JPS60500574A - ヒト白血球インタ−フェロンｎ及び細菌細胞におけるその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト白血球インターフェロンＮ及 び細菌細胞におけるその製造方法 技術分野 この発明は一般に遺伝子工学に関し、そして特にヒト白赤球インターフェロンＮ 及び細菌細胞におけるその製造方法に関する。

背景技術 白血球インターフェロンを含ムインターフェロン類は本質的に、を椎動物におけ る誘導性蛋白質の一群であって、抗ウィルス活性及び抗微生物活性を現わすこと ができ、細胞の免疫反応の制御に関与し、そして放射性保護効果及び抗腫瘍効果 を発揮する。

ヒト白血球インターフェロンは１２種類以上を含む一群から成シ、このこと・は 染色体ＤＮＡ、及びインターフェロンｍＲＮＡ上で合成されたｃＤＮＡの構造解 析、並びにヒト白血球インターフェロンの不均一混合物由来の個々の蛋白質のア ミノ酸配列の解析によシ証明された０ 技術の現状において、遺伝子工学によシ得られる種々のヒト白血球インターフェ ロン、例えばエセリＤＮＡによシ産生されるインターフェロンＡ　（Ｇｏｅｄｄ ｅｌＤ、Ｖ、等、　Ｈｕｍａｎ　１ｅｕｋｏｃｙｔｅ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　 ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｉｓ　ｔＦｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　 ａｃｔｉｖｅ、　Ｎａｔｕｒｅ。

１９８０、２８７．４１１−４１６）、又はヒト白血球インターフェロンＦ　［ ０ｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ　Ｙｕ、Ａ、等、　Ｄｉｒｅｃｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　１ｅｕｋｏｃｙｔｅｉｎｔｅｒ ｆｅｒｏｎ　Ｆ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｔｒａ ｎｓ−ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵＳＳＲＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ、　１９８２゜２６５、２３８−２４２　（ロシア語）〕が知られて おり、後者は１６６個のアミノ酸から成り、次の配夕［ドＣＤＬＰＱＴＩ（ＳＬ ＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＧＲＩ　５ＰＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥ ＦＤＧＮＱＦ’ＱＫＡＱＡＬＳＶＬ）ＩＥＭＩ　ＱＱＴＦＮＬＦＳＴＫＤＳ　５ ＡＴＷＥＱ　５ＬＬＥＫＦＳ置ＮＱＱＬＮＤＭＥＡＣＶＩ　ＱＥＶＧＶＥＥＴＰ ＬＭＮＶＤＳ　Ｉ　ＬＡＶＫＫＹＦＱＲＩ　ＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶ ＶＲＡＥＩＭＲ３ＦＳＬＳＫＩＦＱＥＲＬＲＲＫＥを有する。この配列において 、各記号は次のアミノ酸を意味する。

Ａ−ａｌａ　；　Ｃ−ｃｙｓ　；　Ｄ−ａａｐ　；　Ｅ−ｇｌｕ　：　Ｆ−ｐｈ ｅ　；　Ｇ−ｇｌｙ　；Ｈ−ｈｉｓ　：　１−ｉｌｅ　：に−１ｙｓ　；Ｌ−１ ｅｕ　；Ｍ−ｍｅｔ　；　Ｎ−ａｓｎ　；Ｐ−ｐｒｏ　；Ｑ−ｇｌｎ　；Ｒ−ａ ｒｇ　；　５−ｓｅｒ　；　Ｔ−ｔｈｒ　；　Ｖ−ｖａｌ　；Ｗ−ｔｒｐ　；Ｙ −ｔｙｒ。

上記のインターフェロンＦを製造するために、グアニジン−クロリド−グアニジ ン−チオシアナート法を用いながらニーーカッスル病ウィルスによシ誘導された ヒト血白血９球から粗メソセンジャーＲＮＡが調製される。オリゴ−ｄＴ−セル ロース上での二重精製によりｍＲＮＡのポＩＪ−Ａ画分が調製される。翻訳停止 の領域内のインターフェロンの遺伝子に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用い てｃＤＮ、Ａの合成が行われる。ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｖ断片を用 いて第２鎖の合成が行われる。こうして得られた二重鎖ＤＮＡは、再構成の後、 トリットファンプロモーターの制御下にベクタープラスミドｐＢＲ３２２に挿入 され前記のヒト白血球インターフェロンは、同一のウィルスの細胞変性作用に対 する阻害効果の効率、及び種々のウィルスのほとんどに対する力価において相互 に異る。

