DE3687100T2

DE3687100T2 - Clavamderivate, herstellung und zwischenprodukte.

Info

Publication number: DE3687100T2
Application number: DE8686306564T
Authority: DE
Inventors: Keith Howard Baggaley; Stephen William Elson; Stefan Roland Woroniecki
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1985-08-29
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2006-08-27
Also published as: GR862214B; JPH08242874A; PT83267B; JP2604571B2; ATE82291T1; DE3687100D1; ES2001410A6; JPH08259530A; HK26596A; JP2530825B2; US5130241A; EP0213914A3; JPS6259281A; GB8521516D0; EP0213914B1; US4795809A; JP2648472B2; JPH08266274A; CA1338143C; PT83267A

Description

Diese Erfindung betrifft β-Lactam-Verbindungen und insbesondere ein neues Clavam-Derivat. Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Clavam-Derivaten.
GB-A-1 508 977 beschreibt ein Clavam-Derivat, das als Clavulansäure bekannt ist und durch Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 oder eine Mutante davon, die hohe Erträge liefert, hergestellt wird. Clavulansäure weist die nachstehende Struktur (A) auf, wobei auch die absolute Stereochemie bezeichnet und ein Numerierungssystem angegeben ist.
Clavulansäure ist Z-(2R,5R)-3-(β-Hydroxyethyliden)-7-oxo- 4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure.
Clavulansäure ist ein starker Inhibitor von β-Lactamase- Enzymen und stellt eine wertvolle Verbindung für den klinischen Bereich dar, da sie verhindert, daß β-Lactamase-empfindliche β-Lactam-Antibiotika abgebaut werden.
2R,5R-Clavam-Derivate sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z. B. US 4078067, GB 1585 124 und GB 1603 208.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz oder eine geschützte Form davon bereit.
Die absolute Stereochemie in den Positionen 2 und 5 in Formel (I), die in gleicher Weise wie die Clavulansäure numeriert ist, ist entgegengesetzt zur Stereochemie von Clavulansäure, d. h. 2S,5S. Deshalb zeigen die Verbindung der Formel (I) und deren Salze und Ester im CD (Circulardichroismus)- Spektrum im Bereich von 230 bis 240 nm einen negativen Cotton- Effekt, im Gegensatz zu der von Clavulansäure im gleichen Bereich gezeigten positiven Beugung.
Der Nutzen der Verbindung der Formel (I) und ihrer Salze besteht darin, daß sie in einem Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure wie nachstehend beschrieben als Zwischenprodukte dienen können.
Die Verbindung der Formel (I) kann in Zwitterionenform oder in Salzform vorliegen, z. B. als ein Metallsalz, wie z. B. das Natriumsalz, ein Säureadditionssalz, ein Ammoniumsalz oder ein substituiertes Ammoniumsalz, z. B. ein Salz eines tertiären Amins.
Säureadditionssalze können an der terminalen Aminogruppe entstehen, hierbei handelt es sich beispielsweise um Salze mit anorganischen Säuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Orthophosphorsäure oder Schwefelsäure, oder organischen Säuren, wie z. B. Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Citronensäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure, Salicylsäure oder Acetylsalicylsäure.
Metallsalze können an der Carboxylgruppe entstehen, hierbei handelt es sich beispielsweise um Aluminiumsalze und Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, wie z. B. Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze.
Substituierte Ammoniumsalze können beispielsweise solche mit C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylaminen, wie z. B. Triethylamin, Hydroxy- (C&sub1;&submin;&sub6;)alkylaminen, wie z. B. 2-Hydroxyethylamin, Bis(2-hydroxyethyl)amin oder Tri(2-hydroxyethyl)amin, Cycloalkylaminen, wie z. B. Bicyclohexylamin, oder mit Procain, Dibenzylpiperidin, N- Benzyl-β-phenethylamin, Dehydroabietylamin, N,N'-Bisdehydroabietylamin, Glucamin, N-Methylglucamin oder Basen des Pyridin-Typs, wie z. B. Pyridin, Collidin oder Chinolin, sein.
Es soll so verstanden werden, daß sich die vorliegende Erfindung auch auf eine Verbindung der Formel (I) erstreckt, in der eine oder mehrere der funktionellen Gruppen in geschützter Form vorliegen. So kann die Carboxylgruppe geschützt sein, die Aminogruppe kann geschützt sein oder sowohl die Carboxyl- als auch die Aminogruppe können geschützt sein. Alle diese geschützten Formen der Verbindung der Formel (I) und anderer hier beschriebener Verbindungen sind in dem Begriff "geschützte Form" eingeschlossen. Außerdem umfaßt der Begriff "geschützte Form", wie er auf hier beschriebene Verbindungen angewendet wird, "maskierte" Zwischenprodukte, die durch chemische Verfahren, die bekanntermaßen zur Umwandlung einer funktionellen Gruppe in eine andere befähigt sind (wobei der Rest des Moleküls im wesentlichen unbeeinflußt bleibt), in die Endverbindungen überführt werden können. Bevorzugte maskierte Formen eines Amins umfassen beispielsweise die entsprechenden Azido- und Cyanoanaloga, die durch Reduktion in das gewünschte Amin überführt werden können. (Es muß so verstanden werden, daß die entsprechende Cyanoverbindung ein Kohlenstoffatom weniger in der Seitenkette hat, ausschließlich dem Kohlenstoffatom in der Cyanogruppe.)
Geeignete esterbildende Schutzgruppen für die Carboxylgruppe umfassen gegebenenfalls substituierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub2;&submin;&sub6;-Alkenyl-, C&sub2;&submin;&sub6;-Alkinyl-, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl-, Aryl-, Aryl- C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl- und Tri-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylsilylreste.
Der hier verwendete Begriff "Arylrest" umfaßt die Phenyl- und Naphthylgruppe, jeweils gegebenenfalls substituiert mit bis zu fünf Fluor-, Chloratomen, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy-, Halogen-(C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl, Hydroxy-, Amino-, Carboxy-, C&sub1;&submin;&sub6; Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxycarbonyl(C&sub1;&submin;&sub6;) alkyl-, Nitro-, Aryloxycarbonyloxy-, Aryl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyloxycarbonyloxy-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyloxycarbonyloxy-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylcarbonyloxy-, Arylcarbonyloxy-, Aryl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylcarbonyloxy- oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub6; alkyloxycarbonylresten.
Der Begriff "Halogenatom" bezieht sich auf Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodatome. Die Begriffe Halogen und Halogenid sollen demgemäß interpretiert werden.
Einige Beispiele für beliebige Substituenten in den Schutzgruppen, die wie hier angegeben gegebenenfalls substituiert sind, umfassen bis zu drei Gruppen (die gleich oder verschieden sein können), ausgewählt aus Halogenatom, Hydroxyl-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylthio-, Cyano-, Nitro-, Carboxy-, Carbonsäure-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylester-, Carbamoyl-, Amino-, Mono- (C&sub1;&sub6;)-alkylamino- und Di-(C&sub1;&submin;&sub6;)-alkylaminorest.
Besonders geeignete esterbildende Schutzgruppen für die Carboxylgruppe sind diejenigen Gruppen, die unter üblichen Bedingungen entfernt werden können. Solche Gruppen umfassen den C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest, wie z. B. die Methyl- und Ethylgruppe, die Benzyl-, p-Methoxybenzyl-, Benzoylmethyl-, p-Nitrobenzyl-, 4-Pyridylmethyl-, 2,2,2-Trichlorethyl-, 2,2,2-Tribromethyl-, t-Butyl-, t-Amyl-, Allyl-, Diphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, Adamantyl-, 2-Benzyloxyphenyl-, 4-Methylthiophenyl-, Tetrahydrofur-2-yl, Tetrahydropyran-2-yl-, Pentachlorphenyl-, Acetonyl-, p-Toluolsulfonylethyl-, Methoxymethyl- oder eine Silyl-, Stannylgruppe oder eine phosphorenthaltende Gruppe.
Eine Carboxylgruppe kann aus einem beliebigen vorstehenden Ester durch übliche, für die jeweilige Estergruppe geeignete Verfahren wiedergewonnen werden, z. B. durch säure- oder basenkatalysierte Hydrolyse oder durch enzymatisch katalysierte Hydrolyse oder durch Hydrogenolyse unter Bedingungen, bei denen das restliche Molekül im wesentlichen unbeeinflußt bleibt.
Eine bevorzugte Schutzgruppe für die Carboxylgruppe in der Verbindung der Formel (I) oder einem Salz oder einem Derivat davon mit geschützter Aminogruppe stellt die Benzylgruppe dar.
Geeignete Schutzgruppen für die Aminogruppe sind diejenigen Gruppen, die leicht abgepalten werden können. Eine umfassende Erörterung der Verfahren, mit denen eine Aminogruppe geschützt werden kann, sowie Methoden zur Spaltung der erhaltenen geschützten Derivate findet man z. B. in "Protective Groups in Organic Synthesis" von T. W. Greene (Wiley-Interscience, New York, 1981).
Geeignete Beispiele von Schutzgruppen für Aminogruppen umfassen maskierende Gruppen wie vorstehend erörtert; einen gegebenenfalls substituierten C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylcarbonyl-; Arylcarbonyl-; Aryl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylcarbonyl-; (Heterocyclyl)carbonylrest, wobei der Heterocyclylrest ein 5- oder 6-gliedriger aromatischer Ring ist, der bis zu 4 Heteroatome enthält, ausgewählt aus Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatomen; oder eine ein Carbamat bereitstellende Gruppe, wie z. B. eine Benzyloxycarbonylgruppe, gegebenenfalls im Phenylring substituiert mit einem oder zwei Substituenten, ausgewählt aus einer C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, Trifluormethylgruppe, einem Halogenatom oder einer Nitrogruppe; einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyloxycarbonylrest, z. B. die tert.-Butoxycarbonylgruppe; oder einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyloxycarbonylrest, der gegebenenfalls im Alkylrest mit bis zu drei Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind aus einem C&sub1;&submin;&sub4; Alkoxyrest, einem Halogenatom oder einer Nitrogruppe, z. B. die 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl- oder 1-Chlorethoxycarbonylgruppe.
Bevorzugte Beispiele von N-Schutzgruppen für die in Verbindung (I) vorliegende Aminogruppe umfassen diejenigen, die üblicherweise zum Schutz von Aminogruppen in der Peptidchemie eingesetzt werden, wie nachstehend erörtert.
Eine besonders bevorzugte Schutzgruppe für die Aminogruppe in der Verbindung der Formel (I) oder einem Salz oder einem Derivat davon mit geschützter Carboxylgruppe stellt die Benzyloxycarbonylgruppe dar.
Die Verbindung der Formel (I) liegt wünschenswerterweise in isolierter Form, frei von Nucleinsäurematerial, vor. Die Verbindung liegt geeigneterweise z. B. im wesentlichen rein vor, stärker geeignet ist eine Reinheit von mindestens 75% und bevorzugt eine Reinheit von mindestens 85%, z. B. 90 bis 100%. Eine bevorzugte isolierte Form stellt die feste Form dar, stärker bevorzugt ist die kristalline Form. Es sollte jedoch so verstanden werden, daß die Verwendung von Verbindung (I) in unreiner Form durch die vorstehenden Ausführungen keineswegs ausgeschlossen wird.
Wenn man die erfindungsgemäßen Verbindungen in organischen Lösungsmitteln auskristallisieren läßt oder umkristallisiert, kann das Lösungsmittel der Kristallisation im kristallinen Produkt vorliegen. Diese Erfindung schließt in ihrem Umfang solche Solvate ein. Genauso können die erfindungsgemäßen Verbindungen in wasserhaltigen Lösungsmitteln auskristallisiert oder umkristallisiert werden. In solchen Fällen kann Hydratationswasser erzeugt werden. Diese Erfindung umfaßt sowohl stöchiometrische Hydrate als auch Verbindungen, die verschiedene Mengen Wasser enthalten, die durch Verfahren wie Gefriertrocknung hergestellt werden.
Spezifische erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I) oder ein Salz oder eine geschützte Form davon umfassen die folgenden:
Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo- [3.2.0]heptan-2-carbonsäure;
Z-(2S,5S)-3-(β-Benzyloxycarbonylaminoethyliden)-7-oxo-4- oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure; und
Benzyl-Z-(2S,5S)-3-(β-benzyloxycarbonylaminoethyliden)-7- oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat.
Die vorliegende Verbindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes oder einer geschützten Form davon bereit, das die Behandlung einer Vorläuferverbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon
mit einem Enzymsystem, das die erwünschte Cyclisierung bewirken kann, und anschließend, falls nötig oder erwünscht, die Umwandlung des Produktes in ein Salz oder eine geschützte Form davon umfaßt.
Der hier verwendete Begriff "Enzymsystem" bezeichnet entweder ein Enzym oder eine Reihe von Enzymen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Verbindung der Formel (II) oder ein Salz oder eine geschützte Form davon bereit.
Verbindungen der Formel (II) besitzen zwei asymmetrische Kohlenstoffatome, die in der Formel mit Sternchen markiert sind. Diese Verbindungen können daher in vier stereoisomeren Formen vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfaßt alle Stereoisomeren der Verbindungen der Formel (II) und deren Verwendung, wobei sie sowohl frei von anderen Isomeren als auch gemischt mit anderen Isomeren in einem beliebigen Mengenverhältnis vorliegen können, und schließt daher beispielsweise racemische Gemische von Enantiomeren ein. Solvate, inbesondere Hydrate, der Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon sind auch im Umfang der Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung betrifft außerdem geschützte Derivate der Verbindung der Formel (II), d. h. Verbindungen, in denen eine oder mehrere der funktionellen Gruppen in geschützter Form vorliegen.
Geeignete Schutzgruppen für die Carboxyl- und Aminogruppen in der Verbindung der Formel (II) umfassen diejenigen, die vorstehend als geeignete Schutzgruppen für die Carboxyl- und Aminogruppen der Verbindung der Formel (I) angegeben sind.
Eine bevorzugte Schutzgruppe für die Carboxylgruppe in Verbindungen der Formel (II) ist die Benzylgruppe.
Bevorzugte Schutzgruppen für die Aminogruppe in Verbindungen der Formel (II) umfassen die Benzyloxycarbonyl- und die Azidogruppe.
Geeignete Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe in der Verbindung der Formel (II) umfassen diejenigen, die von T. W. Greene (a.a.O.) erörtert werden. Besonders geeignete Schutzgruppen umfassen diejenigen, die Ester ergeben, z. B. einen gegebenenfalls substituierten C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoylester, wie z. B. das Acetat; gegebenenfalls substituierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- und Arylcarbonate; gegebenenfalls substituierte C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, Aryl- und Aryl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylether; gegebenenfalls substituierte Tri-C&sub1;&sub6; alkylsilylether; und Acetale (z. B. Tetrahydropyranyloxy-Derivate, manchmal als "THP-Ether" beschrieben).
Die Verbindung der Formel (II) liegt wünschenswerterweise in isolierter Form, frei von Nucleinsäurematerial, vor. Die Verbindung liegt geeigneterweise z. B. im wesentlichen rein vor, stärker geeignet ist eine Reinheit von mindestens 75% und bevorzugt eine Reinheit von mindestens 85%, z. B. 90 bis 100%. Eine bevorzugte isolierte Form stellt die feste Form dar, stärker bevorzugt ist die kristalline Form. Es sollte jedoch so verstanden werden, daß die Verwendung von Verbindung (II) in unreiner Form durch die vorstehenden Angaben keinesfalls ausgeschlossen wird.
Die Verbindung der Formel (II) kann in Zwitterionenform vorliegen.
Die Salze von Verbindungen der Formel (II) können beispielsweise Säureadditionssalze, Metallsalze, Ammoniumsalze und substituierte Ammoniumsalze, z. B. tertiäre Aminsalze, sein. Das Salz kann an der Carboxylgruppe und/oder der terminalen Aminogruppe entstehen. Beispiele geeigneter Salze umfassen diejenigen Salze, die in Zusammenhang mit Verbindung (I) vorstehend erwähnt werden.
Besondere Verbindungen der Formel (II) oder ein Salz oder eine geschützte Form davon umfassen die folgenden:
5-Amino-3-hydroxy-2- (2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure;
5-Benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy-2-(2-oxo-azetidin-1- yl)valeriansäure;
Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat; und
Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßigerweise z. B. in einem zellfreien System, d. h. in Abwesenheit von lebenden Zellen, ausgeführt.
Vorzugsweise stammt das verwendete Enzymsystem von einem Mikroorganismus, insbesondere einer Art von Streptomyces.
Alternativ kann (können) das (die) Enzym(e) durch Gentechnologie erzeugt werden.
Bei Verwendung eines zellfreien Systems wird ein zellfreier Extrakt vorzugsweise durch Beschallung oder anderweitigen Aufschluß der Mikroorganismen hergestellt, wobei gegebenenfalls danach Zelltrümmer entfernt werden und das Enzymsystem dabei in Lösung verbleibt.
Das Enzymsystem, das die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon erzeugt, umfaßt zweckmäßigerweise z. B. ein Oxygenaseenzym.
Das Oxygenaseenzym ist zweckmäßigerweise z. B. eine Dioxygenase eines Typs, bei dem ein Atom des Dioxygenmoleküls auf jedes von zwei Substratmolekülen übertragen wird. Die zwei Substratmoleküle können gleich oder verschieden sein. Die Vorläuferverbindung von Formel (II) kann als ein Substratmolekül und ein Molekül, z. B. eine 2-Oxosäure wie 2-Oxoglutarsäure, kann als zweites Substrat(Cosubstrat)-Molekül dienen. Enzyme, bei denen 2-Oxoglutarsäure als Cosubstrat dient, stellen bevorzugte Dioxygenasen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren dar.
