uważa się, że wszystkie wspomniane wyżej geny są transkrybowane przez drożdżową polimerazę RNA II (41). Jest to możliwe, że promotory polimerazy RNA I i III, które dokonują transkrypcji genów rybosomalnego RNA, SS RNA i tRNA (4142) mogą także być użyteczne w tych konstrukcjach ekspresyjnych.

Wreszcie wiele promotorów drożdżowych zawiera także elementy kontrolne transkrypcji, tak, że mogą być wyłączone i włączane przy zmianach warunków wzrostu. Pewnymi przykładami tych promotorów drożdżowych są promotory genów następujących białek: dehydrogenazy alkoholowej II, izocytochromu-c, fofatazy kwaśnej, enzynów degradacyjnych związanych z metabolizmem azotu, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy (39). Taki region kontrolny byłby użyteczny w kontrolowaniu ekspresji produktu białkowego, zwłaszcza gdy jego wytwarzanie byłoby toksyczne dla drożdży. Powinno także być możliwe łączenie regionu kontrolnego jednej 5-skrajnej sekwencji z drugą 5'-skrąjną sekwencją, zwierającego promotor genu o wysokiej ekspresji. Powinno to dać w wyniku promotor hybrydowy a powinno być możliwe, ponieważ region kontrolny i promotor okazują się fizycznie różnymi sekwencjami DNA.

3. Układy hodowli komórkowych/nośniki dla hodowli komórkowych.

Namnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowla tkanek) stało się w ostatnich latach metodą rutynową (43). Można zastosować linie małpich fibroblastów nerki COS-7 jako gospodarza w celu wytwarzania interferonów zwierzęcych (44). Tym niemniej, wyszczególnione te próby można przeprowadzić za pomocą dowolnej linii komórkowej zdolnej do replikowania i ekspresji zgodnego nośnika, takiej j‘ak linia WI38, EHK, 3T3, CEO, VERO i HaLa. Dodatkowo, w nośniku ekspresyjnym wymaganyjest początek replikacji i promotor zlokalizowany przed genem, który ma ulegać ekspresji, wraz ze wszystkimi niezbędnymi miejscami przyłączania rybosomów, miejscami łączenia RNA, miejscami poliadenylacji i sekwencjami zakończenia transkrypcji.

Podczas gdy w niniejszym opisie opisano stosowanie tych zasadniczych elementów z SV40, należy rozumieć, że wynalazku, aczkolwiek opisany on jest w korzystnych swych zastosowaniach, nie należy uważać za ograniczony do tych tylko sekwencji. I tak, np. można użyć na początku

153 902 replikacji rozmaitych nośników wirusowych, takich jak Polyoma, Adeno, VSV, BPV i tak dalej, jak również początków replikacji DNA pochodzenia komórkowego, które mogą działać w stanie , nie zintegrowanym.

B. Układy nośników.

1. Bezpośrednia ekspresja dojrzałego interferonu bydlęcego w E.coli.

Sposób · stosowany w celu otrzymania bezpośredniej ekspresji interferonu bydlęcego· w E.coli w postaci dojrzałego interferonowego polipeptydu (minus sekwencja sygnałowa) obejmuje kombinację plazmidu zawierającego fragment promotora i sygnał startu translacji z przygotowywanym fragmentem DNA zwierzęcego genomu, który zawiera region kodujący dojrzały interferon.

2. Ekspresja w drożdżach.

W celu ekspresji w drożdżach genu heterologicznego, takiego jak DNA genu interferonu zwierzęcego, niezbędne jest skonstruowanie nośnika plazmidowego zawierającego cztery składniki. Pierwszym składnikiem jest część pozwalająca na transformacje zarówno E.colijak i drożdży, musi więc ona zawierać nadający się do selekcji gen z każdego organizmu, takijak gen oporności na ampicylinę z E.coli i gen TRP1 z drożdży. Część ta wymaga także początku replikacji z obu organizmów, aby można było utrzymywać plazmidowy DNA z obu tych organizmów, takiego jak początek E.coli i pPR322 i początek ars 1 z chromosomu III drożdży.

Drugim składnikiem plazmidu jest 5'-skrajna sekwencja z wykazującego wysoką ekspresję genu, powodująca transkrypcję poniżej genu strukturalnego, taka jak 5'-skrajna sekwencja z drożdżowego genu kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK).

Trzecim składnikiem układu jest gen strukturalny skonstruowany w ten sposób, że zawiera on zarówno sygnał startu translacji ATG, jak i sygnał zakończenia translacji. Wyodrębnienie i konstrukcję tego genu opisano w dalszej części opisu.

Czwartym składnikiem jest sekwencja drożdżowego DNA zawierająca 3'-skrajną sekwencję genu drożdżowego, która zawiera prawidłowe sygnały zakończenia transkrypcji i poliadenylacji.

3. Ekspresja w hodowli komórek ssaków.

Strategia syntezy interferonu odpornościowego w hodowli komórek ssaków zależna jest od rozwoju konstrukcji nośnika zdolnego do autonomicznej replikacji jak i do ekspresji obcego genu pod kontrolą heterologicznej jednostki transkrypcyjnej. replikacje tego nośnika w hodowli tkanek można przeprowadzać zapewniając początek replikacji (otrzymany z wirusa SV40) oraz zapewniając funkcję pomocniczą (antygen T) przez wprowadzenie nośnika do komórek wykazujących endogenną ekspresję tego antygenu (46, 47). Późny promotor wirusa SV40 gen strukturalny interferonu poprzedza i zapewnia transkrypcje genu.

Użyteczny nośnik powodujący ekspresję składa się z sekwencji pBR322, co zapewnia cechę selekcyjną w E.Coli (oporność na amicylinę), jak również początek replikacji DNA z E.coli. sekwencje te otrzymuje się z plazmidu pML~¹ (46) i zawierają one region między miejscami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI. Początek z SV40 otrzymuje się z fragmentu PuvII-HindIII zawierającego ten region (48,49) (obydwa końce przeprowadzone w końce EcoRI). Sekwencje te, w dodatku do początku replikacji DNa wirusowego pochodzenia, mają zakodowany promotor zarówno dla wczesnej jak i późnej jednostki transkrypcyjnej. Orientacja regionu pochodzącego z SV40 jest taka, że promotor tej późnej jednostki transkrypcyjnej umieszczony jest blisko genu kodującego interferon.

Sposób · według wynalazku zostanie bliżej zilustrowany w nawiązaniu do załączonych rysunków, na których fig. 1 przedstawia wyniki hybrydyzacji metodą Southerna a/ ludzkich, b/ bydlęcych i c/ świńskich, genomowych DNA trawionych EcoRI i poddanych hybrydyzacji przy różnych stężeniach formamidu ze znakowanym ³²p fragmentem EcoRI o 570 bp zawierającymi region kodujący hybrydowy A/D ludzki interferon leukocytowy. Hybrydyzacja w 20% formamidzie daje najjaśniejszy obraz mutagenności genów rodzin interferonów bydlęcych i świńskich; fig. 2 — przedstawia wyniki hybrydyzacji metodą Southerna czterech różnych rekombinantów fagowych bydlęcych genomowych DNA trawionych EcoRI, BamRI lub Hindlll i poddanych hybrydyzacji z ludzką leukocytową, znakowaną 3²p, próbką sondującą. Klon 83 daje dwa fragmenty hybrydyzujące do każdego z enzymów restrykcyjnych. Fig. 3a przedstawia część sekwencji nukleotydów z plazmidowego podklonu p83BamHI 1,9 kilozasad /kb/jak również wyprowadzoną sekwencję aminokwasów kodowanego przez nią bydlęcego interferonu leukocytowego. Peptyd sygnałowy