この発明は、抗ウイルス効果及び抗増殖効果の特異性を特徴とする新規なヒト白 血球インターフェロンの製造に向けられる。

この発明のヒト白血球インターフェロンＮは本質的に新規なものであり、そして 従来文献に記載されていない。

この発明の目的は、この発明に従えば、この発明のインターフェロンＮは次のア ミノ酸配夕（ドＣＤＬＰＱＴＩ（ＳＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＧＲＩ　Ｓ ＨＦＳＣＬＫＤＲＹＤＦＧＦＰＱＥＶＦＤＧＮＱＦＱＫＡＱＡＬＳＡＦＨＥＭＩ 　ＱＱＴＦＮＬＦＳＴＫＤＳ　５ＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＩ　ＥＬＦＱＱＬＮ ＤＬＥＡＣＶＴＱＥＶＧＶＥＥ　Ｉ　ＡＬＭＮＥＤ　Ｓ　Ｉ　ＬＡＶＲＫＹＦＱ ＲＩ　ＴＬＹＬＭＧＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲ８ＦＳＦＳＴＮＬＱＫ ＧＬＲＲＫＤにより特徴付けられる蛋白質であるという事実に基いて達成される 。

この発明において開示される新規なヒト白血球インターフェロンＮは、抗ウイル ス効果及び抗増殖効果の両者の特異性を特徴とする。この新規な種類のインター フェロンの実際的な適用は、ウィルス及び悪性新生物に対する選択的効果を生じ させるための医薬の範囲を拡張することを可能にするであろう。

前記のヒト白血球インターフェロンＮＯ製造方法は、誘導されたヒト白血球から マトリクスポリ（Ａ）−ｍＲＮＡを分離し、インターフェロン遺伝子を合成し、 トリットファンプロモーターの制御のもとにベクタープラスミドｐＢＲ３２２に 挿入し、そしてこうして得とを含んで成シ、この発明によればインターフェロン 遺伝子として次のＤＮＡ−次構造： ＴＧＴ　ＧＡ’ｒ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＣＡＧＣＣＴＧ　Ｇ ＧＴ　ＡＡＴＡＧＧ　ＡＧＧ　ＧＣＣＴＴＧ　ＡＴＡ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　 ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡＡＧＡ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＣＴＣＣＴＧＣ’ 　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＧＡＴＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＧＧＡ　ＴＴＣＣＣＣ ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＴＴＣＣＡＧ　 ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＣ、ＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　 ＡＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡ 　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＧＧ５ ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＣＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＴＣＴＡＣＡＴＴ　Ｇ ＡＡＣＴＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＡＣＣＴＡ　ＧＡＡ　 ＧＣＣＴＧＴＣＴＧ　ＡＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡ、Ｇ　ＧＴＴ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　Ｇ ＡＡ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＴＣＣ ＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＧＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ 　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ｔ ＡＣＡＧＣＣＣＴ　ＴＧＴ　ＧＣＣＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＴＴＧＴＣＡＧＡ　ＧＣ Ａ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＣＴＴＣＴＣＴ　ＴＴＴＴＣＡ　ＡＣ Ａ　ＡＡＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＡＡＧ ＧＡＴ。

を有することを特徴とする。

発明を実施するための最良の方法 この発明の理解を促進するため、細菌細胞内でヒト白血球インターフェロンＮを 製造するための特定の具体例を記載する。

例 １　ポ＋）　（Ａ）　−ｍＲＮＡの分離、精製、及び特徴付はセンダイウィルス （Ｃａｎｔｅｌｌ　Ｋ、等ｒ　Ｍｅ　ｔ　ｂ　、Ｅｎｚ　’　ｔ１９８１、７８ ．　ｐａｒｔ　Ａ、　２９−３８参照）により誘導した合計］、、４　Ｘ　１０ １０個の精製ヒト血白血球を４５時間インキュベートし、次に１５０　Ｏｒｐｍ にて３０分間遠心分離して沈澱せしめ、そして１００ｍ１の０，８５％ＮａＣ４ 溶液に懸濁した。ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡを白血球の懸濁液から分離し、そして文 献（ナガタＳ０等、　Ｎａｔｕｒｅ。