Beim Vorstehenden soll beachtet werden, daß die Oxygenaseenzyme molekularen Sauerstoff nutzen, folglich sollte das Reaktionsmedium zur Erleichterung der Umsetzung vorzugsweise mit ausreichend Sauerstoff versorgt werden, um einen geeigneten Druck des gelösten Sauerstoffs aufrechtzuerhalten. Eine effiziente Überführung von Sauerstoff aus der Gasphase in die Lösungsphase wird durch Rühren oder Schütteln des Reaktionsmediums unterstützt.
Zusätzlich zum Cosubstrat und Sauerstoff kann das Oxygenaseenzmy-Reaktionsgemisch einen oder mehrere weitere Cofaktoren enthalten. Solche Cofaktoren umfassen üblicherweise eine weiter Quelle von Eisenionen, am geeignetsten Eisen(II)-sulfat.
Eine bevorzugte Quelle des Oxygenaseenzyms stellt eine Strepomyces-Art dar, wie z. B. Stämme von oder Stämme, die abgeleitet sind von S. clavuligerus, S. jumonjinensis, S. katusurahamanus und S. lipmanii. Insbesondere sind die folgenden Stämme dieser Mikroorganismen nützlich: S. clavuligerus ATCC 27064, S. jumonjinensis ATCC 29864, S. katsurahamanus T-272, S. lipmanii NRRL 3584.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Enzym stammt von S. clavuligerus ATCC 27064 und zeigt die nachstehenden Eigenschaften:
a) die Fähigkeit, eine Verbindung der Formel (II) oder ein Salz davon wie vorstehend definiert in eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon wie vorstehend definiert umzuwandeln;
b) eine einzelne Bande entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 48 000 Daltons bei Bestimmung mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese;
c) einen isoelektrischen Punkt (pI) von 5,65 bei Bestimmung mit isoelektrischer Fokussierung.
Das Oxygenaseenzym kann hergestellt werden, indem der Mikroorganismus in üblicher Art und Weise, inbesondere unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten Flüssigkeit oder einem geeigneten halbfesten Medium, gezüchtet wird. Im allgemeinen umfaßt das Kulturmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die von Mikroorganismen assimiliert werden, und anorganische Salz-Nährstoffe, die für das Wachstum von Mikroorganismen essentiell sind. Das Kulturmedium sollte im Hinblick auf die Art der prosthetischen Gruppen in den Oxygenaseenzymen eine Quelle von Metallionen, wie z. B. Eisen, enthalten. Die Kulturbedingungen können bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 80ºC und einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 10 liegen. Bevorzugte Bedingungen sind von 20 bis 30ºC bei einem pH-Wert von 5 bis 9, geeigneterweise z. B. etwa pH 7, 0,5 bis 5 Tage lang.
Das Oxygenaseenzym kann isoliert und in gereinigter Form, teilweise gereinigter Form, in einem unreinen Stadium wie es erhalten wird, als ein Filtrat aus einem aufgeschlossenen Zellpräparat oder als rohes Zellhomogenisat verwendet werden.
Am besten geeignet ist ein Enzym, das z. B. mindestens teilweise gereinigt wird, wodurch andere Enzyme entfernt werden, welche die Zerstörung der Vorläufers, des Enzyms oder des Clavam-Kerns katalysieren könnten. Das Enzym kann an einen unlöslichen polymeren Träger angelagert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen in wässerigen Medien durchgeführt, wobei das Reaktionsgemisch geeigneterweise in einem pH-Bereich von 4 bis 9, stärker geeignet z. B. von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise etwa pH 7,0 bis 7,5, gehalten wird. Der pH-Wert wird geeigneterweise z. B. unter Verwendung von Puffern, wie z. B. 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure-Puffer bei pH 7 kontrolliert. Alternativ kann der pH- Wert durch Zusatz einer geeigneten Säure oder Base eingestellt werden. Die Reaktionstemperatur sollte für das eingesetzte Enzym geeignet sein und liegt im allgemeinen im Bereich von 15 bis 60ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC. Die Reaktionszeit hängt von solchen Faktoren wie Konzentrationen der Reaktionspartner und Cofaktoren, Temperatur und pH-Wert ab.
Der Vorläufer (II) oder ein Salz davon wird vor dem Mischen mit dem Enzym geeigneterweise z. B. in Puffer gelöst. Die Konzentration der Vorläuferlösung hängt von der Löslichkeit des Vorläufers ab; üblicherweise liegt die Konzentration der Vorläuferlösung im Bereich von 5% (Gew./Vol.) bis 0,001% (Gew./Vol.). Nachdem die Umsetzung vollständig abgelaufen ist, kann das Enzym vom Reaktionsgemisch abgetrennt und die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon nach herkömmlichen Verfahren isoliert werden. Die Anfangsreinigung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon umfaßt günstigerweise einen Chromatographie-Schritt. Die Verbindung der Formel (I) kann in einer Form isoliert werden, in der die vorliegende Carboxyl- und/oder Aminogruppe geschützt ist, sodann kann (können) gewünschtenfalls die Schutzgruppe(n) entfernt werden, wodurch die Verbindung (I) in reiner Form erhalten wird.
Anstatt ein zellfreies System einzusetzen, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch unter Verwendung eines intakten Mikroorganismus durchgeführt werden. Die Vorläuferverbindung der Formel (II) oder ein Salz davon wird sodann bereitgestellt und mit dem Mikroorganismus in Kontakt gebracht, wodurch die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon erzeugt wird. Der Mikroorganismus kann in Form einer wachsenden Kultur, einer ruhenden Kultur, von gewaschenem Myzel, immobilisierten Zellen oder Protoplasten vorliegen.
Eine Verbindung der Formel (II) kann durch Cyclisierung einer Verbindung der allgemeinen Formel (III) hergestellt werden
in der X eine abspaltbare Gruppe bedeutet und die funktionellen Gruppen CO&sub2;H, OH und NH&sub2; gegebenenfalls geschützt sind.
Eine durch X dargestellte abspaltbare Gruppe ist eine beliebige Gruppe, die sich unter den Reaktionsbedingungen von einer Ausgangsverbindung abspaltet und auf diese Weise die Umsetzung an einer bestimmten Stelle in Gang bringt. Die hier verwendete Gruppe X kann eine Hydroxyl- oder veresterte Hydroxylgruppe, wie z. B. ein Sulfatester, gegebenenfalls substituiert mit einem Halogenatom; ein Halogenatom, z. B. Brom-, Chlor- oder Iodatom; oder ein Aryl- oder Alkylsulfonyloxyrest, wie z. B. die p-Toluolsulfonyloxy- (Tosyl-) oder Methansulfonyloxy- (Mesyl-)gruppe; oder ein Alkyloxoniumsalz sein.
Das vorstehende Verfahren wird vorzugsweise unter basischen Bedingungen, z. B. in Gegenwart von Natrium- oder Kaliumhydroxid oder Natrium- oder Kaliumhydrid, durchgeführt.
Die Cyclisierungsreaktion kann folgendermaßen durchgeführt werden:
a) wenn X ein Halogenatom oder einen Aryl- oder Alkylsulfonyloxyrest oder ein Alkyloxoniumsalz des Alkohols darstellt, in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie z. B. Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Hexamethylphosphoramid, Dichlormethan, Acetonitril oder Essigsäureethylester oder Gemischen von beliebigen solchen Lösungsmitteln;
b) wenn X ein Halogenatom oder einen Sulfatester des Alkohols, wie z. B. den Chlorsulfatester, darstellt, nach Verfahren der Phasentransfer-Katalyse in wässeriger und/oder organischer Lösung in Gegenwart eines quartären Ammoniumsalzes, wie z. B. Tetrabutylammoniumbisulfat oder -halogenid, oder Benzyltrimethylammoniumhalogenid;
c) wenn X eine Hydroxylgruppe darstellt, in Gegenwart eines geeigneten Reagens, wie z. B.
(C&sub6;H&sub5;)&sub3;P/C&sub2;H&sub5;O&sub2;CN = NCO&sub2;C&sub2;H&sub5;&sub1;.
Geeignete Beispiele von N-Schutzgruppen für die in Verbindung (III) vorliegende Aminogruppe umfassen diejenigen, die für diese Anwendung in der Peptidchemie üblicherweise eingesetzt werden. Beispiele solcher Gruppen umfassen Carbonsäuregruppen, wie z. B. die Acetyl-, Chloracetyl-, Trifluoracetyl-, Butyryl-, Benzoyl-, Phenylacetyl-, Pyridincarbonylgruppe; oder eine von Kohlensäure abgeleitete Säuregruppe, wie z. B. die Ethoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl-, Biphenylisopropoxycarbonyl-, p-Methylbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-, p-(p-Methoxyphenylazo)benzyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonylgruppe; oder eine von einer Sulfon- oder p-Toluolsulfonsäure abgeleitete Säuregruppe; oder andere Gruppen, wie z. B. eine Benzyl-, Trityl-, Formyl-, Phthaloyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Benzyliden- oder Nitrogruppe. Bevorzugte N-Schutzgruppen umfassen die t-Butoxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppe. In bestimmten Fällen kann das Stickstoffatom mit zwei der vorstehenden Gruppen substituiert sein, z. B. mit der Benzyl- und der Benzyloxycarbonylgruppe. Alternativ kann die vorliegende Aminogruppe in Form einer Azido- oder Cyanogruppe geschützt und durch ein geeignetes Verfahren, z. B. durch Reduktion, erzeugt werden.
Die in der resultierenden Verbindung vorliegende(n) Schutzgruppe(n) kann (können) durch ein geeignetes Verfahren, abhängig von der Art der Schutzgruppe (n), entfernt werden. Einige typische Verfahren sind die folgenden: Hydrierung in Gegenwart eines Palladiumkatalysators (z. B. Palladium-Kohle, kolloidales Palladium) für die Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-, p-(p'-Methoxyphenylazo)benzyloxycarbonyl- und Tritylgruppen, die die terminale Aminogruppe schützen; Behandlung mit Bromwasserstoff in Eisessig für die Benzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonylgruppen, die die terminale Aminogruppe schützen; Behandlung mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak für die Benzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl- und Tosylgruppen, die die terminale Aminogruppe schützen; Behandlung mit Salzsäure und/oder Essigsäure für die Trityl-, t- Butoxycarbonyl-, Formyl- und Benzylidengruppen, die die terminale Aminogruppe schützen. Alternativ kann (können) die Schutzgruppe(n) mit einem geeigneten hydrolytischen Enzym, z. B. einer Amidase, abgepalten werden. Eine terminale Azido- oder Cyanogruppe kann z. B. durch Hydrierung in Gegenwart eines Palladiumkatalysators zu einer Aminogruppe reduziert werden.
Geeignete Beispiele von die Carboxylgruppe blockierenden Derivaten für die Gruppe -CO&sub2;H in Verbindung (III) umfassen Salze und Esterderivate der Carbonsäure. Dabei handelt es sich vorzugsweise um ein Derivat, das in einem späteren Stadium der Umsetzung leicht gespalten werden kann. Geeignete Beispiele von Salzen umfassen Metallsalze, wie z. B. diejenigen mit Natrium, Kalium und Lithium, und tertiäre Aminsalze, wie z. B. diejenigen mit Tri(C&sub1;&submin;&sub6;)alkylaminen, N-Ethylpiperidin, 2,6-Lutidin, Pyridin, N-Methylpyrrolidin oder Dimethylpiperazin. Bevorzugt ist ein Salz, das mit Triethylamin gebildet wird.
Geeignete Beispiele von esterbildenden Schutzgruppen für die Carboxylgruppe in Verbindung (III) sind diejenigen, die unter üblichen Bedingungen entfernt werden können, die vorstehend als geeignet zum Schutz der Carboxylgruppe in Verbindungen der Formeln (I) und (II) angegeben werden.
Die Hydroxylgruppe kann genauso wie die Hydroxylgruppe in der Verbindung der Formel (II), z. B. in Form eines Silylethers, oder als ein Esterderivat, insbesondere C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoyl, z. B. als das Acetatderivat, geschützt sein.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (III), wobei die vorliegenden funktionellen Gruppen frei sind oder eine oder mehrere solcher Gruppen in geschützter Form vorliegen, sind neu.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (III) kann hergestellt werden, indem eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV) oder ein N-acylierendes Derivat davon mit einer Verbindung der Formel (V) oder einem Derivat davon gekuppelt wird, das den Ablauf der Acylierung gestattet
wobei X wie vorstehend definiert ist und beliebige funktionelle Gruppen gegebenenfalls geschützt sind.
Die Art der Schutzgruppen und ihre Entfernung ist genauso, wie es vorstehend bezüglich der allgemeinen Formel (III) erörtert wird. Natürlich ist es möglicherweise angebracht, Schutzgruppen aus einer geschützten Form von Verbindung (III) nicht zu entfernen, sondern statt dessen diese Verbindung der Cyclisierung zu unterwerfen, wodurch Verbindung (II) in geschützter Form wie vorstehend erörtert erhalten wird.
Geeignete Beispiele von Gruppen, die das Ablaufen der Acylierung gestatten und die gegebenenfalls an der α-Aminogruppe der Ausgangsverbindung der Formel (V) vorliegen, umfassen N-Silyl-, N-Stannyl- und N-Phosphorgruppen, z. B. Trialkylsilylgruppen, wie die Trimethylsilylgruppe, Trialkylzinngruppen, wie z. B. die Tri-n-butylzinngruppe, Gruppen der Formel -PRaRb, wobei Ra einen Alkyl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Halogenalkyl-, Aryl-, Halogenalkoxy-, Aryloxy- Aralkyloxy- oder Dialkylaminorest bedeutet und Rb gleich wie Ra ist oder ein Halogenatom bedeutet oder Ra und Rb zusammen einen Ring bilden; geeignete Phosphorgruppen sind beispielsweise
Ein reaktives N-acylierendes Derivat der Säure (IV) kann im vorstehenden Verfahren eingesetzt werden. Die Auswahl des reaktiven Derivats hängt natürlich vom chemischen Typ der Substituenten der Säure ab.
Ein geeignetes Beispiel eines N-acylierenden Derivats ist ein Säurehalogenid, vorzugsweise das Säurechlorid oder -bromid. Die Acylierung mit einem Säurehalogenid kann in Gegenwart eines säurebindenden Mittels ausgeführt werden, z. B. eines tertiären Amins, wie z. B. Triethylamin oder Dimethylanilin, einer anorganischen Base, wie z. B. Natriumhydroxid oder Natriumbicarbonat, oder einem Oxiran, das die bei der Acylierungsreaktion freigesetzte Halogenwasserstoffsäure bindet. Das Oxiran ist vorzugsweise ein (C&sub1;&submin;&sub6;)-1,2-Alkylenoxid, wie z. B. Ethylenoxid oder Propylenoxid. Die Acylierungsreaktion unter Verwendung eines Säurehalogenids kann bei einer Temperatur im Bereich von -50 bis +50ºC in wäßrigen oder nichtwässerigen Mitteln, wie z. B. wässerigem Aceton, wässerigem Tetrahydrofuran, Essigsäureethylester, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Acetonitril, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan, oder Gemischen davon durchgeführt werden. Alternativ kann die Umsetzung in einer instabilen Emulsion eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, insbesondere eines aliphatischen Esters oder Ketons, wie z. B. Methylisobutylketon oder Butylacetat, durchgeführt werden.
Andere geeignete Beispiele von N-acylierenden Derivaten der Säure der allgemeinen Formel (IV) umfassen aktivierte Ester, wie z. B. Succinimido-, Phthalimido-, p-Nitrophenylester, oder das Anhydrid von Verbindung (IV) oder gemischte Anhydride von Verbindung (IV) mit anderen Säuren.
Alternativ kann eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV) an eine Verbindung der Formel (V) gekuppelt werden, indem ein Entwässerungsmittel, geeigneterweise z. B. ein Carbodiimid- Reagens, wie z. B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder (1,3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid, verwendet wird.
Die Carbodiimid-Kupplungsreaktion kann in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, einem Zweiphasen-System oder einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel durchgeführt werden, abhängig vom Typ des Carbodiimid-Reagens und den in den Verbindungen (IV) und (V) vorliegenden Schutzgruppen.
Andere Kupplungsreagentien, die bei der Peptidsynthese verwendet werden, wie z. B. Dipyridyldisulfid/Triphenylphosphin, sind auch für die Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (III) aus den Verbindungen (IV) und (V) geeignet.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) kann auch hergestellt werden, indem eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI)
in der X wie vorstehend definiert ist, reduziert wird.
Die Reduktion wird geeigneterweise z. B. unter Verwendung eines Hydrid-Reduktionsmittels, wie z. B. NaBH&sub4;, Zn(BH&sub4;)&sub2; oder NaBH&sub3; CN, in einem geeigneten wässerigen oder organischen Lösungsmittel durchgeführt. Alternativ kann die Verbindung (VI) mit einem geeigneten Enzym in Gegenwart von geeigneten Cofaktoren oder unter Verwendung von ganzen Zellen, wie z. B. Hefe- oder Leberzellen, reduziert werden.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI) kann hergestellt werden, indem eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV) oder ein N-acylierendes Derivat davon mit einer Verbindung der Formel (VII)
gekuppelt wird.
Die Carboxyl- und d-Aminofunktionen von Verbindung (VII) können geeignet geschützt sein. Geeignete Beispiele von Schutzgruppen umfassen diejenigen, die vorstehend für den Schutz von Verbindungen der allgemeinen Formel (III) beschrieben werden. Außerdem kann die Carbonylgruppe in (VII) durch Verfahren geschützt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. diejenigen, die von T. W. Greene (a.a.O.) beschrieben werden. Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Kupplung einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV) mit einer Verbindung der Formel (V) können zur Kupplung einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV) mit einer Verbindung der Formel (VII) verwendet werden. Wieder ist es möglicherweise angebracht, vorliegende Schutzgruppen nicht zu entfernen, bis die Verbindung der allgemeinen Formel (III) hergestellt ist, oder sogar solange, bis die Verbindung der Formel (III) in geschützter Form cyclisiert worden ist.
Eine Verbindung der Formel (VII) kann hergestellt werden, indem eine Verbindung der Formel (VIII) oder der allgemeinen Formel (IX), wobei R eine esterbildende, die Carboxylgruppe blockierende Gruppe bedeutet, mit Glycin (X)
in Gegenwart beispielsweise einer Base in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel kondensiert wird.
Geeignete Beispiele von Basen umfassen anorganische Basen, wie z. B. Natrium- oder Kaliumhydrid, und organische Basen, wie z. B. Lithiumdiisopropylamin oder Lithiumbis(trimethylsilyl)amid.
Eine esterbildende Gruppe R kann beispielsweise ein Alkyl- oder Aralkylrest sein.