153 902 reprezentowanyjest przez reszty aminokwasowe S1-S23. Fig. 3b przedstawia sekwencję nukleotydów plazmidowego podklonu p67EcoRI, 3,2 kb, jak również wyprowadzoną sekwencję aminokwasów drugiego bydlęcego interferonu leukocytowego (a2); fig. 3c—całkowitą dojrzałą sekwencję nukleotydów plazmidowego podklonu p35EcoRI-BamRI 3,5 kb, jak również wyprowadzoną sekwencję trzeciego bydlęcego interferonu leukocytowego (cr3); fig. 3d — sekwencję nukleotydów plazmidowego podklonu p83EcoRI-BamRI 2,9 kb, j‘ak również wyprowadzoną sekwencję aminokwasów czwartego bydlęcego interferonu leukocytowego wytwarzanego sposobem według wynalazku. Peptyd sygnałowy reprezentowanyjest przez reszty aminokwasowe S1-S23. Dojrzałe białko zawiera 172 reszty aminokwasowe. Należy zauważyć, że koniec składający się z 6 reszt aminokwasowych zależny jest od zmiany zasady w sukleotydzie w pozycji 511, co pozwala na 6 dodatkowych ulegających translacji kodonów przy najbliższym, znajdującym się w fazie, sygnałem stop; fig. 4 — porównanie sekwencji aminokwasów BoOFN-cr 1, al, 3 i «4 z sekwencjami 11 znanych ludzkich interferonów leukocytowych. Podano także aminokwasy konserwatywne wśród wszystkich ludzkich interferonów leukocytowych, wszystkich bydlęcych interferonów leukocytowych oraz w odniesieniu do bydlęcych α 1 i er 4 pozycje, w których zachodzi homologia z większością ludzkich interferonów leukocytowych; fig. 5 jest schematycznym diagramem konstrukcji ekspresyjnego plazmidu pBoINF-α ltrp55 dla bydlęcego' interferonu leukocytowego. Materiałem wyjściowym są: nośnik ekspresyjny pdeltaRIser i fragment BamHI z plazmidowego podklonu p83BamHI 1,9 kb, fig. 6 wyniki hybrydyzacji metodą Southerna bydlęcego DNA trawionego EcoRI względnie Hindlll, BamHI, BglH oraz PvuII, z promieniotwórczo znakowaną próbką sondującą otrzymaną z fragmentów genów BoINF-α 1 lub BoINF-a 4. Każdy gen INF w uprzywilejowany sposób hybrydyzuje z różniącą się podrodziną genów BoINF-α, fig. 7 — mapę restrykcyjną insertów genomowego DNA z trzech fagowych rekombinatów, które hybrydyzują z próbką sondującą z genu ludzkiego interferonu fibroblastowego. Umiejscowienie i orientacja każdego BoINF-jS jest wskazana czarnym prostokątem. Miejsca restrykcyjne zaznaczone gwiazdką reprezentują częściową informację dotyczącą mapowania restrykcyjnego, fig. 8 — dokładniejszą mapę restrykcyjną 3 genów przedstawionych na fig. 7. Kreskowanie oznacza sekwencję sygnałową, a zacienienie — dojrzałą, fig. 9a, 9b i 9c przedstawiają sekwencje nukleotydów i wyprowadzone sekwencje aminokwasów genów BoIFN-β 1, /52 i /5 3, na fig. 10 porównano sekwencje aminokwasów trzech BoIFN-/3 z HuIFN-S, fig. 11 przedstawia wyniki rehybrydyzacji, po hybrydyzacji metodą Southerna jak na fig. 6, z próbką sondującą z genu BoIFN-/3 w warunkach, w których na ogół tylko pojedynczy fragment hybrydyzujący stawałby się widoczny przy przeprowadzaniu analogicznego ekspreymentu z ludzkim genowym DNA i genem HuIFN-/3 (9). Fig. 12 schematycznie przedstawia strategię zastosowaną do· ekspresji trzech BoIFN-/5 pod kontrolą operonu trpE.coli, fig. 13 podaje porównanie 3 wyprowadzonych sekwencji aminokwasów BoIFN-y, HuIFN-y i mysiego IFN-y. Fig. 14a-14e przedstawiają całkowitą nukleotydową sekwencję genu i wyprowadzoną z niego sekwencję aminokwasów świńskiego IFN-al, świńskiego IFN-/51, świńskiego IFN-y, kociego IFN-/51 i króliczego IFN-y, fig. 15 przedstawia homologię wśród następujących interferonów: ludzki, bydlęcy, świński, króliczy, mysi i szczurzy IFN-y. Litery są zgodne z następującymi standardowymi oznaczeniami aminokwasów:

Asp D· Kwas asparaginowy Thr T Treonina Ser S Seryna

Glu E Kwag glutaminowy

Pro P Prolina

Gly G Glicyna

Ala A Alanina

Cys C Cysteina

Val V Walina

Met M Metionina

Ile I Izoleucyna Leu L Leucyna Tyr Y Tyrozyna Phe F Fenyloalanina His H Histydyna Lys K Lizyna Arg R Arginina Trp W Tryptofan Gin Q Glutamina

Asn N Asparagina

Następujący opis szczegółowy ilustruje dokładniej sposób według wynalazku wytwarzania, via rekombinantowa technologia DNA, różnych interferonówzwierzęcych i obejmuje metodologię dającą się ogólnie zastosować do wytwarzania bydlęcych interferonów leukocytowych. Sposóbjest opisany w odniesieniu do układu bakteryjnego.

153 902

Przykład :

A. Wyodrębianie bydlęcego DNA.

W celu zestawienia zbioru genów zwierzęcych wyodrębnia się wysokocząsteczkowy DNA z tkanki zwierzęcej zmodyfikowaną metodą Blina i Stafforda (50). Fragmenty DNA otrzymuje się losowo w odniesieniu do locus genu, frakcjonuje pod względem wielkości i otrzymuje się fragmenty po 15-20 kilozasad do klonowania do nośnika Λ-fagowego (51).

Zamrożoną tkankę, . np. trzustkę bydlęcą, miele się aż do otrzymania miałkiego proszku w środowisku ciekłego azotu, po czym solibilizuje w 0,25 M EDTA, 1% sarkozylu, 0,lmg/ml proteinazy K (stosując 25 ml tego płynu na gram tkanki) w ciągu 3 godzin, w temperaturze 50°C. Otrzymany lepki roztwór odbiałcza się, za pomocą, poddania go 3 razy ekstrakcji fenolem i 1 raz chloroformem, po czym dializuje wobec 50 mM Tris-HCl o pH 8,10 mM EDTA, 10 mM NaCl i trawi poddaną obróbce cieplnej rybonukleazę trzustkową (0,1 mg/ml) w ciągu 2 godzin, w temperaturze 37°C. Po ekstrakcji fenolem i eterem DNA wytrąca się dwiema objętościami etanolu, przemywa 95% etanolem, liofilizuje i ponownie rozpuszcza w buforze TE (10 mM Tirs-HCl p pH 7,5,1 mM EDTA) przez noc w temperaturze 4°C do końcowego stężenia 1-2mg/ml. DNA w ' końcowym preparacie ma cząsteczki dłuższe od 100 kilozasad w oznaczeniu za pomocą elektroferezy w 0,5% obojętnym żelu agarozowym.

B. Częściowe trawienie endonukleazą i frakcjonowanie bydlęcego DNA pod względem wielkości.

0,1 mg próbki bydlęcego DNA trawi się za pomocą 1,25,2,5 i 10jednostek Sau3A, w ciągu 60 minut w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej o objętości 1 ml, ' zawierającej 10 mM Tris- HCl o pH7,5,10 mM MgCb, 2mM dwutiotreitol. Inkubację zatrzymuje się za pomocą dodania EDTA do stężenia 25 mM, ekstrahuje fenolem i eterem, doprowadza octanem sodowym , do stężenia 0,3 M (pH 5,2) i wytrąca 3 objętościami etanolu. DNA rozpuszcza się ponownie w buforze TE w temperaturze 68°C i poddaje sedymentacji w liniowym gradiencie sacharozy 10-40% (51) przy użyciu wirnika Beckman SW 27 przy 27000 obr/min, w ciągu 22 godzin w temperaturze 20°C. 0,5 ml frakcje analizuje się w 0,5% żelu, przy użyciu jako standardu masy cząsteczkowej, strawionego EcoRI DNA Charon 4A (51a). Frakcje zawierające fragmenty DNA o 15-20 kilozasad łączy się, wytrąca etanolem i ponownie rozpuszcza w buforze TE.

C. Zestawienie zbioru bydlęcych genomowych DNA.

Produkt nieorganicznego trawienia bydlęcego DNA o 15-20 ' kb klonuje się do nośnika Charon 30A (52), mającego lepkie końce G-A-T-C utworzone przez usunięcie z faga dwóch wewnętrznych fragmentów BamHI. Charon 30A koduje -się w E.coli szczep DP50SupF (ATCC 39061, zdeponowanego dnia 5 marca 1982 r.) w bulionie NZYDT, zatęża przez wytrącenie glikolem polietylenowym i oczyszcza za pomocą wirowania w gradiencie CsCI (53). Fagowy DNA przygotowuje się za pomocą ekstrahowania meteriału fagowego 2 razy fenolem, 1 raz mieszaniną fenolu i eteru, a następnie zatężenia DNA przez wytrącenie etanolem.

Do otrzymania końcowych fragmentów Charon 30A, łączy się 50 pg fagowego· DNA w ciągu 2 godzin, w temperaturze 42°C, w 25 ml 50 mMTris, HC1 o pH 8,0,10 mM MgCU i 0,15 M NaCl, trawi całkowicie BamHI, ekstrahuje fenolem i eterem i poddaje sedymentacji w gradiencie sacharozy 10-40%, jak opisano w powyższej części opisu. Frakcje zawierające połączone ramiona faga łączy się i wytrąca etanolem.

pg oczyszczonych ramion Charon 30A łączy się ponownie w ciągu 2 godzin w temperaturze 42°C, następnie łączy się za pomocą 400 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 z 0,3 μg bydlęcego. DNA o 15-20 kb za pomocą inkubowania przez noc w temperaturze 12°C w mieszaninie reakcyjnej o objętości 0,075 ml zawierającej 50 mM Tris-HCl o pH 7,5,10 mM MgCk, 20' mM dwutriotreitol i 50 mg/ml bydlęcej albuminy surowiczej. Mieszaninę po łączeniu DNA włącza się następnie do cząstek dojrzałego faga λ używając do włączania układu in vitro (54).

Składniki tego układu - ekstrakt z nadźwiękawiania (SE), lizat z zamrażania-rozmnażania (FTL), białko A, bufory A i Ml, otrzymuje się jak opisano (54). Trzy 1 μ\ próbki połączonego DNA inkubuje się w 15p1 buforu A, 2p/1 buforu Ml, 10p1 Se i lpl białka A w ciągu 45 minut w

153 902 temperaturze 27°C. FEL rozmraża się na lodzie w ciągu 45 minut, łączy z 0,1 objętości buforu Ml, wiruje przy 35000 obr/min w ciągu 25 minut w temperaturze 4°C i 0,075 ml próbki supernatantu dodaje się do powyższej mieszaniny reakcyjnej. Po upływie dodatkowych 2 godzin inkubacji w temperaturze 27°C, ustala się miano małej próbki mieszaniny z włączenia na szczepie DP 50 SupF, jak wyżej. W wyniku tego postępowania uzyskuje się łącznie około 1,1 X10® niezależnych rekombinantów bydlęcego DNA. Pozostałość mieszaniny z _ łączenia namnaża się za pomocą metody płytkowo-lizatowej (52) przez wysiewanie rekombinantów na płytce z DP SupF przy gęstości 10000 jednostek tworzących łysinki/15 cm płytkę agarozowąNZYDT.