て精製し、そしシオリゴーｄＴ−セルロース上でのアフィニティークロマトグラ フィー、シュークロースによる直線グラジェント画分（５〜２０％）、及びオリ ゴ−ｄＴ−セルロース上での１２ｓ画分の濃縮を行う。ホ！Ｊ　（Ａ）　−ｍＲ ＮＡの特徴としてキセノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ　）の 卵母細胞中でのマトリクス活性を用いる。この活性はＲＮＡμＩ当、９３０００ ＡＵのインターフェロンであｐ、１２ｓポリ（Ａ）　−ｍＲＮＡの平均収量は４ 〜５μｇである。

（ａ）　単鎖ｃＤＮＡの合成 反応混合物（６００μｌ）は５０　ｍＭ　）す７．−　ＨＣｔ（ＰＨ＝８．１） 、６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオスレイト、１５０　ｍＭ　ＫＣ７、各０ ．５　ｍＭの（３Ｈ］ｄＣＴＰ　、　ｄＡＴＰ　。

ｄＴＴＰ　、　ｄＧＴＰの混合物、７μｉ／ｍｌポリ（Ａ）　−ｒｎＲＮＡ　。

２０μｇ／ｒｎｌオリゴ（ｄＰ）１２〜１８、及び２００　ＡＵ、４！逆転写酵 素ＡＭＴＪを含有する。反応は４２℃にて１時間行う。合成の停止の後、混合物 に、濃度が１０ｍＭになるまでエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）を添加ス る。フェノ（ｐｈｅｎｏ　）及びｃＨｃｔ３（１：１）の１容積を用いて混合物 を脱蛋白し、次に水性媒体を、１０　ｍＭ　）リス−ＨＣ４（ｐＨ＝　７．５　 ）　、　０．２５　Ｍ　ＮａＣｔ中セフアセファデックスＧ５０したカラム（０ ，４Ｘ１５ｃｍ）に通す。ｃＤＮＡとポリ（Ａ　）−ｍＲＮＡとの複合体を、エ タノールを用いて両分から沈澱せしめ、そして沈澱を５０μｌのＨ２Ｏに溶解す る。次に、この溶液に５、１　／ＩＩＪ　Ｃ１５Ｎ　ＮａＯＨ溶液を加え、そし て２０℃にて４０分間インキ−ベートし、そして８５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム により中和し、そして３０μｌのＨ２Ｏを加え、この後エタノールにより単鎖ｃ ＤＮＡを沈澱せしめる。

（ｂ）　二重鎖ｃＤＮＡの合成 単鎖ｃＤＮＡの沈澱を１００μｌの反応混合物を、［Ｋｕｒｔｚ　Ｄ−Ｔ−等、 　Ｇｅｎｅ、　１９８１．１３．１４５−１５２を参照のとと；５０ｍＭ燐酸カ リウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）、ｍＭＭｇＣ６２，１ｍＭ　２−メルカプトエタ ノール、それぞれ５０　／４Ｍ　（Ｄ　α［ニー”Ｐ］ｄＴＴＰ　、　ｄＡＴＰ 　、　ｄＣＴＰ　。

ｄＧＴＰの混合物、］　ＯＯＡＵ／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼ■（Ｋｌｅｎｏｖ 断片）〕に溶解し、この後反応混合物を３７℃にて３０分間インキ−ベートする 。反応の停止後、合成生成物を前の２（ａ）項に記載したようにして分離する。

セファデックスＧ５０上でクロマトグラフ処理した後、高分子量画分を、３０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝４．．５　）　、　０３．ＭＮａＣｊ　、　３　ｍＭ Ｚｎｓ０４．２μｉ　７ｍ１．　Ｅ、　：Ｉりのｔ　ＲＮＡ及び１１５　ＡＵ／ ｍｌヌクレアーゼＳ１を含有する溶液（８５０μｌ）にする。この混合物を３７ ℃にて３０分間インキュベートし、そして前記２（ａ）項に記載したようにして 二重鎖ｃＤＮＡを分離する。

３Ｅ、コリに−１２ＲＲＩ細胞中でのベクタープラスミドｐＢＲ３２２のクロー ニング このプラスミドはＰｓｔ　Ｌ部位にオリゴ（ｄＣ）−オリゴ（ｄＧ）コネクター 法により組み込まれたインターフェロン遺伝子を含有する。