Die Amino- und Carboxylfunktionen der Verbindungen (VIII), (IX) und (X) sind gegebenenfalls geschützt. Sofern während der Umsetzung mit Verbindung (IX) die Carboxylgruppe von Glycin (X) durch eine esterbildende Gruppe geschützt ist, ist diese Gruppe vorzugsweise gleich wie die Gruppe R.
Geeignete Schutzgruppen schließen die vorstehend für die Verbindungen der allgemeinen Formel (III) beschriebenen Gruppen ein. Die Aminofunktionen der Verbindungen (VIII) und (IX) können beispielsweise als Azido- oder Cyanogruppen geschützt sein, die anschließend in Aminogruppen überführt werden können. In Verbindung (X) können die Aminofunktionen als das N- (Diphenylmethylen)- oder Isonitrilderivat geschützt sein.
Eine Verbindung der Formel (V) kann durch ein ähnliches Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Kondensation einer Verbindung der Formel (XI)
H&sub2;N-CH&sub2;-CH&sub2;-CHO (XI)
mit Glycin [Formel (X)].
Die Carboxylfunktion von Glycin (X) und die Aminofunktionen von Glycin (X) und Verbindung (XI) können geeigneterweise durch vorstehend beschriebene Schutzgruppen geschützt sein.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes oder einer geschützten Form davon bereit, das die Kondensation einer Verbindung der Formel (XIA),
Y-CH&sub2;CH&sub2;CHO (XIA)
wobei Y ein Halogenatom oder eine gegebenenfalls geschützte Aminogruppe bedeutet, mit einer Verbindung der Formel (XII) oder einem Salz davon,
wobei die Carboxylgruppe gegebenenfalls geschützt ist; und anschließend, falls nötig oder erwünscht, die Durchführung von einem oder mehreren der folgenden Schritte:
i) Überführung der Gruppe Y in eine Aminogruppe;
ii) Überführung des Produktes in eine freie Säure, ein Salz oder eine geschützte Form davon, umfaßt.
Vorzugsweise hat die Verbindung der Formel (XIA) die Formel (XI) wie vorstehend definiert.
Die Kondensation kann durchgeführt werden, indem die vorstehend bei der Herstellung von Verbindung (VII) beschriebenen basischen Bedingungen eingesetzt werden. Die Carboxylgruppe von Verbindung (XII) ist gegebenenfalls zweckmäßig geschützt, die Aminogruppe von Verbindung (XI) ist gegebenenfalls geschützt. Beispielsweise kann die Aminogruppe als eine Azido- oder Cyanogruppe geschützt sein und durch Reduktion erzeugt werden.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt besteht die Möglichkeit, als Ausgangsverbindung anstelle von Verbindung (XI) die entsprechende Chlorverbindung der Formel (XI')
ClCH&sub2;CH&sub2;CHO (XI')
einzusetzen.
Die bei der Kondensation mit Verbindung (XII) hergestellte Verbindung kann durch Umsetzung mit einem geeigneten Azid, z. B. Natriumazid, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Dimethylsulfoxid, in eine Verbindung umgewandelt werden, die der Verbindung (II) ähnlich ist, die aber eine terminale Azidogruppe aufweist. Verbindung (II) kann sodann durch Reduktion der terminalen Azidogruppe erzeugt werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes oder einer geschützten Form davon bereitgestellt, das die Reduktion einer Verbindung der Formel (XIII) oder eines Salzes davon,
wobei die Carboxyl- und Aminofunktionen, falls erwünscht, durch vorstehend beschriebene Verfahren gegebenenfalls geschützt sind, und anschließend, falls nötig,
i) Entfernung der Schutzgruppen;
ii) Überführung des Produktes in eine freie Säure, ein Salz oder eine geschützte Form davon,
umfaßt.
Geeignete Beispiele von brauchbaren Reduktionsmitteln sind Metallhydridkomplexe, wie z. B. NaBH&sub4;, NaBH&sub3; CN, Zn(BH&sub4;)&sub2;, in wässerigen oder organischen Lösungsmitteln.
Alternativ kann Verbindung (XIII) mit einem geeigneten Enzym in Gegenwart von geeigneten Cofaktoren oder unter Verwendung von ganzen Zellen, wie z. B. Hefe- oder Leberzellen, reduziert werden.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel (XIII) kann aus einer Verbindung der Formel (VIII) oder (IX) durch Kondensation mit einer Verbindung der Formel (XII) hergestellt werden, wobei z. B. die vorstehend beschriebenen basischen Bedingungen eingesetzt werden.
In einem weiteren Reaktionsweg kann eine Verbindung der Formel (II) durch Cyclisierung einer Verbindung der Formel (XIV) hergestellt werden.
Die funktionellen Gruppen in Verbindung (XIV) sind gegebenenfalls wie vorstehend geschützt. Geeignete Schutzgruppen umfassen die für Verbindungen der allgemeinen Formel (III) vorstehend beschriebenen Gruppen. Zum Zweck der Cyclisierung beläßt man die Carboxylgruppe der Propionyleinheit und die sekundäre Aminfunktion vorzugsweise ungeschützt. Die Cyclisierung von Verbindung (XIV) wird gegebenenfalls unter Verwendung eines Entwässerungsmittels ausgeführt. Hierfür eignen sich Mittel, die üblicherweise bei der Peptidsynthese eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Carbodiimid-Reagens oder ein Gemisch aus Triphenylphosphin und Dipyridyldisulfid verwendet werden. Die Carbodiimid-Reagentien werden normalerweise in wässerigen oder organischen Lösungsmitteln verwendet, abhängig vom jeweils verwendeten Reagens. Das Triphenylphosphin/Dipyridyldisulfid-Reagens wird geeigneterweise z. B. in einem organischen Lösungsmittel, üblicherweise Acetonitril, eingesetzt.
Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß eine Verbindung der Formel (II) durch Cyclisierung einer Verbindung der Formel (XIV) oder einer Verbindung der Formel (III) wie vorstehend definiert hergestellt werden kann.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes oder einer geschützten Form davon bereit,
das die Cyclisierung einer Verbindung der Formel (XIVA) oder eines Salzes davon,
wobei Z eine Gruppe der Formel HO&sub2;CCH&sub2;CH&sub2;NH- oder XCH&sub2;CH&sub2;CONH-, in der X eine abspaltbare Gruppe darstellt, bedeutet und beliebige reaktive Gruppen gegebenenfalls geschützt sind, und anschließend, falls nötig, die Durchführung von einem oder mehreren der folgenden Schritte:
i) Entfernung der Schutzgruppen;
ii) Überführung des Produktes in eine freie Säure, ein Salz oder eine geschützte Form davon,
umfaßt.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel (XIV) kann hergestellt werden, indem 3-Hydroxyornithin (V) mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (XV) umgesetzt wird.
Die in der Verbindung (V) vorliegende α-Carboxyl- und d- Aminogruppe sind gegebenenfalls geschützt, z. B. kann die d- Aminogruppe durch eine Benzyloxycarbonylgruppe geschützt sein.
Die Carboxylgruppe der Verbindung (XV) kann in freier Form oder in Salzform oder einer anderen geschützten Form vorliegen. Eine geeignete Schutzgruppe wäre beispielsweise eine Estergruppe. In solchen Fällen wird normalerweise der Trichlorethylester eingesetzt. Die Estergruppe wird üblicherweise nach der Umsetzung unter Verwendung eines Zink/Essigsäure/Tetrahydrofuran-Gemisches entfernt.
Eine Verbindung der Formel (II) kann auch durch herkömmliche Techniken zur Herstellung von β-Lactamen hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel (XVI)
bei einer Synthese, wobei z. B. Phenylsulfenylchlorid und anschließend Kaliumhydroxid in Verbindung mit einem Phasentransfer-Katalysator verwendet wird, in eine Verbindung der Formel (II) umgewandelt werden. Dieses Verfahren wird vorzugsweise als eine "Eintopf"-Synthese durchgeführt. In einem weiteren Syntheseverfahren kann eine Verbindung der Formel (XVII) mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (V)
bei einer Temperatur unter z. B. -70ºC, vorzugsweise bei -78ºC, unter Verwendung von z. B. zuerst t-C&sub4;H&sub9;OCl und sodann Silbernitrit, umgesetzt werden. Dieses Verfahren wird vorzugsweise als eine Eintopf-Synthese durchgeführt. In beiden Verfahren kann eine beliebige funktionelle Gruppe, die nicht an den Umsetzungen beteiligt ist, geschützt sein und die Schutzgruppe gewünschtenfalls anschließend entfernt werden.
In der vorstehenden Umsetzung kann, falls nötig oder erwünscht, eine freie Hydroxyl-, Carboxyl- oder Aminogruppe einer Ausgangsverbindung während der beschriebenen Umsetzungen gegebenenfalls durch auf dem Fachgebiet gebräuchliche Schutzgruppen geschützt sein. Die Schutzgruppen können nach der Herstellung gewünschtenfalls durch die üblichen bekannten Verfahren entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue Zwischenprodukte, die in freier Form oder in einer Form vorliegen, in der eine oder mehrere vorliegende funktionelle Gruppen geschützt sind.
Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes oder eines Esters davon bereitstellt,
das die Behandlung einer Verbindung der Formel (XVIII) oder eines Salzes davon,
wobei die funktionellen Gruppen gegebenenfalls geschützt sind und Z¹ ein Wasserstoffatom oder die Gruppe CH&sub2;=CH-CO- bedeutet, mit Reagentien, die auf dem Fachgebiet dafür bekannt sind, daß sie befähigt sind, die Gruppe Z¹NH-, in der Z¹ wie vorstehend definiert ist, in eine β-Lactamgruppe der Formel
umzuwandeln, und danach, falls nötig oder erwünscht, die Durchführung eines oder mehrerer der folgenden Schritte:
i) Entfernung von Schutzgruppen;
ii) Überführung des Produktes in eine freie Säure, ein Salz oder eine geschützte Form davon,
umfaßt.
Verbindungen der Formeln (IV), (VIII), (IX), (X), (XI), (XI'), (XII), (XV), (XVI) und (XVII) sind entweder bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen durch bekannte Verfahren oder durch Verfahren, die bekannten Verfahren ähnlich sind, hergestellt werden.
Die Verbindung (II) kann auch durch enzymatische Synthese hergestellt werden, z. B. eine zellfreie Synthese, oder durch Isolierung aus einem geeigneten Stamm einer Streptomyces-Art, z. B. S. clavuligerus, S. jumonjinensis, S. katsurahamanus oder S. lipmanii. Die Isolierung von Verbindung (II) umfaßt geeigneterweise das Aufschließen des Myzels und die Isolierung von Verbindung (II) aus dem Zellinhalt. Typischerweise umfaßt die Isolierung von Verbindung (II) in gereinigter Form chromatographische Verfahren. Alternativ kann Verbindung (II) in unreiner Form oder teilweise gereinigter Form verwendet werden.
Es ist so zu verstehen, daß ein Salz einer Verbindung der Formel (II) durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann, wobei ein Salz einer Ausgangsverbindung eingesetzt wird oder eine hergestellte freie Verbindung (II) anschließend in ein Salz überführt wird. Außerdem kann gewünschtenfalls ein Salz der hergestellten Verbindung (II) in eine freie Verbindung ohne Salzbildung oder ein anderes Salz von Verbindung (II) überführt werden.
Die Salze von Verbindungen der Formel (II) können z. B. durch die Behandlung einer Verbindung der Formel (II) mit einer geeigneten Säure oder Base erzeugt werden.
Verbindungen der Formel (II) und Salze davon, die nach den vorstehenden Verfahren hergestellt werden, können durch übliche Methoden gewonnen werden.
Verbindungen der allgemeinen Formel (II) können in diastereoisomere Paare von Enantiomeren getrennt werden, falls erwünscht, z. B. durch fraktionierte Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Methanol oder Essigsäureethylester oder einem Gemisch davon. Das auf diese Weise erhaltene Enantiomerenpaar kann durch übliche Mittel, z. B. durch die Verwendung eines optisch aktiven Salzes als Lösungsmittel oder durch stereoselektive Entfernung einer Schutzgruppe unter Verwendung eines geeigneten Enzyms, z. B. einer Esterase, wie z. B. Subtilisin, in zwei einzelne Stereoisomere getrennt werden. In Gemischen aus Diastereoisomeren der Formel (II) kann das Verhältnis von Diastereoisomeren durch Behandlung mit einer nicht-nucleophilen Base, z. B. 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en, verändert werden.
Geeignete optisch aktive Verbindungen, die als Lösungsmittel verwendet werden können, werden in "Topics in Stereochemistry", Bd. 6, Wiley Interscience, 1971, Allinger, N. L., und Eliel, W. L., Hrsg., beschrieben.
Alternativ kann ein beliebiges Enantiomer einer Verbindung der Formel (II) erhalten werden, indem bei der stereospezifischen Synthese optisch reine Ausgangsverbindungen bekannter Konfiguration eingesetzt werden.
Diese Erfindung betrifft außerdem die Verwendung einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon zur Synthese von Clavulansäure.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure oder eines Salzes davon bereitgestellt, das die Behandlung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon mit einem Enzymsystem umfaßt.
Vorzugsweise wird das Enzymsystem von einem Mikroorganismus abgeleitet, insbesondere einer Streptomyces-Art. Geeigneterweise wird das Verfahren in einem zellfreien System durchgeführt. Geeigneterweise umfaßt die zellfreie Synthese von Clavulansäure die Behandlung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon mit einem Extrakt einer Streptomyces- Art.
Die Streptomyces-Art ist geeigneterweise eine Art, die Clavulansäure produziert.
Der Extrakt aus einer Streptomyces-Art umfaßt ein Enzymsystem. Der zellfreie Extrakt wird vorzugsweise durch Beschallung oder ein anderes Aufschlußverfahren der Streptomyces-Zellen und gegebenenfalls danach Entfernung von Zelltrümmern hergestellt, wobei das Enzymsystem in Lösung oder Suspension verbleibt. Das Enzymsystem kann aus alternativen Quellen hergeleitet werden; z. B. kann (können) das (die) Enzym(e) geeigneterweise durch Gentechnik hergestellt werden. Ein bevorzugtes Enzymsystem stammt aus einer Clavulansäure produzierenden Streptomyces-Art, wie z. B. Clavulansäure produzierende Stämme von S. clavuligerus, S. jumonjinensis und S. katurahamanus, oder davon abgeleiteten Stämmen, z. B. Mutantenstämmen. Insbesondere sind die nachstehenden Stämme dieser Mikroorganismen geeignet: S. clavuligerus ATCC 27064, S. jumonjinensis ATCC 29864 und S. katsurahamanus T-272.
Anstatt ein zellfreies System zu verwenden, kann das vorstehende Verfahren auch unter Einsatz eines intakten Mikroorganismus durchgeführt werden. Die Vorläuferverbindung der Formel (I) oder ein Salz davon wird sodann mit dem Mikroorganismus in Kontakt gebracht, wodurch Clavulansäure oder ein Salz davon erzeugt wird. Der Mikroorganismus kann in Form einer wachsenden Kultur, ruhenden Kultur, von gewaschenem Myzel, immobilisierten Zellen oder Protoplasten vorliegen.
Das Enzymsystem kann hergestellt werden, indem der Mikroorganismus in herkömmlicher Art und Weise, insbesondere unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten Flüssigkeit oder halbfestem Medium, gezüchtet wird. Im allgemeinen enthält das Kulturmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die von Mikroorganismen assimiliert werden können, sowie anorganische Salz- Nährstoffe, die zur Förderung des Wachstums der Mikroorganismen eingesetzt werden. Die Kulturbedingungen können bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 80ºC und einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 10 liegen. Bevorzugte Bedingungen liegen bei 20 bis 30ºC und einem pH-Wert von 5 bis 9, z. B. etwa pH 7, 0,5 bis 5 Tage lang. Das Enzymsystem kann isoliert und in gereinigter Form, in teilweise gereinigter Form, in einem unreinen Stadium, das als Filtrat aus einem Präparat aufgeschlossener Zellen erhalten wird, oder als rohes Zellhomogenisat verwendet werden.
Am geeignetsten wird das Enzymsystem zumindest teilweise gereinigt, um andere Enzyme zu entfernen, welche die Zerstörung des Vorläufers (I), des Enzyms (der Enzyme) oder des Reaktionsproduktes katalysieren könnten. Das (die) Enzym(e) kann (können) an einen unlöslichen Träger angelagert werden.
Das Verfahren wird allgemein in wässerigen Medien durchgeführt, wobei das Reaktionsgemisch in einem Bereich von pH 4 bis 9, geeigneter z. B. 6,5 bis 8,5, gehalten wird. Der pH-Wert wird geeigneterweise unter Verwendung herkömmlicher, auf dem Fachgebiet bekannter Puffer kontrolliert. In einer Ausführungsform wird beispielsweise 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure-Puffer (pH 7) eingesetzt. Die Reaktionstemperatur sollte für das verwendete Enzym geeignet sein und liegt im allgemeinen im Bereich von 15 bis 40ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC. Die Reaktionszeit hängt von Faktoren wie Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer, Temperatur und pH-Wert ab.
Eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon wird z. B. geeigneterweise vor Mischen mit dem Enzymsystem in Puffer gelöst; die Konzentration hängt von der Löslichkeit der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon ab. Geeigneterweise liegt die Konzentration der Lösung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon im Bereich von 5% (Gew./ Vol.) bis 0,001% (Gew./Vol.). Nachdem die Umsetzung vollständig abgelaufen ist, kann (können) das (die) Enzym(e) vom Reaktionsgemisch abgetrennt und die Clavulansäure oder ein Salz davon nach herkömmlichen Verfahren isoliert werden. Die erste Reinigung der Clavulansäure oder eines Salzes davon umfaßt üblicherweise einen Chromatographieschritt.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Umwandlung eines Vorläufers der Formel (II) oder eines Salzes davon in Clavulansäure oder ein Salz davon durch Behandlung mit einem Enzymsystem wie vorstehend beschrieben bereitgestellt. Geeigneterweise wird die Umsetzung als zellfreie Synthese ohne Isolierung des Zwischenproduktes, d. h. von Verbindung (I) oder eines Salzes davon, durchgeführt. Alternativ wird die Umwandlung der Verbindung der Formel (II) in Clavulansäure unter Verwendung eines intakten Mikroorganismus direkt durchgeführt.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Alle Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht und alle Verhältnisangaben auf Volumen. In ¹H-NMR- Spektren tauschen sich Protonen, die bekanntermaßen "austauschbar" sind, unter Schütteln mit D&sub2;O gegen Deuterium aus.