D. Scenning zbioru fagów pod względem genów interferonu bydlęcego.

Strategia zastosowana do zidentyfikowania rekombinantów fagowych polega na wykrywaniu homologii nukleotydów z promieniotwórczymi próbkami sondującymi przygotowanymi z klonowanych genów interferonu: ludzkiego leukocytowego·· (8,9), fibroblastowego (12) i odpornościowego (55). Warunki hybrydyzacji ustalono za pomocą hybrydyzacji metodą Southerna (56) genomowego zawierającego DNA. 5j/g każdego z wysokocząsteczkowych DNA (otrzymanych jak wyżej opisano) z łożyska ludzkiego, trzustki bydlęcej i świńskich ślinianek podszczękowych trawi się całkowicie EcoRI, poddaje elektroferezie o 0,5% żelu agarozowym i przenosi na sączki nitrocelulozowe (56). Próbkę sondującą DNA, znakowaną 3²P przygotowuje się z fragmentu EcoRI o 570· bp zawierającego region kodujący białko dojrzałego ludzkiego interferonu leukocytowego hybrydowego A/D w miejscu restrykcyjnym Bglll (57) zwykłymi . metodami (58). Każdy sączek nitrocelulozowy hybrydyzuje się wstępnie przez noc w temperaturze 42°C w5 X SSC (56), 50 mM fosforanie sodowym o- pH 6,5, 0,1mg/mł nadźwiękowionym DNA ze spermy łososia, 5 X roztworze Denhardta (59), 0,1 siarczanie sodowo-dodecylowym, 0,1% pirofosforanie sodowym, który zawiera 10%, 20% -lub 30% formamifu, a następnie hybrydyzuje się zpróbką sonudującą (100 X10® zliczeń/minutę) w tym samym roztworze zawierającym 10%· siarczanu sodowo-dekstranowego (60). Po- całonocnej inkubacji sączki przemywa się- 4 razy 2XSSC, 0,1%· SDS w temperaturze pokojowej, 1 raz 2 X SSC, po· czym eksponuje przez noc na błonę rentgenowską XR-5 Kodak z ekranami intensyfikującymi Dupont Cronex.

Jak to widać na fig. 1, ilość hydryzujących pasm jest najłatwiej wykrywalna w trawionym DNA bydlęcym i świńskim, gdy w hybrydyzacji jest obecny 20% formamid. Wynik ten zapewnia oznaczenie genów interferonów z wielogenowej rodziny interferonów bydlęcych i świńskich analogicznie do ludzkich, przedstawionych uprzednio (12,61). Te same warunki hybrydyzacji stosuje się w sceeningu genów interferonu w zbiorze bydlęcych DNA.

500000 rekombinantów fagowych wysiewa się na płatki z DP50 SupF przy gęstości 10 000 pfu/15 cm płytkę i wykonuje siępodwójne repliki z każdej płytki na sączkach nitrocelulozowych. Postępuje się tak, dla każdej płytki, metoą Bentona i Davisa (62). Sączki hybrydyzuje się z próbką sondującą ludzkiego genu LelF jak wyżej opisano. Otrzymuje się 96 duplikatów hybrydyzujących łysinek, dających silne sygnały przy powtarzanym sceeningu.

Zbiór bydlęcy poddaje się dalszemu sceeningowi pod względem genów interferonu fibroblastowego i odpornościowego. Próbki sondujące przygotowuje się z fragmentu XbaIBgIIII o 502 bp zawierającego nie naruszony gen dojrzałego- ludzkiego interferonu fibroblastowego i z fragmentu Alul o 318 bp (odpowiadającego aminokwasom 12-116) o 318 bp, oraz z fragmentu Mboll (odpowiadającego aminokwasom 99-162) o 190 bp z genowego regionu kodującego dojrzały ludzki interferon odpornościowy (55). Hybrydyzacja 1,2 X10® fagów rekombinantowych pozwala uzyskać 26 klonów odpowiadających bydlęcemu interferonowi fibroblastowemu i 10-odpornościowemu.

E. Charakterystyka faga rekombinantowego.

Fagowy DNA przygotowuje się (sposobem wyżej opisanym) z 12 rekombinantów, które hybrydyzują z próbką sondującą ludzkiego· interferonu leukocytowego. Każdy DNA trawi się pojedynczo kombinacją enzymów EcoRI, BamHI i Hindll, poddaje elektroferezie w 0,5% żelu agarozowym i położenie sekwencji hybrydyzującej ustala się metodą Southerna (56). Porównanie pojedynczo trawionych DNA z klonów 10, 35,78 i 83 przedstawiono na fig. 2. Dla każdego faga wielkość zaobserwowanych fragmentów restrykcyjnych i ich rozłożenie się jest inne i niepokrywające się, co sugeruje, że każdy z czterech fagów zawiera innych gen interferonu bydlęcego. Oprócz tego, trawienie klonu 83 każdym z tych 3 enzymów daje w każdym przypadku 2 oddzielne hybrydyzujące pasma, wskazując, że ten rekombinant może zawierać 2 ściśle połączone geny interferonu.

153 902

F. Podklonowanie genów bydlęcego interferonu leukocytowego.

Fragmenty restrykcyjne z 3 fagów rekombinantowych, które hybrydyzowały z próbką sondującą z ludzkiego genu leukocytowego podklonowuje się do miejsca klonującego dla wielu enzymów restrykcyjnych pUC9, pochodnej pBR322. Plazmid pUC9 otrzymuje się zpBR322 najpierw przez usunięcie fragmentu EcoRI-PviII o 2067 bp, zawierającego gen oporności na tetracyklinę, ą później przez wprowadzenie fragmentu Haell o 425 bp· z faga M12, pochodnej mP9 (62a) do miejsca Haelll otrzymanego ' plazmidu w pozycji 2352 (w stosunku do numeracji pBR322). Fragment Hael z mp9 zawiera N-końcowy region kodujący z genu E.coli lacZ, do którego wprowdzono między 4 a 5 resztę aminokwasową J-galaktozydazy miejsce klonujące dla wielu enzymów restrykcyjnych o sekwencji: CCA AGC TTG GCA CGG ATC CCC GGG. Insercja fragmentu obcego DNA do tych miejsc klonujących przerywa ciągłość między promotorem lac a genem lacZ, przez co' zmienia fenotyp JM83 transformowanego plazmidem z lac+ na lac^-.

Powyżej przedstawione fragmenty są to: a/ fragment BamHI o 1,9 kb i fragment EcoRI o 3,7 kb z klonu 83 (odpowiadającego niepolkrywającym się segmentem tego samego rr^ltor^liii^^nt^^^, b/ fragment BamHI - EcoRI o 3,5 kb z klonu 35 oraz c/ fragment EcoRI z klonu 67. W każdym przypadku 0,1 //g odpowiednio strawionego nośnika łączy się z 10-krotnym molowym nadmiarem oczyszczonego fragmentu, transformuje się nim E.coli szczep JM83 (ATCC 39062, zdeponowany dnia 5 marca 1982 r.) wysiewa na płytki M9 (63), zawierające 0,04mg/ml 5-bromo-4-chloro-3indolilo-j3-D-galaktozydu i 0,2 mg/ml ampicyliny. Zbiera się białe kolonie, które prawdopodobnie zawierają insert DNA w miejscu restrykcyjnym przerywającym region kodujący gen lacZ w pUC9, przenosi się te kolonie do 5 ml bulionu LB z 0,02 mg/ml ampicyliny, prowadzi hodowlę w ciągu kilku godzin w temperaturze -37°C i przeprowadza screening pod względem wprowadzonego fragmentu za pomocą minipreparatyki plazmidowego DNA (64).

G. Sekwencja DNA genu bydlęcego interferonu leukocytowego w klonie 83.

Oznacza się sekwencję DNA rozciągającą się od miejsca BamHI p83BamHI 1,9 kb (fragment o 1,9 kb z podklonu83) chemiczną metodą Maxama-Gilberta (65), co przedstawiono na fig. 3. Najdłuższa otwarta faza odczytywana koduje polipeptyd o 189 resztach aminokwasowych ze znaczną homologią z ludzkimi interferonami leukocytowymi (fig. 4). W analogii z białkami ludzkimi, bydlęcy interferon leukocytowy składa się z hydrofobowego peptydu sygnałowego z 23 aminokwasów, poprzedzającego dojrzałe białko o 166 aminokwasach identyczną sekwencją: SerLeu-Gly-Cys. 4 reszty cysteiny w pozycjach 1,29,99 i 139 są właśnie konserwatywnymi międzygatunkowo. Porównanie homologii w zestawieniu parami między bydlęcymi a ludzkimi interferonami przedstawionio w poniższej tabeli 1. Jak można było oczekiwać, białko bydlęce jest w znacznym stopniu mniej homologiczne (około 60%) z każdym z ludzkich białek, niż te ostatnie między sobą (ponad 80%).

Sekwencję DNA i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasów dla 3 dodatkowych genów interferonu bydlęcego, znajdującą się w plazmidowych podklonach p67EcoRI 3,2 kb, p35EcoRIBamHI 3,5 kb u p83EcoRI 3,7 kb przedstawiono na figurach, odpowiednio, 3b, 3c i 3d.

Jak widać z podsumowania w tabeli 1, podczas gdy BoINF-cr 2 i a 3 kodują peptydy z mniejszymi wyraźnymi różnicami z BoINF-cr 1, białko BoINF-<a4 jest tak różne od innych peptydów bydlęcych, jak jakikolwiek z bydlęcych i ludzkich interferonów leukocytowych.