（ａ）　コネクターの連結 オリゴ（ｄＣ）コネクターを次のようにして二重鎖ｃＤＮＡに連結する。

２０μｌの反応混合物は１４０ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ＝６．９）、４μ Ｍｚｎｓ０４，０．８ｍＭ２−メルカプトエタノール、　０．４　ｍＭ　ＣｏＣ ｌ２．０．１　ｍＭ［”Ｈ］ｄＣＴＰ　、　１００ｍ９二重鎖ｃＤＮＡ及び５０ 　ＡＵ／ｍｌターミナルデオキシヌクレオチジルートランスフェラーゼを含有す る。３７℃にて５分間インキュベートした後、前記２（ａ）項に記載した手順を 用いて反応生成物を分離する。

オリゴ（ｄＧ）コネクターは、次のようにして制限酵素Ｐｓｔ　ｆで切断したプ ラスミドｐＢＲ３２２に連結される。

１２５μｌの反応混合物は２ｏｏ７カコジル酸カリウム（ｐＨ−６，９）　、　 ］　０１１Ｍ　ＺｎＳＯ４，２ｍＭ　２−メルカプトｘり／　−／ｌ／　、　４ 　ｒｒＭＭｇｃｔ２．１　ｍＭ　ＣｏＣｌ２゜０、２　ｍＭα〔３２Ｐ〕ｄＣＴ Ｐ、制限酵素Ｐｓｔ　（で切断された９ １０　μ９のプラスミドｐＢＲ３２２、及び４００　ＡＵ　／　ｍｌターミナル デオキシヌクレオチジルートランスフェラーゼを含有する。この混合物を３７℃ にて５分間インキュベートし、そして２（ａ）項に記載したようにして合成生成 物を分離する。

前記の反応条件下で、１５〜２０モノマーユニツトのｄＣＭＰ及びｄＣＭＰが、 それぞれ二重鎖ｃＤＮＡ及び切断されたプラスミドｐＢＲ３２２に連結される。

（ｂ）　Ｅ、コリに、１２ＲＲＩ細胞中での組換ＤＮＡのクロ］　ＯｍＭ　）リ ス−ＨＣ１（ｐＨ＝　７．５　）　、　０．　Ｉ　ＭＮａＣｔ及びｌ　ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ中３（ａ）項に記載したようにして得られたベクター４０　ｎｇ及びｃＤ ＮＡ　６　＋Ｊの溶液２０　＃Ｊを、６５℃にて１０分間加熱し、そして４２℃ にて２時間加熱し、次に３時間かけて２２℃に冷却し、そしてこれを用いて、文 献（Ｄａｇｅｒｔ　Ｍ、等、　Ｇｅｎｅ。

１９７９、６．２３−２８　）に記載されている方法に従って、Ｅ、コリに−１ ２ＲＲＩ細胞（Ｆ−、ｐｒｏ　、　ｌｅｕ　、　ｔｈｉ　。

Ｉａｃ　ｙｌ、　ａｔｒｒ、　ｒ’；、　、　鴫、　ｅｎｄｏ　Ｉ−）を形質転 換する。こうして、１２００個のテトラサイクリン耐性（５μ９７ｍ１）を得る 。この内９８％がアンピシリン感受性（１５０μｊ；／／ｍｌ）であシ、そして そのために組換体のスクリーニングに適用し得る。

４　ヒト白血球インターフェロンの遺伝子を担持す（ａ）　ヒト白血球インター フェロンの遺伝子を担持する組換ＤＮＡの選択は、アミノ酸のそれぞれの配列。

ｄＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴ（Ａ）　、　及Ｕ　ｄＣＣＴＣＴＣＡＴＣ ＴＣＣＣＴＣＡ（Ｂ）を特徴とする（３２ｐ〕−）レーザー−アイソトープラベ ル１６連合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて行う。このオリゴヌクレオチ ド配列は、コード鎖のヌクレオチド５０４−５１９の保存的部分、及び非コード 鎖のヌクレオチド６８−８３の部分に相補的であシ、これらの部分はヒト白血球 インターフェロンのすでに知られている遺伝子の多くについて最も特徴的である （　Ｇｏｅｄｄｅ’ｌ　Ｄ、Ｖ、等、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８１．．２９０． ２０−２６を参照のこと）。５′末端マーカーを挿入するたａ６［，３０ｍモル のオリゴヌクレオチドを、５０ｍＭトリス−ＨＣｔ（ｐＨ＝８．０　）　、　５ 　ｍＭジチオスレイト。