Beispiel 1

Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat

Unter einer trockenen Stickstoff-Atmosphäre wird eine Lösung von Benzyl-2-(2-oxoazetidin-1-yl)acetat (3,28 g, 15 mMol) in trockenem Tetrahydrofuran (5 ml) zu Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (15 ml einer 1 M Lösung in Tetrahydrofuran), das auf -70ºC gekühlt worden war, hinzugefügt. Die Zugabe wurde entsprechend langsam durchgeführt, daß die Temperatur der Lösung nicht über -60ºC anstieg, nach vollständiger Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 15 Minuten bei -70ºC gerührt. Eine Lösung von 3-Azidopropionaldehyd (18 mMol) in Tetrahydrofuran (5 ml) wurde zum Reaktionsgemisch hinzugefügt, währenddessen wurde die Temperatur unter -60ºC gehalten. Nach Rühren bei -70ºC für weitere zwei Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit einer Lösung von Essigsäure (0,86 ml, 15 mMol) in Wasser (2 ml) versetzt und bis zum Erreichen von Raumtemperatur stehengelassen.
Das Produkt wurde in Essigsäureethylester extrahiert und nacheinander mit Wasser, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, sodann getrocknet (MgSO&sub4;) und zu einem orangen Öl eingedampft. Das Öl wurde auf Kieselgel (Merck Art. 9385) chromatographiert, das mit Essigsäureethylester/Hexan (2:1) eluiert wurde, wodurch Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2- oxoazetidin-1-yl)valerianat als hellgelbes Öl (2,72 g, 36%) erhalten wurde.
Eine Dünnschichtchromatographie dieses Produktes auf Kieselgelplatten (Merck Art. 5719), die mit einem Gemisch aus Dichlormethan/Essigsäureethylester/Ethanol (60:10:1) eluiert wurden, zeigte ein Diastereoisomeren-Gemisch im Verhältnis von 1:2, Rf 0,44 bzw. 0,40; Sichtbarmachung mit Iod-Dampf. νmax (KBr) 3107, 2100 und 1733 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;; 250 MHz) 1,76 (1H, m), 1,96 (1H, m), 3,02 (2H, m), 3,32 (2H, m), 3,49 (2H, m), 4,03 (1H, d, J 3,3 Hz), 4,28 (1H, m), 4,51 (1H, d, J 5 Hz, austauschbar), 5,23 (2H, s) und 7,34 (5H, s).

Beispiel 2

Epimerisierung von Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2- oxoazetidin-1-yl)valerianat

Eine Lösung von Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat (4,1 g, 12,8 mMol), das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, in Dichlormethan (400 ml) wurde mit 1,5- Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (1,86 g, 14,9 mMol) versetzt und das Gemisch eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und die Hälfte des verbliebenen Öls auf einer Säule (45·4,5 cm) mit Kieselgel (Merck Art. 9385) unter Verwendung eines Gemisches aus Dichlormethan, Essigsäureethylester und Ethanol (60:10:1) chromatographiert, wodurch das schneller laufende Diastereoisomer von Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat (1,1 g) als Öl, das beim Stehenlassen kristallisierte, sowie ein Gemisch aus dem schneller und dem langsamer laufenden Diastereoisomer im Verhältnis von 30 zu 70 (58 mg) als Öl erhalten wurde. Die Chromatographie der anderen Hälfte des Reaktionsgemisches unter den gleichen Bedingungen erzeugte weitere ähnliche Mengen des schnell laufenden Diastereoisomers und des Gemisches aus den zwei Diastereoisomeren. Eine Probe des schneller laufenden Diastereoisomers wurde in Hexan umkristallisiert, wodurch weiße Nadeln erhalten wurden, F. 63- 65ºC. νmax (KBr) 3400, 2101, 1725, 1263, 752, 699 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;; 400 MHz) 1,7 (1H, m), 1,84 (1H, m), 3,03 (2H, m), 3,35 (1H, m), 3,43 (1H, m), 3,51 (2H, m), 4,04 (1H, d, J 3 Hz), 4,32 (2H, m), 5,23 und 5,26 (2H, ABq, J 12 Hz) und 7,37 (5H, s).
(Gefunden: C, 56,63; H, 5,64; N, 17,50%. C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub8;N&sub4;O&sub4; erfordert C, 56,59; H, 5,70; N, 17,60%).
Das langsam laufende Diastereoisomer von Benzyl-5-azido- 3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat wurde als Öl erhalten, indem Proben, die einen Anteil dieses Diastereoisomers enthielten, unter Verwendung des gleichen Systems chromatographiert wurden. δH (CHCl&sub3;; 250 MHz) 1,78 (1H, m), 1,97 (1H, m), 2,99 (2H, t, J 4,5 Hz), 3,33 (2H, m), 3,5 (2H, m), 4,04 (1H, d, J 4,5 Hz), 4,27 (1H, m), 4,52 (1H, d, J 5 Hz), 5,22 (2H, m) und 7,36 (5H, s).
Das langsam laufende Diastereoisomer kann durch Behandlung mit 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en wie vorstehend beschrieben zu einem Gemisch aus dem schneller laufenden Diastereoisomer und dem langsamer laufenden Diastereoisomer im Verhältnis von 3:1 isomerisiert werden.
Die zwei Diastereoisomeren werden einfach getestet, indem ein HPLC-System verwendet wird, das aus einer Spherisorb-Kieselgel-Säule besteht, wobei die Elution mit einem Gemisch aus Acetonitril, Essigsäure und Dichlormethan im Mengenverhältnis von 8:0,1:91,9 durchgeführt wird und der Nachweis mit UV bei 254 nm erfolgt.

Beispiel 3

Racemattrennung des schnell laufenden Diastereoisomers von Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat

Das schnell laufende Diastereoisomer von Benzyl-5-azido- 3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat (300 mg, 0,94 mMol) wurde in Aceton (5,5 ml) und 0,1 M Phosphatpuffer (25 ml) gelöst und bei 37ºC gerührt. Subtilisin Carlsberg (50 mg, erhalten von Sigma Chemical Co. Ltd.) wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch mit 1 M Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines Metrohm pH-Stat bei pH 7,6 gehalten. Wenn keine Natriumhydroxid-Lösung mehr verwendet wurde, etwa nach fünfeinhalb Stunden, stellte sich der pH-Wert der Lösung auf pH 9,5 ein, und die Lösung wurde mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;), wodurch unhydrolysierter Ester (142 mg) erhalten wurde. Die wässerige Fraktion wurde mit verdünnter Salzsäure auf pH 3,0 angesäuert und mit Essigsäureethylester extrahiert, wodurch nach Trocknung (MgSO&sub4;) ein instabiles Öl, 5-Azido-3- hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure (83 mg), erhalten wurde.
Eine Probe von unhydrolysiertem Ester wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Merck Art. 9385) unter Verwendung eines Elutionsmittels aus Essigsäureethylester, Hexan, Ethanol (40:60:2) gereinigt, wodurch Benzyl-5-azido-3-hydroxy- 2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat als reines Enantiomer erhalten wurde. [α]D²&sup0;+31,8º (C 2,0; CHCl&sub3;); ¹H-NMR-Spektrum identisch mit Ausgangsverbindung.

Beispiel 4

Ethyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat

Eine Lösung von Ethyl-5-chlor-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin- 1-yl)valerianat (3,45 g, 13,8 mMol) und Natriumazid (1,10 g, 17 mMol) in trockenem Dimethylsulphoxid (20 ml) wurde 5 Stunden zwischen 55 und 65ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase dreimal mit Wasser gewaschen, sodann getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgel (Merck Art. 9385) chromatographiert, wobei mit Essigsäureethylester/Hexan (2:1) eluiert wurde, wodurch Ethyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat als hellgelbes Öl mit einer Ausbeute von 73% (2,59 g) erhalten wurde. Eine weitere Reinigung des Produktes zu einem farblosen Öl wurde durch Kolben-zu-Kolben-Destillation bei 0,2 mm Hg zwischen 185 und 195ºC erreicht. νmax (KBr) 3405, 2102 und 1733 cm&supmin;¹; δH (CHCl&sub3;; 250 MHz) 1,31 (3H, t, J 7 Hz), 1,81 (1H, m), 1,87 (1H, m), 3,03 (2H, t, J 3 Hz), 3,40 (2H, m), 3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J 3,5 Hz), 4,25 (3H, m) und 4,53 (1H, d, J 4,5 Hz, austauschbar).
(Gefunden: C, 46,93; H, 6,46; N, 21,83%. C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub3;O&sub4; erfordert C, 46,87; H, 6,29; N, 21,86%).

Beispiel 5

5-Azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure

Eine Lösung von Ethyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin- 1-yl)valerianat (0,77 g, 3 mMol) in Tetrahydrofuran (13 ml) und Wasser (13 ml) wurde mit einer Lösung von Kaliumcarbonat (0,445 g, 3,2 mMol) in Wasser (2,5 ml) in solcher Art und Weise versetzt, daß der pH-Wert des Reaktionsgemisches nicht über 11,5 anstieg. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt mit Ethanol extrahiert, filtriert und auf Kieselgel (Merck Art. 9385) chromatographiert, wobei mit Ethanol extrahiert wurde, wodurch ein weißer Feststoff (396 mg) erhalten wurde. Dieses Material (200 mg) wurde in Wasser gelöst und durch eine Säule mit IR 120(H)-Ionenaustauscherharz laufengelassen, wodurch 5-Azido-3hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure (92 mg) als Öl erhalten wurde, das langsam einen weißen Feststoff ergab. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung verwendet. δH [(CD&sub3;)&sub2;SO + D&sub2;O] 1,69 (2H, m), 2,89 (2H, t, J 3 Hz), 3,40 (4H, m), 3,89 (1H, m) und 4,10 (1H, d, J 6,6 Hz).

Beispiel 6

Ethyl-5-chlor-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat

Unter einer trockenen Stickstoff-Atmosphäre wurde eine Lösung von Ethyl-2-(2-oxoazetidin-1-yl)acetat (8,45 g, 54 mMol) in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) zu Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (55 ml einer 1 M Lösung in Tetrahydrofuran), das auf -70ºC gekühlt worden war, hinzugefügt. Die Zugabe wurde entsprechend langsam durchgeführt, daß die Temperatur der Lösung nicht über -60ºC anstieg, nach vollständiger Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 15 Minuten bei -70ºC gerührt. Eine Lösung von 3-Chlorpropionaldehyd (65 mMol) in Ether (90 ml) wurde zum Reaktionsgemisch hinzugefügt, währenddessen wurde die Temperatur unter -60ºC gehalten. Nach Rühren bei -70ºC für weitere zwei Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit einer Lösung von Essigsäure (3,5 ml) in Wasser (3 ml) versetzt und bis zum Erreichen von Raumtemperatur stehengelassen.
Das Produkt wurde mit Essigsäureethylester extrahiert und nacheinander mit Wasser, gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, sodann getrocknet (MgSO&sub4;) und zu einem Öl eingedampft. Das Öl wurde auf Kieselgel (Merck Art. 9385) chromatographiert, wobei mit Essigsäureethylester/Hexan (2:1) eluiert wurde, wodurch Ethyl-5-chlor-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat als Öl mit einer Ausbeute von 29% (3,90 g) und einer 5%-ige Rückgewinnung von Ethyl-2-(2-oxoazetidin-1- yl)acetat erhalten wurde.
Das Produkt konnte durch Kolben-zu-Kolben-Destillation bei 0,3 mm Hg zwischen 170 und 180ºC weiter gereinigt werden.
νmax (KBr) 3383 und 1734 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;; 60 MHz) 1,31 (3H, t, J 6 Hz), 2,09 (2H, m), 3,03 (2H, m), 3,39 (2H, m), 3,70 (2H, m) und 4,25 (5H, m, ein Proton austauschbar).
(Gefunden: C, 48,5; H, 6,8; N, 5,7%. C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;ClNO&sub4; erfordert C, 48,1; H, 6,5; N, 5,6%).

Beispiel 7

Benzyl-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat-Hydrochlorid

Eine gerührte Lösung von Benzyl-N-(diphenylmethylen)glycinat (3,6 g, 11 mMol) in 15 ml trockenem Tetrahydrofuran unter trockenem Stickstoff, gekühlt auf -70ºC, wurde tropfenweise über 20 Minuten mit einer Lösung von Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (11 ml einer 1 M Lösung in THF) versetzt, so daß die Temperatur des Reaktionsgemisches nicht über -60ºC anstieg. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei -70ºC gerührt, sodann eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-3-aminopropionaldehyd (3 g, 14,5 mMol) in 15 ml trockenem Tetrahydrofuran tropfenweise hinzugefügt, wobei die Temperatur wieder unter -60ºC gehalten wurde. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch weitere 7 Minuten bei -70ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch ließ man auf -20ºC erwärmen, sodann wurde es in ein gut gerührtes Gemisch aus Ether (100 ml) und Phosphatpuffer, pH 7,0, (100 ml) gegossen. Die Etherschicht wurde abgetrennt und die wässerige Phase mit Ether extrahiert (2·50 ml). Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und zum Erhalt eines Öls (7,2 g) eingedampft. Das ¹H-NMR-Spektrum dieses Materials zeigte, daß es sich im wesentlichen um reines Benzyl-N²-diphenylmethylen-N&sup5;benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat handelte. Die Verbindung wurde in Ether (25 ml) gelöst, mit 2 N HCl (25 ml) versetzt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann filtriert, wodurch ein Gemisch von Diastereoisomeren von Benzyl-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat-Hydrochlorid als hellgelber Feststoff (2,4 g) erhalten wurde. Die Umkristallisation einer Probe (300 mg) dieses Materials in EtOH ergab das schlechter lösliche Diastereoisomer (110 mg) F. 195-197º, νmax (KBr) 3300, 1708, 1691, 1272 cm&supmin;¹; δH [(CD&sub3;)&sub2;SO] 1,69 (2H, m), 3,1 (2H, m), 3,98 (1H, m), 4,11 (1H, d, J 2,5 Hz), 5,0 (2H, s), 5,18 (1H, d, J 12,5 Hz), 5,28 (1H, d, J 12,5 Hz), 5,77 (1H, d, J 5 Hz), 7,36 (10H, m), 8,53 (3H, br. s).
(Gefunden: C, 58,67; H, 5,96; N, 6,67, Cl, 8,76%. C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub5;ClN&sub2;O&sub5; erfordert C, 58,74; H, 6,16; N, 6,85; Cl, 8,76%).
Abdampfen von Ethanol aus dem Filtrat und Digerieren des Rückstandes mit Essigsäureethylester ergab nach Filtration eine weitere Menge des schlechter löslichen Diastereoisomers (100 mg). Eindampfen des Filtrats ergab das besser lösliche Diastereoisomer von Benzyl-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat-Hydrochlorid als klebrige Masse; δH [(CD&sub3;)&sub2;SO] 1,67 (H, m), 3,14 (2H, m), 4,10 (2H, m), 4,99 (2H, s), 5,20 (1H, d, J 12,5 Hz), 5,30 (1H, d, J 12,5 Hz), 5,80 (1H, d, J 5 Hz), 7,38 (10H, m) und 8,44 (3H, br. s); verunreinigt mit einer kleinen Menge des schlechter löslichen Diastereoisomers.
Eine weitere Menge der gemischten Diastereoisomeren wurde aus der sauren Lösung gewonnen, die nach der Hydrolyse von Benzyl-N²-diphenylmethylen-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat verblieb. Die saure Lösung wurde von der Etherphase getrennt, der pH-Wert auf 6,0 eingestellt und das Wasser durch Abdampfen entfernt. Ethanol wurde zu dem klebrigen Rückstand hinzugefügt und abgedampft, wodurch eine klebrige Masse (1,5 g) gehalten wurde. Digerieren der klebrigen Masse mit Aceton, Filtration der Feststoffe und Abdampfen des Acetonfiltrats ergab ein Gemisch von Diastereoisomeren von Benzyl-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat-Hydrochlorid (500 mg), wobei hauptsächlich das besser lösliche Diastereoisomer vorlag. Die Trennung der Diastereoisomeren wurde durch Digerieren mit Essigsäureethylester erreicht. Die Gesamtausbeute von Benzyl-N&sup5;benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat-Hydrochlorid betrug 2,9 g (65%).