W celu ustalenia, czy gen 4 pochodzi z klasy białek komórkowych tak obszernej jak klasa innych BoINF-cr, genomowy bydlęcy DNA trawi się kilkoma endonukleazami restrykcyjnymi i hybrydyzuje z promieniotwórczymi fragmentami DNA reprezentującymi genowe regiony kodujące białko a 1 (fragment AvaII o 612 bp, fig. 6) i a 4 (fragment EcoRI-ΧΜηΙ z pBoINF-α 4trpl5) w warunkach silnie wymuszających (50% formamid), które nie pozwalają na hybrydyzację krzyżową 2 genów. Jak widać z fig. 6, każdy gen w uprzywilejowany sposób hybrydyzuje z oddzielnym zestawem fragmentów bydlęcego DNA, co jasno wskazuje na istnienie 2 różnych rodzin peptydów odpowiadających bydlęcemu interferonowi leukocytowemu, w których za reprezentatywnych członków uważać można białka a 1 i a 4.

153 902

Tabela 1

Porównanie różnic, w zestawieniu parami, w sekwencjach kodujących ludzkie i bydlęce INF-c

	cl	c2	c3	a4	aA	cB	cC	cD	cF	oH	cl	aJ	cK
BoINF-a 1		94	92	54	61	62	63	64	61	64	63	61	65
BoINF-c 2	96		91	53	61	61	.64	63	62	63	63	64	64
BoINF-a 3	100	96		45
BoBNF-α 4	52	48	52		54	54	58	55	56	58	56	54	54
HuINF-cA	56	52		39		81	81	83	82	83	81	80	86
HuINF-aB	43	39		48	70		81	77	81	83	80	79	81
HulNF-cC	61	57		52	70	65		81	89	86	94	92	83
HuINF-α D	52	48		48	74	61	65		83	81	80	78	84
HuINF-c F	61	57		52	70	65	100	65		83	89	68	83
HuINF-c H	56	52		52	74	74	74	83	74		84	84	84
HuINF-c I	61	57		52	70	65	100	65	100	74		91	81
HuINF-c J	56	52		48	61	57	91	70	91	65	91		80
HuINF-α K	52	48		48	83	70	74	91	74	91	74	65

W tabeli 1 użyto następujących oznaczeń:

— liczby oznaczają procent homologii —lewa niższa połowa odnosi się do presekwencji 23-aminokwasowej —prawa wyższa połowa odnosi się do dojrzałego białka 166-aminokwasowego — A, B, C itd. oznaczają ludzkie interferony, odpowiednio, A, B, C itd.

H. Bezpośrednia ekspresja dojrzałego BolNF-1 w E.coli,

Konstrukcję plazmidu wykazującego bezpośrednią ekspresję podsumowano na fig. 5. Plazmidowy podklon p83BamHI 1,9 kb trawi się całkowicie AvaII i wyodrębnia fragment o 612 bp, zawierający gen bydlęcego interferonu leukocytowego, za pomocą elektroferezy w 6% żelu poliakryloamidowym i elektroelucji. Około 1,5'pg tych fragmentów trawi się Fnu4H, poddaje ekstrakcji fenolem i eterem i wytrąca etanolem. Utworzone lepkie końce Fnu4H wydłuża się do końców wolnych za pomocą 6 jednostek polimerazy DNAI (fragment Klenowa) w ciągu 30 minut, w temperaturze 12°C, w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20μ1, zawierającej 20 mM Tris-HCl o pH 7,5,10 mM MgCb, 4mM dwutiotreitol oraz dATP, dGTP, dCTP i dTTP, każdy w stężeniu 0,1 mM. Po ekstrakcji fenolem i eterem DNA trawi się Pstl i poddaje elektroforezie w 6% żelu. Po elektroelucji z żelu otrzymuje się utworzony tak fragment, zakończony w rezultacie działania Pstl wolnymi końcami o 92 bp, rozciągający się od pierwszego nukleotydu regionu kodującego dojrzały bydlęcy interferon leukocytowy.

Pozostałość dojrzałego- regionu kodującego otrzymuje się w następujący sposób. 3 pg insertu BamHI z p83-BamHl 1,9 kb trawi się częściowo za pomocą 14 jednostek Pstl w ciągu 10 minut w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej o objętości 45μζ zawierającej 10 mM Tris-HCl o pH 7,5, 10 mM MgCh, 2mM dwutiotritol i ekstrahuje fenolem i eterem. Żądany częściowy fragment Pstl-BamHI rozciągający od 93 nukleotydu dojrzałego regionu kodującego wyodrębnia się z 6% żelu poliakryloamidowego.

Plazmid pdeltaRIsrcjest pochodną plazmidu pSRCexl 6 (66), w którym miejsce EcoRI bliskie promotorowi trp i dalekie od genu src usuwa się przez reperację za pomocą polimerazy DNA I (67) i wprowadza się samokomplementarny ołigodezoksynukleotyd AATTATGATTCAT (zsyntetyzowany metodą fosfotriestową (68) do pozostałego miejsca EcoRI bezpośrednio sąsiadującego z miejscem Xbal. 20 //gpdeltaRIscr trawi się całkowicie EcoRI, ekstrahuje fenolem i eterem i wytrąca etanolem. Następnie trawi się plazmid za pomocą 100 jednostek nukleazy SI w ciągu 30 minut w temperaturze 16°C w 25 mM octanie sodowym o pH4,6, ImM ZnCle i 0,3 M NaCl w celu utworzenia wolnego końca o sekwencji ATG. Po ekstrakcji fenolem i eterem i wytrąceniu etanolem, DNA trawi się BamHI, poddaje elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym i wyodrębnia za pomocą elektroelucji duży fragment nośnika o 4300 bp.

Plazmid ekspresyjny otrzymuje się przez połączenie 0,2//g nośnika 0,02pg fragmentu zakończonego w rezultacie działania Pstl wolnym końcem, o 92 bp oraz 0,25 pg częściowego fragmentu Pstl-BamHI o 1400 bp, za pomocą 400 jednostek ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 12°C i używa się go do transformowania E.coli szczep 294 (ATCC 31446) do oporności na ampicylinę.

153 902

Plazmidowy DNA przygotowuje się z 96 kolonii i trawi Xbal i Pstl. 19 z tych plazmidów zawiera żądane fragmenty Xbal-Pstl o 103 bp i Pstl o 1050 bp. Analiza sekwencji DNA potwierdza, że kilka z tych plazmidów ma kodon inicjacji ATG prawidłowo umiejscowiony na początku regionu kodującego interferon bydlęcy. Jeden z tych plazmidów, pBo'INF-altrp55 został wybrany do dalszych badań.

I. bezpośrednia ekspresja w E.coli dojrzałego bydlęcego interferonu leukocytowego (a-4) należącego do drugiej klasy.

Kodon inicjacji ATG umieszcza się na początku dojrzałego regionu kodującego za pomocą enzymatycznego wydłużenia syntetycznym primerem DNA, GATGTGPGAOTTGTCT. Heptadekamer fosforyluje się za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 i y-32PATP, jak uprzednio opisano (12). 250 pmoli primera łączy się z około 1 jg fragmentu HincII o 319 bp, odpowiadającego resztom aminokwasowym S20 do 102, w 30/zl wody, ogrzewa się do wrzenia w ciągu 5 minut i wydłuża za pomocą 25 jednostek polimerazy DNA I (fragment Klenowa) w temperaturze 37°C, w ciągu 3 godzin. Produkt tej reakcji trawi się HgiAI i powstały fragment o 181 bp z wolnymi zakończeniami HgiAI wyodrębnia się 6% żelu poliakryloamidowego.

Nienaruszony gen dojrzałego peptydu umieszcza się za promotorem trp przez enzymatyczne połączenie powyższego fragmentu z fragmentem HgiA-Pstl o 508 bp zawierającym karboksykońcową część peptydu, a następnie wydłuża się plazmid ekspresyjny dla HuINF-y, pIFN-ytrp4813 (55), po trawieniu go E.coli, za pomocą polimerazy DNA (fragment Klenowa) do uzyskania zrównoważonych końców, trawi się Pstl i w końcu wyodrębnia w 6% - żelu poliakryloamidowym. Po transformacji E.coli -294 powstałą mieszaninę identyfikuje się kilka klonów z przywróconym miejscem rozpoznawania EcoRI między regionem obejmującym promotor trp-miejsce przyłączania rybosomów macierzystego nośnika ekspresyjnego i całkowitym regionem kodującym dojrzały bydlęcy INF (pBo-INF-u4trpl5).

J. Podklonowanie genów bydlęcego interferonu fibroblastowego.

fagowych rekombinantów, które hybrydyzowały z próbką sondującą DNA ludzkiego INF-J oczyszcza się i wyodrębnia DNA do dalszej analizy. Mapowanie restrykcyjne hybrydyzacyjną metodą Southerna wskazuje na to, że 6 wyodrębnionych fragmentów zawiera 3 różne regiony genomu bydlęcego, co sugeruje istnienie wielogenowej rodziny BoINF-jS. Podsumowanie tych czynników przedstawiono na fig. 7jako mapę restrykcyjną. W celu uzyskania dokładniejszej mapy restrykcyjnej i sekwencji nukleotydów dla każdej odróżniającej się klasy rekombinantów, podklonowuje się hybrydyzujące fragmenty do nośników plazmidowych. Dokładniej, fragment BgllTo 5 kb faga λβί i fragment faga BamHIAJ2 klonuje się indywidualnie do pBR322 do miejsca BamHI, zachodzące na siebie fragmenty EcoRI-ΧΗοΟ oraz Pstl-Hpal o 1,4 kb z faga λβ3 wprowadza się do, odpowiednio, pUC9 (pozbawionego miejsc EcoRI-Sall) i pLeIF87 (10) (pozbawionego miejsca Hpal-Pstl).