７　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．３　ｐＭγ、−ＣＰ）ＡＴＰ及び２０　ＡＵのバクテリ オファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μｌの反応混合物中３ ７℃にて３０分間インキ−ベートする。５′−〔５２Ｐ〕−ラベルオリゴヌクレ オチドを、Ｈ２０中セファデックスＧ５０　（０，４Ｘ２２　ｃｍ　）上でのク ロマトグラフィーによシ精製する。

（ｂ）　ニトロセルロース上のコロニーと５′−（３２ｐ）−ラベルオリゴヌク レオチドプローブとのノｈイブリド形成。

Ｔ：人品形質転換体を、コロニーが生ずるまでニトロセルロースフィルター（直 径９０門）上で増殖せしめ、次にこのフィルターをクロラムフェニコール（５０ ０μｇ／ｒｎｌ）を加えた寒天上に移し、そして１８時間インキュベーションを 継続する。さらに、フィルターを０．５　Ｎ　ＮａＯＨによ逆処理し、次にＩＭ トリス−ＨＣＬ　（ｐＨ＝　８．　Ｑ　）中で中和し、そして真容乾燥する（８ ０℃にて２〜４時間）。次に、このフィ　ル　タ　−　を　、０．１５Ｍ）　リ 　ス　−　ＨＣＬ　（ＰＨ＝８．０　）　。

０、７５　Ｍ　ＮａＣＬ　、　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ Ｏ４，２５０μ、！９　／ｒｎｌ　ｔＲＮＡ及びドデシル硫酸ナトリウム、ウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ　）　、それぞれ０．１九〇フイコール及ヒポリビニル ピロリドンの混合物中３７℃にて２時間前パイプリド形成にかける。フィルター を乾燥した後、このフィルターを、ＩＸ１０ｔｍｐ／分／ｍｌの５７−　〔３２ ｐ）−オリゴヌクレオチドを含有する上記の混合物（３００μｌ／フイルター） で湿潤し、そしてポリエチレン袋中に密封し、そして３７℃にて２０時間インキ ュベートする。ノ・イブリド形成の後、フィルターを、０．１　Ｍ　）リスーＨ Ｃ１溶液（ｐＨ＝８．０）、０、５　Ｍ　ＮａＣ４溶液、及び０１％のドデシル 硫酸ナトリウム溶液を用いて、２２℃にて次々と３回洗浄し、次に乾燥し、そし て２０〜７０時間にわたってＸ−線オートグラフ処理した。フィルターのオート ラジオグラフィーｔｒｉ　、　５’　−［３２Ｐ）−ラベルオリゴヌクレオチド プローブＡ及びＢの両者との・・イブリド形成が陽性である複数個のコロニーを 明らかにした。これらのコロニーからのプラスミドＤＮＡの制限分析、及び挿入 されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析は、組換ＤＮＡ　ｐＩＦＮ　１０５が ５′−非翻訳セグメントの短配列、ヒト白血球インターフェロンの及び新規な種 類の白血球インターフェロンＮ、及び非翻訳遺伝子セグメントの３７０ヌクシオ チド３を含有することを示（ａ）　ｔｒｐプロモーターの制御のもとにインター フェロンＮの遺伝子を担持するシラスミドｐＩＦＮ　１０５−０ インターフェロンＮの前記の遺伝子を含有する組換プラスミドｐＩＦＮ　１０５ のＤＮＡを、形質転換されたＥ、コリ細胞の溶解物から分離し、そして現在知ら れている方法（Ｃｏｌｍａｎ　Ａ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９７８ ゜９１、３０３−３１０　）に従ってヒドロキシアパタイト上で精製する。次に 、５０μｇのＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉによ逆処理し、そして切断生成物を０ ８％アガロースゲル中で電気泳動的に分離する。ＤＮＡの断片（約９６０塩基対 な含有し）そしてインターフェロン遺伝子を含む、を電気溶出によシ分離し、そ して文献されているようにして精製する。次に、１０１ｔｊｉのＤＮＡ断片を制 限酵素Ｂａｍ　Ｉにょシ切断し、この混合物をヌクレアーゼＳ、　（０，５ＡＵ ／μＦ　ＤＮＡ　）にょシ２２°にて３０分間処理し、次に、犬ＢａｍＨｌ　− Ｐｓｔ断片（９４７塩基対）を、１５％アガロースゲル中で電気泳動した後、Ｐ ｓｔ　ｌ断片について記載した方法に類似する方法によシ分離する。