Beispiel 8

Benzyl-N²-(β-carboxyethyl)-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat

Eine Lösung von Benzyl-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat-Hydrochlorid, enthaltend etwa 90% schlechter lösliches Diastereoisomer und etwa 10% besser lösliches Diastereoisomer, (1,0 g, 2,4 mMol), in Wasser (15 ml) wurde mit Essigsäureethylester (150 ml) gerührt und mit einer verdünnten Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 7,75 eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit Essigsäureethylester (3·100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft, wodurch Benzyl-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat (0,57 g) als teilweise kristallines Öl erhalten wurde. Eine Probe dieses Materials (430 mg, 1,15 mMol) wurde in destilliertem Acetonitril (15 ml), das Acrylsäure (0,788 ml, 11,5 mMol) enthielt, gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Der resultierende weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit wenigen Millilitern Acetonitril gewaschen, wodurch Benzyl-N²-(βcarboxyethyl)-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3-hydroxyornithinat (390 mg, 76%) erhalten wurde, F. 153,5-154,5 (Acetonitril), νmax (KBr) 3336, 1740, 1691, 1633, 1533, 750 und 698 cm&supmin;¹; δH [(CD&sub3;)&sub2;OH; 250 MHz] 1,45 (1H, m), 1,73 (1H, m), 2,31 (2H, t, J 6,6 Hz), 2,56 (1H, m), 2,74 (1H, m), 3,06 (3H, m), 3,37 (2H, br. s), 3,63 (1H, m), 5,00 (2H, s), 5,12 (2H, s), 7,19 (1H, t, J 5,3 Hz) und 7,35 (10H, m).
(Gefunden: C, 61,86; H, 6,18; H, 6,21%. MH&spplus;, (p.i. F.A.B., Thioglycerin), 445. C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub7; erfordert C, 62,15; H, 6,35; N, 6,30%; H, 444).

Beispiel 9

Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1- yl)valerianat

Benzyl-N²-(β-carboxyethyl)-N&sup5;-benzyloxycarbonyl-3- hydroxyornithinat (227 mg, 0,51 mMol) in destilliertem Acetonitril (50 ml) wurde mit umkristallisiertem 2,2'-Dipyridyldisulfid (135 mg, 0,61 mMol) und Triphenylphosphin (160 mg, 0,61 mMol) acht Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Acetonitril wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand über Kieselgel (Merck Art. 9385) wiederholt chromatographiert, wobei die nachstehenden Lösungsmittel als Elutionsmittel verwendet wurden: Ether/Ethanol (49:1), Essigsäureethylester/Isopropylalkohol (19:1) und Hexan/Aceton/Isopropylalkohol (8:8:1), wodurch das langsam laufende Diastereoisomer der Titelverbindung als Öl (217 mg, 64%), das langsam kristallisierte, erhalten wurde, F. 66-68º (Essigsäureethylester/Hexan); [Rf 0,22 auf Dünnschichtchromatographie-Kieselgelplatten (Merck Art. 5719), eluiert mit Dichlormethan/Essigsäureethylester/Ethanol (60:10:1)]. νmax (KBr) 1725, 742 und 698 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;, 250 MHz) 1,85 (2H, m), 2,98 (2H, t, J 4,2 HZ), 3,40 (4H, m), 4,09 (1H, d, J 3,3 Hz), 4,17 (1H, m), 4,69 (1H, d, J 4,1 Hz) (Austausch mit D&sub2;O), 5,10 (2H, s), 5,22 (3H, m) und 7,36 (10H, m).
[Gefunden: C, 64,81; H, 6,12; N, 6,55%; MH&spplus; (p.i. F.A.B. Thioglycerin) 427. C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub7; erfordert C, 64,77; H, 6,15; N, 6,57%; M, 426].

Beispiel 10

Epimerisierung von Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy- 2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat

Das langsam laufende Diastereoisomer der Titelverbindung (0,7 mg, 1,6 uMol), hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben, wurde mit 1,5-Diazabicyclo-[4.3.0]non-5-en (0,25 ul, 2,0 uMol) in Dichlormethan (350 ul) wie in Beispiel 2 versetzt. Die Analyse des Reaktionsgemisches nach neunzig Minuten durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (Säule: Spherisorb 5 uM Silica, Elution mit EssigsäureethylesterHexan-Essigsäure-Gemisch (50:49,85:0,15); Durchfluß, 1,5 ml/min; Nachweis, UV bei 254 nm) zeigte die Überführung in ein Gemisch aus dem schneller laufenden Diastereoisomer (Retentionszeit 9,7 Minuten) und dem langsamer laufenden Diastereoisomer (Retentionszeit 11,1 Minuten) im Verhältnis 71:29. Das schneller laufende Diastereoisomer kann aus dem Gemisch der beiden Diastereoisomeren durch Chromatographie auf Kieselgel (Merck Art. 9385) unter Elution mit Dichlormethan/Essigsäureethylester/Ethanol (60:10:1) abgetrennt werden. Auf Dünnschichtchromatographie- Kieselgel-Platten (Merck Art. 5719) wies das schnellere Diastereoisomer einen Rf von 0,25 auf; das langsame Diastereoisomer hatte im gleichen Lösungsmittelsystem einen Rf von 0,22. Das schnellere Diastereoisomer zeigt die folgenden Spektraleigenschaften; νmax (KBr) 1725, 1527, 752 und 698 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;, 250 MHz) 1,70 (2H, m), 3,01 (2H, t, J 4 Hz), 3,37 (4H, m), 4,34 (1H, d, J 3 Hz), 4,28 (1H, m), 4,49 (1H, d, 8,4 Hz), 5,10 (3H, m), 5,21 (2H, m) und 7,35 (10H, m).

Beispiel 11

Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-oxo-2-(2-oxoazetidin-1- yl)valerianat

Benzyl-2-(2-oxoazetidin-1-yl)acetat (1,25 g, 5,7 mMol) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (40 ml) gelöst und unter trockenem Stickstoff auf -60ºC gekühlt. Lithiumbis(trimethylsilyl)amid (6,27 ml einer 1,0 M Lösung in Hexan) wurde tropfenweise in zehn Minuten hinzugefügt und das Gemisch weitere fünfzehn Minuten bei -60ºC gerührt. β-Benzyloxycarbonylaminopropionylchlorid (2,41 g, 10 mMol) in trockenem Tetrahydrofuran (10 ml) wurde in 15 Minuten hinzugefügt und das Gemisch weitere zweieinhalb Stunden bei -60ºC gerührt.
Essigsäure (0,5 ml) und Essigsäureethylester (400 ml) wurden zum Reaktionsgemisch hinzugefügt, das sodann mit Wasser (50 ml), Kochsalzlösung (50 ml) und gesättigter Natriumbicarbonatlösung (50 ml) gewaschen und getrocknet wurde (MgSO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde bei niedriger Temperatur unter Vakuum abgedampft und das Rohprodukt durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei Kieselgel (Merck Art. 9385) verwendet wurde, das mit Essigsäureethylester eluiert wurde, wodurch Benzyl-5- benzyloxycarbonylamino-3-oxo-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat (0,415 g, 17,1%) als klebrige Masse erhalten wurde. νmax (KBr) 3382, 1760, 1719, 1522 und 1247 cm&supmin;¹; δ(CDCl&sub3;, 250 MHz) 2,58 (1H, t, 7 Hz), 2,9 (2H, m), 3,1 (1H, m), 3,4 (3H, m), 4,0 (1H, m), 5,07 (2H, s), 5,20 (2H, s) und 7,35 (10H, m).

Beispiel 12

Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1- yl)valerianat

Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-oxo-2-(2-oxoazetidin-1- yl)valerianat (6,9 mg, 16 uMol) in Tetrahydrofuran (1,5 ml) wurde mit Natriumborhydrid (2,2 mg, 58 uMol) versetzt. Nach einer Stunde wurde das Reaktionsgemisch durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung ähnlicher Bedingungen wie in Beispiel 10 beschrieben analysiert. Das Reaktionsgemisch enthielt das schnell laufende Diastereoisomer der Titelverbindung und das langsam laufende Diastereoisomer der Titelverbindung im Verhältnis 55:45, außerdem nicht umgesetzte Ausgangsverbindung.

Beispiel 13

Herstellung von 5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure

Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat (1,6 g, 5 mMol) wurde als Gemisch von Diastereoisomeren, hergestellt wie in Beispiel 1, bei Normaldruck in Ethanol (45 ml) und Wasser (7 ml) mit 5% Palladium/Kohle-Katalysator (900 mg) hydriert. Sobald kein weiterer Wasserstoff absorbiert wurde, wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat zum Erhalt einer klebrigen Masse eingedampft. Durch Digerieren mit Ether wurde ein Feststoff erhalten, der abfiltriert und unter Vakuum getrocknet wurde, wodurch ein bröckliger Schaum erhalten wurde. Der Schaum wurde mit Methanol digeriert, wodurch ein weißer Feststoff und eine hellgelbe Lösung erhalten wurden. Der Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet, wodurch das schlechter lösliche Diastereoisomer der Titelverbindung (294 mg) als weißes Pulver erhalten wurde, F. 152-153,5º. νmax (KBr) 3422, 1709, 1637, 1578, 1376, 1333, 1248, 1228 und 1151; δH (D&sub2;O, 250 MHz) 1,93 (2H, m), 3,03 (2H, t, J 4 Hz), 3,21 (2H, m), 3,55 (2H, m) und 4,21 (2H, m); δC (D&sub2;O, 100 MHz) 31,06, 36,23, 37,99, 41,03, 62,49, 69,54, 172,40 und 174,74.
(Gefunden: C, 45,85; H, 6,77; N, 12,94%. C&sub8;H&sub1;&sub4;N&sub2;O&sub4;·1/2H&sub2;O erfordert C, 45,49; H, 7,16; N, 13,26%).
Die hellgelbe Methanollösung wurde eingedampft, wodurch ein Gemisch aus dem vorstehend beschriebenen schlechter löslichen Diastereoisomer und dem besser löslichen Diastereoisomer als Pulver (574,2 mg) erhalten wurde. Experiment zur 2D-Kohlenstoff-Protonen-NMR-Wechselwirkung (δC : δH); 30,9, 1,90; 31,5, 1,84; 36,2, 2,95; 37,8, 3,15; 41,0, 3,44; 41,0, 3,56; 62,39, 4,18; 62,89, 4,13; 69,47, 4,16 und 69,47, 4,26.

Beispiel 14

Herstellung von 5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure

Das schnell laufende Diastereoisomer von Benzyl-5-azido- 3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat (0,76 g, 23,9 mMol) wurde über 5% Palladium/Kohle-Katalysator in Ethanol (20 ml) und Wasser (5 ml) eine Stunde hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Die verbliebene klebrige Masse wurde mit Ether digeriert, wodurch die Titelverbindung nach Filtration als hellgelber Feststoff (456 mg, 97%) erhalten wurde. Die gelbgefärbte Verunreinigung wurde durch Digerieren mit Essigsäureethylester entfernt. Die Titelverbindung (400 mg) wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Merck Art. 9385) unter Verwendung von Wasser/Ethanol (15:85) als Elutionsmittel weiter gereinigt, wodurch die Titelverbindung (290 mg) als weißer Feststoff, der 1/7 molares Äquivalent Ethanol enthielt, erhalten wurde. δH (D&sub2;O, 400 MHz) 1,16 (t, CH&sub3;CH&sub2;OH, 1,84 (2H, m), 3,00 (2H, t, J 3,9 Hz), 3,15 (2H, m), 3,50 (1H, m), 3,58 (1H, m), 3,63 (q, CH&sub3;CH&sub2;OH), 4,07 (1H, d, J 5,4 Hz), 4,19 (1H, m), δC (D&sub2;O, 100 MHz), 31,66, 36,12, 37,61, 40,99, 63,19, 69,54, 174,79 und 174,97. Die Umkristallisation einer Probe in wässerigem Methanol ergab weiße Prismen, F. 130-135º. νmax (KBr) 3349, 1723, 1653, 1611, 1390, 918 und 769.
(Gefunden: C, 43,93; H, 7,40; N, 12,49%. C&sub8;H&sub1;&sub4;N&sub2;O&sub4;·H&sub2;O erfordert C, 43,63; H, 7,32; N, 12,72%).

Beispiel 15

5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure aus Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxo-azetidin-1-yl)valerianat als reines Enantiomer

Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerianat als reines Enantiomer (140 mg), [α]D²&sup0; + 31,8º (C 2,0, CHCl&sub3;), das durch Behandlung des schnell laufenden Diastereoisomers mit Subtilisin Carlsberg wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten wurde, wurde in Ethanol (7 ml) und Wasser (2 ml) über 5% Palladium/Kohle-Katalysator (75 mg) hydriert. Nach Filtration wurde die Lösung eingedampft, wodurch ein Öl erhalten wurde, dieses wurde in Methanol gelöst, filtriert und das Filtrat eingedampft, wodurch 5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure als weißer Feststoff (61 mg) erhalten wurde, [α]D²&sup0; + 7,00 (C 0,5%; H&sub2;O). ¹H-NMR entspricht der in Beispiel 14 hergestellten Verbindung.

Beispiel 16

Benzyl-2-(2-oxo-[2-¹³C]azetidin-1-yl)-[1,2-¹³C&sub2;]acetat

a) Tosylat-Salz von Benzyl-[1,2-¹³C&sub2;]glycinat

[1,2-¹³C&sub2;]-Glycin (1,1 g, 14,3 mMol), 99,5 Atom-% ¹³C an jeder Position, in Benzylalkohol (7 ml, 67,6 mMol) und Toluol (20 ml) wurde mit p-Toluolsulfonsäure (3,1 g, 16,3 mMol) unter Verwendung einer Dean-und-Stark-Apparatur dreieinhalb Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und in gerührten Ether (150 ml) gegossen. Der resultierende kristalline Feststoff wurde abfiltriert, mit Ether (15 ml) gewaschen und getrocknet, wodurch 4,51 g (93%) des Tosylat-Salzes von Benzyl-[1,2-¹³C&sub2;]glycinat, F. 130-132ºC, (Lit. nichtmarkierte Verbindung 132-134ºC) erhalten wurden. νmax (KBr) 1707, 1223, 1181 und 687 cm&supmin;¹; δH [(CD&sub3;)&sub2;SO, 250 MHz] 2,30 (3H, s), 3,90 (2H, dd, J 144,8 und 6,5 Hz), 5,25 (2H, d, J 3,5 Hz), 7,30 (4H, dd, J 92 und 8,0 Hz), 7,40 (5H, m) und 8,25 (3H, br. s). δC [(CD&sub3;)&sub2;SO, 100 MHz], 39,7 (d, 3 62,1 Hz), 167,5 (d, J 62,1 Hz).
Die Auswertung des ¹³C-NMR-Spektrums ergab, daß im Produkt in den Positionen 1 und 2 im Glycinrest 99,5 Atom-% ¹³C vorlag.

b) Benzyl-N-(3-brom-[1-¹³C]propionyl)-[1,2-¹³C&sub2;]glycinat

Das wie vorstehend hergestellte Tosylat-Salz von Benzyl- [1,2-¹³C&sub2;]glycinat (3,23 g, 9,52 mMol) in einem Gemisch aus Wasser (15 ml) und Tetrahydrofuran (15 ml) wurde bei 4ºC kräftig gerührt, während eine Lösung von 3-Brom-[1-¹³C]propionylchlorid (1,64 g, 9,51 mMol, 91 Atom-% ¹³C), hergestellt nach Standardverfahren, in Tetrahydrofuran (5 ml) tropfenweise in zehn Minuten hinzugefügt wurde. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde während der Zugabe und weitere 45 Minuten mit verdünnter Natriumhydroxid-Lösung im Bereich von 5,5 bis 6,5 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigsäureethylester (150 ml) verdünnt, die organische Phase abgetrennt und mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen sowie getrocknet (MgSO&sub4;). Das Eindampfen der getrockneten Lösung ergab einen weißen Feststoff, der nach Digerieren mit Hexan (30 ml) Benzyl-N-(3- brom-[1-¹³C]propionyl)-[1,2-¹³C&sub2;]glycinat (2,7 g, 94%) ergab, F. 62,5-64,0º. νmax (KBr) 3309, 1694, 1611, 1537, 755 und 701 cm&supmin;¹; δH [(CDCl&sub3;), 250 MHz] 2,83 (2H, m), 3,63 (2H, m), 4,13 (2H, dddd, J 141,5, 7,9, 5,4 und 2,8 Hz), 5,20 (2H, d, J 3,2 Hz), 6,10 (1H, br. s) und 7,36 (5H, s); δC (CDCl&sub3;), 100 MHz) 41,5 (d, J 61,6 Hz), 169,6 (dd, J 61,8 und 2 Hz) und 169,7 (d, J 2 Hz).
(Gefunden: C, 48,26; H, 4,65; N, 4,62%; M&spplus;, 302,0254. C&sub9;¹³C&sub3;H&sub1;&sub4;NO&sub3;Br erfordert C, 48,53; H, 4,65; N, 4,62%, M, 302,0259).