K. Sekwencje DNA genów trzech różnych bydlęcych INF fibroblastowych.

Figura 8 przedstawia mapę restrykcyjną każdego z genów trzech typów bydlęcych INF-J, które zostały podklonowane. Są one łatwo odróżnialne z powodu obecności miejsc rozszczepiania unikalnych dla każdego z nich. Regiony kodujące peptydy, jak również sekwencje bezpośrednio „w górę“ i „w dół“ od każdego określono za pomocą chemicznej metody Maxama-Gilberta i przedstawiono na fig. 9a, 9b i 9c. Homologia nukleotydowa z sekwencją określającą gen ludzkiego interferonu fibroblastowego (12) pozwala wyprowadzić prawidłową fazę odczytywania i nienaruszoną sekwencję aminokwasów dla każdego produktu bydlęcego genu, obejmującą hydrofobowy peptyd sygnałowy o 21 aminokwasach z następującym po nim dojrzałym białkiem o 185 resztach. Białka bydlęce są całkowicie odróżnialne jedno od drugiego (tabela 2, fig. 10), ale wykazują jeszcze większą różnicę (około 60%) z peptydem ludzkim.

Wielogenowy charakter bydlęcego interferonu fibroblastowego wykazano dalej za pomocą hybrydyzacji metodą Southerna przedstawioną na fig. 11 z promieniotwórczą próbką sondującą otrzymaną, z fragmentu EcoRI-PvuI o 415 bp z pBoINF-J (opisanego poniżej). Jak widać z fig. 11, eksperyment ten dostarcza danych odnoszących się do istnienia genów dodatkowego, homologicznego INF-J. Pasma hybrydyzujące w mniejszym stopniu mogą w rzeczywistości zaprezentować geny o mniejszym stopniu pokrewieństwa, które z kolei kodują bardziej odróżniające się INF-/5.

153 902

Tabela 2

Porównanie homologii, w zestawieniu parami, w sekwencjach bydlęcych bydlęce INF-/3 i ludzki INF-/?
	01	02	03	HujS
j51		138/83/	138/83/	84/51/
02	20/95/		146/88/	92/55/
03	20/95/	19/90		87/52/
Ηϋ0	16/76/	17/81/	1676/

W powyższej tabeli 2 użyto· następującego układu danych: Wykazano ilość identycznych aminokwasów odpowiadających każdej' parze sekwencji kodujących. 21-aminokwasowe peptydy sygnałowe porównano w lewej niższej części tabeli, a dojrzałe 166-aminokwasowe dojrzałe INF-/S w prawej górnej części. Najpierw wymieniona jest odpowiadająca każdej parze ilość identycznych aminokwasów, a następnie procent homologii.

L. bezpośrednia ekspresja w E.coli trzech bydlęcych INF-/? .

Ponieważ geny trzech bydlęcych INF-/? wykazują wiele wspólnych sekwencji DNA i miejsc restrykcyjnych (patrz fig. 8) dogodny jest ogólny schemat ekspresji wszystkich trzech genów. Z powodu identyczności w każdym przypadku sekwencji DNA kodującej pierwsze cztery aminokwasy, zawierającej 2 miejsca Alul, przeznacza się dwa syntetyczne oligonukleotydy do wprowadzania kodonu inicjacji translacji ATG, przywrócenia kodonów pierwszych czterech aminokwasów dojrzałego bydlęcego INF-/S i utworzenie lepkiego· końca EcoRi w celu wprowadzenia po sekwencji promotora trp. Konstrukcję plazmidów ekspresyjnych podano· schematycznie na fig. 12. Łączy się syntetyczne oligomery z fragmentem Ałul-Xhol o 85 bp otrzymanym z plazmidów podklonu BoINF-/3, a następnie trawienie EcoRI i Xhol doprowadza do utworzenia fragmentu o 104 bp z lepkimi końcami EcoRi i Xhol. Nienaruszoną sekwencję kodującą wbudowuje się następnie do nośnika ekspresyjnego trp przez połączenie fragmentu o 104 bp z fragmentem Xhol-Pst o około 700 bp kodującym pozostałość każdego białka BoINF-β oraz z plazmidem pINF-ytr48-13 (55), z którego usunięto wewnętrzny fragment EcoRI-Pstl. We wszystkich utworzonych plazmidach, pBoINF-jSłtrp, ppBoINF-J2trp i pBoINF-?3trp zachodzi prawidłowa translacja genów INF- pod kontrolą operonu trp E.coli.

M. Charakteryzacja i podklonowanie genu bydlęcego interferonu odpornościowego (BoINF-χ).

Oczyszcza się 10 rekombinantów fagowych, które hybrydyzują zpróbką sondującą ludzkiego INF-y i przygotowuje DNAjak wyżej opisano. Wszystkie 10 próbek DNA daje specyficzne pasma hybrydyzacyjne w hybrydyzacji metodą Southerna. Klony 2/4 i 2γ7 wybrano do dalszej analizy, ponieważ wykazują one rozmaity rozkład pasm hybrydyzacyjnych. Mapowanie restrykcyjne tych dwóch klonów wykazuje, że ich sekwencja zachodzi na siebie. Pokrywający się rejon zawiera miejsca restrykcyjne Xbal, EcoRV i Ncol. Analiza sekwencji DNA tych dwóch klonów wykazuje podobieństwo ogólnej struktury genu do struktury genu ludzkiego interferonu odpornościowego (70). Następnie wskazuje na to, że 2/7 zawiera sekwencję kodującą czwarty egzon, a 2/4 zawiera sekwencje kodujące trzy pierwsze egzony genu bydlęcego INF-y, w oparciu o homologię sekwencji DNA z ludzkim genem INF-y. Sekwencja aminokwasów wydedukowana dla BoINF-/ jest na fig. 13 porównana z sekwencją dla HuINF-y (55) i mysiego INF-y.

Do wbudowania nienaruszonego genu INF-y do ciągłego segmentu DNA wyodrębnia się fragment BamHI-Ncol o 3000 bp obejmujący pierwsze z tych trzech egzonów genu bydlęcego INF-y otrzymanego z 2 /4 i fragment Ncol-Hinlll o 2500 bp obejmujący ostatni egzon otrzymany z 2y7. Te dwa fragmenty DNA klonuje się następnie do nośnika BAmHI-Hindlll otrzymanego z pBR322 via łączenie 3 części.

N. Ekspresja bydlęcego genu INF-y w komórkach ssaków.

W celu otrzymania bezintronowej wersji BoINF-y, gdy gen ten jest zdolny do ekspresji w układzie prokariotycznym, takim jak E.coli, gen przygotowuje się do ekspresji na wspólnym poziomie w układzie ekspresyjnym komórek zwierzęcych z otrzymaniem znacznych ilości swoistego mRNA. W celu ekspresji w komórkach OOS (44) fragment BamHI-Hindlll o 5500 bp, obejmujący nie naruszony gen INF-/3, wprowadza się do nośnika SV40. Dokładniej, fragment

153 902

BamHI-Hindlll genu bydlęcego INF-y klonuje się do SV40 plazmidowego nośnika pDLóRl (otrzymanego z plazmidu ekspresyjnego pHBs348-L dla antygenu HBV, przez entymatyczne usunięcie miejsca EcoRI „w górę“ od początku replikacji SV40 wybiórczo kierującego późną transkrypcją. Ekspresyjny plazmid pHBs348-L konstruuje się za pomocą klonowania fragmentu o 1986. bp powstałego po trawieniu HBV za pomocą EcoRI i BgIII (71), (który obejmuje gen kodujący HBsAg) do plazmidu pML (72) w miejscach EcoRI i BamHI, przy czym ML stanowi pochodną pBR322 z delecją eliminującą sekwencje hamujące replikację plazmidu w komórkach małpich (72). Powstały plazmid (pRI-Bhl) przeprowadza się w postać liniową za pomocą EcoRI i fragment o 348 bp reprezentujący region początku SV40 wprowadza się do miejsca EcoRI pRI-Bgl. Fragment obejmujący początek można włączyć w obydwu orientacjach. Ponieważ fragment ten koduje zarówno wczesne jak i późne promotory SV40 w uzupełnieniu początku replikacji, geny HBV mogą ulegać ekspresji pod kontrolą któregokolwiek bądź promotora zależnego od tej· orientacji (pHBs348-L reprezentujący HBs ulegający ekspresji pod kontrolą późnego promotora) między miejscami BamHI a Sali via łączenie trzech części, w obecności fragmentu-konwertora Hindlll o 600 bp otrzymanego z pBR322. Transfekcja powstałego plazmidu do komórek GOS prowadzi do skutecznej ekspresji bydlęcego INF-y pod kontrolą późnego promotora SV40.

PoliA plus mRNA przygotowuje się z podlegających transfekcji komórek COS i stosuje z kolei do przygotowania cDNA znanymi metodami (55). Wyodrębnia się klony cDNA hybrydyzujące z próbką sondującą bydlęcego INF-y. Klon cDNA z najdłuższym insertem Pstl został wybrany do dalszej analizy. Analiza sekwencji DNA w tym klonie cDNA wykazuje, że wszystkie sekwencje imtronowe wyprowadzone z genomowego, klonu INF-y zostały usunięte prawidłowo.

cDNa przygotowuje się do ekspresji w E.coli za pomocą metody reperacji primera opisanej powyżej.