５μｇのｐＢＲ３２２−ｔｒｐベクタープラスミド［０ｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ　 Ｙｕ、　Ａ９等、　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅＵＳＳＲＡｃａｄ ｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１９８２．２６５．２３８−２４２ンのプ ロモーターセグメントを含有）を、Ｅ、コリの制限酵素ＲＩで切断し、ＤＮＡの 接着末端をポリメラーゼＪ　（Ｋｌｅｎｏｖ断片）により、文献（Ｂａｃｋｍａ ｎ　Ｋ。

等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　１９７６、７ ３．４１７１−４．１７８を参照のこと）に記載されている方法に従って満たし 、１５μｇのベクターを、１０℃にて１８時間　、５　０　ｍＭ　）　リ　ス　 −　ＨＣ−１（ＰＨ＝　７．６　）　、　１　０　ｍＭＭｇＣ１２，インターフ ェロン遺伝子を有するＤＮＡ断片０．２７μｇを含有する１０ｍＭジチオスレイ ト、及ヒ２０ＡＵのＴ４ＤＮＡ−リガーゼを含有する１０μｌの緩衝液中で処理 する。、この混合物を１０ｍＭ　）　’）スーＨＣｔ（ｐＨ＝　７．５　）　、 　５０　ｍＭ　ＮａＣ４，１ｍＭ　ＥＤＴＡの緩衝液１５０μｌによシ稀釈し、 そしてＥ、コリに−」２ＲＲＩ細胞を形質転換する。次に、インターフェロン遺 伝子を含有する形質転換体を、４（ｂ）項に記載したようにして、コロニーのバ イブリド形成により選択する。トリプトファンプロモーターの制御のもとにブレ インターフェロンＮの遺伝子を含有するプラスミドｐＩＦＮ　１０５−　Ｉを制 限分析によシ同定する。

次に、プラスミドｐＩＦＮ　１０５−　Ｉによシ形質転換されたＥ、コリに−１ ２ＲＲ，Ｉ細胞を、・ぐクトトリプトン１０．０ｇ／ｌ　、酵母エキｙ、　５． ０　ｇ／ｌ、　ＮａＣｔｌ　、０．０　ｇ／ｌｊ　。

アンピシリン０．０２ｇ／ｌを含有する培地にＡ６．。＝１の光学濃度が得られ るまで増殖せしめ、そして次にこれらを沈澱せしめ、そして文献（Ｎａｔｕｒｅ 、　１９８０゜ムによ多処理し、そして凍結−解凍を反復することによシ破壊す る。

インターフェロン活性は、０．５〜１．　ＯＸ　１０６ＡＵ／ｌ細菌懸濁液であ る。

（ｂ）成熟インターフェロンＮの発現プラスミド５μｇの大ＢａｍＨｌ　−Ｐｓ ｔ　ｌ断片（ＤＮＡ　ｐＩＦＮ　１０５　）’ｆ、制限酵素Ｓａｕ　３Ａ　（２ ＡＵ／μｇＤＮＡ　、　３７℃にて５分間）で部分分解し、次に断片の混合物を １５％アガロースゲル中での電気泳動により分離し、次に、第１コドン以外の成 熟インターフェロン遺伝子を含有する８６９ヌクレオチドを含む断片を分離する 。次に、接着末端を有するこの断片に、ＥｃｏＲＩ及び５ａｕ３Ａを含有する合 成ヌクレオチドＣＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅＵＳＳＲＡｃａｄｅ ｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１９８２．２６５．２３８−２４２（ロシア 語）を加え、そしてこの断片をベクタープラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ　１部 位及びＥＣＯＲＩ部位に関して連結する。次に、Ｅ、コリ細胞を組換ＤＮＡによ り形質転換し、そしてプローブとバイブリド形成せしめそしてＤＮＡを制限分析 した後、プラスミドｐＩＦＮ１８を形質転換体から選択する。このプラスミドは 成熟インターフェロンＮの変形された遺伝子を担持する。次に、インターフェロ ンの変形遺伝子を含有するプラスミドｐＩＦＮ１８の短所片Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｐ ｓｔ　（を、ｔｒｐ−プロモーターを担持するＤＮＡプラスミドｐＢＲ３２２− ｔｒｐのＰｖｕ　ｌ［−Ｅｃｏ　ＲＩ担持断片（３４０塩基）と連結し、そして ０．４μＩの最終生成物をベクタープラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ　ｌ及びＥ ｃｏ　ＲＪ−充足（ｆｉｌ＋　）部位に挿入する。Ｅ、コリＲＲＩ細胞を形質転 換した後、１０００個のＴ：Ａ、Ｓクローンを選択し、次に組換ＤＮＡをバイブ リド形成及び制限分析にかけ、そしてトリプトファンプロモーターの制御のもと に成熟インターフェロンＮ遺伝子を含有するプラスミドｐｌ’ＦＮ　１８−３８ を選択する。