c) Benzyl-2-(2-oxo-[2-¹³C]azetidin-1-yl)-[1,2-¹³C&sub2;]acetat

Pulverisiertes Kaliumhydroxid (1,05 g, 18,7 mMol) und Tetrabutylammoniumbromid (0,78 g, 2,4 mMol) wurden bei 100º im Vakuum zwei Stunden getrocknet, abgekühlt und in einem Gemisch aus Dichlormethan und Acetonitril (19:1; 300 ml) suspendiert. Das Gemisch wurde kräftig gerührt und bei 30 bis 40º beschallt sowie mit Benzyl-N-(3-brom-[1¹³C]propionyl)-[1,2-¹³C&sub2;]glycinat (2,5 g, 8,2 mMol) in Dichlormethan/Acetonitril (19:1; 300 ml) in einem Zeitraum von fünf Stunden versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt und weitere fünfzehn Minuten beschallt, das unlösliche Material abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Das resultierende Öl wurde gründlich mit Ether extrahiert (2·80 ml) und die vereinigten etherischen Schichten eingedampft. Die Chromatographie des Rückstandes auf Kieselgel (Merck Art. 9385) mit Essigsäureethylester/ Hexan (1:1) ergab die Ausgangsverbindung Benzyl-N-(3-brom-[1- ¹³C]propionyl)-[1,2-¹³C&sub2;]glycinat (0, 84 g, 33%) und Benzyl-2- (2-oxo-[2-¹³C]azetidin-1-yl)-[1,2-¹³C&sub2;]acetat als Öl (0,36 g, 20%). νmax (KBr) 1700, 742 und 700 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;, 250 MHz) 3,04 (2H, dt, J 6 und 4,1 Hz), 3,43 (2H, m), 3,75 (1H, m), 4,31 (1H, m), 5,18 (2H, d, J 3,1 Hz) und 7,37 (5H, m); δC (CDCl&sub3;, 100 MHz) 43,12 (dd, J 62,1 und 0,9 Hz), 167,84 (m) und 168,1 (dd, J 62,3 und 1,2 Hz).
(Gefunden: M&spplus; 222,0996, C&sub9;¹³C&sub3;H&sub1;&sub3;NO&sub3; erfordert M, 222,0996).

Beispiel 17

Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxo-[2-¹³C]azetidin-1-yl)- [1,2-¹³C&sub2;]valerianat

Die Titelverbindung wurde hergestellt, indem Benzyl-2-(2- oxo-[2-¹³C]azetidin-1-yl)-[1,2-¹³C&sub2;]acetat mit 3-Azidopropionaldehyd wie in Beispiel 1 beschrieben umgesetzt, das resultierende Produkt mit 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en wie in Beispiel 2 beschrieben epimerisiert und das schnell laufende Diastereoisomer durch Chromatographie abgetrennt wurde. Das aus der chromatographischen Säule gewonnene Gemisch aus schnell und langsam laufenden Diastereoisomeren wurde weiter isomerisiert, wodurch eine zusätzliche Menge des reinen, schnell laufenden Diastereoisomers der Titelverbindung erhalten wurde. Die Gesamtausbeute des schnell laufenden Diastereoisomers der Titelverbindung betrug 36%. νmax (KBr) 2102, 1696, 1668, 761 und 704 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;, 400 MHz), 1,71 (1H, m), 1,83 (1H, m), 3,03 (2H, m), 3,34 (1H, m), 3,43 (1H, m), 3,51 (2H, m), 3,87 (1/2H, m), 4,22 (1/2H, m), 4,26 (1H, m), 4,34 (1H, m), 5,23 (2H, m) und 7,36 (5H, m); δC (CDCl&sub3;, 100 MHz) 63,4 (d, J 61,3 Hz), 168,1 (d, J 61,2 Hz) und 169,3.
(Gefunden: M&spplus; 322,1506. C&sub1;&sub2;¹³C&sub3;H&sub1;&sub8;N&sub4;O&sub4; erfordert M, 322,1508).

Beispiel 18

5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxo-[2-¹³C]azetidin-1-yl)-[1-2-¹³C&sub2;]valeriansäure

Das schnell laufende Diastereoisomer von Benzyl-5-azido- 3-hydroxy-2-(2-oxo[2-¹³C]azetidin-1-yl)-[1,2-¹³C&sub2;]valerianat wurde in Gegenwart von 5% Palladium/Kohle-Katalysator wie in Beispiel 14 mit Wasserstoff reduziert, wodurch die Titelverbindung als hygroskopisches Pulver erhalten wurde. νmax (KBr) 3424, 1678, 1544 und 1355 cm&supmin;¹; δH (D&sub2;O, 250 MHz) 1,85 (2H, m), 3,0 (2H, m), 3,15 (2H, m), 3,55 (2H, m), 3,80 (1/2H, m), 4,19 (1H, m) und 4,34 (1/2H, m); δC (D&sub2;O, 100 MHz) 63,20 (d, J 54 Hz), 172,6 und 174,97 (d, J 53 Hz).
[Gefunden: MH&spplus; (p.i. F.A.B. Thioglycerin) 206. C&sub5;¹³C&sub3;H&sub1;&sub4;N&sub2;O&sub4; erfordert M 205].
Die Auswertung des ¹³C-NMR-Spektrums ergab, daß der Grad der ¹³C-Anreicherung in den Positionen 1 und 2 des Valeriansäurerestes 99,5% betrug und in Position 2 des Azetidin-1-yl- Restes vergleichbar war.

Beispiel 19

Herstellung von Medien zur Züchtung von Streptomyces clavuligerus und Streptomyces lipmanii

Die für die in den Beispielen beschriebenen Experimente verwendeten Organismen waren ein Reisolat von Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, Streptomyces lipmanii NRRL 3584, Streptomyces jumonjinensis ATCC 29864 und Streptomyces katsurahamanus T-272. Die Kulturen können auf festen oder in flüssigen Medien gezüchtet werden.

Feste Medien

Der nachstehend beschriebene Agar ist geeignet.
Hydrolysierte Stärke (Dextrin, Maisprodukte, Trafford Park, Manchester) 10 g
KH&sub2;PO&sub4; 1 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g
NaCl 1 g
CaCO&sub3; 4 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 g
Spurenelemente-Lösung* 1 ml
Agar (Oxoid Nr. 3) 20 g
Auffüllen auf 1 l mit entionisiertem Wasser.
*Die Spurenelementelösung wird folgendermaßen zusammengestellt:
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1 g
MnSO&sub4;·H&sub2;O 0,1 g
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1 g
Auffüllen auf 100 ml mit entionisiertem Wasser.

Flüssige Medien

Geeignete flüssige Kulturmedien sind:

Anzuchtmedium A

Sojamehl (Arkasoy 50, British Arkady Co., Arkady Soya Mills, Old Trafford, Manchester) 20 g
Hydrolysierte Stärke (Dextrin, Mais-Produkte) 10 g
KH&sub2;PO&sub4; 0,6 g
Glyceryltrioleat (Estol 1434, Price's Chemicals Ltd., Bebington, Wirral Merseyside) 5,0 g
Auffüllen mit Leitungswasser auf 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 mit NaOH-Lösung.

Anzuchtmedium B

Malzextrakt (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hants) 10 g
Bacteriologisches Pepton (Oxoid Ltd.) 10 g
Glycerin 20 g
Auffüllen mit Leitungswasser auf 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0.

Herstellungsmedium A

Sojamehl (Arkasoy 50, Britisch Arkady Co.) 35 g
Hydrolysierte Stärke (Dextrin, Mais-Produkte) 50 g
KH&sub2;PO&sub4; 0,7 g
Glycerin 5,0 g
Spurenelemente-Lösung* 10 ml
Auffüllen mit Leitungswasser auf 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0.
*Die Spurenelementelösung wird folgendermaßen zusammengestellt:
CaCl&sub2;·6H&sub2;O 14,9 g
MgCl&sub2;·6H&sub2;O 10,0 g
NaCl 10,0 g
FeCl&sub3; 3,0 g
ZnCl&sub2; 0,5 g
CaCl&sub2; 0,39 g
MnSO&sub4;·H&sub2;O 0,38 g
Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter.

Herstellungsmedium B

Hydrolysierte Stärke (Dextrin, Mais-Produkte) 20 g
Sojamehl (Arkasoy 50, British Arkady Co.) 10 g
Schlempe ("Distillers solubles")
(Scotaferm, Thos. Borthwick (Glasgow) Ltd., 60 Wellington Street, Glasgow) 0,1 g
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1 g
Auffüllen mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0.

Anzucht-und Herstellungsmedium C

Glyceryltrioleat (Estol 1434, Price's Chemicals Ltd.) 10 g
Sojamehl (Arkasoy 50, British Arkady Co.) 15 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,0 g
Auffüllen mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0.

Anzucht- und Herstellungsmedium D

Sojamehl (Arkosoy 50, British Arkady Co.) 22,5 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,0 g
Glyceryltrioleat (Estol 1434, Price's Chemicals Ltd.) 15,0 g
Hydrolysierte Stärke (Dextrin, Mais-Produkte) 8,0 g
Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0.

Beispiel 20

Herstellung von S. clavuligerus-Zellen für den Aufschluß

Ein Anzuchtkolben (50 ml von Anzuchtmedium A in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben) wurde mit einer Impföse Sporen aus einer S. clavuligerus-Kultur auf festem Medium beimpft und mit 240 UpM 48 Stunden bei 26ºC geschüttelt. Anschließend wurden Aliquots (1 ml) keimfrei in Herstellungskolben (30 ml Produktionsmedium A in 250 ml-Erlenmeyerkolben) überführt, die mit 240 UpM 48 Stunden bei 26ºC geschüttelt wurden. Die Inhalte der Kolben wurden sodann bei 15 000·g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstandflüssigkeit wurde verworfen und das Myzelpellet in kaltem (4ºC) Wasser auf das ursprüngliche Volumen resuspendiert, sodann erneut bei 15 000·g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstandflüssigkeit wurde verworfen und das Myzelpellet wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben zur Herstellung des Enzyms verwendet.

Beispiel 21

Herstellung von rohem Zellhomogenisat von S. clavuligerus durch Behandlung mit Ultraschall

Das wie in Beispiel 20 hergestellte Myzelpellet wurde in 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan("Tris")-Puffer, pH 7,0, bei einer Konzentration von 1,0 g Naßgewicht pro 2,0 ml Puffer resuspendiert. Diese Suspension wurde in Aliquots zu je 20 ml aufgeteilt und das Myzel durch Behandlung mit Ultraschall bei 25 kHz (MSE Soniprep, Fisons Plc, Crawley, Sussex, UK) unter Einsatz von 4·10 Sekunden Impulsfolgen aufgeschlossen und währenddessen in einem Eis/Wasser-Bad gekühlt.

Beispiel 22

Herstellung von rohem Zellhomogenisat von S. clavuligerus durch Aufschluß mit X-Presse

Das wie in Beispiel 20 hergestellte Myzelpellet (6 g Naßgewicht) wurde in den Zylinder einer X-Presse-Apparatur (AB Biox, Jarealla, Schweden) eingebracht, die auf -35ºC gekühlt worden war. Die Zellen wurden aufgeschlossen, indem sie zweimal unter Anwendung eines Drucks von etwa 12 Tonnen durch die Öffnung der X-Presse gedrückt wurden. Anschließend wurden die zertrümmerten Zellen in 12 ml 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, resuspendiert.

Beispiel 23

Herstellung von rohem Zellhomogenisat von S. clavuligerus durch Zerreiben mit Aluminiumoxid

Das wie in Beispiel 20 hergestellte Myzelpellet (4 g Naßgewicht) wurde in eine Reibschale, die auf 4ºC gekühlt worden war, eingebracht und mit 1 g Aluminiumoxid zerrieben. Die aufgeschlossenen Zellen wurden in 8 ml 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, resuspendiert.

Beispiel 24

Herstellung eines geklärten zellfreien Extraktes von S. clavuligerus

Das wie in den Beispielen 21, 22, 23 oder 24 hergestellte rohe Zellhomogenisat wurde 12,5 Minuten bei 38 000·g und 4ºC zentrifugiert, um feste Zelltrümmer zu entfernen. Der geklärte Überstand wurde abgegossen und als zellfreier Extrakt verwendet.

Beispiel 25

Test der Dioxygenase-Aktivität

Die Dioxygenase-Aktivität wurde routinemäßig in Reaktionsansätzen à 1 ml getestet, die 5 mM 5-Amino-3-hydroxy-2- (2-oxoazetidin-1-yl)valerianat plus 1 mM Eisen(II)-sulfat, 5 mM α-Ketoglutarat und die betreffende Enzymprobe enthielten. Alle Reagentien wurden in 50 mM 3(N-Morpholino)propansulfonsäure(MOPS)-Puffer, pH 7,0, angesetzt. Die Reaktionsansätze wurden 10 Minuten bei 28ºC unter Bewegung und Belüftung inkubiert. Die Umsetzungen wurden durch Zusatz eines gleichen Volumens von eiskaltem Methanol und durch zweiminütige Zentrifugation bei 16 000·g gestoppt. Aliquots (200 ul) der Überstände wurden mit 100 ul-Aliquots von Imidazol-Reagens [206 g Imidazol, gelöst in 1 Liter Wasser; pH-Wert eingestellt mit Salzsäure auf 6,8] gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann auf eine HPLC-Säule injiziert. Bei der HPLC wurden die folgenden Bedingungen angewendet:
Säule: u-Bondapak C&sub1;&sub8;(Millipore Waters, Harrow Middlesex, UK)
bewegliche Phase: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 3,2, +6% Methanol
Durchflußgeschwindigkeit: 2 ml/Minute
Nachweis bei Wellenlänge: 313 nm
Das Ergebnis der Umsetzung wurde sichtbar gemacht, indem die Herstellung des Imidazol-Adduktes von Verbindung I nachgewiesen wurde, das eine Retentionszeit von 2,1 Minuten aufweist. Das vorstehende HPLC-System mit Imidazol-Derivatisierung vor der Säulentrennung kann auch zum Nachweis von Clavulansäure verwendet werden (Retentionszeit = 5 Minuten).

Beispiel 26

Herstellung einer Probe von teilweise gereinigtem Dioxygenase- Enzym aus S. clavuligerus

Das wie in Beispiel 20 hergestellte Myzelpellet (125 g Naßgewicht) wurde in 250 ml einer wässerigen Lösung von 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure bei pH 7,0 resuspendiert und wie in Beispiel 21 beschrieben mit Ultraschall behandelt. Die Suspension aufgeschlossener Zellen wurde 15 Minuten bei 21 000·g zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Streptomycinsulfat wurde zum Überstand bis zu einer Endkonzentration von 1% (Gew./Vol.) hinzugefügt. Der Überstand wurde 30 Minuten auf Eis belassen und sodann 20 Minuten bei 24 000·g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen und durch Zusatz von festem Ammoniumsulfat auf 50% Sättigung gebracht. Die Suspension wurde eine Stunde auf Eis belassen und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde mit festem Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht, eine Stunde auf Eis belassen und 60 Minuten bei 24 000·g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 ml 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, resuspendiert und über Nacht gegen drei Liter des gleichen Puffers dialysiert. Das dialysierte Material wurde sodann gefriergetrocknet. Als gefriergetrockneter Extrakt ist das Dioxygenaseenzym mehrere Monate bei -20ºC stabil. Die spezifische Aktivität des Enzyms betrug 0,0173 Einheiten/mg Protein. Eine Einheit ist die Menge Enzym, die bei 28ºC und pH 7,0 pro Minute ein uMol Verbindung I aus Verbindung II erzeugt.
Die Dioxygenase-Aktivität wurde unter Verwendung des in Beispiel 25 beschriebenen Verfahrens getestet.

Beispiel 27

Herstellung einer im wesentlichen reinen Probe des Dioxyenase- Enzyms aus S. clavuligerus

Das wie in Beispiel 26 beschrieben hergestellte, gefriergetrocknete, teilweise gereinigte Enzym (250 mg) wurde auf eine DEAE Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), (30·2,4 cm), aufgetragen, mit 100 ml 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, gewaschen und mit einem Gradienten von 50 bis 500 mM Tris-Puffer, pH 7,0, eluiert. Dioxygenase-positive Fraktionen wurden vereinigt und mit festem Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht. Die Suspension wurde eine Stunde auf Eis gehalten und 60 Minuten bei 24 000·g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 1 ml 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, plus 0,5 ml 30% Saccharose-Lösung (angemacht in dem gleichen Puffer) resuspendiert und auf eine Sephadex G75 superfine-Säule (Pharmacia), (63,5·3,5 cm), aufgetragen, die mit 50 mM Tris- Puffer eluiert wurde. Dioxygenase-positive Fraktionen wurden vereinigt, mit festem Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und der resultierende Niederschlag durch Zentrifugation gewonnen und bei -20ºC gelagert. In diesem Stadium erzeugte das Dioxygenaseenzym in der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzelne Bande, die einem Molekulargewicht von etwa 48 000 Daltons entsprach. Der isoelektrische Punkt wurde durch isoelektrische Fokussierung bestimmt und ergab einen Wert von pI = 5,65.
Die Dioxygenase-Aktivität wurde nach dem in Beispiel 25 beschriebenen Verfahren gemessen.