O. Wyodrębnianie cDNa króliczego i bydlęcego INF-y.

cDNa bydlęcego INF-y używa sięjako sondy hybrydyzacyjnej do wyodrębnienia komplementarnej sekwencji DNA króliczego i świńskiego INF-y. Króliczy i świński RNA wyodrębnia się [Berger i in,. Biochemistry, 18, 5143 (1979)] z odpowiednich hodowli króliczych i świńskich komórek śledzionowych indukowanych fitohemaglutininami w stężeniu 10pg/ml i 12-mirystyno13-octanem· forbolu w stężeniu 10pg/ml przez noc. Pojedyncze próbki króliczego i świńskiego RNA przepuszcza się przez' oligo/dT/-celulozę w celu wzbogacenia w mRNA. Dla otrzymania zbiorów cDNA w bakteriofagowym wektorze λ gtl^O (huynh i in., Practical Approaches in Biochemistry, wyd. Grover, IRL, Oxford, England, 1985) stosuje się zbiory dwuniciowego cDNA z 2//g próbek króliczego i świńskiego mRNA. Otrzymuje się 140 klonów hybrydyzujących (140 w przybliżeniu) po screeningu 1,5 X10⁵ rekombinantów fagowych ze zbioru króliczego cDNA, podczas gdy tylko 16 pozytywnych klonów hybrydyzujących otrzymuje się po screeningu 1,6 X10® rekombinantów fagowych ze zbioru świńskiego cDNA. Mapowanie restrykcyjne DNA ukazuje, że większość z tych rekombinantowyh fagów Agt 10 zawiera insert EcoRI w zakresie wielkości od 1 do

1,5 kb. Dwa z fagów (ARy7 i A Ry 13) ze zbioru króliczego eDNA oraz dwa (APyl4 i A Py 16) ze· zbioru świńskiego cDNA podklonowuje się do M13mpl9 [Norrander i in., Gene, 26,101 (1983)] i sekwencjonuje metodą dwudezoksyzakończenia łańcucha (62a).

Nukleotydowe sekwencje DNA klonu najdłuższego cDNA króliczego INF-y/ARy7/ i klonu ' świńskiego INF-y (APyl4/ oraz ich sekwencję aminokwasów przewidywaną na podstawie homologii sekwencji DNA z cDNA ludzkiego INF-y przedstawiono,. odpowiednio, na fig. 14e i 14c. Nie ma różnicy w nukleotydach między dwoma indywidualnymi klonami cDNA króliczego INF-y z wyjątkiem długości poli-A przy końcu 3'. Podobnie, dwa indywidualne klony cDNA świńskiego INF-y mają taką samą sekwencję· DNA z wyjątkiem długości niekodujących regionów 5' i 3'.

P. Sekwencja aminokwasów INF-.

Figura 15 przedstawia homologię sekwencji białkowej INF-y z kilku gatunków saków. Sekwencje sygnałowe ludzkiego, bydlęcego, świńskiego i króliczego INF-y zawierające 23 aminokwasy, podczas gdy sekwencje sygnałowe mysia i szczurza zawierają 22 aminokwasy z powodu delecji przy dziewiętnastym kodonie. Wyznaczenie sekwencji sygnałowej tych zwierzęcych INF-y jest oparte o strukturalną homologię z naturalnym ludzkim INF-y. Ten ciąg aminokwasów wykazuje cechę wspólną dla wydzielniczych białkowych sekwencji sygnałowych z hydrofobowym rdzeniem z 10 aminokwasów rozciągającym się od aminokwasu -7 do -16. Oczekuje się, że

153 902 sekwencja rozpoznawania peptydazy sygnałowej będzie /Cys/sea/-Tya-/Cns-Gly/, odpowiadając aminokwasom -21 do -23 z miejscem rozszczepienia umiejscowionym za -23.

Łańcuchy polipeptydowe dojrzałego ludzkiego, bydlęcego i świńskiego INF-y mają tę samą długość 143 aminokwasów, podczas gdy dojrzały króliczy INF-y ma 144 aminokwasy z dodatkowym aminokwasem przy końcu karboksylowym. Mysi i szczurzy INF-y mają, odpowiednio, tylko 133 i 134 aminokwasy. Porównanie sekwencji aminokwasów pokazuje, że ostatnich 9 reszt aminokwasowych znajdowanych w ludzkim, bydlęcym i świńskim. INF-y uległo delecji w mysim i szczurzym INF-y. Dodatkowo, w mysim INF-y uległa delecji reszta aminokwasowa26. Oprócz mysiego i szczurzego INP-y z cysteiną na C-końcu, która może nie występować in vivo, żaden z innych opisanych tutaj dojrzałych INF-y nie zawiera cystein w ogóle. Tak więc wiązanie dwusiarczkowe nie jest wymagane do utrzymania ogólnej struktury dojrzałego INF-y, chociaż rekombinantowy mysi INF-y o pełnej długości łatwo tworzy mostek dwusiarczkowy wewnątrz dimeru (który nie zmienia aktywności właściwej). Króliczy INF-y zawiera trzy sekwencje potencjalnej N-glikozylacji Asn-X-/Thr/Ser/ [Struck i in., J.Biol.Chem., 253,5786 (1978)], podczas gdy inne pięć INF-y mają, w dojrzałym białku, tylko dwie. Mysi INF-yjestjedynym INF-y z dodatkowym miejscem glikolacji w swoim peptydzie sygnałowym. Pozycja tych miejsc nie jest więc oczywiście konserwatywna wśród rozmaitych INF-y.

Ogólna homologia sekwencji aminokwasów między ludzkim, bydlęcym, świńskim i króliczym INF-y jest około 60%-owa we wzajemnym odniesieniu, podczas gdy homologia między albo mysim albo· szczurzym INF-y, a każdym innym przedstawionym- tu INF-yjest mniejsza od 40%. Homologia między mysim a szczurzym INF-y przekracza 85%.

Q. Synteza bydlęcego, świńskiego i króliczego· INF- w Ecoli.

Sposoby postępowania używane do ekspresji insertu cDNA bydlęcego, świńskiego i szczurzego INF-y bezpośrednio w E.coli' są następujące.. Przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów wprowadza się kodon inicjatorowej metioniny przed klon Gin przypuszczalnego końca aminowego dojrzałego bydlęcego, świńskiego i króliczego INF-y. Ten inicjatorowy kodon ATG jest z kolei poprzedzony przez lepkie końce Xbal. Przenośne fragmenty restrykcyjne zawierające całkowitą dojrzałą sekwencję kodującą INF-y tworzy się przez rozszczepienie z użyciem Xbal i drugiego enzymu restrykcyjnego z unikalnym miejscem restrykcyjnym umiejscowionym przy niekodującym regionie 3' każdego klonu cDNA INF-y, a mianowicie Dral wprzypadku cDNA bydlęcego INF-y, Sspl wprzypadku cDNA świńskiego INF-y i Nail wprzypadku cDNA króliczego INF-y. Powstałe fragmenty restrykcyjne wprowadza się między miejsce Xbal a Pst trp ekspresyjnego plazmidu pINF-63 (patrz wyżej), którego miejsce Xbal j‘est umiejscowione bezpośrednio w dół od miejsca przyłączania rybosomu lidera trp. '

Wysoki poziom ekspresji bydlęcego, świńskiego i króliczego INF-y osiąga się w wyniku stosowania silnego promotora trp i umieszczenia sekwencji przyłączania rybosomu lidera trp w optymalnej odległości od inicjatorowego kodonu ATP wprowadzonej sekwencji kodującej w celu wydajnej translacji. Analiza ekstraktów bakterii niosących ekspresyjne plazmidy bydlęcego, świńskiego lub króliczego INF-y za pomocą elektroforezy w SDS-żelu wykazuje obecność INF- jako głównego pasma żelu dla białek o pozornej masie cząsteczkowej 17 do 18 kilodaltonów.

Te INF-y oczyszcza się do jednorodności z ekstraktów komórkowych E.coli stosując kombinację chromatografii adsorbcyjnej, jonowymiennej i żelowej. Oczyszczone białka rutynowo przechowuje się w temperaturze 4°Ć w stężeniu 0,5-5,0 mg/ml w 20 mM Tris-HCl, 0,5 M Na Cl, pH 8,0, po wyjałowieniu przez sączenie. Stężenie białka określa się stosując test wiązania barwnika typu Bradford z użyciem bydlęcej albuminy surowiczej jako standardu. Na podstawie SDS PAGE z barwieniem tak barwnikiem Coomassie jak i srebrowym sądzi się, że czystość wszystkich tych INF-yjest ponad 98%-owa. Poziom endotoksyny we wszystkich tych preparatach jest niższy od 0,lng/mg (to jest poniżej jednostki endotoksyny/mg). Chromatografia żelowa na kolumnie Pharmacia Superose 12 w warunkach nieredukujących sugeruje, że rBoINF-y, rPoINF-y i rRBINF-y istnieją w roztworze jako dimery o pozornej masie cząsteczkowej, odpowiednio 25,8, 31,6 i 21,0 kiiodaltona. Jednak w 4M cłhorowodorku .gianidyny chromatoografują się one jako monomery. Te wartości odpowiadają dobrze pozornym masom cząsteczkowym znajdowanym w SDS PAGE. Wszystkie trzy rodzaje ciągle niosą iyicąatoaową metioninę (z ekspresji bezpośredniej) na swoim N-końcu.