白血球インターフェロンＮの収量は４〜６×１０８ＡＵ／ｌ細菌懸濁液の範囲で ある。

工業的利用性 この発明において提供されるヒト白血球インターフェロンＮは抗ウィルス活性を 特徴とし、そして抗ウイルス性、抗微生物性及び抗新生物性医薬として医療の実 際において使用することができる。

国際調査報告 第１頁の続き ■発明者　ツイマニス　アレクサンドルユリエピッチ ０発　明　者　ビシネフスキイ　ユリイ　イソ／ピッチ ０発　明　者　アブサロン　ウルデイス　ルドルフオピッチ ０発　明　者　ディシュラ−アンドリス　パｏ発　明　者　スベルドロフ　エブ ジエニイダビドピッチ ０発　明　者　モナステイルス力ヤ　ガリナセルゲーブナ ０発　明　者　ツアレフ　セルゲイ　アナトリエピッチ ＠発明者　スモＳデインツエフ　ァレクサンドル　アナトリエピッチ ソビエト連邦、　２２６０６９．　リガ、ウリツア　ルドズタ力、ディー、５４ 、クワルチーラ　３７ ソビエト連邦、　２２６０５７．　リガ、ウリツア　マルタス、ディー、５ｇ。

クワ°レチーラ　１ ソビエト連邦、　２２９０２１．サラスピルス、ウリツア　ミエラ、ディ＋、　 １６／７．　クワルチーラ　４１３ソビエト連邦、　２２６０２５．　リガ、ク ンジンサラ、９−アヤ　ポペレチニア、ディー、　１３．　クワルチーラ　１連 邦、　２２６０５９．　リガ、ウリツア　ライムドタス、ディー。

６１、クワルチーラ　２８ ソビエト３１１邦、　１１９５１７．モスクワ、ウリツア　マトビーフスカヤ。

ディー、１０．コルプス　４．クワルチーラ　３５７ソビエト連邦、　１１３５ １９．モスクワ、ウリツア　チェルタノフスカヤ、ディー、２＄　コルプス　１ ．クワルチーラ　１２６ソビエト連邦、　１１７５９７．モスクワ、ノポヤセネ フスキイ　プロスペクト、ディー、１＄　コルプス　４．クワルチーラ　３２６ ソビエト連邦、　１９５２７３．　レニングラード、ウリツア　ベルノステイ、 ディー、３４．クワルチーラ　３ ０発　明　者　イオブレフ　ウラディミル　イ＠発明者　デュク　アルニス　エ ルネストピッチ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次のアミノ酸配列： を特徴とする蛋白質であるヒト白血球インターフェロンＮ０ ２、請求の範囲第１項記載のヒト白血球インターフェロンＮの製造方法であって 、誘導されたヒト白血球由来のマトリクスポリ（Ａ）　−ｍＲＮＡを分離し、該 インターフェロンの遺伝子を合成し、トリプトファンプロモーターの制御下にベ クタープラスミドｐＢＲ３２２中に挿入し、そして得られた組換ＤＮＡをＥ、コ リ細菌細胞に形質転換することを含んで成シ、インターフェロン遺伝子として次 のＤＮＡ−次構造：を有するインターフェロンＮ遺伝子を使用することを特徴と する特許 １