Beispiel 28

Isolierung von 5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxo-azetidin-1-yl)valeriansäure (Verbindung II) aus Streptomyces clavuligerus

Ein Fermentationsgefäß zu 300 Litern, das mit einem 8 1/2- Inch-Scheibenrührer ausgerüstet war und 150 l Herstellungsmedium A (wie in Beispiel 19 beschrieben) enthielt, wurde mit 1,5 l einer Kultur von Streptomyces clavuligerus, die 48 Stunden in Anzuchtmedium A (wie in Beispiel 19 beschrieben) gezüchtet worden war, beimpft. Das Gefäß wurde mit 570 UpM gerührt und 150 l sterile Luft pro Minute eingeblasen. Die Schaumbildung wurde durch das Vorliegen von 0,02% Pluronic L81-Antischaum (Blagden-Campbell Chemical Co., Croydon, UK.) im Medium kontrolliert. Das Gefäß wurde 48 Stunden bei 26ºC gehalten. Anschließend wurde die Kultur auf 5ºC abgeschreckt und die Zellen durch kontinuierliche Zentrifugation entfernt. Die Zellpaste wurde in 75 Litern Wasser bei 1 bis 5ºC resuspendiert und die Zellen durch Durchlaufen eines Manton-Gaulin- Homogenisators (Modell 15M-8BA, APV, Crawley, Sussex, UK) bei einem Druck von 3000 bis 5000 Psi aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch kontinuierliche Zentrifugation entfernt und der Überstand unter Verwendung einer Alfa Laval UFS-4 Ultrafiltrationsapparatur, die 10 m² PM10 Polysulfon-Membran mit einem nominellen Molekulargewichts-Ausschlußwert von 10 000 Daltons enthielt, ultrafiltriert. Die niedermolekulare Fraktion wurde durch Umkehrosmose auf ein Volumen von 6 l eingeengt, diese wurden gefriergetrocknet, wodurch 474 g Feststoffe (Charge 1) erhalten wurden, die Verbindung II enthielten (Verbindung II wurde getestet, indem sie unter Verwendung eines Dioxygenasepräparates in Verbindung I umgewandelt und sodann die Menge der erzeugten Verbindung I unter Verwendung des in Beispiel 25 beschriebenen HPLC-Verfahrens mit Imidazol- Derivatisierung vor der Säulentrennung bestimmt wurde. Da die Umwandlung von Verbindung II in Verbindung I nicht immer quantitativ verlief, wurde der Test als qualitativer Anhaltspunkt zur Auswahl von Fraktionen, die Verbindung II enthielten, verwendet). Eine zweite Fermentation und Isolierung wurde in identischer Art und Weise durchgeführt, wodurch 544 g gefriergetrocknete Feststoffe (Charge 2), die Verbindung II enthielten, erhalten wurden.
Ein Teil der gefriergetrockneten Feststoffe (166 g von Charge 1 plus 334 g von Charge 2) wurde in 5·100 g-Aliquots folgendermaßen weiter gereinigt. Jedes 100 g-Aliquot wurde in 140 ml Wasser gelöst, sodann mit 140 ml Ethanol versetzt und die Suspension 15 Minuten bei 10 000·g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen und der Überstand, der Verbindung II enthielt, auf einer Säule (18·19,5 cm) mit Silica 60, 230-400 Mesh (E. Merck, Darmstadt, BRD), chromatographiert, die in vergälltem Alkohol (IMS) gefüllt und mit 85% IMS/15% Wasser mit 45 ml/Minute eluiert wurde. Die Fraktionen, die Verbindung II enthielten, aus allen fünf Läufen wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft, wodurch 66,5 g Feststoffe erhalten wurden. Diese Gewicht wurde auf 25 g reduziert, indem das Produkt erneut auf einer Silica 60-Säule mit ähnlicher Größe wie vorstehend laufen gelassen wurde. Anschließend wurde die Probe zweimal auf einer Säule (8·50 cm) mit Diaion HP20 SS (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) chromatographiert, die in Wasser gefüllt und mit Wasser bei 7 ml/min eluiert wurde. Fraktionen, die Verbindung II enthielten, wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft (10,0 g), erneut in 34 ml Wasser gelöst und auf eine Biogel P2-Säule (Bio-Rad Laboratories, Watford, Hertfordshire, UK), 8·57,5 cm, gepackt mit Wasser, aufgetragen. Die Verbindung wurde mit Wasser mit 5 ml/min eluiert. Fraktionen, die Verbindung II enthielten, wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft, wodurch 5,25 g Feststoffe erhalten wurden. Diese wurden in 6 ml Wasser gelöst, sodann mit 6 ml Ethanol versetzt und die Lösung auf eine Säule, 5·21 cm, mit Merck Silica 60 (230-400 Mesh), gepackt mit 85% Ethanol/15% Wasser bei 2 ml/min, aufgetragen. Anschließend wurden positive Fraktionen erneut zuerst durch eine ähnliche Säule laufengelassen und sodann einer weiteren Reinigung der Probe (2,15 g) durch Biogel P2-Säulenchromatographie, 2,7·117 cm, gepackt mit Wasser und eluiert mit Wasser bei 0,8 ml/min, unterzogen. Die Eluatfraktionen, die Verbindung II enthielten, wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft, wodurch 580 mg Probe von 60 bis 70% Reinheit, bestimmt durch NMR-Chromatographie, erhalten wurden.
Ein kleiner Teil dieser Probe wurde durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Umkehrphasensystems (Millipore Waters p-Bondapak CN-Säule, 3,9 mm·30 cm, eluiert mit Wasser bei 0,7 ml/min) zur Homogenität gereinigt. Die Probe (21,85 mg) wurde in Wasser mit 10 mg/ml gelöst und in Aliquots zu 15 ul auf eine Säule injiziert. Der Hauptpeak (UV-Nachweis bei 205 nm) wurde als eine diskrete Fraktion gesammelt, eingeengt, sodann erneut wie vorstehend chromatographiert und rotationsverdampft, wodurch 7,3 mg von Verbindung II als farbloser glasiger Feststoff erhalten wurden. νmax (KBr) 3400, 2900, 1720 und 1600 cm&supmin;¹; δH (D&sub2;O, 250 MHz), 1,89 (2H, m), 3,02 (2H, t), 3,18 (2H, dt), 3,52 (1H, m), 3,60 (1H, m), 4,08 (1H, d) und 4,22 (1H, m).
[Gefunden: MH&spplus; (p.i. F.A.B.), 203,1028. [C&sub8;H&sub1;&sub4;N&sub2;O&sub4;]H&spplus; erfordert 203,1032].

Beispiel 29

Umwandlung von 5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure (Verbindung II) in Z(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7- oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]hentan-2-carbonsäure (Verbindung I) durch zellfreie Extrakte von Streptomyces-Arten

Ein zellfreier Extrakt von S. lipmanii NRRL 3584 wurde wie in Beispiel 21 für S. clavuligerus beschrieben hergestellt. Ein Reaktionsansatz wurde zubereitet, der 500 ul Extrakt, 200 ul 50 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure-Puffer, pH 7,0, 100 ul 10 mM α-Ketoglutarat (angesetzt in demselben Puffer), 100 ul 10 mM FeSO&sub4; (angesetzt in H&sub2;O) und 100 ul von 10 mg/ml Verbindung II (hergestellt wie in Beispiel 13 aber ohne Trennung der Diastereoisomeren) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 28ºC mit Belüftung und Bewegung inkubiert. Nach 60 Minuten zeigte der HPLC-Test mit Imidazol- Derivatisierung vor der Säulentrennung (in Beispiel 25 beschrieben), daß die Cyclisierung von Verbindung II zu Verbindung I stattgefunden hatte. Zellfreie Enzymextrakte wurden auch aus S. jumonjinensis ATCC 29864 und S. katsurahamanus T- 272 wie für S. clavuligerus in Beispiel 21 beschrieben hergestellt. Jeder Extrakt wurde mit 1 mM α-Ketoglutarat und 1 mM Eisen(II)-sulfat bei 28ºC in 50 mM MOPS-Puffer inkubiert. Die Reaktionsgemische wurden durch HPLC untersucht, wobei gefunden wurde, daß die endogene Verbindung II in den Extrakten innerhalb eines Zeitraums von einer Stunde in Verbindung I überführt worden war.

Beispiel 30

Umwandlung von 5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure (Verbindung II) in Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7- oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure (Verbindung I) durch ein teilweise gereinigtes Dioxygenasepräparat von Streptomyces clavuligerus

Ein Reaktionsansatz wurde zubereitet, der 15 mg/ml eines gefriergetrockneten Dioxygenasepräparates (hergestellt wie in Beispiel 26 beschrieben), 1 mM Eisen(II)-sulfat, 5 mM α-Ketoglutarat, 5 mM Verbindung II (ein Diastereoisomer, hergestellt wie in Beispiel 14) und 50 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure bei pH 7,0 enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 28ºC fortgesetzt geschüttelt (um eine ausreichende Übertragung von Luftsauerstoff sicherzustellen). Nach 60 Minuten wurde das Reaktionsgemisch nach dem in Beispiel 25 beschriebene Verfahren mit Imidazol-Derivatisierung vor der Säulentrennung untersucht, wobei gefunden wurde, daß 42% von Verbindung II (d. h. 84% des Enantiomers der natürlichen Stereochemie) in Verbindung I überführt worden war.

Beispiel 31

Eine enzymatische Umwandlung in großen Mengen von 5-Amino-3- hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure (Verbindung II) in Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo- [3.2.0]heptan-2-carbonsäure (Verbindung I) und anschließende Isolierung durch Derivatisierung

Im nachstehenden Experiment wurde die Tatsache ausgenutzt, daß die Verbindung II und das Dioxygenaseenzym beide in Streptomyces clavuligerus vorkommen, hierbei schloß man S. clavuligerus-Zellen auf und ließ das endogene Enzym die endogene Verbindung II umwandeln, wodurch Verbindung I erhalten wurde. Die Verfahren zur Herstellung der aufgebrochenen Zellen waren im wesentlichen die gleichen, die in Beispiel 28 beschrieben werden.
150 Liter einer 48-Stunden-Kultur von Streptomyces clavuligerus wurden zentrifugiert und das Myzel bei 5ºC in H&sub2;O auf 90 Liter resuspendiert. Sodann wurden die Zellen unter Verwendung eines Manton-Gaulin-Homogenisators, der bei 3000 bis 5000 psi arbeitete, aufgeschlossen. α-Ketoglutarat und Eisen(II)sulfat wurden beide zur Suspension der aufgeschlossenen Zellen hinzugefügt, so daß Endkonzentrationen von 1 mM erhalten wurden; die Konzentration von Verbindung II im Gemisch betrug 16 ug/ml. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei pH 7,0 und 25ºC gerührt und Luft hineingeblasen. Anschließend wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und der Überstand, der Verbindung I enthielt, ultrafiltriert. Das Filtrat wurde durch Umkehrosmose auf 6,2 Liter eingeengt (die etwa 600 mg von Verbindung I enthielten). Sodann wurde die Verbindung I wie nachstehend in das N&sup5;-Benzyloxycarbonyl(CBZ)-Derivat umgewandelt.
Das Konzentrat wurde mit 6,2 Liter Aceton und anschließend in einem Zeitraum von 10 Minuten mit 600 ml 50% Benzylchlorformiat in Aceton versetzt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 (5ºC) gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 30 Minuten bei einem pH-Wert von 7,5 gehalten und sodann wieder auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht. Das Aceton wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wodurch 4,75 Liter Konzentrat erhalten wurden.
Die Lösung wurde mit 1/2 Volumen und 1/4 Volumen Essigsäureethylester bei pH 2,0 und 5ºC extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und mit Wasser bei pH 7,0 rückextrahiert, wobei 1/2 und 1/4 des Essigsäureethylester-Volumens verwendet wurde.
Die vereinigten Rückextrakte wurden mit H&sub2;O auf 5 Liter aufgefüllt, an eine IRA-Anionenaustauschersäule (Acetat-Zyklus, 22·5 cm, Durchflußgeschwindigkeit 25 ml/min) adsorbiert und mit 1 N NaCl desorbiert. Das Produkt wurde nach dem vorstehenden Essigsäureethylester-Extraktionsverfahren entsalzt. Die wäßrige Rückextraktion und die anschließende Gefriertrocknung ergab das rohe CBZ-Derivat von I. Ein Teil dieses Produktes wurde folgendermaßen in den Benzylester umgewandelt.
100 g gefriergetrocknetes Derivat wurden in 120 ml Dimethylformamid gelöst und mit 60 ml Benzylbromid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 7 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und über Nacht bei 5ºC stehengelassen. Sodann wurde ein Liter Essigsäureethylester (5ºC) hinzugefügt und der resultierende Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wurde im Rotationsverdampfer auf 300 ml eingedampft und mit 4 M NaCl (200 ml, sodann 100 ml) bei pH 7,0 gewaschen. Eine weitere Rotationsverdampfung ergab einen Sirup (100 ml), der mit Cyclohexan (200 ml) gewaschen wurde. Der Sirup wurde auf eine Kieselgel- Säule (Merck Silica Art. 7734), 9,5·17 cm, aufgetragen und mit einem Petrolether/Essigsäureethylester-Gradienten von 6:1 bis 1:1 eluiert.
Das Produkt wurde durch Kieselgel-DC, Petrolether/Essigsäureethylester (2:1), Rf 0,4, identifiziert, wobei es unter Verwendung des in Beispiel 33 beschriebenen Triphenyltetrazolium-Sprühreagens als roter Punkt nachgewiesen wurde. Positive Fraktionen wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer zum Erhalt von 3,9 g Öl eingedampft.
Dieses wurde auf eine Kieselgel-Säule (Silica "S", 230- 400 Mesh, Reidel-de Haen AG, Seelze, BRD), 5·14 cm, Durchflußgeschwindigkeit 8 ml/min, aufgetragen und mit einem 2 bis 5% Ethanol-in-Chloroform-Gradienten eluiert. Positive Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer zum Erhalt von 590 mg klebriger Masse (etwa 20% rein) eingedampft. Dieses Produkt wurde auf eine Sephadex LH 20-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), 18·3 cm, Durchflußgeschwindigkeit 2 ml/min aufgetragen und mit Chloroform/Cyclohexan (1:1) eluiert, wodurch 230 mg (etwa 30% rein) erhalten wurden, die in einer Kieselgelsäule (Silica "S", 230-400 Mesh, 19·3,5 cm, Durchflußgeschwindigkeit 3 ml/min), eluiert mit 5% Essigsäureethylester in Chloroform, weiter gereinigt wurden. Das resultierende Material war eine im wesentlichen reine Probe des N&sup5;-CBZ-Benzylesters von Verbindung I (63 mg).
νmax (KBr) 3300, 1800, 1730 und 1690 cm &supmin;¹. δH (CDCl&sub3;, 90 MHz) 2,98 (1H, d, J 16 Hz), 3,42 (1H, dd, J 16 und 3 Hz), 3,81 (2H, t, J 7 Hz), 4,68 (2H, m)&sub1; 5,0 (1H, s), 5,07 (2H, s), 5,14 (2H, s), 5,61 (1H, d, J 3 Hz) und 7,30 (10H, s). δC (CDCl&sub3;, 63 MHz) 36,66 (C-6), 46,33 (C-10), 60,47 (C-2), 66,71 (Ar-CH&sub2;), 67,77 (Ar-CH&sub2;), 87,93 (C-5), 97,51 (C-9), 128,12 (Aryl-C), 128,40 (Aryl-C), 136,51 (Aryl-C), 152,51 (C- 3), 156,14 (CH&sub2;NHCO), 166,87 (C-8), 174,42 (C-7). [MH&spplus; (F.A.B.) 423,1561; (C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub6;)H&spplus; erfordert 423,1556].
Der N&sup5;-CBZ-Benzylester von Verbindung I ergab einen negativen Cotton-Effekt mit einem Minimum bei 243 nm im CD-Spektrum.
Eine 50 mg-Probe dieses Materials wurde zur Abspaltung der Schutzgruppen folgendermaßen behandelt. Die Probe wurde in 15 ml Essigsäureethylester/Ethanol (70:30) gelöst und zu 50 mg 10% Palladium/Kohle-Katalysator hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei einer Atmosphäre Druck 15 Minuten hydriert. Die DC-Untersuchung zeigte eine unvollständige Abspaltung der Schutzgruppen (Kieselgel Merck Art. 5719, Ethanol/Wasser, 90:10, Rf 0,2). Der Katalysator wurde abfiltriert und aufbewahrt und die Hydrierung mit frischem Katalysator wiederholt. Nach vollständigem Ablaufen der Umsetzung wurde die erste Charge Katalysator zum Reaktionsgemisch hinzugegeben und die Suspension am Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Wasser (20 ml) wurde hinzugefügt, um das Produkt zu lösen, und der Katalysator abzentrifugiert. Das wässerige Produkt wurde auf 1,5 ml eingeengt. Diese wurden auf eine Diaion HP20 SS-Säule (1,5·20 cm, Durchflußgeschwindigkeit 1,5 ml/min) aufgetragen und mit Wasser eluiert. Positive Fraktionen wurden durch DC identifiziert, anschließend vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch 5,7 mg Verbindung I erhalten wurden.
νmax (KBr) 3430, 1780 und 1640 cm&supmin;¹; δH (D&sub2;O, 250 MHz), 3,15 (1H, d, J 17 Hz), 3,57 (1H, dd, J 17 und 2,6 Hz), 3,67 (2H, t, J 7,5 Hz), 4,84 (1H, dt, J 7,5 und 1 Hz), 5,01 (1H, d, J 1 Hz), 5,77 (1H, d J 2,6 Hz).