153 902

R. Określenie ilości genów INF-y w genomie bydlęcym, świńskim i króliczym.

Ilość genów INF-y w różnych genomach ssaków oznacza się stosując hybrydyzację metodą Southerna. Bydlęcy, świński i króliczy DNA chromosomalny trawi się kilkoma, enzymami restrykcyjnymi, frakcjonuje stosując elektroforezę w żelu agarozowym i przenosi się na nitrocelulozę. Hybrydyzację prowadzi się w warunkach ostrych lub .nieostrych z promieniotwórczo znakowanym fragmentem AvaII o 600 bp otrzymanym z klonu cDNA bydlęcego INF-y. Obecność tylko jednego lub dwóch hybrydyzujących pasm po . strawieniu różnymi enzymami restrykcyjnymi wskazuje na· istnienie zaledwie jednej kopii genu INF-y na haploidalny genom. Bydlęcy, świński, króliczy, ludzki i mysi INF-y pochodzą więc wszystkie z genów będących pojedyńczą kopią.

S. Konstrukcja plazmidu bakteryjnego do ekspresji świńskiego INF-y 1.

Wyznacza się dwa syntetyczne nukleotydy

M C_d_L P

5'-AATTCATGTGCGACCTGCC

GTACACGCTGGACGGACT-5' które włączają kodon inicjacji translacji ATG, odtwarzają kodony pierwszych czterech aminokwasów dojrzałego świńskiego INF-crl i tworzą lepkie końce EcoRI i Ddel. Ligowanie tych oligomerów z fragmentem z częściowego trawienia Ddel-Ncol o 150 bp i z fragmentem Ncol-Ahalll o 550 bp pochodzącym z klonu genomowego świńskiego INF-crl tworzy syntetyczno-naturalny gen o 720 bp kodujący dojrzały świński INF-crl ograniczony miejscami EcoRI i AhalU. Włączenie genu świńskiego INF-crl oflankowanego końcami EcoRI i AhalU do plazmidu pINF--/33 [Leung i in., Bio/technology, 2,458 (1984)] między miejsca EcoRI a PsTI daje w wyniku ekspresyjny plazmid pTrpPoAl, w którym świński gen al ulega transkrypcji pod kontrolą operonu trp E.coli.

T. Przygotowanie ekstraktów bakteryjnych.

Całonocną hodowlę w biulionie LB zawierającym albo 0,02mg/ml ampicyliny, albo 0,005 mg/ml tetracykliny, zaszczepia się przy rozcieńczeniu 1:100 50 ml podłoża M9 (63) zawierającego 0,2% glukozy, 0,5% casamino acids i odpowiedni lek, po czym prowadzi się hodowlę ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C aż do uzyskania A5501,0. Drobnoustroje z 10 ml próbki osadza się za pomocą odwirowania i bezpośrednio po tym szybko zamraża w łaźni suchy lód-etanol. Zamrożony osad ponownie zawiesza się w 1ml 7 M guanidyny, inkubuje na lodzie w ciągu 5 minut i rozcieńcza PBS do badania. Alternatywnie, zamrożony osad poddaje się lizie przy użyciu 0,2 ml 20% sacharozy, 10 mM Tris-HCl o pH 8,0,20 mM RDTA i 5 mg/ml lizozymu. Po upływie 20 minut przetrzymywania na lodzie dodaje się 0,8 ml 0,3% triton Χ-100, 0,15 M Tris-HCl o pH 8,0, 0,2 M' EDTA i 0,1 mM PMSF. Lizat klaruje się przez odwirowanie przy 19 000 obr/min w ciągu 15 minut i supernatant po rozcieńczeniu PBS poddaje się badaniom.

U. Badania interferonu.

Aktywność interferonu bydlęcego bada się przez zahamowanie efektu cytopatycznego (CPE) przeprowadzając badanie w płytkach do mikromiareczkowania o 96 dołkach w następujący sposób.

1. Do każdego dołka w płytce do mikromiareczkowania z 96 dołkami (8 rzędów X12 kolumn) dodaje się 100 jul zawiesiny komórek w podłożach zawierających 10% płodową surowicę cielęcą. Stężenie komórek doprowadza się do takiego poziomu, który zapewnia uzyskanie następnego dnia hodowli w zlewającej się pojedynczej warstwie.

2. Płytki poddaje się łagodnemu kołysaniu na platformie przechylnej w celu równomiernego rozłożenia się komórek.

Następnego dnia:

3. W pierwszej kolumnie dodaje się do każdego dołka po 80 pl dodatkowych podłoży.

4. Do dołka w pierwszej kolumnie dodaje się 20μ1 próbki, w której bada się aktywność interferonu.

153 902

5. Miesza się próbkę i podłoże w dołku przez kilkakrotne pobieranie i ponowne wprowadzanie 100 μ! zawartości dołka za pomocą 1^0// pipety.

6. Przenosi się 100 μΐ zawartości dołka w pierwszej kolumnie poziomo do dołka w drugiej kolumnie.

7. Miesza się jak w stadium 3.

8. Kontynuuje się przenoszenie 100 μΐ zawartości dołka z kolumny do następnej kolumny, aż wykona się 11 przeniesień.

9. Usuwa się i odrzuca 100μ/1 zawartości dołka w 12 kolumnie. Zastosowanie tej metody daje seryjny zestaw rozcieńczeń dwukrotnych.

10. W każdej z badanych płytek znajdują się odpowiednie standardy NIH.

11. Inkubuje się płytki w atmosferze zawierającej CO2 w ciągu 24 godzin w temperaturze 37°C.

12. Każda płytka badana zawiera dołki z 100 μΐ zawiesiny komórek i 100μ1 podłoża, służące jako kontrola wzrostu komórek i dołki z 100μΐ zawiesiny komórek, 100μΐ podłoża i 50//^1 zawiesiny wirusa służące jako kontrola indukowanego przez wirusa efektu cytopatycznego.

13. Komórki we wszystkich dołkach, oprócz kontroli komórek, zakaża się przez dodanie 50μ! zawiesiny wirusa. Dawką zakażającąjest ta ilość wirusa, która wywołuje w ciągu 24 godzin 100% efekt cytopatyczny w stosunku do określonej linii komórek.

14. Ponownie inkubuje się płytki w atmosferze zawierającej CO2 w ciągu 24 godzin w temperaturze 37°C.

15. Usuwa się z płytek płyn, komórki barwi 0,5% .fioletem krystalicznym. Pozwala się im barwić przez 2-5 minut.

16. Płucze się dobrze płytki wodą wodociągową i pozostawia do wyschnięcia.

17. Miano interferonu w próbce jest odwrotnością rozcieńczenia, w którym pozostaje 50% żywotnych komórek.

18. Aktywność wszystkich próbek normalizuje się przez odniesienie do faktora konwersji w jednostkach referencyjnych, który oblicza się z następującego wzoru:

^Rzecz^lwiste mhno śmianiu ^NIH =

Miano zaobserwowane w badaniach w jednostkach referencyjnych (patrz 69).

Ekstrakty przygotowane z E.coli szczep 294 (ATCC 31446) transformowane pBo INFaltrp55 wykazują znaczną aktywność wobec linii komórek nerki bydlęcej (MDBK) zakażonej wirusem VB (szczep Indiana), ale nie wykazują jej wobec linii komórek małpy (VERO), ludzkiego raka szyjki (He-La), nerki królika (Rk-13) lub mysich (LO29) zakażonych w podobny sposób. Ekstrakty kontrolne ze szczepu 294 transformowanego pBR322 nie wykazują aktywności wobec komórek MDBK. Tabela 3 podsumowuje wyniki badania aktywności BoINF-σΙ in vitro wobec różnych zakażonych zwierzęcych i ludzkich linii komórkowych. BoINF-α jest łatwo odróżnialny od ludzkich INF leukocytowych przez oczywisty brak aktywności przeciwwirusowej wobec komórek ludzkich w przeciwieństwie do jego aktywności wobec komórek bydlęcych z zakażeniem wirusem VS. Tabela 4 przedstawia poziom aktywności przeciwwirusowej w ekstraktach przygotowanych z E.coli W3110 tranformowanej plazmidami ekspresyjnymi, takimi jak pBoINF-a4trpl 5, pBoINF-altrp, pBoINF-a2trp oraz pBoINF-crtrp. Szczególnie znacząca jest obserwacja, że bydlęce interferony fibroblastowe są 30 X aktywniejsze wobec linii komórek bydlęcej nerki aniżeli wobec linii komórek, podczas gdy odwrotny stosunek stwierdza się w odniesieniu do ludzkiego INF fibroblastowego (12).

153 902

Ta b e 1 a 3

Linia komórkowa	Preparat INF .	Miano (jedn/ml)
VSV	EMCV
	Standard LelF A	640	NA
MDBK	Bydlęcy INF leukocytowy	300000	NA-
	Ekstrakt kontrolny	<40	NA
	Standard LelF A	650	1500
HeLa	Bydlęcy IFN leukocytowy	<40	<23
	Ekstrakt kontrolny	<40	<23
	Standard IFN	640	1000
L-929	Bydlęcy IFN leukocytowy	<20	<31
	Ekstrakt kontrolny	<20	<31
	Standard INF	1000	NA
RK-13	Bydlęcy IFN leukocytowy	<60	NA
	Ekstrakt kontrolny	<60	NA
	Standard LelF A		1500
VERO	Bydlęcy IFN leukocytowy		<12
	Ekstrakt kontrolny		<12

W powyższej tabeli 3 użyto następujących oznaczeń:

MDBK=komórki nerki bydlęcej,

VERO = komórki nerki afrykańskiego koczkodana zielonego,

HeLa=ludzkie komórki raka szyjki

RK-13 = komórki nerki królika

Na = nie można badać, gdyż wirus nie namnaża się dobrze w odnośnych komórkach.

Tabela 4

Aktywność interferonu w ekstraktach E.coli

E.coli 294	Aktywność INF-/5	Aktywność INF-/3
transformowana za pomocą	Oedn/litr hodowli) MDBK-VSV	(iedn/litr hodowli) WISH-VSV
pINF-ol	1,0X10®	N.D.
pINF-al	2,2 Χ108	6,5X00®
pINF-a2	1,1X 108	3,5X00®
pINF-a3	6,0X10e	2,0 Χ107

W powyższej tabeli 4 użyto następujących oznaczeń: Ekstrakty bakteryjne przygotowano i badano w nich aktywność interferonu z zastosowaniem linii komórek nerki bydlęcej MDBK lub ludzkich komórek owodni WISH i' zakażeniem VSV zgodnie z opublikowaną metodą (Weck i wsp., 1981). N.D. = nie oznaczono.

Podobnie, wyniki badań biologicznych wykazują istnienie aktywności podanych w tabeli 5.

T a b e1a 5

Aktywność,

Interferon Linia komórkowa która przetrwała w E.coli

świński INF-yl	MDBK
świński INF-y	PK-15
króliczy INF-y	RK-13

^2,5 X Π)¹⁰ jednostek/htr 8,33 X 10®jednostek/ml/OD 1,2 X10^w jednostek/litr 3 X10® jednostek/ml/OD 1,58 X10® jednostek/litr 8 X10⁴ jednostek/ml/OD.

Związki wytworzone sposobem według wynalazku można formułować znanymi metodami w celu przygotowania kompozycji użytecznych farmaceutycznie, w których produkt w postaci zwierzęcego interferonu łączy się z domieszką dozwolonego nośnika (nośników). Odpowiednie nośniki i ich formułowanie są znane. Kompozycje tego typu będą zawierać skuteczną ilość białka interferonowego wytworzonego sposobem według wynalazku łącznie z odpowiednią ilością nośnika i będą odpowiednie do skutecznego podawania pacjentowi znanymi drogami, np. pozajelitowo.

153 902

Należy rozumieć, że interferony zwierzęce wytwarzane sposobem według wynalazku istnieją w naturalnych wariacjach allelicznych. Wariacje te mogą występowaćjako różnica (różnice) w całości sekwencji aminokwasów spowodowana przez delecje, podstawienia, insercje, inwersje i dodatkowy aminokwas (aminokwasy) we wspomnianej sekwencji. Wszystkie te wariacje alleliczne objęte są zakresem sposobu według wynalazku.

Piśmiennictwo

1. Rinaldo i wsp., Infection and Immunity 14,660 (1976).

2. Fułton i Rosenąuist, Am.J.Vet.Res. 37,1497 (1976).

3. Babrick i Rouse, Infection and Immunity 13,1567 (1976).

4. Todd i wsp., Infection and Immunity 5,699 (1972).

5. Ahl i Rump, Infection and Immunity 14,603 (1976).

6. Babrick i Rouse, Interrirology 8, 250 (1977).

7. Tovey i wsp., J. Gen. Virol. 36, 341 (1977).

8. Geoddel i wsp., Naturę 287,411 (1980).

9. Geoddel i wsp., Naturę 290,20 (1981).

10. Yelverton i wsp., Nucleic Acids Reseacch 9, 731 (1981).

11. Gutterman i wsp., Annals of Int.Med. 93,399 (1980).

12. Geodel i wsp., Nucleic Acids Reseach 8, 5047 (1980).

13. Yip i wsp., Proc. Natl. Acd. Sci. (USA) 78, 1601 (1981).

14. Taniguchi i wsp., Proc. Natl. Acd. Sci. (USA) 78, 3469 (1981).

15. Bloom, Naturę 289, 593 (1980).

16. Sonnenfeld i wsp., Cellular Immunology. 40,285 (1978).

17. Fleishmann i wsp., Infection and Immunity 26,248 (1979).

18. Blalock i wsp., Cellular Immunoloy 49, 390 (1980).

19. Rudin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci, (USA) 77, 5928.

20. Crane i wsp., J.NatI. Cancer Inst. 61, 871 (1978).

21. Brytyjski opis patentowy nr2 007 676A.

22. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

23. Microbiology, 2 wyd., Harper and Row Publisers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), szczególnie str.1122 i następne.

24. Scientific American 245, 66 i następne (1981).

25. Brytyjski opis patentowy nr 2055 382A.

26. Niemiecki opis patentowy 2644432.

26a. Leder i wsp., Science 196,175 (1977).

27. Chang i wsp., Naturę 275, 617 (1978).

28. Itakura i wsp., Science 198,1056 (1977).

29. Europejski opis patentowy nr0036776.

30. Siebenlist i wsp., Celi 20,269 (1980).

31. Stinchcomb i wsp., Naturę 286, 39 (1979).

32. Kingsman i wsp., Gene 7,141 (1979).

33. Tschumper i wsp.,Gene 10,157 (1980).

34. Mortimer i wsp., Mikrobiological Reriews 44, 519 (198).

35. Miozzar i wsp., Journal of Bacteriology 134,48 (1978).

36. Jones, Genetics 85,23 (1977).

37. Hitzeman i wsp., J.Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

38. Hess i wsp., J.Adv. Enzyme Reguł. 7,149 (1968).

39. Holland i wsp., Biochemistry 17,4900 (1978).

40. Bostian i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77,4504 (1980).

41. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

42. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

43. Tissue Culture, Academic Pres, Krusę and Patterson, wyd. (1973).

44. Gluzman, Celi 23,175 (1981).

45. Geoddel i wsp., Naturę 281, 544 (1979).

46. Lusky i wsp., Naturę 293, 79 (1981).

47. Gluzman i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44,293 (1980).

48. Fiers i wsp., Naturę 273,113 (1978).

153 902

49. Reddy i wsp., Science 200,494 (1978).

50. Blin i Stafford Nucleic Acids Research 3, 2303 (1976).

51. Maniatis i wsp., Celi 15, 687 (1978).

51a Blattner i wsp., Science 196, 162 (1977).

52. Rimm i wsp., Gene 12, 301 (1980). .

53. Blattner 'i wsp., (1978) Procedures for Use of Charon Phages in Recombinat DNA Research, Research Resources Branch, National Institute of Allergy and Infectious Deseases, Bethesda, Maryland.

54. Blattner i wsp., Science 202,1279 (1978).

55. Bray i wsp., Naturę 295,503 (1982).

56. Southern, J. Mol Biol, 98, 503 (1975).

57. Weck i wsp., Nucleic Acids Research 9, 6153.

58. Taylor i wsp., Blochem. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

59. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. '23,641 (1966).

60. Wahl i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 76 3683 (1979).

61. Nagata i wsp., Naturę 287,4101 (1980).

62. Benton and Davis, Science 196, 180 (1977).

62a. Messing i wsp., Nucleic acids Research 9, 309 (1981).

63. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

64. Birnboim i wsp., Nucleic Acids Research 7,1513 (1979).

65. Maxam i Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci.74, 560 (1977).

66. McGrath i Levinson, Naturę 295,423 (1982).

67. Itakura i wsp., Sciencs 198,1056 (1977).

68. Crea i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 5765 (1978).

69. Stewart (1979) The Interferon System, Springer-Verlag, New York, str. 17 i następne.

70. Gray i Goeddel, Naturę 298, 859 (1982).

71. Animal Virus Genetics (Wyd. Fields i wsp.,) Rozdział 5, str. 57, Academic Press, N.Y. (1980).

72. Lusky i Botchan. Naturę 293,79 (1981).

Claims (7)

1. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego sekwencje aminokwasów interferonu zwierzęcego, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę drobnoustroju lub hodowlę komórkową transformowaną replikującym się nośnikiem ekspresyjnym prowadzącą do polipeptydu przez wywołanie ekspresji sekwencji DNA operatywnie połączonej z drugą sekwencją DNA, zdolną do wywoływania ekspresji pierwszej sekwencji, po czym izoluje się otrzymany peptyd, przy czym peptyd ten ewentualnie zawiera aminokwas, metioninę przyłączoną do N-końca aminokwasu będącego zwykle pierwszym aminokwasem interferonu lub ewentualnie zawiera odszczepialny koniugat lub białko sygnałowe przyłączone do N-końca aminokwasu będącego zwykle pierwszym aminokwasem interferonu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania bydlęcego interferonu leukocytowego al i jego wariantów o aktywności interferonu bydlęcego, w którym peptyd sygnałowy obejmuje reszty aminokwasowe S1-S23, stosuje się przedstawioną na fig. 3a część sekwencji nukleotydowej.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania bydlęcego interferonu leukocytowego a2 i jego wariantów o aktywności interferonu bydlęcego stosuje się przedstawioną na fig. 3b część sekwencji nukleotydowej.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania bydlęcego interferonu leukocytowego a3 i jego wariantów o aktywności interferonu bydlęcego stosuje się przedstawioną na fig. 3c całkowitą, dojrzałą sekwencję nukleotydów plazmidowego podklonu.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania bydlęcego- interferonu leukocytowego a4 i jego wariantów o aktywności interferonu bydlęcego, w którym peptyd sygnałowy obejmuje reszty aminokwasowe S1-S23, stosuje się przedstawioną na fig. 3d sekwencję nukleotydową.

153 902

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprzypadku wytwarzania BoINF-/Jl,j82 lub β3 i ich wariantów o aktywności interferonu bydlęcego stosuje się odpowiednio sekwencje nukleotydowe przedstawione na fig. 9a, 9b i 9c.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania świńskiego INF-al, świńskiego INF-/J1, świńskiego INF-y, kociego INF-/J1 i króliczego INF-y i ich wariantów o aktywności odpowiedniego interferonu zwierzęcego stosuje się odpowiednio całkowite sekwencje nukleotydowe genów przedstawione na fig. 14a, 14b, 14c, 14d i 14e.