Beispiel 32

Die enzymatische Umwandlung von 3-Hydroxy-5-amino-2-(2-oxo[2- ¹³C]azetidin-1-yl)[1,2-¹³C&sub2;]valeriansäure ([¹³C&sub3;]-Verbindung II) in [2,7,8-¹³C&sub3;]-Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7-oxo-4- oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure ([¹³C&sub3;]-Verbindung I)

[¹³C&sub3;]-Verbindung II (116,4 mg; hergestellt wie in Beispiel 18) wurde zu einem Reaktionsgemisch hinzugefügt, bestehend aus 1,74 g gefriergetrocknetem Dioxygenaseenzym (hergestellt wie in Beispiel 26), gelöst in 97,5 ml 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure-Puffer, pH 7,0, der mit 2,33 ml 50 mM Eisen(II)-sulfat-Lösung und 11,64 ml 50 mM α-Ketoglutarat- Lösung versetzt war. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Erlenmeyerkolben bei 28ºC unter fortgesetztem Schütteln inkubiert, um die ausreichende Übertragung von Luftsauerstoff sicherzustellen. Nach 70 Minuten zeigte der HPLC-Test mit Imidazol-Derivatisierung vor der Säulentrennung (dargestellt in Beispiel 26), daß 55,2 mg Verbindung I hergestellt worden waren (95% Umwandlung des biologisch aktiven Enantiomers). Die [¹³C&sub3;]-Verbindung I wurde nach dem nachstehenden Verfahren vom inaktiven Enantiomer von [¹³C]-Verbindung II abgetrennt.
Das Reaktionsvolumen wurde durch Rotationsverdampfung auf 17 ml reduziert und durch Biogel P2-Säulenchromatographie (Bio-Rad Laboratories) folgendermaßen entproteiniert. Die Probe wurde auf eine Säule mit Biogel P2 (5,2·13,5 cm, gepackt mit Wasser) aufgetragen und mit Wasser mit 1 ml/min bei 4ºC eluiert. Fraktionen, die Verbindung I enthielten, wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft, in 5 ml Wasser gelöst und bei 4ºC auf einer Merck Silica 60-Säule (3·16 cm, gepackt mit 85% Ethanol, 15% Wasser) chromatographiert und mit dem gleichen Lösungsmittel mit 0,6 ml/min eluiert. Fraktionen, die Verbindung I, nicht aber Verbindung II enthielten, wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Die ¹³C-NMR-Analyse der Probe zeigte, daß im wesentlichen die einzige vorliegende [¹³C&sub3;[-markierte Verbindungsart die [¹³C&sub3;]- Verbindung I war. Eine kleine Menge [¹³C&sub3;]-Verbindung II konnte noch nachgewiesen werden, die Menge des aktiven Enantiomers von [¹³C&sub3;]-Verbindung II betrug jedoch nur bis zu 0,5% der gesamten markierten Verbindungsarten. Die Analyse dieses Produktes durch das HPLC-Verfahren mit Imidazol-Derivatisierung vor der Säulentrennung zeigte, daß es 18,5 mg von Verbindung I enthielt.
Das nachstehende HPLC-Verfahren wurde verwendet, um das Vorliegen von Verbindung II in den Säulenfraktionen nachzuweisen.
Säule: C&sub1;&sub8; u Bondapak (Millipore Waters)
Lösungsmittel: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 3,0
Durchflußgeschwindigk.: 1,5 ml/min
Nachweis bei Wellenlänge: 205 nm
Unter diesen Bedingungen wies Verbindung II eine Retentionszeit von 2,55 Minuten auf.

Beispiel 33

Umwandlung von [2,7,8-¹³C&sub3;]-Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7- oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure ([¹³C&sub3;]-Verbindung I) in [2,7,8-¹³C]-Clavulansäure durch wachsende Streptomyces clavuligerus-Zellen

Ein 250 ml-Erlenmeyerkolben, der 30 ml Medium D (Beispiel 19) enthielt, wurde mit einer Impföse Sporen von S. clavuligerus beimpft. Der Kolben wurde 65 Stunden bei 26ºC geschüttelt, sodann wurden Aliquots à 1 ml in 3 weitere Kolben überführt, die jeweils 30 ml Medium D enthielten. Nach 31-stündigem Schütteln bei 26ºC hatte der Titer von Clavulansäure 129 ug/ml erreicht, sodann wurden zu jedem Kolben 6,2 mg [¹³C&sub3;]-Verbindung I hinzugegeben. Nach weiteren 16,5 Stunden Wachstum wurden die Kulturen durch Zentrifugation geerntet und der Überstand gefriergetrocknet. Der Clavulansäuretiter des Überstandes betrug 354 ug/ml, gemessen durch das in Beispiel 25 dargestellte Verfahren mit Imidazol-Derivatisierung vor der Säulentrennung.
Die gefriergetrockneten Feststoffe wurden mit Dimethylformamid (15 ml), enthaltend Benzylbromid (0,8 ml), aufgeschlämmt und 6,5 Stunden bei Raumtemperatur (etwa 20ºC) stehengelassen. Das resultierende Benzylclavulanat wurde mit Essigsäureethylester extrahiert und zum Erhalt eines braunen Öls am Rotationsverdampfer eingedampft. Dieses wurde auf eine Kieselgel-Säule (Silica "S", 230-400 Mesh, Riedel-de Haen), (1,5 cm·8,5 cm), gepackt mit Cyclohexan/Essigsäureethylester (6:1), aufgetragen und mit einem Gradienten aus Cyclohexan/ Essigsäureethylester (6:1 bis 1:1) eluiert. Das Vorliegen von Benzylclavulanat in den Fraktionen wurde mittels Kieselgel-DC (Merck Art. 5719) untersucht, wobei in Essigsäureethylester/ Cyclohexan (2:1) entwickelt und mit Triphenyltetrazoliumchlorid-Sprühreagens (4% Triphenyltetrazoliumchlorid in Methanol, verdünnt mit einem gleichen Volumen 1 M wässerigem Natriumhydroxid) sichtbar gemacht wurde (roter Punkt bei Rf etwa 0,6). Fraktionen, die Benzylclavulanat enthielten, wurden vereinigt und zum Erhalt einer klebrigen Masse am Rotationsverdampfer eingedampft. Diese wurde auf eine Sephadex LH20-Säule (Pharmacia), (1,5·10 cm), gepackt mit Cyclohexan/Chloroform (1:1), aufgetragen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Fraktionen, die Benzylclavulanat enthielten, wurden vereinigt und zu einer farblosen klebrigen Masse (14,2 mg) eingeengt, die mittels [¹³C]-NMR (100 MHz) untersucht wurde, Atom-% -Anreicherungen von [¹³C] wurden bezogen auf ein natürliches Häufigkeitsspektrum berechnet. Signifikante Anreicherungen wurden nur bei Kohlenstoffatom 2, 7 und 8 nachgewiesen, der Einbau von jeder [¹³C]-Markierung in Clavulansäure betrug etwa 4,3%. Weitreichende ¹³C-¹³C-Spin-Spin-Kopplungen wurden nachgewiesen, dies ist der gleichzeitigen Anreicherung der Kohlenstoffatome 7, 2 und 8 zuzuschreiben, was zeigte, daß die Bindungen zwischen den Kohlenstoffatomen 7, 2 und 8 während des Einbaus intakt geblieben waren.
Eine ¹H-NMR-Analyse wurde mit dem markierten Benzylclavulanat durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Markierung in Clavulansäure vorlag und nicht auf Verunreinigung mit [¹³C&sub3;]- Verbindung I oder einem Derivat davon zurückzuführen war. Das ¹H-NMR-Spektrum bei 400 MHz zeigte keine Signale, die auf das Vorliegen einer 10-Aminodesoxyclavulanat-Verbindung zurückgeführt werden konnten. Um in diesem Punkt doppelt sicherzugehen, wurde die Probe von [¹³C&sub3;]-Benzylclavulanat nach dem folgenden Verfahren in den 10-Methylether umgewandelt. [2,7,8- ¹³C&sub3;]-Benzylclavulanat (8,5 mg, 29 mMol) wurde in Dichlormethan (3,5 ml) gelöst und mit Magnesiumsulfat (30 mg, 250 uMol, 24 Stunden bei 170ºC getrocknet) und Silber(I)-oxid (23 mg, 100 uMol, 3,5 Stunden bei 170ºC getrocknet) versetzt. Die resultierende Suspension wurde drei Tage mit Methyliodid (0,2 ml, 3,2 mMol) bei Raumtemperatur und im Dunkeln gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft und über Kieselgel (Merck Art. 9385) in Essigsäureethylester/Hexan (1:2) chromatographiert, wodurch Benzyl-10-O-methylclavulanat als Öl (4,2 mg, 47%) bereitgestellt wurde; νmax (KBr) 1804, 1751, 1695, 743 und 699 cm&supmin;¹; δH (CDCl&sub3;, 250 MHz), 3,08 (1H, dd, J 16,7 und 0,5 Hz), 3,28 (3H, s), 3,49 (1H, dd, J 2,8 und 16,8 Hz), 4,00 Hz (2H, m), 4,82 (1H, dt, J 7,1 und 1,3 Hz), 5,10 (1H, d, 0,9 Hz), 5,20 (2H, s), 5,70 (1H, dd, J 2,7 und 0,5 Hz) und 7,37 (5H, m); δC (CDCl&sub3;, 100 MHz), 46,39, 57,74, 60,60 (dd, J 67,4 und 2,0 Hz), 60,61, 66,36, 67,85, 87,89, 97,66, 128,67, 134,70, 153,11, 166,91 (dd, J 67,5 und 3,5 Hz), 166,87 und 174,25 (m); (Gefunden M&spplus; + NH&sub4;, 321. C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub7;NO&sub5;+ NH&sub4;&spplus; erfordert 321).
Bei Untersuchung mittels Gaschromatographie zeigte sich, daß Proben des Methylethers von Benzyl-[¹³C&sub3;]-clavulanat und des Methylethers von nichtmarkiertem Benzylclavulanat die gleiche Retentionszeit (19,5 Minuten) aufwiesen. (Säule: 25 Meter BPI-Kapillar; Trägergas: Helium; Temperaturprogramm: 2 Minuten bei 120ºC, sodann Anstieg um 8ºC pro Minute bis auf 280ºC). Peaks, die mit der Retentionszeit des Methylethers von Benzylclavulanat eluierten, wurden mittels Massenspektroskopie untersucht. Die Daten von wiederholten Messungen wurden zusammengenommen und daraus mit dem Computer die Mittelwerte gebildet. Der Vergleich der Massenspektren der markierten und nichtmarkierten Proben zeigte, daß das markierte Material 4% dreifach [¹³C]-markierte Verbindungen enthielt. Hiermit wurde bestätigt, daß [2,7,8-¹³C&sub3;]-Verbindung I durch wachsende S. clavuligerus-Zellen in [2,7,8-¹³C&sub3;]-Clavulansäure umgewandelt wurde.

Beispiel 34

Umwandlung von Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7-oxo-4-oxa-1- azabicvclo[3.2.0]hentan-2-carbonsäure (Verbindung I) in Clavulansäure durch teilweise gereinigten Enzymextrakt von S. clavuligerus

Ein geklärter zellfreier Extrakt von S. clavuligerus wurde wie in den Beispielen 21 und 24 hergestellt. Streptomycinsulfat (1% Gew./Vol.) wurde bei 0ºC hinzugefügt und eine Stunde belassen. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 35 000·g und 4ºC zentrifugiert und der Überstand aufbewahrt. Ammoniumsulfat wurde hinzugefügt, so daß eine Konzentration von 80% Sättigung erhalten wurde, und die Suspension 18 Stunden bei 4ºC belassen. Die Suspension wurde eine Stunde bei 35 000·g und 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, resuspendiert. Die Lösung wurde zweimal eine Stunde im vorstehenden Puffer dialysiert (Visking Membran, Größe 1, Medicell International) und anschließend gefriergetrocknet, wodurch teilweise gereinigter Enzymextrakt als Pulver erhalten wurde.
Ein Reaktionsansatz wurde zubereitet, der den vorstehenden Enzymextrakt (40 mg/ml), Verbindung I (1 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Pyridoxal-5-phosphat (1 mM) und β-Nicotinamid- Dinucleotidphosphat (reduzierte Form; 1 mM), alles gelöst in 50 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, pH 7,0, enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei 28ºC inkubiert. In dieser Zeitspanne stieg der Clavulansäuretiter von weniger als 0,1 ug/ml auf 0,6 ug/ml. Die vorstehende Umsetzung wurde wiederholt, wobei Natriumglyoxylat oder α-Ketobutyrat anstelle von Natriumpyruvat eingesetzt wurde. In beiden Fällen stieg der Clavulansäuretiter von weniger als 0,1 ug/ml auf 0,8 ug/ml. Die Clavulansäuretiter wurden mit dem in Beispiel 25 beschriebenen HPLC-Verfahren mit Imidazol-Derivatisierung vor der Säulentrennung gemessen.

Claims

1. Verbindung der Formel (I) oder ein Salz oder eine geschützte Form davon:

2. Verbindung nach Anspruch 1 ausgewählt von:

Z-(2S,5S)-3-(β-Aminoethyliden)-7oxo-4-oxa-1-azabicyclo- [3.2.0]heptan-2-carbonsäure;

Z-(2S,5S)-3-(β-Benzyloxycarbonylaminoethyliden)-7-oxo-4- oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure; und

Benzyl-Z-(2S,5S)-3-(β-benzyloxycarbonylaminoethyliden)- 7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes oder einer geschützten Form davon nach Anspruch 1, das die Behandlung einer Verbindung der Formel (II) oder eines Salzes davon:

mit einer Oxygenase, die die erwünschte Cyclisierung bewirken kann, und anschließend gegebenenfalls, falls nötig, die Umwandlung des Produktes in eine freie Säure, ein Salz, oder eine geschützte Form davon umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, in dem das Enzym ein Dioxygenaseenzym ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, in dem das Enzym von der Art der Streptomyces abgeleitet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, in dem die Streptomycesart S. clavuligerus ATCC 27064 ist.

7. Verbindung der Formel (II) oder ein Salz oder eine geschützte Form davon:

8. Verbindung nach Anspruch 7 ausgewählt von:

5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valeriansäure;

5-Benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy-2-(2-oxo-azetidin-1- yl)valeriansäure;

Benzyl-5-benzyloxycarbonylamino-3-hydroxy-2-(2- oxo)azetidin-1-yl)valerianat;

Benzyl-5-azido-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)-valerianat.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Formel (II) oder eines Salzes oder einer geschützten Form davon nach Anspruch 7, das die Umsetzung einer Verbindung der Formel (XIA):

Y-CH&sub2;CH&sub2;CHO (XIA)

wobei Y ein Halogenatom oder eine gegebenenfalls geschützte Aminogruppe ist, mit einer Verbindung der Formel (XII) oder einem Salz davon:

wobei die Carboxylgruppe gegebenenfalls geschützt ist, und anschließend, falls nötig, die Durchführung von einem oder mehreren der folgenden Schritte:

i) Überführung der Gruppe Y in eine Aminogruppe;

ii) Überführung des Produktes in eine freie Säure, ein Salz oder eine geschützte Form davon, umfaßt.

10. Von S. clavuligerus ATCC 27064 abgeleitetes Dioxygenaseenzym mit den folgenden Eigenschaften:

a) die Fähigkeit, eine Verbindung der Formel (II) oder ein Salz davon nach Anspruch 7 in eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon nach Anspruch 1 zu überführen;

b) das Auftreten einer einzelnen Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 48 000 Daltons in der Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese;

c) ein mit der isoelektrischen Fokusierung bestimmter isoelektrischer Punkt von 5,65.

11. Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure oder eines Salzes davon, das die Behandlung eines Amins der Formel I oder eines Salzes davon

mit einem von der Art der Streptomyces abgeleiteten enzymatischen System, das das Amin in Clavulansäure oder ein Salz davon umwandeln kann, und anschließend gegebenenfalls, falls nötig, die Überführung des Produktes in eine freie Säure oder ein Salz umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Streptomyces Art ein Clavulansäure erzeugender Stamm ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, das in einem zellfreien System durchgeführt wird.

14. Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure oder eines Salzes davon, das die Behandlung eines Amins der Formel (II) oder eines Salzes davon:

mit einem von einer Streptomyces Art abgeleiteten enzymatischen System, das das Amin in Clavulansäure oder ein Salz davon umwandeln kann, und anschließend gegebenenfalls, falls nötig, die Überführung des Produktes in eine freie Säure oder ein Salz umfaßt.